Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä edelleen yleisin maligniteetti miesten Yhdysvalloissa, eikä korjata tällä hetkellä saatavilla edennyt pitkälle hormoni tulenkestävät syöpä. Tämä johtuu osittain epätäydellisestä ymmärtämistä androgeenisäädellyn proteiinit ja niiden koodatut toiminnot. Koko-solu proteomeja androgen-ruokittu ja androgeenin käsiteltyjen LNCaP-solut analysoitiin puolikvantitatiivinen vääntelehtien mutakuopassa ESI- ioniloukku MS /MS ja määrällinen iTRAQ MALDI- TOF MS /MS alustat, joissa tunnistaminen yli 1300 high-luottamusta proteiineja. Rikastumisen perustuva reitin kartoitus androgeenisäädellyn proteomic aineistoja paljastui huomattava häiriöstä aminoasyyli-tRNA-syntetaasit, mikä osoittaa kasvua proteiinia biosynthesis- tunnusmerkki aikana eturauhassyövän etenemistä. Tämä havainto tukee immunoblottauksella ja transcript tietoja LNCaP, ja eturauhasen syöpä kudosta. Siten tiedot olivat peräisin useista proteomiikan alustojen ja transkriptio tiedot yhdistettynä tietotekniikan analyysi antaa syvällisemmin toiminnalliset seuraukset androgeenitoiminnan eturauhassyövän.

Citation: Vellaichamy A, Sreekumar A Strahlerin JR, Rajendiran T, yu J, Varambally S, et ai. (2009) proteomiikan kuulustelu androgeenitoiminnan eturauhassyöpäsoluissa paljastaa roolit Aminoasyyli tRNA Syntetaasit. PLoS ONE 4 (9): e7075. doi: 10,1371 /journal.pone.0007075

Editor: Lennart Randau, Yalen yliopisto, Yhdysvallat

vastaanotettu: 3. heinäkuuta 2009; Hyväksytty: 29 heinäkuu 2009; Julkaistu: 18 syyskuu 2009

Copyright: © 2009 Vellaichamy et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoitettiin osittain Michigan Technology Tri-Corridor, Michigan Economic Development Corporation avustusta 687 varten Michigan proteomiikka Alliance for Cancer Research (GSO, AMC, AS, AV), National Institutes of Health myöntää U54DA021519 National Center for Integrative Biomedical Informatics (GSO, AMC), R01CA126239 (AN), RO1CA133458 (AS, AMC) U01 CA111275 (AMC), 1K99CA129565-01A1 (JY), ja P50 CA69568 (AMC, AS), Department of Defense PC080665 (JY), ja rahasto Discovery of Michiganin yliopiston Kattava Cancer Center (AS). AMC tukee Clinical Translational tiedepalkinto päässä Burroughs Tervetuloa Foundation ja on tutkija ja Howard Hughes Medical Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpä eturauhasen (PCA) on yleisimmin diagnosoitu syöpä miehillä Yhdysvalloissa, arviolta 200000 uutta tapausta ja 29000 kuolemantapausta 2008 [1]. Monet raportit viittaavat siihen, että androgeenien, joita tarvitaan normaalia kehitystä eturauhasen tukevat myös kasvua ja etenemistä PCa. Androgeenit aikaansaavat solujen vaikutuksia sitoutumalla androgeenireseptorin (AR), jäsen ydin- hormonin reseptorin (ET) Super perhe. AR puolestaan ​​sitoutuu androgeenireseptorin elementteihin (ARE) kun promoottori ja tehostaja alueiden kohdegeenien, toimii transkription sääntelijä transdusoimalla sukulais hormoni signaalin tumaan [2], [3]. Eturauhassyöpä hoito läpi androgeeniablaatio aluksi saavuttaa regressio kasvainten; kuitenkin, aggressiivisempi, hormoni-tulenkestävien muoto kasvain (HR-PCA) voi kehittyä, myöhempien kuolleisuutta. Vaikka useita ryhmiä ovat kuulustelleet androgeenisäädellyn muutoksia, jotka transcriptome ja proteomiin tasot käyttäen geenien ilmentymisen paneelit ja massaspektrometria, vastaavasti [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10 ], on edelleen puute merkittävää ymmärrystä toiminnallinen seurauksena hormonin toiminnan aikana eturauhassyövän kehitystä. Osittain tämä puute on osoitus harvalukuisuuden että proteomic data; johtuvat rajoitukset proteomic teknologioiden kokonaismäärä proteiinien tunnistettu ja määrällisesti yhdessä tutkimuksessa on vaatimaton. Lisäksi on olemassa teknisiä haasteita tällaisista aliedustus proteiinien ja arvioitaessa tilastollista merkitystä eroista proteiinin ilmentymisen.

