Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cancer Targeting Gene-Viro-Therapy (CTGVT) on muodostettu lisäämällä antituumorisena geeni onkolyyttisten virus (OV). Se on itse asiassa OV-geeniterapian, joka on paljon parempi antituumorivaikutus kuin joko geeniterapiaan yksinään tai virotherapy yksin meidän aiemmin julkaistu papereita. Tämä tutkimus on muunnos CTGVT lisäämällä peräsuolen syöpä (CRC) erityiset estävä geeni, ST13, osaksi CRC erityinen onkolyyttisten virus, Ad · CEA · E1A (Δ24), rakentaa Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) kasvattamiseksi kohdistamista tropismista peräsuolen syövän ja se oli lyhyesti nimetty CTGVT-CRC. Vaikka monet tutkimukset CEA promoottori ja ST13 geenin raportoitu, mutta ei konstruktio on suoritettu yhdistää molempia uutena strategian peräsuolen syöpä (CRC) erityishoitoa. Sen lisäksi, että CRC spesifisyyden antituumorivaikutus Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) oli myös erinomainen ja sai lähes täydellinen estäminen (ei poistamiseen) CRC -ksenografti koska ST13 oli tehokas kasvainten vastainen geeni vähemmän myrkyllisyyttä, ja kiinalainen patentti (nro +201110319434,4) oli saatavilla tämän tutkimuksen. Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) aiheutti apoptoosin kautta P38 MAPK (ts P38), joka voimistunut CHOP ja ATF2 ilme. Mitokondrioiden Lääkeaineita apoptoosireittiä aktivoitiin kasvu kaspaasi 9 ja kaspaasi 3: n ekspressio.

Citation: Zhou X, Xie G, Wang S, Wang Y, Zhang K, Zheng S, et ai. (2012) tehokas ja spesifinen Antituumorivaikutus peräsuolen syövän CEA ja Rb Double säännelty Onkolyyttiset adenovirus kätkeminen

ST13

Gene. PLoS ONE 7 (10): e47566. doi: 10,1371 /journal.pone.0047566

Editor: Zhaozhong Han, Vanderbilt University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 22, 2012; Hyväksytty: 18 syyskuu 2012; Julkaistu: 15 lokakuu 2012

Copyright: © Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Science Foundation of Zhejiang Sci-Tech University (ZSTU) alle Grant nro 1016834-Y, National Basic Research Program of China (973 Program) (nro 2010CB529901, No. 2011CB510104), National Natural Science Foundation of Kiina (81172449), Tärkeä National Science Teknologia Erityisiä projekti hepatiitti ja hepatooma Related Program (2008ZX10002-023), ja uusi keksintö Program (2009-ZX-09102-246). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on maailmanlaajuisesti merkittävä kansanterveydellinen ongelma. Yhteensä 1.529.560 uutta syöpätapausta ja 569490 syöpäkuolemaa tapahtunut pelkästään Yhdysvalloissa vuonna 2010 [1]. Peräsuolen syöpä on toiseksi yleisin kuolinsyy Yhdysvalloissa ja on neljänneksi yleisin syöpä miehillä ja kolmanneksi yleisin syöpä naisilla maailmanlaajuisesti [2]. Näin ollen on olennaista tutkijoiden ja lääkärit kehittää uusia strategioita paksusuolen syövän hoitoon. Yksi strategia, jonka aloitti meille vuonna 1999 vuoteen 2011, kutsutaan Cancer Targeting Gene-Viro-Therapy (CTGVT), liittyy lisäämällä kasvaimia estävän geenin osaksi onkolyyttisten virus (OV) [3], [4]. Se on itse asiassa OV-geeniterapia. CTGVT (OV-geeni) on voimakas antituumorivaikutus, joka on seurausta lisättyjä geenejä voidaan monistaa useita satoja kertaa yhdessä replikaation onkolyyttisten viruksen syöpäsoluissa [5]. Yleensä järjestys antituumorivaikutuksen on paremmin CTGVT (OV-geeni) kuin vaikutus OV ja Ad-geeni. Olemme omistautuneet tutkia CTGVT (OV-geeni) strategia yli 10 vuotta ja julkaissut noin 70 liittyvien papereita, joka aina osoitti paljon suurempi antituumorivaikutus kuin Ad-geenin [6], [7], [8]. CTGVT (OV-geeni) on ajankohtainen tulossa kuuma aihe, sillä Amgen maksettu 1 miljardi dollaria ostaa OncoHSV-GM-CSF (OV Herpes simplex virus) alkaen BioVex [9] ja OncoPox-GM-CSF: n on julkaistu Nature, 2011 [10].

