Krooninen sairaus

tiivistelmä

peräsuolen syöpä (CRC) on toiseksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien länsimaissa ja vuorovaikutukset geneettisten ja ympäristötekijöiden, kuten ruokavalio, ehdotetaan olevan keskeinen rooli sen etiologia. Teimme pitkän aikavälin ruokinta kokeilu hiiren käsitellä geenien ilmentymistä ja metylaatiomuutokset syntyvät histologisesti normaalissa paksusuolen limakalvon putatiivisiksi syöpään altistavia tapahtumia saatavilla varhaiseen havaitsemiseen. Ilmaisu on 94 kasvua säätelygeeneissä aiemmin liitetty ihmisen CRC tutkittiin kahdessa ajankohtina (5 viikkoa ja 12 kuukauden ikäisiä) in heterozygoottiset

MLH1

+/-

hiirillä eläinmallissa ihmisen Lynch oireyhtymä (LS), ja villityypin

MLH1

+ /+

littermates, syötetään joko länsimaiseen (WD) tai AIN-93G ohjaus ruokavalio. Hiirillä ruokittu WD, proksimaalinen paksusuolen limakalvo, hallitseva sivusto syövän muodostumisen LS, osoitti merkittävän ilmentymisen väheneminen tuumorisuppressorigeeneille,

Dkk1, Hoxd1

,

Slc5a8

, ja

Socs1

, kaksi jälkimmäistä vain

MLH1

+/-

hiirillä. Vähentynyt mRNA ilmentyminen liittyi lisääntynyt promoottori metylaation vastaavat geenit. Vahvin lauseke vähennys (7,3-kertainen) sekä merkittävä kasvu sen promoottorin metylaation nähtiin

Dkk1

, antagonisti kanonisen Wnt signalointireitille. Lisäksi inaktivaatio

Dkk1

näyttäisi altistaa neoplasioihin proksimaalisen paksusuolen. Tämä ja se, että

MLH1

jotka osoittivat vaatimatonta metylaatio oli vielä ilmaistu molemmissa

MLH1

+/-

ja

MLH1

+ /+

hiirillä osoittavat, että ilmaisua vähenee ja inaktivaatioon

Dkk1

erityisesti herättävä, varhainen markkeri paksusuolen syövän synnyn.

Citation: Pussila M, Sarantaus L, Dermadi Bebek D, Valo S, Reyhani N, Ollila S, et ai. (2013) Cancer-ennakointi Gene Expression Muutokset Paksusuolen limakalvon länsimaisen ruokavalion Fed

MLH1

+/- hiiret. PLoS ONE 8 (10): e76865. doi: 10,1371 /journal.pone.0076865

Editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 22, 2013; Hyväksytty: 28 elokuu 2013; Julkaistu: 08 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Pussila et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ sai taloudellista tukea avustuksia Euroopan tutkimusneuvoston (2008-ADG-232635), Sigrid Juseliuksen säätiö (https://www.sigridjuselius.fi/foundation), suomi Cancer Järjestöt (https://www.cancer.fi/en /), Suomen Akatemia (https://www.aka.fi/eng), ja Biocentrum Helsinki (https://www.helsinki.fi/biocentrum/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) kehittyy monivaiheinen prosessi, joka vaatii useita geneettisiä ja epigeneettiset muutokset. Prosessi kiihtyy yksilöiden perinnöllinen syöpä taipumus, ja vuorovaikutukset geneettisten ja ympäristötekijöiden, kuten ruokavalio, näyttävät olevan avainasemassa sen etiologiassa [1,2]. Tärkeys epigeneettiset muutokset, kuten DNA: n metylaation muutoksia aloittamisen CRC on nyt tunnustettu [3,4], mutta, aikaisintaan tapahtumien normaalissa paksusuolen limakalvolla saatavilla varhaiseen havaitsemiseen ja ehkäisyyn syövän kehityksen jäävät selvittämättä.

Vaikka perinyt mutaatioita tuumorisuppressorigeeniä (APT) APC (adenomatoottisen polypoosin coli), joka on tärkeä osa Wnt /β-kateniinin signalointireitin, ja epäsuhta korjaus (MMR) geenien (esim

