Krooninen sairaus

tiivistelmä

ekspressiotasot anoctamin 1 (ANO1, TMEM16A), kalsium-aktivoitujen kloridi kanava (CACC) , ovat huomattavasti useissa kasvaimissa, sekä estämällä ANO1 tiedetään vähentävän solujen lisääntymisen ja muuttoliike. Täällä suoritimme solu-pohjainen seulonta kokoelma luonnontuotteita ja huumeiden kaltaisia ​​yhdisteitä inhibiittorien tunnistamiseksi ANO1. Seurauksena seulonnan, idebenoni, mikonatsoli ja plumbagin tunnistettiin uusi ANO1 estäjät. Elektrofysiologiset tutkimukset osoittivat, että idebenone, synteettinen analogi koentsyymi Q10, täysin tukossa ANO1 aktiivisuutta FRT soluissa, jotka ilmentävät ANO1 ilman mitään vaikutusta solunsisäisen kalsiumin signalointi ja CFTR, cAMP-säännelty kloridikanava. CACC toiminta PC-3 ja CFPAC-1-solut ilmentävät runsaasti endogeenistä ANO1 voimakkaasti estetty idebenone. Idebenoni inhiboi solujen proliferaatiota ja indusoi apoptoosin PC-3 ja CFPAC-1-soluissa, mutta ei A549-soluja, jotka eivät ilmennä ANO1. Nämä tiedot viittaavat siihen, että idebenonia, uusi ANO1 estäjä, on mahdollista käyttää syövän hoidossa.

Citation: Seo Y, Park J, Kim M, Lee HK, Kim J-H, Jeong J-H, et al. (2015) esto ANO1 /TMEM16A kloridi Channel mukaan Idebenone ja sen sytotoksisuus Cancer Cell Lines. PLoS ONE 10 (7): e0133656. doi: 10,1371 /journal.pone.0133656

Editor: Johannes Reisert, Monell Chemical Senses Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 15 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 29 Kesäkuu 2015; Julkaistu: 21 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Seo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Yonsein yliopisto Global Erikoistuminen Project 2014, Grant ja Korean Healthcare teknologian t Welfare asioiden Korean tasavalta (HI08C2149) ja Basic Science Research Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama opetus-, tiede- ja teknologia [NRF-2012R1A1A1040142].

Kilpailevat edut: Tällä kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kalsium-aktivoitu CI

– kanavaa (CaCCs) ilmennetään laajasti erilaisissa solutyypeissä ja kudoksissa, ja ne ovat osallisina monissa fysiologisia toimintoja, kuten epiteelin nesteen eritystä, sileän lihaksen supistumisen, ja aistien signaalitransduktion [1-3]. CaCCs kuvattiin ensimmäisen kerran yli 3 vuotta sitten, mutta molekyyli identiteetin CaCCs on äskettäin tunnistettu [4]. Vuonna 2008 kolme riippumatonta tutkimusryhmää raportoi, että anoctamin-1 (ANO1, TMEM16A) geeni koodaa CACC, joka osoittaa kalsium-aktivoitujen CI

– virtoja, kun se oli ilmaistu oosyyteissä ja nisäkässoluissa [5-7]. ANO1 ilmentyy erilaisissa solutyypeissä, mukaan lukien henkitorven, suolen, ja rauhasten epiteeli, sileän lihaksen solut, suolen tahdistimen solut, aistihermoilla, ja useita kasvaimia [5, 7-9].

ANO1 tunnetaan myös nimellä löydetty on GIST-1 (DOG1), kasvain vahvistetaan ja yli-ilmentyy järjestyksessä 2 (TAOS2), ja suusyövästä yliekspressoitu 2 (ORAOV2) [10, 11]. DOG1, TAOS2 ja ORAOV2 on nimetty niin, koska ANO1 voimakkaasti yliekspressoituu ruuansulatuskanavan tukikudosten kasvaimet (GIST) ja suun okasolusyöpää. ANO1 on kartoitettu kromosomin kaistan 11q13, joka on usein monistettiin erilaisissa ihmisen karsinoomien, kuten pään ja kaulan okasolusyöpä (HNSCC), GIST, rinta- ja eturauhassyöpää. Viimeaikaiset todisteet viittaavat ANO1 osallistumista solujen lisääntymisen, solujen vaeltaminen, kasvaimen kehittymisen ja syövän etenemistä [12, 13]. Esimerkiksi, inhibitio ANO1 ilmentymisen eturauhassyöpä PC-3-solujen vähensi merkittävästi proliferaatiota, metastaasin ja invaasion, ja estää kasvaimen kasvua ksenografti hiirimallissa [14]. Farmakologinen esto ANO1 mukaan T16A

inh-A01, selektiivinen ANO1 estäjä, vähentää proliferaatiota interstitiaalinen solujen Cajal (ICC) ja CFPAC-1 haimasyövän soluja, jotka ekspressoivat endogeenistä ANO1 [15]. Rintasyöpäsoluissa, alas-sääntely ANO1 geeniekspression pienentää leviämisen, provosoi apoptoosin, ja esti kasvaimen kasvua ksenograftimallia. Lisäksi farmakologinen esto CACC aktiivisuuden ANO1 vähentää solujen elinkelpoisuutta HNSCC, ruokatorven okasolusyöpä (ESCC) ja rintasyöpä solujen eston kautta epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja kalmoduliinin-riippuvaisen proteiinikinaasin II (CaMKII) signalointia [16 ].