peräsuolen kasvainten synnyssä on monimutkainen prosessi, joka ohjaa useita geenejä ja käsittää lukuisia vaiheita. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että

ras

geenimutaatioita; deleetiot kromosomeja 5q, 17Q ja 18q;

neu, c-myc,

tai

c-myb

monistuksissa; ja uudelleenjärjestelyt

trk

onkogeeni olivat mukana Kolorektaalituumorien [11]. Nämä molekyylitason muutoksia ei täysin selittää koko prosessin peräsuolen kasvaimien syntyyn. Vuonna 1993, Zheng

et al

. tunnistettu ja peräsuolen syöpään liittyvien geeni, joka on vaimentua kolorektaalisyövässä, nimeltään kasvaimia aiheuttavan kyvyn tukahduttamisen 13 (ST13) (GenBank nro HSU17714), joka kloonattiin vähentävän hybridisaation seulonta välillä cDNA normaalin limakalvon kudosten ja mRNA paksusuolen karsinooma kudokset [12], [13], [14], [15]. Siten ST13 oli ehdokkaana kasvaimeen vaimennin geeni osallistuu kolorektaalikarsinoomasta [16], [17]. Lisääntynyt ST13 proteiinin ilmentyminen voi tukahduttaa lisääntymistä ja indusoi apoptoosin peräsuolen solulinjoissa. Aiemmat tutkimuksemme varmistanut, että käyttö ZD55-ST13 (a onkolyyttinen adenovirus poistamalla E1B 55KDa) johti 100-kertainen estävä vaikutus kasvaimen solujen kasvua verrattuna Ad-ST13

in vitro,

ja ZD55-ST13 myös kohdistuu voimakas antituumorivaikutus käytettäessä SW620 ksenografti- eläinmallissa kolorektaalisyöpää [18]. Parannettu antituumorivaikutuksen tehoa toisen onkolyyttisten adenoviruksen rakentamisen SG500-ST13 yli SG500 ilmeni kokeita käyttäen HCT116 ja SW620 solulinjoissa

in vitro

sekä soveltaminen HCT116 ksenograftimallia

in vivo

[19]. Kaikissa edellä ST13 tutkimus, ei ole tekoa käyttäen solutyyppispesifiselle CEA promoottori ajaa E1A (Δ24) lauseke ohjaamaan valikoivan replikaation virusta edelleen CRC erityistä hoitoa.

Karsinoembryonaalinen antigeeni (CEA) on laajalti käytetty tuumorimarkkeri erityisesti valvonnan paksusuolen syövän potilaille [20]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että CEA voi toimia adheesiomolekyyli, joka voi olla tärkeä rooli alkionkehityksen aikana ja mahdollisesti aikana kasvainten kehittymiseen [21]. Schrewe H

et al

., Havaitsivat, että CEA geenin promoottorikonstruktiin osoitti syövän vastaista aktiivisuutta, joka oli yhdeksän kertaa suurempi vastaan ​​CEA tuottava Adenokarsinoomasolulinja SW403 kuin ei-CEA tuottava HeLa-solulinjasta [20]. CEA-promoottori, joka on kytketty herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasin (HSV-tk), näytti selektiivisesti upregulate ilmentymisen HSK-tk CEA-ilmentäviä haimakarsinooma solulinjan BXPC3, mikä johti antituumorivaikutukset [22]. AdCEAp /Rep, jossa E1A ilmentymisen taustalla oli CEA promoottori, tehokkaasti esti useita maksametastaaseista CEA-positiiviset paksusuolensyöpä M7609 vuonna ksenograftimallia [23].

Tässä tutkimuksessa ST13 geeni lisättiin osaksi onkolyyttinen virus- vektori Ad · CEA · E1A (Δ24), joka levitetään CEA promoottori ohjaamaan E1A ilmentymisen 24 emäsparin deleetio E1A alueella vastuussa sitoutumisesta retinoblastooma (Rb) proteiinin ja sen replikaatiota ja tätä konstruktia kutsutaan Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) (jäljempänä ST13 suluissa edustaa ekspressiokasetti). Tämä on muunnos CTGVT CRC erityisiä Cancer Targeting Gene-Viro-Therapy (lyhyesti CTGVT-CRC), joka on uusi strategia, jota ei ole aikaisemmin raportoitu. Tuloksemme osoittivat, että antitumor Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) oli suurempi kuin Ad · (EGFP) CEA · E1A (Δ24), lisäksi suurempi kuin ONYX-015

in vitro

ja

in vivo

. Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) käsittely estivät merkittävästi, mutta ei kokonaan hävittää kasvun ksenograftissa SW620 peräsuolen karsinooman nude-hiirissä, ja elinaika oli huomattavasti parempi ilman sitä nude-hiirten kuoleman Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) hoidetussa ryhmässä. Nämä tulokset tarjoavat uudenlaisen oivalluksia kliinisen kolorektaalisyövän erityisiä hoito ja patentti on haettu [+201110319434,4].

