Krooninen sairaus

tiivistelmä

Onnistunut geeniterapia riippuu pitkälti valikoivaa käyttöönottoa terapeuttisten geenien oikeisiin kohde syöpäsoluja. Yksi tehokkaimmista ja lupaavia lähestymistapoja kohdistaminen kasvainkudoksen aikana geeni toimitus on käyttää virusvektoreita, jotka mahdollistavat korkean hyötysuhteen geeninsiirtovälineen. Kuitenkin käyttö virusvektoreiden ei ole riskitöntä ja turvallisuusongelmia, kuten toksisuutta, isännän immuunivaste viruksen vasta tai mahdollisen viruksen rekombinaatiolla isännän kromosomiin; Näiden riskien rajoittamiseksi kliininen käyttö virusvektoreita. Prinsessa Ruusunen (SB) transposonin perustuva järjestelmä on houkutteleva, ei-virus vaihtoehto virus- jakelujärjestelmiä. SB voi olla vähemmän immunogeenisiä kuin virusvektori järjestelmän vuoksi sen puute virussekvenssien. SB-pohjainen geenin jakelujärjestelmä voi stabiilisti integroitua isäntäsolun genomiin tuottaa terapeuttista geenituotetta elinaikana solun. Kuitenkin, kun verrataan virusvektoreita, ei-virus-SB-pohjainen geeninkuljetussysteemiä edelleen rajoitettu terapeuttinen teho puutteen vuoksi kestävien geenin ilmentymisen mahdollisuuksia ja kasvainsolujen spesifisen geenin siirron kyky. Nämä rajoitukset voidaan ratkaista muuttamalla SB järjestelmän ottamalla käyttöön hTERT-promootterin ja SV40-tehostaja. Tässä tutkimuksessa, joka on modifioitu SB jakelujärjestelmä, hallinnassa hTERT-promootterin yhdessä SV40-tehostaja, pystyi onnistuneesti siirtää itsemurhan geeni (HSV-TK) useisiin syöpäsolujen. Modifioitu SB transfektoituja syöpäsolut osoittivat merkittävästi lisääntynyt syöpäsolun erityisiä kuolleisuus. Nämä tiedot viittaavat siihen, että modifioitu SB-pohjainen geeninkuljetussysteemi voidaan käyttää turvallisena ja tehokas väline syöpäsolun erityisiä terapeuttisia geeninsiirto ja stabiili pitkäaikaisen ilmentymisen.

Citation: Hong IS, Lee HY, Kim HP (2014) Novel hoitomenetelmiä eri syöpätyyppien käyttäminen Modified Ruususen-Based Gene Delivery System. PLoS ONE 9 (1): e86324. doi: 10,1371 /journal.pone.0086324

Editor: Eduard Ayuso, University of Nantes, Ranska

vastaanotettu: 11 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 06 joulukuu 2013; Julkaistu: 21. 2014

Copyright: © 2014 Hong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat tukea (Project Code No., Z-1541745-2012-13-09) peräisin eläinten ja kasvien karanteeniin viraston, maatalous-, elintarvike- ja maaseutuasiat. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Gene-suunnattu entsyymin aihiolääketerapia (GDEPT) on yksi lupaava vaihtoehtoja perinteisille kemoterapiaa; GDEPT minimoi systeemistä toksisuutta ottamalla käyttöön katalyyttinen entsyymit muuntavat matala- tai myrkyttömiä aihiolääkkeet aineenvaihduntatuotteita kasvainsoluissa [1]. Tämä terapeuttinen järjestelmä koostuu aktiivinen matala- tai ei-toksisia aihiolääkkeitä, ja geeni, joka koodaa entsyymiä, [2]. Sen jälkeen muuntamalla geneettisesti kasvainsolujen ilmaista tällaisten entsyymien ja systeeminen anto aihiolääkkeen, aihiolääke paikallisesti muunnettava entsyymin aineenvaihduntatuotteita, jotka johtavat selektiivisen tappamisen kasvainsoluja. Koska myrkyllinen aineenvaihduntatuote on vain tuotetaan ja vapautetaan paikallista kasvaimen, jossa geeni on annettu, mikä suuresti vähentää verenkierrossa pitoisuus vapaan myrkyllinen lääke, tämä terapeuttinen järjestelmä on nimeltään paikallista kemoterapiaa. On olemassa useita geenejä, jotka koodaavat aihiolääkkeen aktivoiva entsyymejä. Niistä yleisin geeni on Herpes Simplex Virus-1 tymidiinikinaasi (HSV-TK), joka on hyvin tunnettu itsemurha geeni, joka voidaan eristää Herpes simplex virus tai