voittamiseksi näihin haasteisiin ja saada tarkempaa tietoa androgeenisäädellyn proteomic muutoksia eturauhassyöpä, käytimme kaksitahoinen strategia. Ensinnäkin parannettu henkäys androgeenisäädellyn proteomiin profiloitua tässä tutkimuksessa käyttämällä kahta täydentävää massaspektrometrialla (MS) alustat: yksi, johon isotooppi merkinnät peptidien kanssa iTRAQ reagenssin seurasi 2D nestekromatografialla (LC) MALDI- TOF MS /MS-analyysi ABI 4800 MALDI tandem ajan lennon (TOF /TOF) väline [11] ja toinen tarra-vapaa lähestymistapa perustuu spektrin laskenta [12], [13], [14], [15] Multi-ulotteinen Protein Identification Technology (vääntelehtien mutakuopassa) [16] kanssa sähkösumutusionisaatioon (ESI) – ioni ansa MS /MS lineaarisesti ioniloukku (LTQ) väline. Toiseksi meidän selvitetty Proteomiikan muutoksia yhteydessä toiminnallisen reittejä käyttäen Molecular Concepts Mapping (MCM, jota kutsutaan myös Oncomine Concepts Mapping (OCM)) [17], saada syvällisemmin biologia androgeenitoiminnan eturauhassyövässä. Erityisesti tällaiset kombinatorinen analyysit paljastivat silmiinpistävä kohoavan aminoasyyli-tRNA syntetaaseja (AAR), jotka voisivat taustalla kasvu proteiinibiosynteesin ennustivat eturauhassyövän eri geenien ilmentyminen tutkimukset.

Tulokset

meillä työskentelee integroiva strategia (kuva 1) ymmärtää androgeenitoiminnan eturauhassyövässä. Lyhyesti, suoritimme massaspektrometria-pohjainen proteomiin profilointi androgen riistää ja androgen stimuloimaa LNCaP. Trypsiini-pilkottu proteiineja tunnistettiin ja määrällisesti käyttäen kahta massaspektrometrisia alustoille: iTRAQ MALDI-TOF MS /MS ja vääntelehtien mutakuopassa ESI- ioniloukku MS /MS. Tiedot kustakin näistä alustojen normalisoitiin itsenäisesti ja yhdistää tuottaa luettelon androgen säänneltyjen proteiinien. Androgen säännelty proteomiin kuulusteltiin biologiseen yhdistysten käyttäen Molecular Concepts Mapping (MCM). Monista molekyyli, mukaan luettuina androgeenisäädellyn ja eturauhassyövän käsitteitä, jotka rikastettiin meidän androgen sääteli datajoukon, käsitettä kuvaavat koholla aminoasyyli-tRNA syntetaaseja (aaRSs) valittiin jatkotutkimuksiin. Osaa näistä proteiineista validoitiin immunoblot-analyysillä. Käyttämällä transcriptomic profilointi ja kromatiinin immunosaostus, osoitimme että androgeenireseptorin ohjaa ilmentymistä aaRSs at transkriptin tasolla. Lopuksi osoitti koholla Aars kapealla aikana eturauhassyövän etenemisen avulla kliinisistä näytteistä.

androgeenin stimuloi LNCaP-solut profiloitu käyttäen sekä määrällisiä iTRAQ MALDI- TOF /TOF ja semikvantitatiivinen vääntelehtien mutakuopassa ESI- LTQ proteomiikka alustoille. Tiedot kustakin näistä alustojen normalisoitiin itsenäisesti ja yhdistää tuottaa luettelon androgeenisäädellyn proteiineja. Tämä lista kuulusteltiin biologiseen yhdistysten käyttäen Molecular Concepts Mapping (MCM). Konsepti kuvataan aminoasyyli-tRNA syntetaaseja valittiin jatkotutkimuksiin; valitut proteiinit validoitiin käyttäen immunoblottaus ja immunofluoresenssivärjäyksen. Transcriptomic profilointi ja chromatin immunosaostus osoitti, että androgeenien ohjaa ekspressiota aminoasyyli-tRNA synthases at transkriptio tasolla. Tämä vahvistettiin käyttämällä syöpäkudoksessa geeniekspression data ja immunoblot-analyysi eturauhasen kudosnäytteitä, joka osoitti, että on olemassa kohonnut aminoasyyli-tRNA syntaasin kapealla aikana eturauhassyövän etenemisen.

tunnistaminen ja suhteellinen kvantitointi LNCaP proteiinien iTRAQ MALDI-TOF MS /MS

Käyttämällä iTRAQ MALDI-TOF MS /MS-alustalla, tunnistimme 904 proteiinien korkea luottamus tulokset määritettynä SEQUEST [18], PeptideProphet [19] ja ProteinProphet [20] laskennallisia työkaluja. Näistä 879 oli määrällisesti jälkeisen datan normalisointi (kuvio 2A), yleisen proteiinin tunnistaminen FDR alle 1% (katso materiaalit ja menetelmät yksityiskohta).