Materiaalit ja menetelmät

Plasmidit, viruksista ja reagenssit

pMD18-T vektoriin ostettiin Takara, Ltd., ja pBHGE3 plasmidi ostettiin Microbix Biosystem Inc. (Toronto). PAD · E1A (Δ24), pMD18-T Simple-HCMV-MCS-polyA (SV40) ja pXC2-CEA plasmidit aikaisemmin rakentama ryhmämme. PCA13-ST13, ONYX-015 ja Ad-WT virukset pidettiin laboratoriossamme.

. Kaavamainen rakentaminen Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) ja Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24). Natiivi

E1A

promoottori korvattiin CEA promoottori ohjaamaan ilmentymistä

E1A

geenin 24 emäsparin deleetio. ST13 tai EGFP ekspressiokasetin valvonnassa hCMV-promoottorin väliin ψ pakkaus signaalisekvenssin ja E1A-geeni. B. tunnistetiedot CEA promoottorin ja ST13 geenin pAd · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) PCR. Kaista M: DL2000 Marker; Kaista 1: CEA-promoottori; Kaista 2: ST13-geenin. C. havaitseminen E1A (Δ24) ja ST13 ekspressiotasot kun SW620-soluja infektoitiin Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) tai tyypillinen onkolyyttisten virus ONYX- 015 MOI 5 48 tuntia. Western blot analyysi suoritettiin havaitsemiseksi E1A (Δ24) ja ST13 proteiinin tasoja.

Vasta-aineita kaspaasi-3, kaspaasi-9, Fas, Bcl-XL, CHOP, E1A, p38, Phospho-p38 MAP-kinaasi, ATF-2 ja Phospho-ATF-2 hankittiin Cell Signaling Technology, Inc. PARP-puoli ja β-aktiini-vasta-aineita saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), anti-ST13 ja anti-Hexon vasta-aineet hankittiin Epitomic, ja IRDye® 680 aasin anti-hiiri-IgG ja IRDye® 680 aasin anti-kani-IgG hankittiin LI-COR.

elinkelpoisuus kasvainsoluja, joilla on eri mõis eri onkolyyttisten adenoviruksia. Kolme CRC kasvainsolulinjoja (SW620, HCT116 ja HT29), ja kolme CEA-negatiivinen solulinjoissa (Bcap37 rintasyöpä, Tietoliikennejärjestelmien Nasopharynageal syöpä ja HeLa kohdunkaulan karsinooma) ja kaksi normaalien solujen (QSG7701 ja WI38-) infektoitiin joko Ad · (ST13 ) · CEA · E1A (Δ24), Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24), tai tyypillinen onkolyyttisten virus ONYX-015: n etäisyydellä mõis (0,1, 1, 5 tai 10 MOI), 4 päivää, solu elinkelpoisuus määritettiin käyttäen MTT-määritystä. Infektoimattomat solut katsottiin 100% elinkelpoisia. Pylväät edustavat keskiarvoja ± SD (n = 6). B. vaikutus virusinfektion solujen elinkelpoisuuden eri aikoina. Kolme CEA positiivisissa solulinjoissa (SW620, HCT116, ja HT29) ja kolme CEA-negatiivinen solulinjoissa (Bcap37, CNE ja HeLa) ja kaksi normaalien solujen (QSG7701 ja WI38-) infektoitiin joko ONYX-015, Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24), tai Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) MOI-arvolla 10. Kun 24, 48, 72, ja 96 tuntia, solujen elävyys mitattiin käyttäen MTT-määritystä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD rinnakkaisessa kokeessa. C. elinkelpoisuus kasvainsolujen tartunnan eri MÕIS Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24). CEA-negatiivinen koolonisyöpäsolulinja (Colo-320) ja CEA-positiivisia kuin koolonisyöpäsolulinja (A549, MCF-7) infektoitiin Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) at erilaisia ​​Mois ( 0,1, 1, 5 tai 10 MOI), 3 päivää, solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen MTT-määritystä. Pylväät edustavat keskiarvoja ± SD (n = 6).