Useimmat todisteet osoittavat, että farmakologinen esto ANO1 kanavan toiminta voi olla potentiaalia tuottaa terapeuttisia etuja HNSCC, ESCC, GIST, rinta- ja eturauhassyövän potilailla. Koska ANO1 on äskettäin tunnistettu, vain harvat yhdisteet havaittiin voimakas ANO1 estäjiä, kuten CACC

inh-A01, parkkihappo, T16A

inh-A01, digallic diklorofeenin, bentsbromaroni, ja N – ((4 metoksi) -2-naftyyli) -5-nitroantraniilihapon (Monna). Lisäksi farmakologinen ominaisuus ja mekanismit toiminnan inhibiittorit ovat vielä epäselviä [17-21].

tunnistamiseksi romaani ANO1 estäjien, suoritimme solu-pohjainen seulonta kokoelma luonnontuotteita ja huumeiden -kuten yhdisteitä käytetään soluun perustuva korkean suoritustehon seulomismäärityksessä perustettu tunnistamiseksi ANO1 estäjien aiemmissa tutkimuksessa [19]. Löysimme lääkkeen kaltaisten yhdisteiden ja luonnon tuotteita, joiden voimakas ANO1 estävä aktiivisuus, ja tutki vaikutusta osuma yhdisteiden kasvun estäminen syövän solulinjat, jotka ilmentävät ANO1 endogeenisesti.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit ja ratkaisuja

Idebenoni, koentsyymi Q10, plumbagin, mikonatsoli, ja muita kemikaaleja, ellei toisin ole mainittu, ostettiin Sigma. Hiiren ANO2 ostettiin Origene Technologies Inc. (Rockville, MD, USA, luettelonro MC205812). Yhdistettä kokoelma käyttää seulontaan (Spectrum Collection, 2320 yhdisteet) hankittiin MicroSource Discovery Inc. (Gaylordsville, CT). Tämä kirjasto koostuu ihmisen terapeuttisten lääkkeiden tai huumeiden kaltaisia ​​yhdisteitä ja luonnontuotteita. Yhdisteet laimennettiin DMSO: lla päästä pitoisuuteen 2,5 mM. Tämä käytettiin 100x konsentroitiin kantaliuosta, joka käsiteltiin soluissa.

Soluviljely

Fisher rotan kilpirauhasen (FRT) solut transfektoitiin stabiilisti ihmisen ANO1 (abc) tai ihmisen villin tyypin CFTR erikseen, ja molemmat solut transfektoitiin stabiilisti halogenidin anturi YFP-H148Q /I152L /F46L tai YFP-H148Q, kuten on kuvattu edellisessä tutkimuksessa [20, 22]. FRT-solut transfektoitiin stabiilisti hiiren ANO2 (Origene Technologies Inc.) ja halogenidi-anturi YFP-F46L /H148Q /I152L. FRT-soluja viljeltiin Coon`s modifioitua F12 -alustassa, johon oli lisätty 10% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. PC3 ja HT-29-soluja kasvatettiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. A549-soluja viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), joka sisälsi 10% FBS: ää, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. CFPAC-1-soluja kasvatettiin Iscoven muunnettuun Dulbeccon alustaan ​​(IMDM), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä.

Cell seulontaa

ANO1 /TMEM16A ja YFP ilmentävät FRT-soluja maljattiin 96-kuoppaisille musta-muurin mikrotiitterilevyt (Corning Inc., Corning, NY) tiheydellä 20000 solua per kuoppa F12 -alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä. Analyysit tehtiin käyttäen Fluostar Omega mikrolevylukijaa (BMG Labtech, Ortenberg, Saksa) ja MARS Data Analysis Software (BMG Labtech). Kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisella levyllä pestiin 3 kertaa PBS: ssä (200 ul /pesu), jättäen 100 ui PBS: ää. Testattavat yhdisteet (1 ui) lisättiin kuhunkin kuoppaan 25 uM lopullinen pitoisuus. 10 minuutin kuluttua lisättiin 96-kuoppaisille levyille siirrettiin levylukijalla fluoresenssin määritystä. Jokainen kuoppa määritettiin yksilöllisesti TMEM16A välittämän I

– tulva kirjaamalla fluoresenssia jatkuvasti (400 ms per piste) 2 s (lähtötilanteessa), sitten 100 ui 140 mM I

– liuosta, joka sisältää 200 uM ATP: tä lisättiin 2 s ja sitten YFP fluoresenssi kirjattiin 6 s. Alustava jodidi tulva korko määritettiin alkukaltevuuden fluoresenssin väheneminen, jonka epälineaarinen regressio, infuusion jälkeen jodidi ATP.