A) Venn kaavio esittäen kokonaismäärän ja osa-sarjaa androgeenisäädellyn proteiinit tunnistettiin iTRAQ MALDI TOF- MS /MS-analyysi. Vähimmäismäärä 1,25 SD maailmanlaajuisesta keskiarvosta sekä androgeeni- käsiteltyjen näytteiden ja vähintään 1,5 SD jossakin androgeenireseptorin käsiteltyjen näytteiden asetettiin. B) Venn kaavio esittäen lukumäärät koko ja androgeenisäädellyn LNCaP proteiinit tunnistettu vääntelehtien mutakuopassa (ESI ioni trap- MS /MS) analyysi. Proteiinit suluissa ei otettu huomioon ero koska ne liittyvät alemman spektrin laskee. C) Venn-kaavio, joka esittää kokonaismäärä proteiinien tunnistettiin kaksi massa-spektrometrinen alustat ja niiden päällekkäin. D) Venn kaavio esittäen kokonaismäärä androgeenin sääteli proteiinit tunnistettiin kaksi massatuotantona spektrometristen alustat ja niiden päällekkäisyyksiä. E. Venn kaavio, jossa kokonaismäärä androgeenin alassäädetty proteiineja tunnistettiin kaksi massatuotantona spektrometristen alustat ja niiden päällekkäisyyksiä.

Oikeudenkäynnissä androgeeni proteomia arvioitiin iTRAQ käyttämällä kahta itsenäistä biologista rinnakkaista. Kaksinkertainen duplex iTRAQ koe suoritettiin jossa androgeeni-käsiteltyjen näytteiden kussakin rinnakkaisnäytteessä leimattiin 115 ja 117 isobaaristen tagit kun niitä vastaavat vertailunäytteet leimattiin käyttäen 114 ja 116 isobaaristen tageja. Jotta voitaisiin laskea kynnystä määrittämään proteiinin ilmentyminen muuttuu, me normalisoitui suhteellinen proteiinin suhde kutakin androgeenin käsiteltyjen näytteiden ja yksi valvonnan (merkitty isobaaristen tag 116) proteiinin ilmentymistä kontrollinäytteessä leimattu 114 isobaaristen tag. Jakautuminen kaikkien proteiinin tunnusluvut androgen-käsiteltyä näytettä (tag 115) versus kontrolli (tag 116) on esitetty Täydennyskuvio S1A. Yli 80% proteiineista oli suhde alueella 0,8-1,2. Mediaani-keskitetty normalisointi aikaansai keskimäärin lähes yhtenäisyyttä kaikki näytteet, ja keskihajonta ohjaus rinnakkaisten (tag 116, SD = 0,16) käytettiin asteikolla asettaa raja suhde ilmentyvät eri proteiineja. Niinpä muutokset että vähimmäismäärä 1,25 SD (suhde 1,2 säädelty ja 0,83 varten alassäädetty) katsottiin merkittäviksi (katso materiaalit ja menetelmät lisätietoja). Luettelot kaikista 70 androgeenin säädelty ja 39 alassäädetty proteiineja tunnistettiin tästä analyysistä esitetään Täydentävät taulukossa S1 ja täydentävä taulukko S2 vastaavasti.

Semikvantitatiivisilla vertailu proteiinien avulla vääntelehtien mutakuopassa analyysiä

Käyttämällä vääntelehtien mutakuopassa ESI- ioniloukku MS /MS proteomic profilointi lähestymistapa 857 proteiinit tunnistettiin vähimmäis- proteiinin todennäköisyys pisteet 0,9 (arvioitu FDR alle 1%); 67% (574) kuului tunnistettiin yhteistä on kontrolli ja androgeenin-käsiteltyjen näytteiden, kun taas 126 proteiinit ja 157 proteiinit tunnistettiin vain ohjaus ja androgeenista käsiteltyjen näytteiden, vastaavasti (kuvio 2B). Lisäksi määritettäessä läsnäolon tai puuttumisen proteiinien, teimme tilastollinen analyysi verrata suhteellisia spektrisiä laskee proteiinien kussakin käsittelyssä. Kokonaismäärä spektrejä joko ohjaus- tai androgeeni-käsitelty data on itsenäisesti normalisoitu, ja normalisoitu kumulatiivinen spektrin laskee kaikkien peptidien kullekin proteiinille käytettiin mittana proteiinin runsautta. Perustuu tilastolliseen analyysiin tietojen proteiinit nimettiin ilmentyvät eri jos ne tunnistettiin vain joko ohjaus (alassäädetty) tai androgeenien käsitellyn näytteen (säädelty) neljällä tai enemmän peptidejä. Proteiineja tunnistettiin molemmissa näytteissä, normalisoitu spektrin count suhde kahden keskihajonnan yli tai alle keskiarvon kaikkien proteiinien ryhmän (joka vastaa nelinkertaista muutos) käytettiin cut-off (katso materiaalit ja menetelmät, katso Täydentäviä Kuva S1B jakeluun normalisoidun spektrin määrä tunnusluvut tunnistettujen proteiinien ohjaus ja androgeenin-käsiteltyjen näytteiden). Näiden kriteerien perusteella, 65 ja 57 proteiinit nimettiin androgen säädelty ja alassäädetty, vastaavasti (täydentävä taulukko S3, upplementary taulukko S4).