rakentaminen eri rekombinantti-adenovirusesThe CEA-promoottori pXC2-CEA subkloonattiin pAd · E1A (Δ24) muodostamiseksi pAd · CEA · E1A (Δ24 ) kuljettaa adenovirusserotyypin 5 E1A geenin 24 emäsparin poistamisen 923 bp 946 bp. Koko ST13 ekspressiokasetti edelleen työnnetään pAd · CEA · E1A (Δ24) muodostamaan pAd · (ST13) · CEA · E1A (Δ24). Valmistustapaan sukupolven pAd · (EGFP) CEA · E1A (Δ24) oli samanlainen kuin jarrupalojen · (ST13) CEA · E1A (Δ24)

. Sekvenssi kutakin plasmidirakenteet varmistettiin käyttämällä restriktioentsyymidigestiota, PCR: llä ja DNA-sekvensoinnilla. Onkolyyttisten virukset Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) ja Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) tuotettiin homologirekombinaatiolla pAd · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) tai laikka · ( ST13) · CEA · E1A (Δ24) ja adenovirus pakkaus plasmidi pBHGE3 (Microbix Biosystems) HEK293-soluissa käyttäen EFFECTENE transfektioreagenssia (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kukin rekombinantti adenovirus valittiin kolmen plakkipuhdistuskierroksella HEK293-soluissa ja sen erikseen tunnistettiin PCR: llä. Lopullinen puhdistus viruksen suoritettiin cesiumkloriditiheysgradientissa sentrifugoimalla.

Morfologiset havainnot kasvainsolujen ja normaalien solujen, jotka oli infektoitu eri onkolyyttisten adenovirukset, kuten havaitaan mikroskoopilla. Solut infektoitiin MOI 10, ja morfologisia muutoksia soluissa havaittiin mikroskoopilla sen jälkeen, kun 72 tunnin infektion. B. havaitseminen apoptoosin SW620-soluissa FACS. SW620-solut infektoitiin joko ONYX-015, Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) tai Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) MOI 10. 48 tuntia, solut kerättiin ja värjätään anneksiini V-FITC (alkuvaiheen apoptoosin) tai PI (myöhemmän vaiheen apoptoosin) ja tutkittiin virtaussytometrialla. C. prosenttiosuus apoptoottisten solujen laskettiin käyttämällä Cell Quest ohjelmisto. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD (virhepalkit) kolminkertaisten kokeissa. (** P 0,01; *** p 0,001).

Solulinjat ja Cell Culture

HEK293 (ihmisen alkion munuais- solulinja) solujen, A549 (ihmisen keuhkojen adenokarsinooma line), Colo-320 (ihmisen paksusuolen syövän solulinja) ja MCF-7 (ihmisen rintasyöpäsolulinja) saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). HeLa (ihmisen kohdunkaulansyövän solulinja), SW620, HT29 ja HCT116 (paksu- ja peräsuolisyövän solulinjat), WI38- (ihmisen normaalia sikiön keuhkojen fibroblastisolulinjan), ja QSG-7701 (ihmisen normaali maksan solulinjasta) solut ostettiin Cell Pankki on Type Culture Collection of Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). SW620-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (DMEM, GIBCO BRL, Grand Island, NY), joka oli täydennetty 5% naudan sikiön seerumia (FBS), 4 mM glutamiinia, penisilliiniä (100 U /ml), ja streptomysiinillä (100 ug /ml). Kaikki muut solulinjat viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Kaikki soluviljelmät pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa kosteutetussa inkubaattorissa. Soluja logaritmisessa kasvuvaiheessa käytettiin kokeissa.

SW620-solujen Western blot. SW620-solut infektoitiin joko ONYX-015, Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) tai Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) MOI 5, 48 tuntia, apoptoosin liittyvät proteiinit analysoitiin western-blotilla.

Western blot -analyysi

edelleen tutkia molekyylitason mekanismeja vastuussa indusoimaa solukuolemaa rekombinantti adenovirus, Western blot analyysit suoritettiin. SW620 ja HCT116-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 5 x 10

5 per kuoppa ja viljeltiin yön yli, ja sitten niitä käsiteltiin kanssa tai ilman virusta 48 tuntia. Sekä pysyvä ja kelluvat solut kerättiin lyysipuskuriin [62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% natriumdodekyylisulfaattia (SDS), 10 mM glyserolia ja 1,55% ditiotreitolia]. Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttäen Bicinchoninic Acid (BCA) proteiini iinianalyysikitissä (Thermo Scientific, Rockford, USA). Yhtä suuret määrät proteiinit erotettiin 12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin sitten nitroselluloosalle (NC) kalvoja. Membraanit blokattiin 5% kuorittua maitoa, ja sitten niitä inkuboitiin primääristen vasta-aineiden ja sopivan sekundäärisen fluoresoivan vasta-aineita. Immunodetektio visualisoitiin käyttäen Odyssey infrapuna Imaging System (LI-COR Biosciences Inc, Amerikka).