E. coli

[3], [4]. HSV-TK muuntaa systeemisesti aihiolääkkeen gansikloviiri (GCV) myrkylliseksi metaboliitiksi, joka tappaa syöpäsoluja [5]. Tämä yhdistelmä menetelmää on sovellettu onnistuneesti monissa kliinisissä tiloissa, kuten geeniterapian syövän hoitoon [6] ja Käänteishyljintä (GVHD) [7].

Onnistunut GDEPT riippuu pitkälti valikoivaa käyttöönottoa itsemurhan geeni sopiva kohde syöpäsoluja. Yksi tehokkaimmista ja lupaavia lähestymistapoja geenin toimittamisen kohde tuumorikudoksessa on käyttää virusvektoreita, jotka mahdollistavat korkean tehokkuuden geeninsiirto [8], [9]. Nämä vektorit on tällä hetkellä riskejä ja turvallisuusongelmia, kuten toksisuutta, isännän immuunivasteita kohti viruksen vasta tai mahdollisen viruksen rekombinaatiolla isännän kromosomeista, jotka rajoittavat niiden kliinistä soveltamista [10]. Toinen ongelma, jossa käytetään virusvektoreita geeniterapiaan on, että virusvektori valmiste on työlästä ja kallista [11], [12] Siten, parempi vaihtoehto voi olla kehittää geeninsiirtovälineen menetelmä, joka ohjaisi terapeuttiset aineet asianmukaisia ​​sivustoja ja konstitutiivisesti ilmaista terapeuttisten geenien sisällä tai lähellä kasvain sivuston ilman näitä rajoituksia.

transposoni-pohjainen järjestelmä on houkutteleva, ei-virus vaihtoehto viruksen jakelujärjestelmiä. Transposoneja ovat erillisiä segmenttejä DNA, joilla on luontainen kyky liikkua paikasta toiseen ja voi toistaa itseään genomissa käyttäen isäntäsolun soluelimiin ja muut koneet. Kuitenkin, verrattuna virusvektoreita, transposoneja eivät ole tarttuvia, ja niiden toiminta ei siis rajoitu solunsisäisiin osastoihin erityisiä toimintoja. Vuonna selkärangattomat, useita erityyppisiä endogeenisen transposoneista on laajalti käytetty, kuten TC1 Mariner kaltainen elementti

Caenorhabditis elegans

ja P elementti

Drosophila

[13], [14] . Valitettavasti tällaista aktiivista ja endogeenisen transposoneja ovat saatavilla selkärankaisten johtuen kertynyt mutaatioita transposoni sekvenssi [15]. Yksi lähestymistapa tämän ongelman voittamiseksi selkärankaisilla oli molekyyli- jälleenrakentaminen geneettisesti aktiivisen selkärankainen TC1 /Mariner-tyyppinen siirrettävissä elementti nimeltään Lumikki (SB) peräisin antiikin ”kuollut” transposoni fossiileja kalassa genomien [16]. SB esittää tehokas transpositional aktiivisuus hiiren alkion kantasoluja (ES-solut) [17], ja hiiren somaattisten kudosten [18], ja hiiren iturataan [19]. Lisäksi SB on osoittanut valtava menestys tehokkaana geeninsiirtovälineen hiirimalleissa ihmisen sairauden [20] – [23]. Aiemmissa tutkimuksissa, laulu et al. havaittu, että SB transposoni välittää itsemurhan geenin ilmentymisen maksasolukarsinoomassa aiheuttaa apoptoosin [24] ja telomeraasin geeninsiirto suojaamaan kemikaaleja (t-BH, CCl4, tai d-GalN) – indusoidun akuutin soluvauriosta [25].