Ussing jaosto tutkimus

Snapwell inserttejä sisältäviä ANO1- tai CFTR ilmentävä FRT solut Ussing-kammioihin kiinnitettyjen (Fysiologinen Instruments, San Diego, CA). Basolateraalisessa kylpy täytettiin HCO

3

– puskuroitu liuos, joka sisältää (mM): 120 NaCl, 5 KCI, 1 MgCI

2, 1 CaCl

2, 10 D-glukoosia, 2,5 HEPES, ja 25 NaHCO

3 (pH 7,4), ja apikaalisella kylpy täytettiin puoliksi CI

– ratkaisu. Vuoden puoli-CI

– ratkaisu 65 mM NaCI HCO

3

– puskuroitu liuos korvattiin Na-glukonaatti. Basolateraalisessa Kalvo läpäiseviksi 250 ug /ml amfoterisiini B: Soluja kylvettää varten 20 min tasaantumisaika ja ilmastettiin 95% O

2/5% CO

2 37 ° C: ssa. ATP levitettiin apikaalisella pesuliuoksen aiheuttaa solunsisäisen kalsiumin lisäys; idebenone, forskoliini ja CFTR

inh-172 lisättiin apikaalisella ja basolateraalisessa kylpy ratkaisu. Apikaalisella kalvo virrat mitattiin EVC4000 Multi-Channel V /I Clamp (World Precision Instruments, Sarasota, FL) ja tallennetaan käyttäen Powerlab 4/35 (AD Instruments, Castle Hill, Australia). Tiedot kerättiin ja analysoitiin ADInstruments hankintaohjel- -ohjetta Pro 7 ohjelmisto. Näytteenottotaajuus oli 4 Hz.

Patch-clamp

Kokosolun patch-clamp tallenteet tehtiin ANO1 ilmentäviä FRT solujen ja PC3-soluissa. Kylpy sisälsi (mM): 140 NMDG Cl, 1 CaCl

2, 1 MgCI

2, 10 glukoosia ja 10 HEPES (pH 7,4). Pipetin sisälsi (mM): 130 CsCI, 0,5 EGTA, 1 MgCI

2, 1 Tris-ATP, ja 10 HEPES (pH 7,2). Pipetit vedettiin borosilikaattilasista ja oli resistanssit 3-5 MQ tulipalon jälkeen kiillotus. Muodostamisen jälkeen koko solun konfiguraatio, ANO1 aktivoitiin ATP (100 uM). Koko solun virrat aikaansaatiin käyttämällä hyperpolarisaatio ja depolarisoivan jännite pulssit pitopotentiaalissa 0 mV potentiaalien välillä -80 mV ja +80 mV askelin 20 mV. Tallenteet tehtiin huoneenlämmössä käyttäen Axopatch-200B (Axon Instruments, Union City, CA). Virrat olivat digitoidaan ja analysoidaan käyttämällä Digidata 1440a muuntimen (Axon Instruments), ja pCLAMP 10,2 ohjelmistot (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Virtaukset olivat alipäästösuodatetaan 1 kHz ja näytteitä 5 kHz.

Immunoblotvärjäys

Solun tiivisteet ja immunoblottaus valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [23]. FRT-ANO1, PC3, CFPAC-1 ja A549-soluja hajotettiin solujen hajotuspuskuria (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% Nonidet P-40, 0,25% natriumdeoksikolaatti, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Na

3Vo

4, ja proteaasinestäjä seosta). Kokosolulysaateille sentrifugoitiin 15000 g: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa solujätteiden poistamiseksi, ja yhtä suuret määrät (80 ug proteiinia /kaista) supernatanttia proteiinia erotettiin 4-12% Tris-glysiini-betonielementtien geeli (KOMA Biotech, Seoul, Korea) ja sitten siirretään PVDF-kalvolle (Millipore, Billerica, MA). Kalvo blokattiin 5% rasvatonta kuorittua maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl), joka sisältää 0,1% Tween 20: ssa 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Tämä kalvo inkuboitiin sitten yön yli ensisijaisen ANO1 vasta-aineella (antelias lahja Young Duk Yang, CHA University). Kun oli pesty 0,1% Tween 20: Tris puskuroidussa suolaliuoksessa (TBST), blottia inkuboitiin vielä 45 min huoneenlämmössä anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (Cell Signaling). Membraani pestiin sitten kolme kertaa TBST: llä 5 minuutin ajan ja sitten visualisoidaan käyttäen ECL Plus Western blot tunnistusjärjestelmä (GE Healthcare Amersham, Piscataway, NJ).