solunelinkykyisyysmääritys

Solut jaettiin 96-kuoppalevyille ja käsiteltiin joko ONYX-015, Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24), tai Ad (ST13) · CEA · E1A (Δ24) on ilmoittanut mÕIS ja ajankohtina. MTT-määritys suoritettiin määrittämään solujen elinkelpoisuuden hoidon jälkeen eri adenovirukset. Neljä tuntia ennen loppua Inkubaation 20 ui MTT-liuosta (5,0 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Saadut kiteet liuotettiin 150 ul DMSO /hyvin ravistelemalla, 10 min. Optinen tiheys (O.D.) mitattiin aallonpituudella 570 nm käyttäen DNA-mikrolevylukijalla (GENIOS malli; Tecan, Mannedorf, Sveitsi). Solun eloonjäämisen prosenttiosuus laskettiin käyttämällä seuraavaa kaavaa: solujen eloonjäämistä% = (absorbanssi arvo käsiteltyjen solujen /absorbanssin arvo käsittelemätön kontrolli solut) x 100%. Kuusi samanlaiset näytteet arvioitiin kunkin pitoisuuden.

Kasvaimet todettiin injektoimalla SW620 soluja ihon alle oikeaan kylkeen nude-hiirten. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet 100-130 mm

3, hiiret jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään (n = 8) ja hoidettiin päivittäin peräkkäisen kasvaimensisäisenä injektioita neljä kertaa ONYX-015, Ad · (EGFP) · CEA · E1A ( Δ24) tai Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) 5 x 10

8 PFU /vrk ja PBS. A. Tuumorin koko mitattiin mittaharpilla, ja tuumorin tilavuus laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: kasvaimen tilavuus (mm

3) = 0,5 x pituus x leveys

2. B. selviytyminen käyrä eläimistä havaintojakson aikana. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD (virhepalkit). Log-rank-testi on käytetty analysoimaan eloonjäämisluvut eri ryhmissä. Tilastollinen merkitys: a, p 0,001, verrattuna PBS; b, p 0,01 verrattuna ONYX015; c, p 0,05, verrattuna Ad * (EGFP) * CEA * E1A (Δ24). C. Hexon ja ST13 ilmaisun

in vivo.

Tuumorisektioiden peräisin PBS: llä tai eri adenovirus huumeita käsiteltiin 4 päivää analysoitiin Hexon ja ST13 ilmaisun immunohistokemiallisesti. Alkuperäinen suurennos 400x.

Virtaussytometrianalyysi

Ihmisen peräsuolen syövän SW620-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 5 x 10

5 kuoppaa kohti ja niitä viljeltiin 37 ° C: ssa 5% CO

2: ssa kosteutetussa inkubaattorissa. Yön yli viljelyn jälkeen solut käsiteltiin joko ONYX-015 tai Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) MOI-arvolla 5. solut trypsinoitiin ja kerättiin 48 h käsittelyn jälkeen. Sitten solut värjättiin anneksiini V-fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) ja propidiumjodidilla (PI) sitovassa puskurissa, kuten on kuvattu anneksiini V-FITC apoptoosin havaitsemiseen kitin (BioVision, Palo Alto, CA). Värjäyksen jälkeen solut analysoitiin apoptoosin fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS; Becton Dickinson).

Ethics ohjausjärjestelmästä ja eläinten Experiment

BALB /c-nude-hiiriin (4-viikko- ikäisiä) huollettu ja käytetty kevyen ja kylmä- huoneen käytettäessä AAALAC-akkreditoitu laitos, ja juotettava ja laboratorioruokaa

halun mukaan.

Kaikki koetoimenpiteet hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea Shanghai Institute Biokemian ja solubiologian alle protokolla IBCB-SPF0029. Ksenosiirrettyjä hiiriä käytettiin mallina järjestelmä tutkia sytotoksisille vaikutuksille SW620-soluja (Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kiina)

in vivo

. SW620-soluja (5 x 10

6/100 ui) ihonalaisesti alempaan oikeaan kylkeen naisen nude-hiirten luoda -tuumoriksenografti mallia. Kasvaimen tilavuus (V), joka perustuu mittaharppimittauksilla, laskettiin käyttäen kaavaa V (mm

3) = pituus (mm) x leveys (mm)

2/2. Sen jälkeen, kun kasvaimet olivat saavuttaneet 100-130 mm

3 koko, hiiret jaettiin satunnaisesti kontrolli- ja testiryhmään (n = 8). Hoitoryhmien hallinnoi kasvaimensisäisesti klo peräkkäisenä päivänä annoksina 5 x 10

8 plakkia muodostavaa yksikköä (PFU) /100 ui joko ONYX-015, Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24), Ad ( ST13) · CEA · E1A (Δ24) neljän päivän ajan. Kontrolliryhmä käsiteltiin peräkkäisen kasvaimeen injektiot neljä kertaa samalla tilavuudella PBS: ää.