Yhdistetty luettelo ilmentyvät eri proteiinien tunnistettiin kahdesta MS alustoilla

ymmärtäen, että luetteloon peptidien profiloitu massaspektrometrillä vaikuttavat ionisointilähteeseen ja massa-analysaattorin [21] (tässä tapauksessa MALDI- TOF vs. ESI-ioni ansa), yhdistimme proteiini luettelot johdettu kahdesta MS alustojen johtamiseksi komposiitti lista. Tämä helpotti se, että näiden alustojen tunnistettu yhtä paljon suuri luottamus proteiineja (857 ja 879 proteiineja vääntelehtien mutakuopassa ja iTRAQ vastaavasti vertailukelpoisia FDR alle 1%). Ensimmäisenä vaiheena prosessissa, ei-tarpeeton proteiinit poimitaan kunkin kokeen muuntamalla niiden IPI liittymisen numeroita geenin tunnukset. Kolme proteiineja (lektiini, mannoosia sitova 2, LMAN2; CLPX, kaseinolyyttistä peptidaasi X-homologi, ja 40S ribosomaalinen proteiini S9, RPS9) joka osoitti ristiriitaisia ​​suuntauksia niiden ilmentyminen näiden alustojen välillä poistettiin. Nämä menettelyt saatiin yhteensä 844 ja 875 proteiineja, vastaavasti, vääntelehtien mutakuopassa ja iTRAQ tietomääriä (kuvio 2B, 2A). Yhdessä 1306 proteiinit havaittiin yhdistetty aineisto (kuvio 1 ja kuvio 2C). Näistä 126 proteiineja olivat koholla, kun androgen hoitoon. Erityisesti 9 näistä androgen-up säädellään proteiinit päällekkäin kahden proteomic alustoilla (kuva 2D): KLK3, ACSL3, FASN, FKBP5, Aars (alanyyli-tRNA-syntetaasin), FDFT1 (skvaleenisyntaasi 1), UAP1 (UDP- N-acteylglucosamine fosforylaasin 1), ENDOD1 (endonukleaasi domeenin, joka sisältää 1), ja NDRG1. Yhdistetty alassäädetty sisältyvä luettelo 95 proteiineja, ja yksi (HNRPL, heterogeeninen ydin- ribonukleoproteiini- L isoformin a) oli yleinen välillä iTRAQ ja vääntelehtien mutakuopassa alustoilla (kuvio 2E).

Listamme sääteli proteiinit sisältyi viisi proteiineja jotka on aiemmin osoitettu olevan koholla androgeenien toiminnan: ACSL3 (iTRAQ suhde 2,76), FKBP51 (iTRAQ suhde 1,91; vääntelehtien mutakuopassa spektrin laskee 17:0), FASN (iTRAQ suhde 1,85; vääntelehtien mutakuopassa spektrin laskee 417:45), NDRG1 (iTRAQ suhde 1,76; vääntelehtien mutakuopassa spektrin laskee 05:00), ja KLK3 (tunnetaan myös PSA, eturauhasen antigeenin [22], iTRAQ suhde 1,44; vääntelehtien mutakuopassa suhde 11:00). Suora määrällinen vertailu proteiinien tunnistettiin sekä MS alustoilla oli korkea positiivinen korrelaatio (R2 = 0,92) kolmen proteiineja (ACSL3, FASN, ja AAR; katso Täydentävät kuva S1). Nämä havainnot itsenäisesti validoitu meidän normalisointi menettely ja kynnykset, joita käytettiin rakentamaan yhdistetyn luettelon androgeenisäädellyn proteiineja. Edelleen, immunoblot-analyysi käytettiin vahvistamaan androgen-sääntely osajoukon sääteli proteiineista (kuvio 3A). Erityisesti, lisäksi validointi meidän massaspektrometria tuloksia, immunoblot-analyysi paljasti merkittävän puristuksen kertainen muutos proteiinin ilmentymisen rajattu iTRAQ kokeessa (kuvio 3A). Samanlainen kohtisuorassa tarkastusta tehtäessä androgeeni- up-säänneltyjen proteiini rasvahappo taasin immunofluorescence- mikroskopia on esitetty kuviossa 3B.