MLH1

, mutL- homologi 1), jotka ohjaavat mutaatiovauhdin solussa [2] voi antaa suuren elinikäinen riski syövän varhaisessa iässä puhkeamista, peräsuolen syöpä on selvästi sairaus iän myötä [3,4]. Niinpä metylaatiomuutokset pienen osajoukon APT on havaittu ikääntymisen paksusuolen limakalvo normaalin terveen yksilön, ja tämä metylointi sisältää geenejä, jotka usein entistä huomattavasti metyloitavaa neoplastiset solut [5-7], mikä viittaa niiden merkitys syövän aloittamista ja etenemistä. Yhdessä ikääntyminen joitakin eksogeenisen yhdisteitä ravinnosta ovat tärkeitä määritteet metylaatiovyöhykkeiden paksusuolessa [8], luultavasti selittää miksi Länsi väestön kuluttavat huomattavia määriä punaista lihaa, tyydyttynyttä rasvaa ja sokeria, ja vain kohtuullisesti ravintokuitua, vitamiineja ja kivennäisaineita (esim kalsiumia, folaatin, ja D-vitamiinia) sekä kasvien johdettu ravinteiden näyttää korkeimman CRC ilmaantuvuus maailmassa [1] (World Cancer Research Fund, www.dietandcancerreport.org). Epigeneettiset muutokset tarjoavat siten välistä mahdollista yhteyttä ravinnon ja syövän [9] ja korostaa tarvetta selventää ruokavalion vaikutuksia geenisäätelyn suolen limakalvolla.

Eläinten malleja, erityisesti jyrsijät, tarjoavat arvokas resurssi alalla ympäristö- epigenetiikka lukien tutkimukset muutokset välittyvät ruokavalio [10]. Tulokset viittaa siihen, että länsimaiseen ruokavalioon (WD) aiheuttaa ruoansulatuskanavan kasvaimet hiiren malleja familiaalinen suoliston syöpä ja jopa villityypin (WT) hiirillä ilman mitään karsinogeeni hoitoa [11-14] sai meidät tutkimaan vaikutuksia WD vastuita geenien sääntely ja metylointi normaalissa paksusuolen limakalvon kanssa ja ilman perinnöllinen paksusuolen syöpä alttius. Valitsimme 94 kasvua säätelygeeneissä aiemmin liitetty ihmisen CRC ja tutkittiin niiden ilmentyminen heterozygoottiset

MLH1

+/-

hiiriä analoginen ihmisen Lynch oireyhtymä (LS), ja WT

MLH1

+ /+

littermates. Aikana pitkän aikavälin ruokintakokeen käytimme oman muuttaminen länsimaiseen ruokavalioon (WD *), joka suuresti muistuttaa New Western Diet (NWD) osoitettu aiheuttavan hyvän- ja pahanlaatuisten kasvaimien paksusuolen normaali C57BL /6 jälkeen 18 kuukauden ruokintakoe [12]. Suurin ero NWD ja WD * on rasvan lähde jota WD * pitkälti muuttunut öljystä eläimen (maito) rasvaa ja siten muistuttavat enemmän rasvaa kulutetaan Länsi populaatiot. Täällä, proksimaalinen paksusuolen, hallitseva sivusto syövän muodostumisen LS [15], paljasti useita merkittäviä ikään liittyviä muutoksia geenien ilmaisuja. Joitakin muutoksia voimistaa WD * ja jotkut havaittiin vain hiirillä geneettisen syövän taipumus. Olemme lisäksi osoittaneet, että ilmentyminen muuttuu tunnistaa esimerkiksi histologisesti normaalin limakalvon olivat huomattavan aikaisin esiintyy ennen

APC

inaktivaatiota ja toinen osuma

MLH1

.

Methods

hiiret

Heterotsygoottianalyysin B6.129-

MLH1

tm1Rak

hiiriä (MLH1

+/-) (kanta 01XA2) saatiin NCI -MMHCC; National Institutes of Health, hiiri Repository, NCI-Frederick, MD. Vuonna B6.129-

MLH1

tm1Rak

hiirillä, eksonin 2, puuttuu toinen

MLH1

alleelien johtaa ei-toiminnalliset MLH1-proteiinia [16 ]. MLH1

+/- hiirillä on lisääntynyt sairastuvuus verrattuna niiden WT poikueesta ja noin kolmasosa kehittää kasvaimia, kuten lymfoomat sekä kasvaimia pienten ja paksusuolen ja useita muita elimiä elinkaarensa aikana [17]. MLH1

+/- ja MLH1

+ /+ hiirillä genotyypattiin käyttämällä genomista DNA: ta korvamerkkejä protokollan mukaisesti julkaistaan ​​Mouse Repository verkkosivuilla (https://mouse.ncifcrf.gov/protocols.asp? ID = 01XA2 p_allele = MLH1% 3Ctm1Rak% 3E prot_no = 1) (katso materiaalit ja menetelmät S1).

Ethics selvitys

Hiiriä kasvatetaan ja käsitellään tutkimuksen mukaan protokollan hyväksymän kansallisen eläinten Experiment Board Suomessa (ESLH-2008-06502 /Ym-23). Hiiret humaanisti eutanasia CO2 hengitettynä.

Ruokavalion

iässä 5 viikon (aika kohta 0, tp0),

MLH1

+ /-

ja

MLH1

+ /+

hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ruokavalion ryhmään (n = 8 /ryhmä, sisältäen molemmat sukupuolet) syötetään AIN-93G ( AIN) verrokkiruoalla [18] tai länsimaiseen (WD *) ruokavaliota (Harlan Teklad, Madison, WI) (taulukko 1, yksityiskohtainen kuvaus ruokavalion ja niiden ravitsemukselliset koostumukset ovat taulukossa S1).