Tumor osa HCT116 CRC analysoitiin kuolion hematoksyliini- eosiinilla (H & E) värjäys, apoptoosi TdT-välitteisen dUTP-biotiini nick-end merkinnät (TUNEL), ja morfologista huomautuksia lähetyksen elektronimikroskoopilla (TEM) analyysi. (B1), Apoptosis tuumorisoluissa. (B2), selvyyden vuoksi yksi kasvain havaittiin apoptoosin.

immunohistokemiallinen ja histopatologinen Kokeet

immunohistokemiallista arviointia, kaksi hiirtä ryhmää kohti valittiin satunnaisesti 4 päivää sen jälkeen, kun virus hallinto. Aseptisissa olosuhteissa, kasvaimen kudokset kerättiin ja leikattiin paloiksi noin 1 kuutiometriä millimetrin kokoisia. Tuore kudos välittömästi upotettiin 4% paraformaldehydiä, jossa sitä pidettiin 48 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja sitten upottaa parafiiniin. Jälkeenpäin näytteet leikattiin 4 um: n paksuisia leikkeitä. Immunohistokemia suoritettiin anti-adenoviruksen heksoni- tai anti-ST13-vasta-ainetta (Biodesign International, Saco, ME), käyttäen immunohistokemiallista mukainen pakkaus valmistajan protokollaa. Lisäksi, patologiset muutokset kasvainkudoksessa tutkittiin sen jälkeen, kun hematoksyliinillä ja eosiinilla (H & E), värjäystä ja TUNEL värjäys sekä lähetyksen sähköinen (TEM).

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SD ja käsiteltiin käyttäen SPSS 10.1 tilasto-ohjelmalla. Kukin kvantitatiivinen koe suoritettiin vähintään kolme kertaa, ja tilastollinen merkitsevyys osoitettu P-arvot ≤0.05.

Kun Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) infektio, toisaalta, fosforyloitu P38, ATF2 ja voimistumista CHOP ilmaisun havaittiin. Toisaalta, pyöveli kaspaasi-3 aktivoitiin.

Tulokset

Rakentaminen ja karakterisointi Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) B

Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) vektori onnistuneesti rakennettu korvaamalla natiivi E1A-promoottorin kanssa kolorektaalisyöpä erityisiä CEA promoottori, poistamalla 24 emäsparia Ad · E1A (923-946 bp) ja kätkeminen kasvainvastaisen ST13 -geenin, kuten on esitetty kuviossa. 1A. Tunnistaminen ST13 ja CEA ilmaisun PCR kuvassa. 1B. Määrittämään E1A (Δ24) ja ST13 esiintyvien eri viruksia, CRC SW620-solulinja infektoitiin joko Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), Ad · (EGFP) CEA · E1A (Δ24), tai tyypillinen onkolyyttisten virus ONYX-015 MOI 5. Western blot-analyysit käyttää havaitsemaan E1A (Δ24) ja ST13 proteiinia. Tulokset osoittivat, että Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) vektori indusoi spesifejä ST13 ilmaisun ja suurin E1A (Δ24) lauseke (Fig. 1 C) havaittavia CRC soluissa.

CRC-specific Antitumor vaikutus Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24)

in vitro

CEA-positiivinen CRC solulinjoissa (SW620, HCT116, ja HT29), ja kolme CEA-negatiivinen syöpäsolun linjat (rintasyöpä Bcap37 solulinja, Nasopharynageal karsinooma CNE solulinjassa ja kohdunkaulansyövän HeLa-solulinja) ja kaksi normaalia solulinjoissa (QSG7701 ja WI38-) infektoitiin joko Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), Ad · ( EGFP) · CEA · E1A (Δ24), tai ONYX-015 on osoitettu mõis (0,1, 1, 5 tai 10). Jälkeen 96 h, solujen elinkykyisyys analysoitiin käyttämällä MTT-määritystä.