kuitenkin, verrattuna virusvektoreita, ei-virus-SB perustuva geeninkuljetussysteemiä edelleen rajoitettu terapeuttinen teho puutteen vuoksi kestävien geenin ilmentymisen ja syöpäsolujen spesifisen geenin siirron kyky. HTERT-geenin usein uudelleen noin 90%: kuolemattomiksi ihmisen solujen ja syöpäsolujen eri alkuperää [26] – [28]. hTERT-promootterin on laajasti käytetty kohdennettuja syövän geeniterapiassa [29] – [31]. Lisäksi, SV40-tehostaja on laajasti käytetty parantamaan aktiivisuutta promoottorien edistää pitkäkestoista geenin ilmentymisen [32]. Näin ollen lisätä promoottorin voimakkuutta säilyttäen kudosspesifisyys, käytimme rekombinantti SV40-tehostaja, joka sisältää kasvainspesifisen hTERT-promootterin [33]. Vaikka laulu et al. ovat raportoineet yhdistyksen välillä muutettu SB ja kasvaimen kasvun estoa [24], niiden tutkimus on rajattava niihin yhden maksasyövän solulinja (Hep3B) jossa univeral antituumorivaikutukset erilaisissa syöpäsolutyyppien puuttuvat. Samoin, vaikka tuumoria tukahduttavan vaikutukset muunnettu SB on ehdotettu, nämä vaikutukset ovat samankaltaiset kuin yhden in vitro (ATP solunelinkykyisyysmääritys), jossa kattavampi profiili antituumorivaikutukset muutettu SB puuttuu edelleen [24]. Siksi tässä tutkimuksessa, modifioitu SB-pohjainen geeninkuljetussysteemiä käytettiin siirtämään itsemurhageenille (HSV-TK) useiksi syöpäsolujen, mukaan lukien H358 (keuhkosyöpä), H1299 (keuhkosyöpä), PC3 (eturauhassyöpä syöpä), DU145 (eturauhassyöpä), ja OVCAR3 (munasarjasyöpä) soluja, joilla on erilaisia ​​kokeellisia lähestymistapoja, kuten TUNEL-määritys, solunelinkykyisyysmääritys, FACS-analyysillä, ja in vivo kokeessa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että modifioitu SB-pohjainen geeninkuljetussysteemi voidaan käyttää turvallisena ja tehokas väline syöpäsolun erityisiä terapeuttisia geeninsiirto ja stabiili pitkäaikaisen ilmentymisen.

Materiaalit ja menetelmät

Cell kulttuuri

Ihmisen normaali fibroblasti, WI-38 ja IMR-90-soluja ylläpidettiin DMEM (GIBCO BRL, Saksa), jota oli täydennetty 10% kuolemaan johtava vasikan seerumia (FCS) (HyClone, Logan, USA), penisilliiniä (50 yksikköä /ml), ja streptomysiinillä (50 ug /ml), kun läsnä on 5% CO

2. H358 (keuhkosyöpä), H1299 (keuhkosyöpä), PC3 (eturauhassyöpä), DU145 (eturauhassyöpä), ja OVCAR3 (munasarjasyöpä) kasvatettiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FCS, penisilliini (50 yksikköä /ml), ja streptomysiinillä (50 ug /ml), 5% CO2: ta. Kaikki solulinjat saatiin Korea Cell Line Bank (Seoul, Korea).

Eläinkokeet

Keuhkosyöpä solut (H358), eturauhassyövän solulinjaa (DU-145), ja munasarjasyöpä solut (OVCAR3) kerättiin trypsinoimalla, ja 1 x 10

5 elävien solujen (määritettynä trypaanisiniekskluusiolla) kokonaistilavuudessa 200 ui injektoitiin subkutaanisesti 6- 10-viikon ikäisiä, NOD /SCID hiirillä. Kaksi päivää kasvaimen kylvö, eläimet injektoitiin suonensisäisesti kautta häntälaskimoiden 100 mg /kg gansikloviiri (GCV) kanssa joko 25 ug tyhjällä plasmidilla (pT. HTP. Con) tai muunnettu SB-järjestelmä (pT.hTp.HSV-tk. Con). Hiiret tapettiin 28 päivää sen jälkeen, kun kasvaimen injektion jälkeen ja vaikutus muutettu SB järjestelmän kasvaimen kasvuun arvioitiin mittaamalla kasvaimen koko. Minimoida kärsimyksen, kaikki kirurgisen suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesian. Eläinkokeet hyväksyi eettinen komitea eläinkokeiden of Jungwon University (Luvan numero: 2013-0610).