AIN93- g

WD *

Rasva Lähteet (g /kg)

a kappale (g /kg)

bSoybean Oil70-vedetön maitorasva-133Canola Öljy-55Sunflower Öljy-12Carbohydrate SourcesStarch397306Maltodextrin13295Sucrose100116Protein Source200 ( kaseiini) 232 (kaseiini, vitamiini ilmainen) Yhteensä energiasisältö (kcal /g) 3.84.6Kcal rasvasta (%) 17.239.2Kcal hiilihydraateista (%) 63.942.3Kcal proteiinista (%) 18.818.5Vitamin D (IU /kg) 1000100Folic acid (mg /kg) 20.2Calcium50.5Table 1. Diet ravitsemuksellista tietoa.

yksityiskohtaisia ​​koostumus koedieettejä katso taulukko S1.

a Jos ei toisin mainita

b Jos ei toisin mainita CSV Lataa CSV

Näytteen valmistus

Kahdeksan hiirtä per kukin ryhmä tp0 (MLH1

+/-, MLH1

+ /+) ja TP1 (12 kuukauden ikäisiä) (MLH1

+ /+ AIN, MLH1

+/- AIN, MLH1

+ /+ WD *, MLH1

+/- WD *) 48 hiiret yhteensä tapettiin ja näytteet. Histologinen tutkimukset tehtiin The Suomen Centre for Laboratory Animal patologia (FCLAP), University of Helsinki, Suomi.

genomista DNA ja kokonais-RNA uuttoa, limakalvojen (6 x 4 mm) erotettiin taustalla submukoosassa ja lihakset alla preparointimikroskooppia. Näytteet RNA säilytettiin RNAlater (Qiagen, Valencia, CA) -80 ° C: ssa.

RNA ja käänteinen transkriptio

Koko RNA-näytteet valmistettiin käyttämällä RNeasy Plus Kit ( Qiagen, Valencia, CA) ylimääräinen DNaasikäsittelyä (Qiagen, Valencia, CA). RNA eheys analysoitiin Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ja vain laadukkaita RNA (RNA eheys numero RIN 8) käytettiin cDNA-synteesin reaktiot, jotka ajettiin kaksoiskappaleiksi ja yhdistettiin RT -qPCR reaktioita. Käänteinen transkriptio joko 200 ng (yksittäisten näytteiden StellARray) tai 1600 ng (altaat kahdeksan näytettä, 200 ng kutakin, kahdeksasta eri hiiristä kuuluu kuhunkin tp1 ryhmän TaqMan RT-qPCR) kokonais-RNA saavutettiin M-MuLV RNase H

+ (Thermo Scientific, Suomi) tai Superscript III (Life Technologies, Carlsbad, CA), vastaavasti, käyttämällä satunnaisia ​​alukkeita mukaan valmistajan ohjeiden.

RNA ilmentämistutkimuksissa

RNA ilmauksia histologisesti normaalin kudosnäytteitä koolonin proksimaalista limakalvon analysoitiin käyttämällä kvantitatiivista mittatilaustyönä StellARray

TM alustalle (Lonza Ltd, Bar Harbor Biotechnology). StellARray sisältyi 94 geenejä (73 APT) aiemmin liittyvät kehittäminen paksusuolisyövän ja /tai dokumentoitu näytteille CpG Island (CGI) hypermetylaation CRC ja muissa ihmisen syövissä (taulukko S2).

APC

sisällytettiin array indikaattorina jatkuvan syövän synnyn. Kahdeksan hiirtä kustakin tutkimusryhmän niistä analysoitiin erikseen ilmaus 94 kiinnostavia geenejä (48 RT-qPCR paneelit yhteensä).

Jokaisessa StellARray kuoppaan laitettiin 20 ui SYBR Green master mix sisältävien 8μl näytteen erityisiä cDNA ja muunnetut

Thermus brockianuksesta

DNA-polymeraasia (Thermo Scientific, Suomi). RT-qPCR paneelit ajettiin Mx3000P cycler (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) käyttäen seuraavia sykliparametrit: 50 ° C 2 min, 95 ° C: ssa 7 min, 40 sykliä 95 ° C 15 s, ja 60 ° C 1 min. Fluoresenssi tiedot hankittiin aikana 60 ° C /pidentyminen askel. Aluke spesifisyys seurattiin läpi sulamiskäyräanalyysi. Ilmaisu erot eri hiiren ryhmien analysoitiin käyttämällä Global Pattern Recognition ™ (GPR) ohjelmisto (Bar Harbor Biotechnology, Trenton, ME) B