solunsisäisen kalsiumin mittaus

FRT ja HT-29-soluja viljeltiin 96-kuoppaisilla musta muurin mikrolevyillä ja ladataan Fluo-4 NW kohti valmistajan protokollaa (Invitrogen, Carlsbad, CA). Lyhyesti, soluja inkuboitiin 100 ui määrityspuskurissa (1 x Hanks ’tasapainotettuun suolaliuokseen, jossa on 2,5 mM probenesidiä ja 20 mM HEPES), mukaan lukien Fluo-4 NW. 1 tunnin kuluttua inkubaation 96-kuoppalevyille siirrettiin levylukijalla fluoresenssin määritystä. Fluo-4 fluoresenssi mitattiin Fluostar Omega mikrolevylukijalla (BMG Labtech) varustettu ruisku pumput ja mukautettuja Fluo-4 eksitaatio /emissio suodattimet (485/538 nm). Solunsisäisen kalsiumin oli lisäystä soveltamalla 100 uM ATP: tä.

soluproliferaatiomääritykset

PC3, CFPAC-1 ja A549-solut maljattiin 96-kuoppaisille mikrolevyille. Sen jälkeen, kun 24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla idebenonia (3, 10, 30 uM), koentsyymi Q10 (100 uM) ja T16A

inh-A01 (10 uM), ja sen jälkeen niitä inkuboitiin 2 päivää. Yhtä suuri määrä DMSO: ta lisättiin kaikkiin valvontaa. Elatusaineeseen ja yhdisteet vaihdettiin joka 12. tunti. Arvioida solujen lisääntymistä, sen jälkeen, kun 48 tunnin inkubaation yhdisteiden, BrdU (lopullinen konsentraatio: 10 uM) lisättiin ja soluja johdettiin ääntä vielä 2 tunnin ajan. BrdU määritettiin Cell Proliferation ELISA, BrdU (kolorimetrinen) kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). MTS-määritys, sen jälkeen, kun 48 tunnin inkubaation jälkeen solut johdettiin ääntä MTS 1 tunnin ajan. Liukoinen formatsaanin tuotetaan solujen väheneminen MTS kvantitoitiin mittaamalla absorbanssi 490 nm: ssä Infinite M200 (Tecan, Grödig, Itävalta) mikrolevyn lukijaa. MTS-määritys tehtiin käyttäen CellTiter 96 vesikerros Solution Cell Proliferation Assay Kit (Promega, Madison, WI, USA).

Haavan paranemista määritys

Solun liikkuvuus arvioitiin käyttäen naarmu haava määritystä. PC3-soluja viljeltiin 96-kuoppaisella levyllä, kunnes se oli konfluentteja. Solu kerros haavoittui käyttämällä 96-Well WoundMaker (Essen BioScience, Michigan, USA) ja pestään kahdesti tuoreella seerumivapaassa. Soluja inkuboitiin seerumittomalla väliaineella, ja kuvia haavat automaattisesti ottaa joka 2 tuntia 48 tuntia käyttäen IncuCyte ZOOM (Essen BioScience). Kuvat analysoitiin IncuCyte ohjelmistopaketti (Essen BioScience).

TUNEL määrityksissä

PC3, CFPAC-1 ja A549-solut maljattiin 96-kuoppaisille musta-aidattuja mikrotiitterilevyillä. Sen jälkeen, kun 24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut käsiteltiin idebenoni (30 uM), ja inkuboidaan sitten 2 päivää. Solut kiinnitettiin ja värjättiin TUNEL (terminaali deoksinukleotiditransferaasia välittämää dUTP nick-end merkintöjä, vihreä) käyttäen ApopTag Fluoreseiini Direct In situ Apoptosis Detection Kit (Millipore, Billerica, MA, USA), ja sen jälkeen tuma värjättiin DAPI ( 4,6-diamino-2-fenyyli, sininen).

tilastollinen

tulokset useista kokeista esitetään keskiarvoina ± SE Tilastollinen analyysi suoritettiin Studentin t-testillä tai analysoimalla varianssi tarvittaessa. Arvo

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

tunnistaminen ANO1 /TMEM16A estäjien

Solu-pohjainen seulonta kokoelma luonnontuotteita ja huumeiden kaltaisia ​​yhdisteitä tehtiin tunnistaminen ANO1 estäjiä. ANO1 kloridi-kanava-aktiivisuus mitattiin käyttäen rotan Fischer kilpirauhasen (FRT) soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti ihmisen ANO1 ja geneettisesti koodattu jodidi-sensing fluoresoiva proteiini, YFP-F46L /H148Q /I152L. Kuten on esitetty kuviossa 1A, seulomiseksi tunnistamaan ANO1 estäjät, FRT-soluja esi-inkuboitiin testiyhdisteiden kanssa PBS: ssä, ennen kuin lisättiin jodidin ja ATP, agonisti P2 purinerginen reseptori, joka aiheuttaa solunsisäisen kalsiumpitoisuuden, sisältävä liuos. Kun läsnä on ANO1 estäjä, YFP fluoresenssisammutuksen mukaan jodidi saannin kautta ANO1 estyy.

