Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aikaisemmin olemme vahvistaneet, että CC-kemokiinireseptori 7 (CCR7-) edistää solujen lisääntymistä kautta solunulkoisen signaalin -regulated kinaasi (ERK) reitin, mutta sen rooli apoptoosin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjat edelleen tuntematon. A549 ja H460 soluja NSCLC käytettiin vaikutuksen tutkimiseksi CCL21 /CCR7- apoptoosiin virtaussytometriaa käyttämällä. Tulokset osoittivat, että aktivoituminen CCR7- sen ligandin, eksogeeninen kemokiini ligandin 21 (CCL21), liittyi merkittävästi vähentynyt prosenttia apoptoosin. Western blot ja tosiaikaisen PCR: n tutkimukset osoittivat, että aktivointi CCR7 merkittävästi aiheutti ylössäätely anti-apoptoottisten Bcl-2 ja vaimennussäätely pro-apoptoottisten bax ja kaspaasi-3, mutta ei p53, sekä proteiini- ja mRNA-tasoja. CCR7- Sirna merkittävästi heikennetty nämä vaikutukset eksogeenisen CCL21. Lisäksi PD98059, selektiivinen estäjä MEK joka häiritsee aktivointi loppupään ERK, merkittävästi poisti nämä vaikutukset CCL21 /CCR7. Coimmunoprecipitation edelleen vahvisti, että oli olemassa vuorovaikutusta p-ERK ja BCL-2, bax, tai kaspaasi-3, erityisesti kun läsnä on CCL21. Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että CCL21 /CCR7 estää apoptoosia säätelemällä ilmentymistä bcl-2 ja vähen- tämisessä ilmentymistä Bax ja kaspaasi-3 mahdollisesti kautta ERK-reitin A549 ja H460-soluja ei-pienisoluisen keuhkosyövän.

Johdanto-osan: Xu Y, Liu L, Qiu X, Liu Z, Li H, Li Z, et al. (2012) CCL21 /CCR7- Estää Apoptosis kautta ERK Pathway in Human ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 7 (3): e33262. doi: 10,1371 /journal.pone.0033262

Editor: Demetrios Vavvas, Massachusetts Eye Korva sairaala, Harvard Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 marraskuu 2011; Hyväksytty: 06 helmikuu 2012; Julkaistu: 16 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Chemokines, perheen pienimolekyylipainoisen pro -inflammatory sytokiineja, on kuvattu tärkeänä välittäjinä paitsi soluliikennöinti-, urut kehitystä, kudoksen uudelleen, ja kasvainmetastaasit [1] – [3], mutta muissa biologisissa tapahtumissa, kuten angiogeneesin, lymfopoieesin, planktonin kasvu, ja apoptoosin [ ,,,0],4], [5]. Niiden biologiset toiminnot välittyvät vuorovaikutus kemokiinireseptori perheen G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR: t) (eli C, CC, CXC, ja CX3C reseptorit) [6]. C-C-kemokiinireseptori 7 (CCR7), yksi CC kemokiinireseptoreita, ilmaistaan ​​kaikki naiivien T-solujen, joidenkin T-muisti- solut, B-solut ja kypsät dendriittisolut [7]. CCR7- vuorovaikutuksessa sen ligandien, kemokiini ligandin 19 (CCL19) ja kemokiinin ligandin 21 (CCL21) [8], on merkittäviä rooleja lymfosyyttien kulkeutumiseen ja itseohjautuva imusolmukkeisiin aikana immuunijärjestelmän ja tulehdusreaktioita [9] – [11].