tulokset tilastollisesti merkittäviä ilmentymisen muutoksista suhteessa WD * ja /tai perinnöllinen syöpä taipumus oli validoitu tp1 käyttäen TaqMan määrityksiä (taulukko S3). Toisin kuin StellARray RT-qPCR, TaqMan-RT-qPCR analyysi tehtiin yhdistetyistä näytteistä. Kukin yhdistetty näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena kohdegeenien, sekä endogeenisen viitteenä geenit käyttäen seuraavia sykliparametrit: 1 sykli 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 40 sykliä 95 ° C 15 s, ja 60 ° C: ssa 1 minuutti. Lämpökäsittelyyn ja fluoresenssia tiedonkeruu suoritettiin kanssa StepOnePlus cycler (Life Technologies, Carlsbad, CA) ja Cq arvot kutsuttiin käyttämällä Data-avustaa v2.0 ohjelmisto (Life Technologies, Carlsbad, CA). Tasaisesti ilmaisi viite geenien (

HDAC1

ja

Stk4

) valittiin käyttämällä GeNorm algoritmia [19] joukosta 94 geenien mukana StellARray.

MLH1

ekspressiotasoja at tp0 myös kvantitatiivisesti käyttäen TaqMan määritystä.

Jos määrä mallin oli liian alhainen antaa luotettavia tuloksia, RT-qPCR validointi suoritettiin käyttäen valmiiksi monistettu cDNA. Kullekin tp1 ryhmä, yhdistettyä näytettä oli multiplex ennalta monistettiin käyttäen 16 ng cDNA TaqMan Esivahvistustaso Master Mix Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pyöräily parametrit olivat seuraavat: 1 sykli 95 ° C: ssa 10 minuuttia ja 10 pre-monistussykliä 95 ° C: ssa 15 s, ja 60 ° C: ssa 4 min ajan.

DNA metylointianalyysi

DNA metylointianalyysi, vain geenit, jotka olivat osoittaneet merkittävää mRNA ilmaisu vähennys (eli ehdokas hypermetyloitunut APT) yhdessä perinnöllinen alttius ja /tai WD * valittiin, ja metylaatiotasot niiden CpG-saarekkeiden (CGI) arvioitiin erikseen jokaiselle tp0 ja tp1 hiiri. Genominen DNA varten metylointianalyysi uutettiin käyttäen DNeasy Veri Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) peräisin kudosnäytteitä välittömässä läheisyydessä joita käytetään RNA: n ilmentymisen tutkimukset.

kvantitatiivinen metylaatio analyysi suoritettiin Sequenom n MassARRAY EPITYPER

TM-järjestelmä (Sequenom GmbH, Hampuri , Saksa), joka on bisulfaatti-pohjainen tekniikka tukeutuen pohja-katkaisua RNA: n ja matriisin laserdesorptio ionisaatio-lentoaika-massaspektrometrialla (MALDI-TOF-MS) määrittää suhteellinen määrä metylaation DNA-fragmentteja, jotka sisältävät joko yhden tai useamman myöhemmän CpG sivustoja, joita kutsutaan CpG-yksikköä [20]. Massaspektrissä, selvä signaali kuvio johtuu metyloidut ja metyloitumattomien kohdesekvenssin, ja EPITYPER ohjelmisto määrittää yksittäisten metylaatio suhde (eli signaalin intensiteetin suhde prosentteina metyloitua ja ei-metyloitua signaalit) CpG-sivustojen /yksikkö kohdesekvenssiin. Järjestelmä pystyy havaitsemaan metylaatiotasoilla niinkin alhainen kuin 5%.

amplikoneihin oli ensisijaisesti valittu kattamaan CGI selityksin jonka UCSC genomin selain ja on päällekkäinen transkription aloituskohdasta ja 5 ’UTR tai olla niiden lähellä. Kaikkiaan kaksitoista eri amplikoneihin (pituudet välillä 174 ja 499 emäsparia) analysoitiin joista kahdeksan kuului ennalta validoitu Mouse Standard EpiPanel ja neljä mukautettua DNA: n metylaatio määritykset suunniteltiin käyttäen Sequenom n EpiDESIGNER ohjelmisto (Sequenom GmbH, www.epidesigner.com), joille alukesekvensseissä ja kohdesivustot esitetään taulukossa S4. Vähentääkseen metyloinnin vaihtelun aikana lisättyä PCR [21], kolme rinnakkaista monistukset suoritettiin ja yhdistettiin massan analyysi. Alkuperäinen metylaatio Aineisto suodatettu Sequenom jättää huonolaatuisia mittauksia. CpG yksiköt tuottivat tietoja yli 75% näytteistä läpäissyt alkuperäisen laadun valvontaa. Näistä näytteistä, jotka saatiin tietoja yli 80% kaikkien CpG yksiköitä amplikoni valittiin, että näyte /amplikoni pari. Lisäanalyysiä, CpG yksiköitä joissa oli tietoja alle 50% kaikista näytteistä ja näytteet joissa oli tietoja alle 50% kaikista CpG yksikköä ulkopuolelle. Sen jälkeen laadunvalvonta 78% CpG yksiköiden analysoitu (152 ulos 196) ja kaikki 48 näytettä otettiin mukaan tarkempaa analysointia vaiheet.