(A) periaate solupohjaisen, fluoresenssi high-throughput seulonta-analyysissä. (B) Chemical rakenteet ANO1 estäjiä. (C) YFP fluoresenssi mitataan yhdessä kuoppiin 96-kuoppalevyillä, jotka osoittavat inhiboivaa vaikutusta idebenonia, mikonatsoli ja plumbagin on ANO1 kanavan aktiivisuutta. Osoitetut pitoisuudet idebenonia, mikonatsoli ja plumbagin lisättiin 20min ennen ANO1 aktivaatio 100 uM ATP.

seulonta 2320 yhdisteiden tuotti 24 yhdisteitä, jotka estänyt jodidi tulva by 70% 25 uM. Löysimme kolme uutta ANO estäjät, idebenonia, plumbagin ja mikonatsoli, ensisijaiselta osuma yhdisteitä. Idebenoni, plumbagin mikonatsoli estivät merkittävästi ANO1 kloridi-aktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla ja täysin inhiboitu ANO1 30 uM (kuvio 1C).

karakterisointi idebenonin

idebenoni tutkittiin edelleen, koska idebenoni synteettinen analogi koentsyymi Q10 (CoQ10), osoittaa voimakas ja selektiivinen inhibitio ANO1, ja sitä käytetään laajasti voimakas antioksidantti. Apikaalisella kalvo virtaukset mittaus ANO1 ilmentäviä FRT solujen antoi IC

50 9,2 uM idebenonilla ja näyttää lähes täydellinen estyminen ANO1 kloridi virtojen 30pM idebenone (kuvio 2A ja 2B). Vaikutuksen tutkimiseksi idebenonin on solunsisäisen kalsiumin signalointi, HT-29 ja FRT-solut ladattiin Fluo-4 NW, fluoresoiva kalsiumia anturi. Soluja esikäsiteltiin 30 uM idebenonilla ja sitten ATP levitetään pitoisuutena 100 uM indusoidun ohimenevää sytosolin kalsiumin pitoisuus. ATP aiheuttama soluliman kalsiumin lisäys ei merkittävästi vaikuttanut idebenone (kuvio 2C). Selvittämiseksi, jos idebenoni muuttaa muiden kloridikanavia, cftr (CFTR) ja ANO2 (TMEM16B), joka jakaa korkean aminohappohomologiaa ANO1, mittasimme apikaalisella kalvo virtaukset FRT-soluissa, jotka ekspressoivat ihmisen villin tyypin CFTR ja hiiri ANO2 (mANO2). CFTR-kanavan toiminta vaikutti vain vähän by idebenone. Se esti CFTR 8,2 ± 0,2% 30 uM, pitoisuus, joka on täysin estää ANO1 (kuvio 2D), mutta, ei ole yllättävää, idebenoni inhiboi voimakkaasti 100 uM ATP-indusoidun aktivaation mANO2 annoksesta riippuvaisella tavalla FTR-mANO2 soluja ( kuvio 2E). Mittasimme apikaalisella kalvo virrat tarkkailla vaikutus Q10 on ANO1 kanavalla toimintaa FTR-ANO1 solujen koska idebenone on lyhyen ketjun analogi Q10. Kuten kuviossa 2F, 100 uM Q10 ei estänyt ATP-indusoidun ANO1 kloridi virtaukset. Sen tutkimiseksi, idebenone estää reversiibelisti ANO1 mittasimme apikaalisella kalvo virtoja FTR-ANO1 solun E

teko, erityinen aktivaattori ANO1. Esikäsittely 100gM idebenonin estivät täysin E

teko aiheuttama ANO1 aktivaation (kuvio 2G). Kuten kuviossa 2H, esikäsittely 100 uM idebenonin estivät täysin ATP-indusoidun ANO1 aktivointi. Kuitenkin jälkeen huuhtoutumiskauden useimmat estävää vaikutusta Idebenonin on ANO1 aktivoitumisen E

teko poistettiin. Idebenone siten estää reversiibelisti ANO1 ilman muutoksia solunsisäisen kalsiumin signalointi.

(A) Apical kalvo virrat mitattiin FRT-ANO1 soluissa. Idebenoni lisättiin 10 min ennen ANO1 aktivaatio 100 uM ATP: tä. (B) Yhteenveto annos-vaste (keskiarvo ± keskivirhe, n = 3-4). (C) Solunsisäinen kalsiumpitoisuus mitattiin käyttämällä Fluo-4 in HT-29 ja FRT soluja. 30pM idebenone (IDE), mikonatsoli (MCZ) ja plumbagin (PLB) esikäsiteltiin 20min ja sitten 100 uM ATP sovellettiin. (D) Vaikutus Idebenonin on CFTR kloridikanava aktiivisuus mitattiin FRT soluissa, jotka ilmentävät ihmisen villityypin CFTR. CFTR aktivoitiin 20 uM forskoliinin ja estävät 10pM CFTR

inh-172. (E) Vaikutus Idebenonin hiiren ANO2 (mANO2) mitattiin FRT-mANO2 soluissa. (F) vaikutus koentsyymi Q10 (Q10) on ANO1 kanavalla aktiivisuutta havaittiin FRT-ANO1 soluissa. 100 uM Q10 esikäsiteltiin 20 min ja sitten 100 uM ATP sovellettiin. (Oikealla) Yhteenveto huippuvirta (keskiarvo ± keskivirhe, n = 3-4). (G) Vaikutus Idebenonin on ANO1 aktivoitumisen E