edellinen tutkimus osoittaa, että CCR7- ilmentyy voimakkaasti ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin, ja että CCL21 /CCR7- edistää leviämisen A549 ja H460-solujen NSCLC kautta ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK) reitin [ ,,,0],12], [13]. ERK, joka on mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasien (MAPK) perheenjäsen, liittyy solujen lisääntymistä, erilaistumista, solusyklin säätelyssä, solun selviytymisen, ja apoptoosin [14] – [17]. Kuitenkin rooli CCR7- vuonna apoptoosin ihmisen NSCLC-solujen ei ole selvitetty.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia vaikutusta ja sääntelyn mekanismi CCL21 /CCR7- vuorovaikutusta apoptoosiin A549 ja H460 ihmisen NSCLC solut. Olemme osoittaneet tässä, että CCL21 /CCR7 estää apoptoosia säätelemällä ekspressiota anti-apoptoottisten Bcl-2 ja vähen- tämisessä ilmentymistä pro-apoptoottisten bax ja kaspaasi-3, mutta ei p53, joka on mahdollisesti välittyvät ERK väylän NSCLC-solut. Tämä tutkimus tuottaa uusia todisteita mekanismeja selviytymisen CCR7- välittämän syöpäsoluja ja se voi olla hyödyllistä tutkia hoitoon kohteena NSCLC.

Tulokset

CCL21 /CCR7- estää apoptoosia A549 ja H460 solut. Aiemmissa tutkimuksessa tunnistimme korkeamman CCR7- ekspressiotaso A549 ja H460 ihmisen NSCLC solulinjoissa, ja sen aktivointi edistää solujen lisääntymistä [12], [13]. Sen määrittämiseksi, onko aktivointi CCR7- vaikuttaa myös apoptoosin A549 ja H460-soluissa, CCR7- aktivaatio ja inhibitio indusoitiin eksogeenisen CCL21 ja CCR7 Sirna (siRNA), vastaavasti [13]. Anneksiini V: värjäys analyysi suoritettiin käyttämällä virtaussytometriaa määrittää vaikutus CCL21 /CCR7 apoptoosiin A549 ja H460-soluja. Kuten kuviossa 1, osuus ennalta apoptoottisten solujen CCL21 ryhmässä merkittävästi vähentää, verrattuna muiden (kaikki

P

0,01), kun taas ei ollut merkittäviä eroja toiset (kaikki

P

0,05), syytetään että aktivointi CCR7 voi estää apoptoosia A549 ja H460 soluissa, kun taas vaikutus CCL21 voidaan poistaa estämällä CCR7.

A549 (A) ja H460 (B) soluja käsiteltiin CCL21 (100 ng /ml) 24 h transfektion jälkeen CCR7 siRNA (siCCR7). Hoidon jälkeen, apoptoosi arvioitiin käyttäen Annexin V-värjäyksellä, kuten on kuvattu menetelmät. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. ** P 0,01, verrattuna kontrollisoluihin.

A549 (A) ja H460 (B) Soluja käsiteltiin CCL21 (100 ng /ml) 24 h transfektion jälkeen CCR7 siRNA (siCCR7 ). Käsittelyn jälkeen ekspressiota bcl-2, bax, kaspaasi-3 ja p53 sekä proteiinin (a) ja mRNA: n (b) arvioitiin käyttäen western blot (a) ja reaaliaikainen PCR (b), kuten on kuvattu menetelmät. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 tai ** p 0,01, verrattuna kontrollisoluihin.

A549 (A) ja H460 (B) Soluja käsiteltiin CCL21 (100 ng /ml) 24 tunnin kuluttua altistuksesta että PD98059, selektiivinen estäjä MEK joka häiritsee aktivointi loppupään ERK, 1 h. Käsittelyn jälkeen apoptoosin arvioitiin käyttämällä anneksiini V värjäystä. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, verrattuna kontrollisoluihin.

A549 (A) ja H460 (B) Soluja käsiteltiin CCL21 (100 ng /ml) 24 tuntia altistuksen jälkeen PD98059, selektiivinen estäjä MEK joka häiritsee aktivointi alavirtaan ERK, 1 h. Käsittelyn jälkeen ekspressiotasot näiden komponenttien arvioitiin käyttäen western blot. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 tai ** p 0,01 verrattuna kontrolli soluihin.