Tilastolliset analyysit

StellARray RT-qPCR, yhteinen kynnys asetettiin kaikissa 48 levyjen sisällä kokeen. Ilmaisu erot eri ryhmien analysoitiin käyttämällä Global Pattern Recognition ™ (GPR) ohjelmisto, joka suorittaa tehokkuus korjaus ja viite geenin ja kontrolliryhmässä normalizations (www.bhbio.com/BHB/dw/products.gpr.html). GPR hyödyntää myös biologisen rinnakkaisnäytteiden poimia merkittäviä muutoksia geenien ilmentyminen. StellARray järjestelmä ei toimi käyttäjän määrittelemä viite geenejä. Sen sijaan GPR ohjelmisto algoritmi määrittää paras sarja viite geenien kokeen vertaamalla ilmaus kaikkien geenien mukana analyysissä koe- ja kontrollinäytteiden, generoi globaalin kuvio ilmaisun muutoksia, ja luo sijoittui listan merkittävistä muutokset [22]. Tällä tavoin valittaessa viite geenien on puolueeton, koska se mahdollistaa kokeelliset tiedot määritellä pysyvästi ilmensivät viittaus geenejä.

TaqMan määrityksissä, suhteelliset mRNA ilmaisu muutoksia analysoitiin käyttämällä vertailevan C

t (ΔΔC

t) menetelmällä, jossa esitetään tiedot on kertaiseksi muutoksia geenien ilmentyminen normalisoitu endogeenisten viite geenejä ja suhteessa kontrolliryhmään [23]. Data-avustaa v2.0 ohjelmisto (Life Technologies, Carlsbad, CA) käytettiin laadunvalvontaan ja normalisoimiseen kvantifiointiin sykli (Cq) tiedot, ja mediaani permutaatio menetelmä [24] käytettiin määrittämään merkitystä ilmaisun kertamuutoksia verrattuna kontrolliryhmään kanssa merkitsevyystasolla

P

0.05.

Korrelaatio StellARray ekspressiokuvioita 5 viikkoa vanha

MLH1

+ /+

ja

MLH1

+/-

hiiriä tutkittiin Pearsonin korrelaatio analyysi (

R

arvo) PASW Statistics 18 järjestelmä.

Chipster-ohjelmisto [25] käytettiin visualisoimaan ja analysoimaan metylaatio tiedot. Non-metrinen moniulotteinen skaalaus (NMDS) -työkalua käytettiin tuottamaan kaksiulotteinen kartat perustuvat otokseen erilaisuus lasketaan Euklidinen etäisyys, ja Dendrogrammi työkalua käytetään luomaan dendrogrammissa näytteiden avulla normalisoitu data Pearson korrelaatio ja keskimääräinen sidos menetelmä . Sillä Chipster analyysit, puuttuu metylaatio arvot yksittäisten CpG yksiköt määritellään mediaanin arvo CpG yksikön sisällä erityisesti hiiren ryhmään.

vertailu keskimääräisestä metylaatiotasoilla eri hiiren ryhmien suoritettiin käyttäen Mann-Whitneyn testiä on PASW Statistics 18 järjestelmä.

tulokset

Colonic neoplasioihin kehittää pääasiassa WD * hiirillä

Kaiken yksi proksimaalinen adenokarsinooma ja viisi adenoomia /hyperplastic polyyppeja havaittu 32 hiirillä TP1. Merkitys WD * CRC riski meidän hiiren sarjassa korostuu se, että 5 out of 6 hiirten neoplasioihin ruokittiin WD * ja että WD * aiheutti kasvaimen kehitystä myös villityypin hiirissä ilman perinnöllinen alttius, eli vain syöpä ja yksi adenooma löytyivät

MLH1

+ /+

WD * hiirillä (taulukko 2, kuva S1). Yksittäinen AIN syöttää hiiren kehittää neoplasia (hyperplastic polyyppi) oli mutaatio harjoittaja.

Hiiri Ryhmä

Dkk1

ilmaistaan ​​(n = 16) B

Dkk1

ei ilmaista ( n = 16) B

MLH1

+ /+

AIN62

MLH1

+/-

AIN3

a5

MLH1

+ /+

WD * 4

b4

c

MLH1

+/-

WD * 35

a, b, bdTable 2.