säädöksen ANO1 ilmentäviä FRT soluissa. 100 uM idebenone (harmaa viiva) esikäsiteltiin 20 min ja ANO1 aktivoitiin 10pM E

teko. Loput ANO1 virrat inhiboi T16A

inh-A01. (Oikealla) Yhteenveto huippuvirta (keskiarvo ± keskivirhe, n = 3). (H) Idebenone palautuvuus. Jälkeen vanishment 100 uM ATP-indusoidun ANO1 virran, solut pestiin kolme kertaa 5 minuutin ajan kutakin, ja sitten ANO1 aktivoitiin 10 uM E

säädöstä. (Oikealla) Yhteenveto huippuvirta (keskiarvo ± keskivirhe, n = 3). ** P 0,01, *** P 0,001, Opiskelijan paritonta t-testiä.

Kokosolun patch clamp in FRT-ANO1 ja PC-3-solujen

Kuvassa 3, koko solun patch clamp analyysi oli tehty määrittämään estäminen mekanismeja idebenonia. Vuonna FRT solut, jotka ilmentävät ANO1 soveltaminen 10 uM idebenonin inhiboi ATP-indusoidun ANO1 kloridi virtaukset kaikki jännitteet, mikä osoittaa, että sillä on estävä vaikutus kautta jännite-riippumaton mekanismi (kuvio 3A). Patch clamp mittaus kokosolu-virtojen PC-3 (ihmisen eturauhasen adenokarsinooma johdettu) solut, jotka ilmentävät korkea ANO1 osoitti, että idebenoni 10 uM ja 30 uM inhiboi ATP-indusoidun CaCCs kloridi virtojen ~ 54% ja ~ 90%: lla (kuvio 3B).

(A) (vasen) Kokosolun ANO1 nykyinen tallennettu pitopotentiaalissa 0 mV ja sykkivä jännitteisiin välillä ± 80 mV (askelin 20 mV) puuttuessa ja läsnäoloa 10pM idebenonia. ANO1 aktivoitiin 100 uM ATP: tä. (Keskellä) Nykyinen /jännite (I /V) käyrä keskiarvosta virtojen kumpikin keskellä jännitepulssilla. (Oikealla) Pylväskuviot yhteenveto virrantiheys tiedot mitataan + 80 mV (keskiarvo ± keskivirhe, n = 4). (B) (vasen) Kokosolun Laastaripuristinmittaukset PC3-solujen. CACC virrat kirjataan poissa ja läsnä ollessa idebenonia. CACC stimuloitiin 100 uM ATP. (Keskellä) Nykyinen /jännite (I /V) käyrä keskiarvosta virtojen kumpikin keskellä jännitepulssilla. (Oikealla) Pylväskuviot yhteenveto virrantiheys tiedot mitataan + 80 mV (keskiarvo ± keskivirhe, n = 4). ** P 0,01, Opiskelijan paritonta t-testiä.

ANO1 estäjät vähentävät solujen lisääntymisen ja muuttoliike adenokarsinoomasolua

kolmenlaista ihmisen adenokarsinooman solulinjoja testattiin vaikutuksen määrittämiseksi Idebenonin on endogeenisen CaCCs aktiivisuutta ja solujen kasvua ja muuttoliike. Western blotting osoitti, että endogeeninen ANO1 ilmentyy korkeilla tasoilla PC3 ja CFPAC-1 (ihmisen haiman adenokarsinooma johdetut solut), mutta ei A549 (ihmisen keuhko adenokarsinooma johdettu) soluissa (kuvio 4A). YFP fluoresenssin määritystä CFPAC-1-soluissa, jotka ilmentävät halogenidi tunnistus mutantti YFP paljasti, että idebenoni voimakkaasti estetty ATP-indusoidun CACC kloridikanavan aktivaation annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4B). Sen tutkimiseksi, onko ANO1 inhibiittorit vaikuttavat solujen kasvuun, idebenoni, mikonatsoli ja plumbagin levitettiin PC3-solut ilmentävät korkeita ANO1 ja A549-solut eivät ilmennä ANO1. Tulokset on esitetty kuviossa 4C, ja ne paljastavat, että idebenoni esti merkitsevästi solujen kasvua PC3-soluissa, mutta ei A549-soluja. Mikonatsoli ja plumbagin osoitti vahvaa solujen kasvun esto sekä PC3 ja A549-soluja, mutta se ei ollut yllättävää, sillä useissa aiemmissa tutkimuksissa on osoitettu, että mikonatsoli ja plumbagin estivät solujen kasvua erilaisten ihmisen syöpäsolujen erilaisten mekanismien kautta [24-29] . Vaikutus ANO1 inhibition idebenoni on solumigraation määritettiin käyttäen haavan paranemista määritys PC3-soluissa. Määrityksessä, ohjaus PC3-solut kattaa 63,6 ± 2,5% (n = 5) haavan, kun taas T16A

inh-A01 (30 uM) ja idebenonilla (10 ja 30 uM) käsiteltyjä soluja kattoi 39,6 ± 2,5, 26,1 ± 1,8 ja 13,8 ± 0,8% (n = 5), ja haava 48 h haava, vastaavasti (kuvio 4D).