RT-PCR-analyysi

Yhteensä RNA eristettiin kustakin soluista käyttämällä Ehdottomasti RNA Microprep (Stratagene, La Jolla, USA) valmistajan protokollan ja käsiteltiin DNaasi I: llä, jotta genomisen DNA: n kontaminaatiota. cDNA-synteesi suoritettiin 1 ug RNA: ta käyttäen SuperScript III käänteistranskriptaasia (Invitrogen, Calsbad, USA), jossa Oligo (dT) aluketta (Promega, Madison, USA) lopulliseen tilavuuteen 20 ui. 1 ul: n cDNA: ta käytettiin monistamaan cDNA: ta 20 ul: ssa koko reaktion. PCR-olosuhteet monistuksen olivat: 94 ° C 5 min; 30 sykliä 94 ° C 1 min, 55 ° C 1 min, ja 72 ° C: ssa 90 sekuntia; ja lopuksi, 72 ° C: ssa 10 min). hTR cDNA monistettiin hTR erityisiä alukesarja (5′-tttgtctaaccctaactgagaagg-3 ’eteenpäin ja 5′-tgtgagccgagtcctgggtgcacg-3′ reverse). hTERT: n cDNA monistettiin forward-aluketta (5’-cggaagagtctggagcaa-3 ’), ja reverse-aluketta (5′-ggatgaagcggagtctgga-3′). Ilmentymis- eroja kustakin näytteestä normalisoitiin GAPDH (eteenpäin 5’-aacgagcggttccgatgccctgag-3 ’; taaksepäin 5′-tgtcgccttcaccgttccagt t-3’). PCR-tuotteet erotettiin 2% agaroosigeelielektroforeesilla, joka sisälsi 0,5 ug /ml etidiumbromidia.

Plasmidien

Plasmidit Ruususen-transposonin järjestelmä, pCMV-SB ja pCMV MSB (transposaasientsyymin jonka missensemutaatio sen C-terminaalista Asp-Asp-Glu motiivi) oli ystävällisesti Dr. Joonseok Song (University of Pittsburgh) [25]. Rakentamiseksi transposonin, pGL3-HT-Con ja pGL3-HT-TK-Con plasmidit leikattiin Kpnl ja BamHI restriktioentsyymeillä. Lusiferaasia ja HSV-TK-geeni ligatoitiin pT-MCS vektori, joka aiheutti pT.hTp.Con ja pT.hTp.HSV-tk.Con vektoreita vastaavasti (Fig. 1). HTERT-promootterin ja SV40-tehostaja-alueen, monistettiin PCR: llä käyttäen Ex Taq DNA-polymeraasia (Takara, Shiga, Japani) ja subkloonattiin pGL3-HT-Con vektori. HTERT-promootterin eteenpäin (5′-accaggtagtggattcgcgggcacaga-3 ’) ja reverse (5′-agatctagggcttcccacgtgcgcag-3′) alukkeina, ja SV40E eteenpäin (5’-gcattcgatggagcgg-3 ’) ja reverse (5′-ggatccgctgtggaatg-3’) alukkeita. PCR suoritettiin 35 sykliä 94 ° C 1 min, 60 ° C 1 min, ja 72 ° C: ssa 1 min.

rakentamiseksi transposonin plasmidin pGL3-HT-Con ja pGL3-HT-TK-Con plasmidit leikattiin KpnI ja BamHI; päät lusiferaasin kasetin ja HSV-TK kasetti täytettiin käyttämällä DNA-polymeraasi I: n ja tylppä pää ligoitiin pT-MCS vektori, jolloin pT.hTp.Con ja pT.hTp.HSV-tk.Con vektorit, vastaavasti. PT.hTp.nori.Con plasmidi konstruoitiin pTnori plasmidista insertoimalla ihmisen telomeraasin promoottori (hTERTp) ja SV40-tehostaja. SV40-promoottori korvattiin hTERTp pilkkomalla pTnori plasmidi SexAI ja Bglll. SV40-tehostaja insertoitiin Bsml ja BamHI-kohtien pTnori. HTERT-promootterin ja SV40-tehostaja-alueen, monistettiin PCR: llä pGL3-HT-Con-vektorin kanssa käyttämällä Ex-Taq-polymeraasia.