Dkk1

inaktivoitumista ja paksusuolen neoplasioihin eri hiiren ryhmissä.

hyperplastinen polyyppi;

b adenooma;

c adenokarsinooma;

d ei histologisesti varmennettu CSV Lataa CSV

MLH1

+/- ja MLH1

+ /+ hiirillä osoittavat samanlaista mRNA: n ilmentymisen kuvioita alussa

alussa kokeellisen ruokinta aikana (tp0), The MLH1

+/- ja MLH1

+ /+ hiiret osoittivat hämmästyttävän hyvä korrelaatio (Pearson

R

= 0,989,

P

0,01) välillä mRNA ilmaisun kuviot 94 geenien mukana mukautetun StellARray RT-qPCR array (kuvio S2A). Kuitenkin, erillään muista geeneistä, mutta mukaisesti eri genotyyppiä, ilmaus

MLH1

oli noin 50% pienempi heterozygoottiset hiirissä kuin WT-hiirissä (kuvio S2B). Kaiken kaikkiaan, joka on isogeenisestä tausta alussa teki perusteltua selvää, että ilmaisua erojen näyttäisi eri hiiret ryhmissä myöhemmin hankittiin eikä tuloksista periytyvän geneettisen perustuslain.

WD * ja /tai perinnöllinen alttius liittyy ero ilmentyminen useiden geenien tp1

kun 12 kuukauden ikäisiä (TP1), ilmaus useiden geenien havaittiin lisätä tai vähentää verrattuna tp0 (taulukot 3 ja 4). Kaikki GPR tulokset (

P

-arvot ja kertamuutoksia) ilmentymisen eroja eri hiiriä ryhmien kaikki 94 geenit ovat taulukossa S5. Yhdeksän 94 geenien osoitettiin tilastollisesti merkitsevä (

P

0,05) ilmentyminen muuttuu välillä tp0 ja tp1 kaikkien hiirten ryhmissä (MLH1

+ /+ AIN, MLH1

+/- AIN, MLH1

+ /+ WD *, MLH1

+/- WD *) (taulukko 3). Vähentynyt mRNA havaittiin

CCND1

(sykliini D1),

Cdh1

(kadheriinin 1), ja

Mal

(Myelin ja lymfosyyttien proteiinin, T solujen erilaistumista proteiinia), kun taas lisääntynyt ilmentyminen havaittiin

Axin2

,

Cdx1

(Caudal tyyppi homeobox 1),

Fzd10

[Frizzled homologi 10 (

Drosophila

)],

Mbd2

(metyyli-CpG: tä sitova domeeni proteiini 2),

Mbd4

(metyyli-CpG: tä sitova domeeni proteiini 4), ja

Rasgrf2

(Ras-proteiini-spesifinen guaniininukleotidiä vapauttava kerroin 2). Koska nämä muutokset eivät riipu peritty alttius tai WD * ne voivat johtua ikääntymisestä.

MLH1

+ /+

AIN

MLH1

+/-

AIN

MLH1

+ /+

WD

MLH1

+/-

WD

vaimentua GenesFold muutos (

P

) Taita muutos (

P

) Taita muutos (

P

) kertaluokkamuutos (

P

)

CCND1

3,3 (0,003) 3,8 (0,000) 4,3 (0,001) 3,6 (0,000)

Cdh1

5,4 (0,002) 4,9 (0,000) 5,9 (0,002 ) 8,4 (0,000)

Mal

3,4 (0,025) 3,4 (0,014) 3,2 (0,034) 2,7 (0,028) voimistuvan GenesFold muutos (

P

) Taita muutos (

P

) Taita Change (

P

) Taita muutos (

P

)

Axin2

2,6 (0,005) 3,0 (0,002) 1,8 (0,039) 1,6 (0,028)

Cdx1

4,1 (0,002) 5,6 (0,000) 3,4 (0,002) 5,4 (0,000)

Fzd10

4,8 (0,002) 7,6 (0,000) 3,4 (0,021) 5,0 (0,000)

Mbd2

3.3 (0,004) 4,7 (0,000) 3,2 (0,003) 5,7 (0,000)

Mbd4

3,0 (0,005) 6,0 (0,000) 3,0 (0,004) 3,3 (0,000)

Rasgrf2

2,3 (0,002) 1,8 (0,006) 2,3 (0,001) 1,5 (0,040) Taulukko 3. Genes osoittaa tilastollisesti merkitsevä (

P

0.05) mRNA: n ilmentymisen eroja tp0 ja tp1 kaikissa neljässä hiiren ryhmää; kontrolliryhmässä (MLH1

+ /+ AIN) sekä kolme tutkimusryhmissä (MLH1

+/- AIN, MLH1

+ /+ WD, MLH1

+/- WD).