Kuten kuviossa. 2A, onkolyyttisten vaikutus Ad (ST13) · CEA · E1A (Δ24) käsittely osoitti ylivoimainen antituumorivaikutus kuin teki hoidon Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) tai ONYX-015 MOI 5 tai 10. Lisäksi esto oli annoksesta riippuva. Bcap37 Tietoliikennejärjestelmien ja HeLa-solut osoittivat alhaisempia inhibition kuin kolme CRC solulinjat, ja ei ollut inhibition QSG7701 tai WI38- normaali solulinjat.

Kuten kuviossa. 2B ajankulku hoitoon rekombinanttiviruksilla testattiin myös. Solut infektoitiin joko Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) tai ONYX-015 MOI 10 eripituisia aikoja (24, 48, 72 tai 96 h), ja solujen elinkyky infektion jälkeen määritettiin käyttäen MTT-määritystä. Tulokset osoittivat, että solun esto oli ajasta riippuva. Antituumorivaikutuksen vaikutus Seuraavat Ad (ST13) · CEA · E1A (Δ24) käsittely oli parempi kuin seuraava ilmoitus · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) ja ONYX-015 kohtelun kussakin solulinjoista tutkitaan (Fig. 2B) . Sen jälkeen 96 h, elinkelpoisuutta Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) infektoiduista soluista oli merkittävästi vähentynyt. Jälleen sytotoksisuutta Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) kolmessa kolorektaalisyövissä osoitti suurempi antituumorivaikutus kuin kolme CEA-negatiivinen syöpä, kun taas sytotoksisuutta kahdessa normaaleissa soluissa.

Nämä tulokset osoittivat, että Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) aiheutti suuremman erityinen antituumorivaikutus kolmeen CEA-positiiviset peräsuolen syövän soluja kuin kolme CEA-negatiivinen syöpä.

edelleen vahvistaa, jos antituumorivaikutuksen Ad (ST13) · CEA · E1A (Δ24) oli CEA-spesifisiä tai paksusuolen-specific, vertasimme sen vaikutus CEA-negatiivinen koolonisyöpäsolulinja (Colo-320) ja CEA-positiivisen ei-koolonisyöpäsolulinja (A549 MCF-7), kuten on esitetty kuviossa. 3C. Meidän havainnot ehdottivat, että Ad (ST13) · CEA · E1A (Δ24) oli tarkemmin on CEA-positiivinen syöpäsoluja.

morfologiset muutokset ja indusoiman apoptoosin viruksen hoitoon ja määritettiin virtauksen eytometryMorphological muutoksia kasvainsoluissa ja normaaleissa solut käsiteltiin erilaisilla viruksilla MOI 10 72 tunnin kuluttua havaittiin mikroskoopilla. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, solutuhovaikutuksen havaittiin CEA-positiiviset peräsuolen syöpäsolujen infektoitu joko Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) tai ONYX-015 verrattuna CEA-negatiivinen HeLa-soluissa. Tulokset osoittivat, että oli enemmän merkittäviä morfologisia muutoksia Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) infektoiduista syöpäsoluja kuin Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) infektoiduista tai ONYX-015-tartunnan saaneiden solujen , kuten solujen kutistuminen ja ulkonäkö pienten solujen palasia. Lisäksi ei morfologisia muutoksia ei havaittu normaalissa QSG7701 maksan solulinjaan. Nämä tulokset vahvistavat lisäksi tulokset MTT määritysten.

Voit selvittää apoptoosin oli mukana Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) aiheuttaman solukuoleman, apoptoosin arvioitiin käyttämällä virtaussytometria määritystä. SW620-solut infektoitiin joko ONYX-015 tai Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) MOI 5 48 tuntia. Sitten solut altistettiin anneksiini V-värjäyksellä tunnistetaan alkuvaiheen apoptoosin ja PI-värjäyksellä tunnistaa myöhäisvaiheen apoptoosin virtaussytometria-analyysin. Kuten on esitetty kuviossa. 3B, prosenttiosuudet Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) infektoiduista kasvainsolujen alkuvaiheen ja loppuvaiheen apoptoosin olivat 7,13% ja 22,22%, tässä järjestyksessä. Summat solun prosenttiosuuksien varhaisen ja myöhäisen vaiheen apoptoosin, joka on esitetty kuvassa. 3C, oli 29,35% Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), 8,85% ONYX-015 ja 3,9% for mock-tartunnan saaneiden solujen. Näistä tiedoista kävi ilmi, että ilmoitus (ST13) · CEA · E1A (Δ24) käsittely voisi tehokkaasti aiheuttaa syöpää solukuoleman nimenomaan aiheuttamaan apoptoosin.