lusiferaasianalyysissä

Luciferase määritykset suoritettiin käyttäen Luciferase Assay System (Promega, Madison, USA) ja AutoLumat LB953 luminometrillä (Berthold, Wildbad, Saksa) valmistajan mukaan protokollia. Lyhyesti, 3 x 10

4-solut ympättiin 16 mm: n kudosviljelymaljaa transfektoitiin 1 ug: lla lusiferaasireportteri plasmidit ja 0,25 ug: lla pSV-β-galaktosidaasi-ohjaus plasmidivektori. Solulysaatit valmistettiin 48 tuntia transfektion jälkeen lisäämällä 100 ui toimittaja lyysipuskuria ja lusiferaasin aktiivisuudet mitattiin. PGL3-promoottori plasmidilla, joka sisälsi SV40-promoottorin käytettiin positiivisena kontrollina. Lusiferaasin aktiivisuus pGL3-promoottori plasmidin kussakin solulinjassa pidettiin 1, ja suhteellinen lusiferaasin aktiivisuus laskettiin. Kaikki lusiferaasi määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.

plasmiditransfektiolla kanssa GCV hoidon in vitro

Syöpä ja normaalien solujen (10

5 solua maljaa kohden) maljattiin 35 mm: n kulttuuri ruokia ennen transfektiota, ja ne transfektoitiin pCMV-SB tai pCMV-MSB-plasmidi pT.hTp.HSV-TK.Con plasmidi käyttäen Lipofectamine 2000 transfektioreagenssia (Invitrogen, Carlsbad, USA). Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 3 päivää, 2 ml väliainetta, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia Gansikloviiri (GCV; InvivoGen, San Diego, USA) lisättiin soluihin. Kaikki tiedot on esitetty tässä raportissa saatiin vähintään kolmen erillisen kokeen.

TUNEL määritys

DNA-säikeen katkoksia apoptoottisia soluja mitattiin TUNEL määritys käyttäen In situ Detection Kit (Roche Molecular Biochemicals, Saksa). Näytteet kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 15 minuutin ajan ja inkuboitiin 0,1% jääkylmää Triton X-100, liuos läpäiseväksi 10 minuutin ajan mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Cell pestiin sitten 3 kertaa PBS: llä ja saatettiin reagoimaan 50 ui TUNEL reaktioseosta 37 ° C: ssa 60 minuutin ajan pimeässä, kosteassa kammiossa. Solut pestiin kolme kertaa PBS: ssä. Alle fluoresenssimikroskopialla määrä TUNEL-positiivisia soluja laskettiin.

apoptoosimäärityksessä

apoptoottiset hinnat normaaleissa ja syöpäsolujen mitattiin anneksiini V-FITC Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA). Lyhyesti, pT.hTp.HSV-TK.Con ja pCMV-SB-transfektoituja soluja käsiteltiin GCV (50 ug /ml, 3 tuntia 37 ° C: ssa) jälkeen 10 päivää transfektion. Solut kerättiin ja huuhdeltiin 1 x anneksiini-sitomispuskuria ja suspendoidaan sitten uudelleen 100 ul: lla 1 x anneksiini-sitomispuskuria. Kun oli lisätty 5 ui FITC anneksiini V ja 1 ui propidiumjodidia (PI; 100 ug /ml), soluja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 15 minuutin ajan pimeässä. Osuus elävät solut analysoitiin FACScalibur -virtaussytometrissä (Becton Dickinson, San Jose, CA) ja kvantifioidaan Flowjo ohjelmisto (Puu Star Inc., Ashland, USA).