CSV Lataa CSV

MLH1

+ /+

AIN

MLH1

+/-

AIN

MLH1

+ /+

WD

MLH1

+/-

WD

downregulate GenesFold muutos (

P

) Taita muutos (

P

) Taita muutos (

P

) Taita muutos (

P

)

Dkk1

2,0 (0,110) 5,1 (0,012) 6,2 (0,003) 7,3 (0,003)

Slc5a8

1,3 (0,078) 1,7 (0,041) 1,3 (0,224) 1,5 (0,032)

Hoxd1

1,1 (0,348 ) 2,0 (0,075) 2,1 (0,019) 1,5 (0,191)

Socs1

1,6 (0,460) 2,7 (0,067) 1,0 (0,485) 3,1 (0,026) voimistuvan GenesFold muutos (

P

) kertaluokkamuutos (

P

) Taita muutos (

P

) Taita muutos (

P

)

Dkk2

2,2 (0,108) 2,2 (0,037) 1,7 (0,329) 1.0 (0,637)

Rprm

1,4 (0,442) 2,0 (0,017) 1,1 (0,725) 3,3 (0,019)

Acaa1b

2,4 (0,120) 1,8 (0,140) 3,5 (0,124) 9,4 (0,000) Taulukko 4. Geenit osoittaa tilastollisesti merkitsevä (

P

0.05) mRNA: n ilmentymisen eroja tp0 ja tp1 ainakin yhdessä tutkimuksen kanssa, mutta ei kontrolliryhmässä (MLH1

+ /+ AIN).

CSV Lataa CSV

Tilastollisesti merkitsevä ilmaisu muutoksia välillä tp0 ja tp1 liittyy perinnöllinen syöpä alttius (MLH1

+/-) ja /tai WD * havaittiin seitsemässä geenejä (taulukko 4, taulukko S5); vähentynyt ilmentyminen

Dkk1

[Dickkopf homologin 1 (

Xenopus laevis

)]

, Slc5a8

[(liuenneen aineen kantaja perheen 5 (jodidi kuljettaja), jäsen 8]

, Hoxd1

(Homeobox D1), ja

Socs1

(Suppressor sytokiinin signaloinnin 1), ja lisääntynyt ekspressio

Dkk2

[Dickkopf homologi 2 (

Xenopus laevis

)],

Rprm

(Reprimo, TP53 riippuvainen G2 pidätys välittäjänä ehdokas), ja

Acaa1b

(asetyyli-koentsyymi A: asyylitransferaasin 1B).

vahvin lauseke vähennys (7,3 kertainen) nähtiin Wnt signalointia estävä geeni

Dkk1

joukossa MLH1

+/- hiiret ruokittu WD *. vuonna heterotsygoottinen hiirillä ruokittu AIN ja WT hiirillä ruokittu WD *, vähennys oli 5.1 ja 6.2 kertaiseksi. Mielenkiintoista, homeobox geeni

Hoxd1

osoitti ikään liittyvä ilmaus vähennys (2,1-kertainen) vain MLH1

+ /+ WD * ryhmä, ja tilastollisesti merkittävää laskua liittyvä WD * edelleen havaittu, kun tätä ryhmää verrattiin kontrolliryhmään (

MLH1

+ /+

AIN) klo tp1 (1,9-kertainen) (taulukko S5). Ilmaisu lasku kuljettaja butyraatti

Slc5a8

liitetään vain

MLH1

heterotsygotian (1,5 ja 1,7 kertaisesti WD * ja AIN-ryhmässä), kun taas

Socs1

, sytokiini signalointi säädin, oli merkitsevästi säädeltiin (3,1-kertainen) vain, jos molemmat riskitekijöitä olivat läsnä, eli

MLH1

+/-

WD * ryhmä.

ilmentyminen

Dkk2

, toinen Wnt signalointia modulaattori, oli merkittävästi lisääntynyt MLH1

+/- AIN ryhmä (taulukko 4) siten, että tp1,

Dkk2

ilmaus keskuudessa MLH1

+/- hiirillä oli merkitsevästi alhaisempi (2,2 kertainen) WD * ryhmässä verrattuna AIN ryhmään (taulukko S5).

Rprm

havaittiin tilastollisesti merkittävä ikääntymiseen liittyvien ilmentymisen lisääntyminen yhdessä

MLH1

heterotsygotian (3.3 ja 2.0. Taita WD * ja AIN, vastaavasti).

Acaa1b

osoitti merkittävää ilmentymistä kasvun MLH1

+/- WD * hiiret (9,4-kertainen) ja ekspressiotasot paljasti merkittävän eron (5,0-kertainen), kun

MLH1

+/-

WD * hiiret olivat verrattuna

MLH1

+/-

AIN ryhmä tp1 (taulukko S5).

ei ollut saatavilla kudosnäytteitä /poimii tulosten validointiin proteiinitasolla. Näin ollen, TaqMan RT-qPCR käytettiin vahvistamaan ekspression muutoksia, jotka liittyvät syöpään altistavia

MLH1

mutaation ja /tai WD *. Isogeenisissä tausta ja omat tulokset hiirillä osoittivat samanlaisia ​​mRNA ilmaisu kuvioita alussa (kuvio S2A, S2B) teki perusteltua yhdistää yksittäiset näytteet (n = 8) kustakin ryhmästä pooleihin myöhempää käyttöä validointi kokeita. Kuvio 1 havainnollistaa eroja havaittu ryhmien välillä ja verrokkiryhmä tp1.