A549 (A) ja H460 (B) solujen puuttuessa tai läsnä CCL21 (100 ng /ml) 24 h alistettiin immunosaostukselle vasta-aineiden bcl-2 tai IgG, jota seuraa western blotting ja bax ja kaspaasi-3 (a). Vastavuoroinen immunosaostuksella vasta-aineita bax tai IgG analysoitiin western-blottauksella ja bcl-2 ja kaspaasi-3 (b). Vastavuoroinen immunosaostuksella vasta-aineita kaspaasi-3 tai IgG analysoitiin western-blottauksella ja bcl-2 ja bax (c).

inhibitio apoptoosi säätelyyn anti-apoptoottisten Bcl-2 ja proapoptootti- Bax ja kaspaasi-3, mutta ei p53 A549 ja H460-soluissa. On osoitettu, että apoptoosin soluissa on pääasiassa mukana ilmentymisen bcl-2, bax, kaspaasi-3, tai p53 [4], [18] – [20]. Määrittämään mahdollinen mekanismi, jonka avulla aktivointi CCR7 inhiboi apoptoosia A549 ja H460-soluissa, Western blot ja reaaliaikainen PCR-määritykset suoritettiin. Kuten on esitetty kuviossa 2, ilmaisu sekä proteiini- ja mRNA-tasoja anti-apoptoottisten Bcl-2 ja pro-apoptoottisten bax ja kaspaasi-3 olivat vastaavasti ylössäädelty ja vaimentua in CCL21 ryhmässä, verrattuna muiden (kaikki

P

0,01), kun taas ei ollut merkittäviä eroja toiset (kaikki

P

0,05). Mielenkiintoista, ilmaus proapoptoottisten p53 ei ole muuttunut (

P

0,05). Nämä tulokset osoittivat, että toiminto CCR7- estäjänä on apoptoosin NSCLC-solujen on pääasiassa toteutettu mahdollisesti reitit bcl-2, bax, ja kaspaasi-3, mutta ei p53.

CCL21 /CCR7 säätelee bcl-2, Bax ja kaspaasi-3: n kautta ERK-reitin. Aikaisemmat tutkimus vahvisti, että CCL21 /CCR7- vuorovaikutus lisää fosforylaatioon ERK (p-ERK) A549 ja H460-solujen [13]. Sen määrittämiseksi, onko ERK-reitin on mukana myös anti-apoptoottisen toiminnan CCL21 /CCR7, soluja käsiteltiin PD98059, selektiivinen estäjä MEK joka häiritsee aktivointi alavirtaan ERK, 1 h. Olemme havainneet, että PD98059 merkittävästi poistetaan CCL21 /CCR7-välitteisen apoptoosin vastaisen vaikutukset (kuvio 3) ja muutoksia ilmentymisen bcl-2, Bax ja kaspaasi-3 (kuvio 4). Mielenkiintoista on, että PD98059 yksinään (hoito 1 h) oli merkittävä vaikutus ekspressioon bcl-2, mutta ei ilmentymistä Bax ja kaspaasi-3 ja apoptoosin. Kuten bax on osoitettu olevan alavirran efektori bcl-2-säännelty reitin apoptoosin ja aktivointi bcl-2 voi edistää vapautumista bax, mikä johtaa kaspaasien aktivaatio [21], [22], pyrimme tutkia, onko vuorovaikutusta bcl-2, Bax ja capspase-3. Niiden välinen vuorovaikutus varmistettiin coimmunoprecipitation tulokset (kuvio 5).