A) Expression kertainen muutos androgeenisäädellyn proteiinien massa- spektrometrinen määritysrajan verrattuna immunoblot arviointi . Siinä on esitetty immunoblot bändejä ja niiden intensiteetit androgen sääteli proteiinit ja niiden lasketaan intensiteettisuhteet sekä iTRAQ suhteet ja vääntelehtien mutakuopassa spektrin laskee varten vastaavat proteiinit. Beeta-tubuliinia käytetään näyte lastaus ohjaus. B) immunofluoresenssi AR (punainen) ja FASN (vihreä) seuraavat ajoneuvo (etanoli) ja 1 nM R1881 hoitoja 48 h LNCaP-soluissa. Hoitoa annettiin 48 tunnin jälkeen androgeenien puutetta.

Analyysi androgeenin sääteli biologisia prosesseja ja väylät MCM analyysi

perehtyä toiminnalliset seuraus androgeenin toiminnan, laajamittainen yhdistys analyysi tehtiin vertailemalla androgen säädelty proteiini tietojen joukko 126 proteiinien kanssa kussakin 13364 käsitteiden MCM [23]. Menettely mukana valinnassa merkittävien molekyylien käsitteitä kuvataan ”Materiaalit ja menetelmät -osiossa. Virikkeellistämisstrategioita verkosto johti MCM analyysin kanssa yhdistelmän androgeenin sääteli proteiineista on esitetty kuvassa 4. Tärkeää on, että analyysi osoitti rikastumista tunnettujen eturauhassyövän-erityisiä ja androgeenisäädellyn käsitteitä, mikä tarjoaa validointi proteomic data syntyy tässä työssä (kuva 4, punaisia ​​reunoja). Sisäkkäin Näiden aiemmin tunnettujen prostataspesifisen käsitteitä oli yksi, joka on kuvattu joukko yhteistyössä rikastettua geenien alassäädetty eturauhassyöpäpotilailla jälkikäsitelty neoadjuvant (antiandrogeeni) hoito [17]. Muita käsitteitä merkitystä sisältyvät ne, aminoasyyli-tRNA biosynteesiä ja ER Golgi liikenteen (molemmat GO biologinen prosessi), aminoasyylirapa- siirto RNA syntetaasin Class II (Interpro), ja RSRFC4 (MEF2A) ja NKX3A (molemmat Transfac). Olimme kiehtoi näitä käsitteitä tarkoitettua aminoasyyli tRNA syntetaaseja (Kegg koulutusjakson: https://www.genome.jp/kegg/[24], [23]), koska ne mahdollisesti heijastavat nousua aminohappo käyttöasteen ja siten kasvaa alavirran proteiinibiosynteesin kun androgeenien hoitoon (kuva 4, siniset reunat). Tämä havainto on yhtäpitävä aikaisemmassa geeniekspressiota perustuvan ennusteen kasvoi proteiinibiosynteesin kuin yksi tunnusmerkkejä aikana eturauhassyövän kehitystä [17]. Kohonnut Aars aktiivisuus oli myös yksi merkittävä käsitteet rikastettiin sovitetun transcriptome tietojen androgen käsiteltyjen LNCaP-soluja (tuloksia ei ole esitetty). Siten tällaisia ​​huomautuksia johti meidät valitsemaan aminoasyyli-tRNA-syntetaasin konseptin jatkotutkimuksiin.

Verkon näkymä molekyyli- käsitteitä tai sarjaa biologisesti liittyvien geenien rikastettu androgeeni up-säänneltyjen proteiini set saatu Molecular Concepts Mapping (MCM) analyysi. Kukin solmu edustaa biologinen käsite; solmun koko on verrannollinen geenien kussakin käsite. Jokainen reuna osoittaa tilastollisesti merkittävää etua. P-arvo kunkin käsitteen ja MCM numero käsitteen ovat suluissa. Kaikkein rikastettu käsite on merkitty paksu reuna. Punaisia ​​reunat osoittavat rikastamista tunnettujen eturauhassyövän-erityisiä ja androgeenisäädellyn käsitteitä. Toisiinsa aminoasyyli-tRNA-syntetaasin käsitteitä on merkitty sinisellä reunat alareunassa verkon.