Sytotoksisuusmääritvs

useita 5 x 10

3 pT.hTp.HSV-TK.Con ja pCMV-SB-transfektoituja soluja siirrostettiin 96-kuoppaiselle levylle. Levyä inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa ja 5% CO 2: ssa 24 tuntia. GCV lisättiin pitoisuuden tasoa 10, 30, 50 ug /ml kolminkertaisesti kutakin pitoisuutta. Sitten soluja inkuboitiin 3 tuntia ja lisättiin MTT, jossa soluja viljeltiin vielä 4 tuntia. Sitten supernatantti poistettiin, ja DMSO: ta lisättiin liuottamaan MTT formatsaanikiteet. OD-arvo 570 nm: ssä detektoitiin mikrolevylukijalla. Solujen eloonjäämisaste on laskettu: eloonjäämisaste (%) = A /B × 100 (A: OD-arvo pT.hTp.HSV-TK.Con ja pCMV-SB transfektoiduissa soluissa, B: OD-arvo pT.hTp.Con ja pCMV-SB). Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Survival käyrä tuottamista keskiarvo elinkyvyt kunkin solulinjojen ordinaattana akselilla ja pitoisuudet GCV kuin vaaka-akselilla

Tilastollinen

Jokainen koesarja suoritettiin kahtena tai kolmena kappaleena. Tulokset Kunkin kokeen rinnakkaista esitettiin keskiarvona ± SD. Tiedot arvioitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA) ja merkittäviä tuloksia arvioitiin edelleen Tukeyn useita vertailutestejä. Tilastollinen merkitsevyys määriteltiin P tasolla 0,05.

Tulokset

hTERT on lupaava kohde SB geenihoidolla

Onnistunut geeniterapia riippuu paljolti valikoiva ilmentyminen itsemurhan geenin tavoitearvon syöpäsolut, mutta ei normaalissa ympäröivien solujen. Ihmisen telomeraasin käänteistranskriptaasin (hTERT) geeni, joka koodaa katalyyttistä alayksikköä telomeraasi, ilmentyy vahvasti alkion kantasoluja ja on asteittain alassäädetty erilaistumisen aikana, jolloin äänenvaimennusjärjestelmän täysin eriytetty somaattisten solujen. hTERT usein uudelleen noin 90%: kuolemattomiksi ihmisen solujen ja syöpäsolujen eri alkuperää [26] – [28]. Näin ollen, se voi olla lupaava kohde geenihoidon eri kasvaintyypeissä. Ensin tarkasteltiin ilmentymisen profiilit ihmisen telomeraasin RNA komponentit (hTR) ja hTERT käyttäen RT-PCR fibroblasteissa ja eri syöpäsolun linjat. hTR on konstitutiivisesti sekä fibroblasteissa ja syöpäsolulinjoissa, jotka olivat yhdenmukaisia ​​aiempien huomautusten [34]. Ilmentyminen hTERT havaittiin kaikissa syöpäsoluissa, mukaan lukien kaksi keuhkosyövän solulinjoja (H358 ja H1299), kaksi eturauhassyövän solulinjoissa (PC3 ja DU145), ja munasarjasyövän solulinja (OVCAR3), mutta se ei ole havaittu kaksi fibroblastisolulinjat (WI-38 ja IMR-90) (Fig. 2). Näin ollen ilmaus hTERT näytti olevan tiukasti liitetty kasvainten kehittymiseen, ja hTERT voisi olla lupaava kohde SB-välitteisen geeniterapian eri syöpätyyppien.

hTR ja hTERT-ekspressiotasot erilaisissa syöpäsolulinjoissa ja normaalien fibroblastien määritettiin käyttämällä RT-PCR: ää. Kokonais-RNA monistettiin käyttämällä hTR ja hTERT spesifisiä alukkeita (ylimmän ja keskijohdon, vastaavasti). GAPDH ilmaisua käytettiin sisäisenä kontrollina normalisoitumista hTR ja hTERT ilme. hTR oli konstitutiivisesti sekä fibroblasteissa ja syöpäsolun linjat. Ilmentyminen hTERT havaittiin kaikissa syöpäsoluissa, kun taas sitä ei havaita kahden fibroblastisolulinjat. Keuhkosyöpä solulinjoja (H358 ja H1299); eturauhassyövän solulinjoissa (PC3 ja DU145); munasarjasyövän solulinja (OVCAR3); fibroblastisolulinjat (WI-38 ja IMR-90).