fosforylaatio ERK, indusoi CCL21 /CCR7, vuorovaikutuksessa Bcl-2, bax, tai kaspaasi-3. Edelleen määrittää, onko vuorovaikutus p-ERK ja BCL-2, bax, tai kaspaasi-3, coimmunoprecipitation suoritettiin. A549 ja H460-solujen läsnä ollessa tai ilman CCL21 24 tuntia alistettiin immunosaostukselle vasta-aineita p-ERK tai IgG, jota seuraa Western blotting ja BCL-2, Bax ja kaspaasi-3. Korostunut, välistä spesifistä vuorovaikutusta p-ERK ja BCL-2, bax, tai kaspaasi-3 havaittiin, erityisesti silloin, kun soluja käsiteltiin CCL21 24 h (kuvio 6a). Vastavuoroinen immunosaostuksella vasta-aineiden BCL-2, bax, kaspaasi-3 tai IgG arvioitiin western-blottauksella p-ERK, ja taas, vuorovaikutus p-ERK ja BCL-2, bax, tai kaspaasi-3-oli merkittävä, erityisesti kun läsnä on CCL21 (kuva 6b).

A549 (A) ja H460 (B-solujen) läsnä ollessa tai ilman CCL21 (100 ng /ml) 24 tuntia tehtiin immunosaostus vasta-aineiden p-ERK tai IgG, jota seuraa western blotting ja bCL-2, Bax ja kaspaasi-3 (a). Vastavuoroinen immunosaostuksella vasta-aineiden BCL-2, bax, kaspaasi-3 tai IgG analysoitiin western-blottauksella ja p-ERK (b).

Keskustelu

edellisen tutkimukset ovat dokumentoitu, että aktivointi CCR7-, aiheuttama ligandiaan CCL21, voi edistää solujen lisääntymistä ja välittävät sen imusolmuke etäpesäke NSCLC soluissa [12], [13]. Kuitenkin rooli CCL21 /CCR7- apoptoosin NSCLC on epämääräinen. Nykyisessä tutkimuksessa osoitimme, että CCL21 /CCR7- estää apoptoosin A549 ja H460 solujen NSCLC, joka on mahdollisesti välittyvät ERK-reitin.

Bcl-2: n ja Bax ovat säätelijöitä solun sisäinen apoptoosireitin, joka säätelee eheyden ulomman mitokondriokalvon [21], [23], [24]. On osoitettu, että jotkut Bcl-2-perheen jäsenistä, jotka sijaitsevat mitokondrion kalvon (kuten Bax, bcl-XL, Mcl-1, BCL-2, ja Bid) voidaan muuttaa läpäisevyyttä mitokondrion kalvon ja laukaisemaan kaspaasien , mikä johtaa apoptoottisen solukuoleman [25] – [27]. Kanssa tulokset solun eri mallit [4], [18], [20], [28] – [30], tuloksemme osoittivat, että aktivointi CCR7 esti apoptoosin, mikä johtaa ekspression lisääntymisen anti-apoptoottisten Bcl -2 ja lasku ilmentymisen pro-apoptoottisten bax ja kaspaasi-3. Kiinnostavaa kyllä, tämä estävä vaikutus ei ilmeisesti liittynyt polulla p53. Lisäksi p53 ei ole merkittävää vaikutusta ilmaisun CCR7- [31].

Aikaisemmat tutkimuksessa on osoitettu, että aktivointi CCR7- voi parantaa fosforylaatiota ERK A549 ja H460-solujen [13], joka on yhdenmukainen useita tutkimuksia käyttämällä muita solutyyppejä [20], [28], [32] – [43]. Tässä tutkimuksessa selvitimme rooli fosforylaation ERK in CCL21 /CCR7- välittämää anti-apoptoosin A549 ja H460-soluissa. Huomasimme, että CCL21 /CCR7- välittämää antiapoptoosi liittyviä toimia ilmentymistä Bcl-2, Bax ja kaspaasi-3 voitaisiin poistaa käsittelemällä PD98059. PD98059 yksinään (hoito 1 h) oli merkittävä vaikutus ekspressioon bcl-2, mutta ei ilmentymistä Bax ja kaspaasi-3 ja apoptoosin. Lisäksi coimmunoprecipitation tulokset vahvistivat, ettei vuorovaikutusta Bcl-2, Bax, ja kaspaasi-3. Syynä puuttuminen muutoksen ilmentymisen Bax ja kaspaasi-3 johtuu mahdollisesti rajoittamisesta havaitun aikaa, koska Bax ja kaspaasi-3: n on osoitettu olevan alavirtaan efektoreiden Bcl-2-säännelty reitin apoptoosin [21] , [22].