Suhteellinen sen erilaisissa tutkimusryhmissä (MLH1

+/- AIN, MLH1

+ /+ WD *, ja MLH1

+/- WD *) verrataan kontrolliryhmään (MLH1

+ /+ AIN). Kukin näyte on seos, jossa kahdeksan RNA-näytteet kahdeksasta eri tp1 hiiret kuuluvat kunkin hiiren ryhmään. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM (standard keskivirhe) (n = 3), * merkittävä ero verrattuna kontrolliryhmään. Mediaani permutaatio menetelmä,

P

0,05. (A)

MLH1

esittää samaa 50% ilmaisun ero genotyyppien kuin lähtökohta tutkimuksen. (B)

Dkk1

merkittävästi alaspäin säännellään tutkimuksessa ryhmien WD * ja /tai

MLH1

heterotsygoottisuustesti. (C)

Slc5a8

ei osoita merkittävää ilmaisua eroja TP1. (D)

Hoxd1

on säädeltiin yhdessä WD * molemmissa genotyyppejä; alas asetuksen ollessa erityisen voimakasta MLH1

+ /+ WD ryhmä. (E)

Socs1

ei osoita merkittävää ilmaisua eroja TP1. (F)

Dkk2

on säädeltiin yhdessä WD * molemmissa genotyypit.

Taqman vahvisti havainto, että

Dkk1

on yksi näkyvä ehdokkaat ilmaisua paksusuolen limakalvon muuttunut yhdessä perinnöllinen syöpä alttius ja WD *. Koska alhainen

Dkk1

mRNA, RT-qPCR suoritettiin esivahvistettua cDNA (vahvistus tasaisuus arvo -0,76).

Dkk1

mRNA oli merkittävästi vähentynyt verrattuna kontrolliryhmään (

MLH1

+ /+

AIN) kaikissa tutkimusryhmissä [MLH1

+ /+ WD *, 1,5 kertaiseksi (vaihteluväli 1,4-1,7); MLH1

+/- AIN, 1,4 (1,3-1,5); MLH1

+/- WD *, 1,2 (1,1-1,2)] (kuvio 1 B). Ilmaisu on

Hoxd1

väheni huomattavasti paitsi MLH1

+ /+ WD * hiirillä [1,9 (1,7-2,2)], toteaminen jo havaittu StellARray, mutta myös MLH1

+/- WD * ryhmä [1,3 (1,2-1,3)] (Kuva 1 D), korostaen vaikutus WD * on

Hoxd1

ilme. Taqman RT-qPCR vahvisti myös, että on tärkeää WD * ilmoitustapa

Dkk2

, missä StellARray tilastollisesti merkitsevä lasku nähtiin MLH1

+/- WD * hiirillä [1,2, (1.2- 1,3)], mutta nyt myös WT hiirillä ruokittu WD * [1,2 (1,2-1,3),

P

= 0,053] (kuva 1 F). Ilmaisu on

Acaa1b

havaittiin myös olevan merkittävästi lisääntynyt sekä MLH1

+/- WD * ja MLH1

+ /+ WD * hiirillä [2,6 (2,3-2,8) ja 1.7 ( 1,7-1,8), vastaavasti] (kuvio S3). Ilmaisu tasot

Slc5a8

ja

Socs1

ei ollut eroa kontrolliryhmän ja tutkimusryhmät (kuvio 1 C, E).

On huomattava, ei merkittäviä iästä tai ruokavalion liittyvä ilmaus muutoksia havaittiin

APC

tai

MLH1

. Kuten alussa, ilmaus

MLH1

oli noin 50% pienempi heterozygoottiset hiirissä verrattuna WT hiirillä, mikä osoittaa, että toinen inaktivoiva osuma

MLH1

ei ollut vielä tapahtunut TP1 ( kuvio 1A). Ilmaisu on

APC

oli samankaltainen molemmissa genotyyppien (StellARray).

merkittävä nousu DNA metylaatiotasoilla mukana vähensi geenien ilmentymistä

metylaatiotasoilla on CGI on geenit, jotka olivat osoittaneet tilastollisesti merkitsevä lasku mRNA ilmaisun yhdessä

MLH1

heterotsygoottisuuden ja /tai WD * (

Dkk1, Slc5a8, Hoxd1

, ja

Socs1

; Taulukko 4 ) analysoitiin erikseen jokaiselle tp0 ja tp1 hiiren avulla Sequenom n MassARRAY EPITYPER

TM järjestelmän. Lisäksi

MLH1

, ja

Sfrp1

joka oli osoittanut ikään liittyvän ilmentymisen lasku rajatapaus merkitys (1,4-kertainen,

P

= 0,06) että MLH1

+ 0,05.