Apoptoosi tunnistanut Caspase Related Enzyms

Apoptosis on yleisesti mukana dramaattisia muutoksia kaspaasi liittyviä entsyymejä ja proteiineja. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ZD55-ST13 hoidon aiheuttaman apoptoosin kautta mitokondrioiden reitin [18]. Siksi useat apoptoosiin liittyviä proteiineja SW620 soluista analysoitiin western blot. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, taso anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-XL oli vähentynyt, mikä tukee roolia mitokondrioiden apoptoosin. Lisäksi, pilkottiin kaspaasi-9, pilkottiin kaspaasi-3 ja lohkaisu PARP, olivat kaikki merkittävästi lisääntynyt Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) infektoiduista soluista. Oli selvää, että Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) indusoi apoptoosin tehokkaammin kuin hoito joko Ad · (EGFP) CEA · E1A (Δ24) tai ONYX-015.

p38 signaalinvälitysreitin, joka on mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) reitin, on keskeinen rooli säätelyssä monissa solun toiminnoissa, mukaan lukien tulehdus, solujen erilaistumista, solujen kasvua ja kuolema. Lisäksi p38 on myös transdusoi signaaleja solun muiden komponenttien toteuttamista varten eri soluvasteiden. ATF2, substraatti p38, voivat muodostaa heterodimeerejä jäsenten kesäkuu perheen transkriptiotekijöiden ja voivat siten suoraan liittää AP-1 sitoutumiskohdassa [24]. CHOP, jäsen C /EBP perheen transkriptiotekijöiden, on myös kutsutaan kasvun pysähtymisen ja DNA-vaurioita-geenin, 153 (GADD153) ja osallistuu säätelyyn solujen kasvun ja erilaistumisen [25]. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, ilmentyminen fosforyloidun p38 kasvoi merkittävästi, kun Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) hoitoon. Samaan aikaan aktivoitu p38 lisääntynyt taso fosforyloidun ATF2 ja ilmaus CHOP. Nämä tulokset osoittivat, että p38 voi osallistua apoptoottisen reitin, joka indusoitiin CRC erityinen onkolyyttinen adenovirus kätkeminen ST13 (CTGVT-CRC). Samanlainen Tulokset noin apoptoosiin liittyviä proteiineja havaittiin paksu- ja peräsuolisyövän solulinjoissa HCT116. (Fig. S1).

Antitumor tehokkuus Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) nude-hiirissä

SW620 ksenograftimallia ihmisen Kolorektaalituumorien perustettiin kateenkorvattomissa nude-hiirissä voidaan arvioida tuumorin vastaista tehoa Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24)

in vivo.

Kuten kuvassa. 5A, kasvaimet kasvoi nopeasti PBS-hoidetussa ryhmässä, kun taas eriasteisia kasvaimen kasvun tukahduttaminen havaittiin ONYX-015-, Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) – ja Ad (ST13) · CEA · E1A (Δ24) hoidetun ryhmiä. Keskimääräinen tilavuus Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) hoidetun SW620 kasvaimet oli noin 170 mm

3 30 päivää hoidon jälkeen, mikä on lisäystä vain 40-70 mm

3 verrattuna alkuperäiseen kasvaimen tilavuus 100-130 mm

3. Lopullinen kasvaimen tilavuus PBS-käsitellyn ryhmän oli noin 2500 mm

3, mikä osoittaa, että siellä oli noin 98% kasvaimen kasvun esto näillä eläimillä, mikä viittaa siihen, että lähes täydellinen inhibitio havaittiin kokeellisesti käsitellyissä eläimissä . Tämä voimakas ja spesifinen esto CRC käyttäen CTGVT-CRC strategia ei ollut aiemmin raportoitu.

Lisäksi eläin eloonjäämistä seurattiin vasta 54 päivää hoidon jälkeen, ja kaikki hiiret selvisivät Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) ryhmä. Muissa ryhmissä eloonjäämisluvut olivat merkittävästi vähentynyt eri tahtiin, kuten Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) ryhmä oli 50% eloonjääneitä, ONYX-015 ryhmässä oli 37,5% eloonjääneitä, ja PBS-käsiteltyjen ryhmä oli ainoastaan ​​12,5% eloonjääneitä (Fig. 5B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että CTGVT-CRC strategia Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) voitaisiin tehokkaasti parantaa eloonjäämislukuja hiirillä.

Tutkia mekanismi Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) toimintaa, immunohistokemiallinen tutkimus heksoniin ilmentymisen adenoviruksen ja ST13 geenin ilmentymisen taso

in vivo

tehtiin. Kuten on esitetty kuviossa. 5C, Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) hoidettujen ryhmässä heksoniproteiinia taso oli suurempi kuin villityypin virus-käsiteltyjen ryhmien ja ST13 oli niinikään ilmentyy voimakkaasti. Kuten on esitetty kuviossa.