n androgeenisäätely aminoasyyli-tRNA syntetaaseja

Oli 7 proteiinien AAR luokka, joka ylitti asetetun kynnys yhdistetyssä luettelossa proteiinien määritelty sekä MS alustat: Aars alaniinia (AAR), fenyylialaniini (FARSLA), glysiini (GARS), histidiini (Hars), asparagiini (NARS), treoniini (tervat) ja tryptofaani (WARS). Näistä vain AAR ja Hars nimeämää vääntelehtien mutakuopassa alustan (taulukko S3), kun taas Aars ja loput nimeämän iTRAQ tutkimuksessa (taulukko S1). Vaikka kokonaismäärät Aars yksilöityjen iTRAQ ja vääntelehtien mutakuopassa kokeet olivat 14 ja 13, vastaavasti, useat näistä proteiineista tunnistettiin vähemmän kuin neljä peptidien vääntelehtien mutakuopassa kokeessa mikä on vähemmän luotettavia niiden spektrin määrä, joka perustuu kvantitointiin. Tämä osoittaa myös alhainen runsas luonne tämän kriittisen luokan proteiineja. Siksi olemme keskittyneet edelleen analysoida iTRAQ tunnistettu aaRSs ja tutkitaan, onko puristus ilmaus suhde huolimatta koholla ilme. Niistä 14 aaRSs tunnistettu iTRAQ tutkimuksessa kuusi oli iTRAQ suhteet 1,2 ja yli, ja niistä kolme oli suhdeluvut 1.1 ja edellä sekä androgeeni hoidetuilla (115 ja 117) samanlaiset näytteet. Yli-ilmentyminen enemmistö näistä (yhdeksän 14) aaRSs on kuvattu lämpöä kartta (kuvio 5A). Osaa näistä iTRAQ tunnistettu aaRSs (GARS, KARS, ja WARS) validoitiin käyttäen androgen käsiteltyjen LNCaP immunoblottausanalyysillä (kuvio 5C). Lisäksi tutkimme opintosuoritusotteensa tasoa käyttäen sovitetun geenien ilmentyminen tietoja androgen käsiteltyjen LNCaP-soluja (katso materiaalit ja menetelmät -osiossa). Yhdeksän neljästätoista proteiinien tunnistetaan meidän proteiini profiloinnin olivat koholla transkriptio tasolla koko riippumaton geenien ilmentyminen kokeiluja (kuvio 5B). Tämä paljasti Mahdollista asetusta näiden proteiinien transkription aktivaation androgen. Nämä tiedot tukevat myös havainto puristus kertainen muutos proteiinin ilmentymistä iTRAQ suhteissa.

A) Heat kartan kohonnut ilmentyminen aminoasyyli-tRNA-syntetaaseja tunnistettiin iTRAQ kokeilu. Vain proteiinit lihavoitu on nimetty androgen ajan säännelty iTRAQ tietojen perusteella kynnystä cut-off käytetty. B) Lämpö kartan yhtäpitävän yli-ilmentyminen selostukset mitataan oligonukleotidia mikrosirulla (Affymetrix U133 Plus 2.0) varten aminoasyyli-tRNA syntetaaseja esitetty A. C) immunoblottianalyysi aminoasyyli t-RNA syntetaasien GARS, KARS, ja WARS vastauksena androgen hoito LNCaP-soluissa. Beta-tubuliinia käytetään latauskontrollina. D) immunoblottianalyysi KARS ja GARS in paikallinen eturauhassyöpä (PCA), ja metastaattinen eturauhassyöpä (Met) verrattuna normaaliin (hyvänlaatuinen) eturauhaskudoksiin. Beta-aktiini käytetään latauskontrollina. E) promoottori-täyttöaste AR aminoasyyli tRNA geenejä. Kromatiinin immunosaostus (chip) -PCR analyysi osoittaa androgeeniriippuvaisen rikastuminen AR-sitoutuvat kohteeseen promoottorien

GARS

ja

KARS

. Rikastus laskettiin määrän perusteella kohteen monistumisesta vastaan ​​tulo DNA, alukkeilla

GAPDH

promoottoria käytettiin kontrollina. Alukesekvensseissä ulottuu geenin promoottorit on esitetty taulukossa S5. F) Meta-analyysi aminoasyyli t-RNA syntetaasin geenejä (proteiinien esitetty A) kolmella eri eturauhassyövän geeniekspressioprofilointi tutkimuksia. Oncomine lämpö kartta, joka esittää yli-ilmentyminen osajoukon aminoasyyli-tRNA-syntetaasin geenien paikallinen eturauhassyöpä verrattuna niiden hyvänlaatuinen valvontaa. Gene symboleja proteiineja, jotka kulkevat raja-arvo ja määrättiin androgeeni- säädellään ylöspäin iTRAQ tiedot on lihavoitu kasvot. P-arvo edustaa merkitys ilmentymisen kahdessa kolmesta tutkimuksesta. Punainen, valkoinen ja sininen (ei läsnä kuvassa) osoittaa suhteellinen yli, muuttumaton, ja alle ilmaisu, vastaavasti.

Androgeenit välittäjänä myönteisen vaikutuksen transkription sitoutumalla androgeenireseptorin, joka puolestaan sitoutuu androgen vastaus elementtejä promoottorit kohdegeenien [25]. Näin ollen meidän on tutkinut androgeenin sitoutuminen promoottorien aminoasyyli-tRNA syntetaaseja käyttäen kromatiinin immunosaostuksella (siru, katso Materiaalit ja menetelmät). Kuva 5E esittää edustava esimerkki lisääntynyt käyttöaste AR edistäjä

GARS

ja

KARS

vahvistaa androgen sääntelyä sen ilmentymisen transkriptio tasolla.