(A) Immunoblotti ANO1 proteiinin FRT-ANO1, PC3, CFPAC-1 ja A549-soluja. Edustajat kolmesta tutkimuksessa esitetään. (B) Vaikutus Idebenonin on CaCCs mitattiin CFPAC-1-solut ilmentävät halidi mutantti YFP. CaCCs aktivoitiin 100 uM ATP: tä. (C) PC3 ja A549-soluja käsiteltiin idebenoni (30 uM), mikonatsoli (30 uM) ja plumbagin (30 uM), ja solujen lisääntyminen mitattiin 2 päivää käyttäen MTS määritykset (keskiarvo ± keskivirhe, n = 6). (D) Haavan paranemista määritystä PC3-soluissa. Solut käsiteltiin T16A

inh-A01 (30 uM) ja idebenoni. (Vasen puoli) haavansulkemiseen kvantifioitiin kaikissa 2 tunnin jälkeinen haava (keskiarvo ± keskivirhe, n = 5). (Oikealla) Kuvat ovat otettu 0 tunnin ja 48 tunnin haavan tekemisen (x 10). ** P 0,01, Opiskelijan paritonta t-testiä.

edelleen vaikutuksen määrittämiseksi Idebenonin soluproliferaatioon, havaitsimme soluproliferaatiota vasteena idebenone käyttäen MTS määritystä ja BrdU määritys PC3, CFPAC-1 ja A549-soluja (kuvio 5). Tässä tutkimuksessa, koentsyymi Q10, käytettiin negatiivisena kontrollina, koska se ei estä ANO1 /CaCCs vaikka idebenoni on synteettinen analogi koentsyymi Q10 (kuvio 2F). Solut käsiteltiin idebenone (3, 10 ja 30 uM), koentsyymi Q10 (100 uM) ja T16A

inh-A01 (10 uM), ja solujen lisääntyminen kvantitatiivisesti arvioitiin jälkeen 2 päivää. PC3 ja CFPAC-1-solut, idebenoni inhiboi solujen elinkelpoisuuden ja BrdU-annoksesta riippuvaisella tavalla, mutta idebenoni ja T16A

inh-A01did eivät vaikuta solujen elinkelpoisuuteen ja BrdU-A549-soluja (kuvio 5A-5C). Koentsyymi Q10 ei estä solujen lisääntymistä kaikissa solulinjoissa. Downregulation ANO1 indusoi apoptoosin useissa syöpäsolulinjoissa yli-ilmentävät ANO1 [14, 16, 30]. Sen tutkimiseksi, onko idebenone indusoi apoptoosia ANO1 ilmentävien solujen TUNEL värjäys suoritettiin adenokarsinooman solulinjoja. PC3, CFPAC-1 ja A549-soluja inkuboitiin 30 uM idebenoni 48 tuntia, ja sitten DNA-vaurioita seurattiin käyttämällä TUNEL-määritystä. TUNEL-positiivisia soluja havaittiin PC3 ja CFPAC-1-soluissa, mutta ei A549-soluissa (kuvio 5D-5F).

(AC) PC3, CFPAC-1 ja A549-solut siirrostettiin 96-kuoppalevyille, ja sen jälkeen 24 h inkubaation, niitä käsiteltiin ilmoitettuina pitoisuuksina idebenonia (IDE), 100 uM koentsyymi Q10 (Q10) ja 10 uM T16A

inh-A01 (A01) MTS-määritys. IDE (30 uM), koentsyymi Q10 (100 uM) ja T16A

inh-A01 (10 uM) on sovellettu solujen BrdU määrityksessä. Soluproliferaatiota arvioitiin sen jälkeen, kun 2 päivää kautta MTS (vasen) tai BrdU (oikealla) määritys (keskiarvo ± keskivirhe, n = 6). (D-F) PC3, CFPAC-1 ja A549-soluja käsiteltiin 30 uM idebenonia. Solut värjättiin TUNEL (terminaali deoksinukleotiditransferaasia välittämää dUTP nick-end merkintöjä, vihreä) ja DAPI (4,6-diamino-2-fenyyli, sininen). Mittaviivat edustaa 20 um. * P 0,05, Opiskelijan paritonta t-testiä.