Koska CCL21 /CCR7- kykeni ekspressiota sääteleviä bcl-2, Bax ja kaspaasi-3, pyrimme määrittämään onko vuorovaikutusta p-ERK ja bcl-2 , bax, tai kaspaasi-3. Coimmunoprecipitation ja vastavuoroisesti immunosaostus tulokset viittasivat vahvasti siihen, että on olemassa vuorovaikutusta p-ERK ja BCL-2, bax, tai kaspaasi-3, erityisesti kun läsnä on CCL21. Nämä tulokset osoittavat, että vaikutus CCL21 /CCR7 solun apoptoosin mukana ilmentymisen bcl-2, Bax ja kaspaasi-3 voi tapahtua ERK-reitin ihmisen NSCLC-soluja.

Tämä tutkimus viittaa siihen, että aktivaatio CCR7-, aiheuttama CCL21, voidaan merkittävästi ehkäistä apoptoosin NSCLC-solujen, joka on mahdollisesti välittyvät ERK-reitin. Tämä tieto voi auttaa selventämään mekanismeja syöpäsolun selviytymisen ja tunnistaa potentiaalisia hoitoon NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

A549 ja H460-solulinjoja aikaisemmista julkaistu paperi [12], [13] viljeltiin RPMI-1640 tai DMEM-F12 lisätty 10% HyClone naudan sikiön seerumia (FBS) (ThermoFisher Scientific, Fremont, CA, USA) atmosfäärissä 5% CO

2 37 ° C: ssa. Soluja kasvatettiin 75 cm

2 viljelypulloissa ja kerätyistä trypsiinin liuos-EDTA: logaritmisen kasvun vaiheessa.

Bcl-2, bax, kaspaasi-3, p-ERK, IgG, ja β-aktiini hiiren tai kanin monoklonaalisia vasta-aineita ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Rekombinantti ihmisen CCL21 oli peräisin Pepro Tech (Rocky Hill, NJ, USA). Lipofectamine 2000 oli Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Sekvenssit siCCR7 ja ohjaus siRNA ja menetelmä transfektion on raportoitu toisessa paperissa [13]. PD98059 saatiin Sigma (St. Louis, MO, USA) ja käytettiin 50 uM (lopulliset pitoisuudet) mukaisesti aikaisempien raporttien [13], [41], [44], [45]. Proteiini A /G-helmiä olivat Beyotime (Haimen, Kiina).

anneksiini V-värjäys

käsittelyn jälkeen CCL21: ssa 24 tuntia, solut kerättiin ja pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä varovasti ravistellen. Solut suspendoidaan uudestaan ​​lisättiin Sidonta puskuriin (1 x) ja oikaistu solutiheyteen 2-5 x 10

5 /ml. Pimeässä, 5 ui anneksiini V-FITC: tä (50 mM TRIS, 100 mM NaCl, 1% BSA, 0,02% natriumatsidi, pH 7,4) lisättiin solu- suspensioon Sekoita 195 ui ja inkuboitiin 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ennen kuin lisättiin 190 ui Sidonta puskuria (1 x) ja 10 ui PI. Kymmenentuhatta tapahtumaa per näyte hankittiin käyttäen FACS-scan -virtaussytometrissä (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) ja prosenttiosuus solun apoptoosin analysoitiin CellQuest analyysin ohjelmisto (Becton-Dickinson).