Seuraava laajentaneet solulinja havainto eturauhassyöpää kudosnäytteet. Ensinnäkin, käytimme ONCOMINE tietokanta (www.oncomine.org) suorittaa meta-analyysi aminoasyyli-tRNA-syntetaasin selostukset useille eturauhassyövän tutkimuksissa [26]. Osajoukko aaRSs havaittiin olevan säädellään ylöspäin lokalisoitu eturauhassyöpänäytteissä useammassa kuin yhdessä tutkimuksessa (kuvio 5F). Tämä havainto varmistettiin käyttämällä immunoblot-analyysi eturauhasen johdettujen näytteiden mukana hyvänlaatuinen vieressä, paikallinen eturauhassyöpä, ja etäpesäkkeitä. Tärkeää on, neljä viidestä lokalisoitu PCa ja neljä viidestä metastaattisen PCa osoitti kohonnut ilmentyminen KARS ja GARS verrattuna kolmeen neljästä hyvänlaatuinen testatut näytteet (kuvio 5D). Nämä antaa valtakirjan mahdollisen roolin androgeenisäädellyn aminoasyyli-tRNA syntetaaseja toiminnan aikana eturauhassyövän etenemisen.

Keskustelu

hahmotta- biologisia prosesseja ja polkuja, jotka ovat väärin säädellystä androgeenien eturauhassyövässä, me hyväksyi strategian globaalin MS-pohjainen proteomic profilointi kytketty rikastukseen perustuva reitin kartoitus androgeenisäädellyn reagoiva eturauhassyöpä LNCaP. Olemme profiloitu proteomiin LNCaP ja ilman androgeenien hoitoon käytetään kaksi proteomic alustoille: kvantitatiivinen iTRAQ MALDI-TOF MS ja semikvantitatiivinen vääntelehtien mutakuopassa Ion Trap MS. Kukin alustojen itsenäisesti tunnistettu yli 850 korkea luottamus proteiineja, jolloin saatiin yhteensä 1306 voitto koottuihin proteiinin määrä on yhdenmukainen aiemman kuvaavat raportit etu kyselevän globaalin proteomeja käyttäen täydentäviä massaspektrometriaa alustojen [21], [27] . Pystyimme tunnistamaan 126 proteiineja, jotka olivat ajan säädellään androgen hoitoon. Mukana olivat tunnettuja maaleja androgeenitoiminnan: KLK3, FKBP5, FASN, AGR2 (etummainen gradientti homologi 2), Sord (sorbitolidehydrogenaasin), NDRG1, ACSL3 ja FOLH1 (foolihapon hydrolaasi 1). Lisäksi pesi Compendia erilaisesti säänneltyjen proteiinien, olivat uusia tavoitteita androgeenitoiminnan jotka sisältyvät PCID1 (PCI domain sisältää 1), RAB10 (ras liittyvät GTP-sitovaa proteiinia RAB10), ja PEA15 (fosfoproteiinista rikastunut astrosyytit 15).

Toinen etu käyttää ioni trap- perustuu profilointi strategiaa rinnalla TOF-TOF perustuva kvantitatiivinen profilointi oli, että tietoja entisestä auttoi korvaamiseksi resoluutio johtuvien iTRAQ suhde puristus nähty jälkimmäisessä. Tämä sallittu käyttö alarajan tasolla iTRAQ-pohjainen kvantitointi varten hämminki analyysi. Suhde puristus on laajalti raportoitu muiden, esim. [28], ja kuvaa hyvin suora vertailu iTRAQ tunnusluvut androgeenisäädellyn proteiinien vastaavaan ilme arvioituna immunoblottausanalyysillä (kuva 3). Esimerkiksi proteiini FASN tunnistettiin 17 peptidit; joukossa kaikkein ilmentyvät eri peptidi oli iTRAQ suhde 2,79. Erityisesti, keskimäärin kaikki iTRAQ suhteet 17 peptidien johti edelleen pakatun proteiinin iTRAQ suhde 1,85, kun taas tiheysmittaria perustuva analyysi sen ekspression immunoblottauksella paljasti kertainen muutos kahdeksan ja immunofluoresenssi osoitti myös erittäin kohonnut ilmentyminen. Tätä päätelmää tukevat spektrin laskenta vääntelehtien mutakuopassa datan, jolloin FASN edusti 417 spektrin androgeenisäädellyn käsitellyn näytteen verrattuna vain 45 spektrin kontrollinäytteessä. Tällainen suhde puristus, vaikka nähty muissa tutkimuksissa, oli huomattavampi meidän iTRAQ MALDI- TOF /TOF tietojen verrattuna muihin määrällinen MS alustoilla kuten ICCAT [9]. Tämä ero voi selittyä laajempi massa toleranssi ikkunan valintaan peptidin ionien MS /MS pirstoutumista ABI 4800 TOF /TOF massa analysaattorin tässä [29]. Uskomme, että tämä puristus suhde voi osittain selittää huono päällekkäistä sarjaa androgeenisäädellyn proteiinien ehdolla kustakin kaksi MS alustoilla. Lisäksi tekijät, kuten erot peptidin käsittely (leimattu vs. leimaamaton), peptidi fraktiointi (on-line ja offline), MS tiedonkeruu (ioniloukku versus TOF /TOF massa-analysaattori), data normalisointi (suhteet spektrin laskee verrattuna suhteet iTRAQ label huippuintensiteetit), ja ominaisuudet peptidien valittu MS /MS sekvensointi voisi olla keskeinen rooli puute globaalin aloista. Nämä tekijät, lisäksi biologisen vaihtelut kuten usean liitos muodostaa yhden liittymistä olisikin voinut vaikuttaa näihin kolmeen proteiinien osoitti ristiriitaisia ​​suuntauksia näiden alustojen välillä havaittu.