Keskustelu

ANO1, äskettäin tunnistettu CACC, on voimakkaasti yli-ilmentynyt eri kasvaintyypeissä kuten HNSCC, GIST, rinta- ja eturauhassyöpää. Erityisesti Viimeaikaiset todisteet osoittavat selvästi ANO1 osallistumista solujen lisääntymisen, solujen vaeltaminen, kasvaimen kehittymisen ja syövän etenemistä [12, 13, 16, 31]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että ANO1 voidaan käyttää terapeuttisena kohteena kasvaimia, koska säätelyä alaspäin ANO1 osoitti potentiaalisia terapeuttisia etuja HNSCC, ESCC, GIST, rinta- ja eturauhassyöpää [14, 16, 30, 32, 33]. Kiitos äskettäin tunnistamiseen ANO1, muutama pieni molekyyli ANO1 inhibiittorit ovat saatavilla, kuten CACC

inh-A01, parkkihappo, T16A

inh-A01, ja Monna [17, 19-21], mutta farmakologisen omaisuutta ja mekanismeja toiminnan inhibiittorit ovat vielä epäselviä. Tässä tutkimuksessa olemme suoritettiin solu-pohjainen seulonta tunnistaa uusia ANO1 estäjiä kokoelma lääkkeen kaltaisten yhdisteiden ja luonnon tuotteita. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että idebenoni inhiboivat voimakkaasti ANO1.

Idebenoni [2,3-dimetoksi-5-metyyli-6- (10-hydroksi-) -21,4-bentsokinoni] on synteettinen lyhytketjuinen bentsokinoni kuin analoginen ubikinonia (koentsyymi Q10). Idebenoni tutkii parhaillaan hoitoon useiden mitokondrioiden ja neuromuskulaariset sairaudet, kuten Friedreichin ataksia (FRDA), mitokondrioiden enkefalopatia maitohappoasidoosia ja aivohalvauksen kaltaisia ​​episodi (MELAS) ja Duchennen lihasdystrofia (DMD), koska sen kyky palvelemaan elektronikantajaa mitokondrion elektroninsiirtoketju ja sen voimakas antioksidantti. Edullisia vaikutuksia Idebenonin on raportoitu idebenoni saaneilla FRDA (300-2250 mg /vrk; ,5-5vuotta), MELAS (90-270 mg /vrk; 163 päivää) ja DMD (450 mg /vrk; 12 kk) [34-36]. Lisäksi tulokset laajassa kliinisessä tutkimuksessa osoitti, että idebenonilla oli turvallinen ja hyvin siedetty [37, 38].

Osoitimme, että idebenone voimakkaasti esti ANO1 aktiivisuus YFP fluoresenssin määritys (kuvio 1 C) ja Elektrofysiologiset tutkimukset ( Kuviot 2A ja 3A). Selvittää antioksidantti ja elektronikantaja aktiivisuus Idebenonin vaikuttaa ANO1 kanava toiminto, havaitsimme vaikutus Q10 on ANO1 kanavatoimintaa koska idebenonilla ja Q10 samaa korvausmalli kinoni osan ja eroavat vain alkyyli- hännän kiinnitetty C6 -hiiliatomiin niiden kinonirengasta. Kuten kuviossa 2F, esikäsittely 100 uM Q10 hieman (mutta ei merkittävästi) kasvoi ANO1 virtojen sijasta inhiboimaan ATP-indusoidun ANO1 virtojen ANO1 ilmentävät FRT-soluja. Lisäksi, Q10 ei estänyt solujen elävyys ja lisääntymistä monissa ANO1 ilmentäviä solulinjoja (kuvio 5), ja idebenoni ei vaikuttanut CFTR ja solunsisäisen kalsiumin signalointi (kuvio 2C ja 2D). Yhdessä edellä esitetyt tulokset viittaavat siihen, että vaikutusmekanismi Idebenonin on ANO1 esto voi olla suora sijaan sen hapettumisenestoaine ja elektroni harjoittaja kyky. Vielä on mahdollista, että idebenone vaikuttaa solujen lisääntymistä ja apoptoosia kautta muita väyliä. Kuitenkin idebenoni osoitti voimakas esto ANO1 ja soluproliferaation ANO1 ilmentävien solujen ja ANO1 spesifinen estäjä T16A

inh-A01 osoitti samanlaista vastetta soluproliferaatioon (kuva 5). Tämä tulos viittaa siihen, että idebenoni indusoi ANO1 inhibitio on ainakin osittain mukana sytotoksista vaikutusta idebenonia. Kuviossa 4D, osoitimme, että vahva esto solumigraation haavaan alueella idebenone. Haavan paranemista määrityksessä käytettiin seerumitonta soluviljelyalustoissa vähentää solujen kasvua, koska sekä solujen proliferaatio ja migraatio vaikuttavat haavan paranemista. Seerumideprivaatiolle johti ~ 54% kasvun inhibitio (tuloksia ei ole esitetty), ja inhiboiva vaikutus idebenonin haavan paranemista oli voimakkaampi kuin idebenonin soluproliferaatioon (kuviot 4D ja 5A). Nämä tulokset viittaavat siihen, että idebenone estää solujen vaeltamiseen vaikka kasvun esto idebenone voivat vaikuttaa tulokseen.

Kliinisessä tutkimuksessa potilaat on hoidettu idebenone jopa 2250 mg /vrk.