Western blot-analyysi

käsittelyn jälkeen CCL21: ssa 24 tuntia, solut uutettiin lyysipuskurilla (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 2 ug /ml aprotiniini ja 1 mM PMSF), 30 min 4 ° C: ssa. Uutteet sentrifugoitiin 12000 x

g

15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantit sisältävä kokonaisproteiinista sitten korjattu. Alikvootit, joista jokainen sisältää 50 ug proteiineja, erotettiin 12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvoille 40 V: ssa 2 tuntia alhaisessa lämpötilassa. Membraanit blokattiin kuoritun maidon 5% 2 h, ja proteiinit havaittiin käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita 1:200 laimennuksen yön yli 4 ° C: ssa. Proteiinit saatiin näkyviin käyttäen anti-hiiri- tai anti-kani-IgG: llä konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin (HRP) on 1:6000 (kaspaasi-3, p53, bax) tai 1:8000 (muut) laimennoksena 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, vastaavasti . Bändit oli kuvattu kanssa EC3 Imaging System (UVP LLC, Upland, CA, USA), ja optinen tiheys (OD) mitattiin käyttämällä ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA). OD ero testattiin proteiinien ja β-aktiini, että samasta näytteestä laskettiin suhteellinen pitoisuus ja ilmaistiin graafisesti.

Reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA eristettiin soluista käyttämällä TRIzol (Invitrogen) mukaan valmistajan ohjeiden. Reaaliaikainen PCR suoritettiin ABI Prism 7900HT Fast System (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) käyttäen SYBR Esisekoite Ex Taq II (TaKaRa, Dalian, Kiina). Monistukset suoritettiin kokonaistilavuudessa 20 ui ja kierrätettiin 40 kertaa, kun alkudenaturaation (95 ° C, 30 s) ja seuraavia parametrejä: 95 ° C: ssa 5 s ja 60 ° C: ssa 30 s. Alukkeet sekvenssit on lueteltu taulukossa 1 ja β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina [13], [46]. Luotettavuus PCR tulokset tukivat analysoimalla dissosiaatiokäyrä. Reaaliaikainen PCR tiedot laskettiin 2

-ΔΔCT menetelmää SDS 2,4 ohjelmistopaketti (Applied Biosystems) [47].

Coimmunoprecipitation

hoidon jälkeen CCL21 24 tuntia solut uutettiin lyysipuskurilla (10 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 10 mM HEPES [pH 7,9], 1 mM PMSF, 1 mM DTT) ja homogenoitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Uutteet sentrifugoitiin 12000 x

g

15 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantit, jotka sisältävät koko proteiinia kerättiin. Yhtä suuret määrät proteiinia, altistettiin vasta-aineita p-ERK, bcl-2, Bax ja kaspaasi-3, joka oli immobilisoitu proteiini-A /G-helmiä. Seuraavat 3-tunnin inkuboinnin 4 ° C: ssa varo- vaisesti pyörittäen, helmet pestiin perusteellisesti viisi kertaa hajotuspuskurilla, keitetyt ja mikrosentrifugoitiin. Proteiinit havaittiin vasta-aineita p-ERK, Bcl-2, Bax ja kaspaasi-3 Western blot.

Tilastollinen

Tiedot analysoitiin SPSS 16.0 ohjelmistolla (SPSS Inc., Chicago , IL, USA). Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) käytettiin arvioimaan eroja ryhmien kanssa erilaisia ​​hoitoja, ja vähiten merkitsevä ero (LSD) testi tai Dunnettin T3 testiä käytettiin post hoc alaryhmäanalyysi. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tulokset katsottiin tilastollisesti merkittävä p 0,05. N-kertainen arvot geenin ilmentymisen muuttaminen korkeintaan 0,5 ja alle 2 otettiin nonsignificant mukaisesti saadut arvot negatiivinen kontrolli geeneistä [47], [48].