Itse asiassa on todettu, että eri proteomic alustoilla osoittaa huomattavia eroja fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien tunnistettujen peptidien [30]. Siten strategia käytetään kahta eri massaspektrometrit, jotka eroavat sekä niiden ionisointilähteeseen ja periaate peptidin havaitseminen, pystyimme rakentamaan lisäainetta luettelo proteiinien ja saada syvällisemmin androgeenisäädellyn proteomiin. Suuremmilla tason rikastamiseen analyysit, meidän tutkimus osoitti, että osajoukot proteiineja, nimeämä kummankin alustoja, karttaa samanlaisia ​​käsitteitä myös ne jotka on androgen-johdettu ja eturauhassyövän johdettu. Kanssa tiukemmat raja puitteet spektrin määrä, joka perustuu osittain määritysrajan, The vääntelehtien mutakuopassa kokeilu oli ehdolla vain kaksi aaRSs ehdokasta androgeeni- säännelty. Kuitenkin johtuen nimittämistä useampia aaRSs peräisin iTRAQ kokeessa molekyyli käsite verkko, jossa on yhdistetty datajoukon osoittivat joukko toisiinsa Aars käsitteiden merkittäviä tulokset (kuva 4). Vielä kiehtova, oli kuitenkin, että kukin kaksi riippumatonta luettelot proteiinien, kun analysoidaan erikseen käyttäen MCM analyysiä, rikastettiin käsitteet olisivat tiedetään liittyvän eturauhassyöpään etenemisen mutta ei analyysissä yksilöidyt yhdistetyn aineisto (kuva 4, Täydennyskuvio S2). Esimerkkinä tästä oli rikastuminen ETS (ETV1 ja ERG) yli-ilmentyminen käsitteitä androgeenisäädellyn proteiinien nimeämän vääntelehtien mutakuopassa analyysi. Tämä oli mielenkiintoinen yhteydessä aiemmat raportit, jotka kuvaavat olemassaolon toistuvat geenifuusioiden joihin ETS transkriptiotekijöitä olevan pathonomonic eturauhassyövän kehitykseen [31], [32]. Nämä geenifuusiot on osoitettu tuo ETS transkriptiotekijät alle androgen valvonnan, ja ETV1 (kromosomi 7p21) tiedetään olevan yli-ilmentynyt androgeenien kautta toisiintumisreaktio 14q13.3-14q21.1 kromosomin alueen 14 LNCaP-solulinja tutkittiin täällä [31]. Kuten määrä ETS säänneltyjen proteiinien tunnistettu vääntelehtien mutakuopassa riitti kartoittaa ETS yli-ilmentyminen käsite, ettei saman verran tämän luokan proteiinien iTRAQ alustan mahdollisesti johtanut katoamiseen saman konseptin yhdistetyssä analyysissä. Siten käyttö useiden massaspektrometrisia alustoille auttaa selvittämään useita rooleja androgeenitoiminnan.

Lisäksi aiemmin tunnettu androgeenisäädellyn biologisiin prosesseihin liittyy eturauhasen syövän etenemisessä, kuten NDRG1 [33], joka auttoi vahvistamaan meidän proteomic tutkimus, meidän luettelo androgeenisäädellyn proteiinien rikastettiin aminoasyyli-tRNA-syntetaaseja. Useat aaRSs, joiden tiedetään keskeinen rooli proteiinien biosynteesiä kuuluivat tähän käsitteeseen. Tämä havainto oli mielenkiintoinen yhteydessä aikaisempien geeniekspression perustuvia ennustuksia meidän laboratorio: kasvu proteiinisynteesiä aikana eturauhassyövän etenemisen seurausta toimista ETS transkriptiotekijöiden [17]. Nämä havainnot johtavat meidät validointi tämän havainnon eri tasoilla;