Tumor erityisiä aktivointi hTERT-promoottorin SV40-tehostaja

Koska normaali tai luonnollinen promoottori ei ollut tarpeeksi vahva indusoivat tehokkaan ilmentymisen terapeuttisten geenien tietyissä kasvainsoluissa, tehokas kasvaimen-promoottori on välttämätöntä saavuttaa onnistuneita pitkäaikaisia ​​terapeuttisen geenin ilmentymisen. Simian virus 40 (SV40) tehostaja on laajasti käytetty parantamaan aktiivisuutta promoottorit [32] ja 3 poly (A) häntä on tärkeää vakauden ja translaation mRNA: n [35]. Näin ollen lisätä promoottorin voimakkuutta säilyttäen kudosspesifisyys, rakensimme rekombinantti hTERT-promootterin, joka sisälsi SV40-tehostaja ja SV40: n PolyA (Simian virus 40 PolyAan, jota kutsutaan myös PolyA). SV40-tehostaja-sekvenssi monistettiin ja insertoitiin useita klooni (MCS) alavirtaan hTERT-promootterin. Transkription aktiivisuus transfektion jälkeen kanssa pT-HTP-Con-plasmidi (jossa SV40-tehostaja ja SV40: n PolyA) tai pT-HTP-Pro-plasmidi (ilman SV40-tehostaja ja SV40: n PolyA) havaittiin, ja verrattiin normaalien ja syöpäsolulinjoissa, ja vaikutus SV40-tehostaja toimintaa kasvaimen tietyn hTERT-promootterin arvioitiin. Kuten on esitetty kuviossa. 3, PT-HTP-Con plasmidi, joka sisältää SV40-tehostaja ja SV40 PolyAan, osoittivat merkittävää kasvua transkriptio aktiivisuuden telome- positiivisen syöpäsolun linjat, vaikkei ollut mitään muutosta kaksi normaalia fibroblastisolulinjat. Nämä tulokset osoittivat, että hTERT-promootterin esillä suhteellisen korkea transkription toimintoja useimmilla kasvaimen solulinjojen samalla kun ne osoittavat vain vähän aktiivisuutta normaalissa fibroblastisolulinjat, ja SV40-tehostaja ja SV40: n PolyA huomattavasti aktiivisuutta hTERT-promootterin yksinomaan syöpäsolun linjat.

jälkeen transfektion joko pT-HTP-Con-plasmidi (jossa SV40-tehostaja ja SV40: n PolyA) tai pT-HTP-Pro-plasmidi (ilman SV40-tehostaja ja SV40: n PolyA), lusiferaasin aktiivisuutta havaittiin ja verrattiin normaalien ja syöpäsolujen linjat. Telome- positiivisia syöpäsolulinjoja, SV40-tehostaja ja SV40: n PolyA aktivoida hTERT-geenin promoottori vähintään 7-kertaiseksi verrattuna hTERT-geenin promoottorin aktiivisuutta ilman näitä sekvenssejä. Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus standardoitu transfektion ohjaus- pGL3-promoottori plasmidin. Keuhkosyöpä solulinjoja (H358 ja H1299); eturauhassyövän solulinjoissa (PC3 ja DU145); munasarjasyövän solulinja (OVCAR3); fibroblastisolulinjat (WI-38 ja IMR-90). Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** P 0,01 ja *** P 0,001.

Pitkän aikavälin kestävyys modifioidun SB jakelujärjestelmä erilaisissa syöpäsoluissa

onnistunut geeniterapia riippuu pitkän aikavälin kestävyyteen terapeuttisen geenin ilmentymisen parantaa tai hidastaa etenemistä syövän kehittymisen. Siksi tutkimme seuraavaksi, onko SB jakelujärjestelmä on modifioitu hTERT-promootterin ja SV40-tehostaja jatkuva pitkäaikainen terapeuttinen geeni-ilmentymisen erilaisissa syöpäsolulinjoissa. Koska transposaasi tuottavat auttaja plasmidi on olennaista lisäämistä SB isännän genomeja, me kotransfektoidaan normaalia fibroblastien ja syöpäsolujen linjojen kanssa lusiferaasin ilmentävät versio pT-HTP-Con plasmidiin yhdessä joko aktiivisen auttaja plasmidi ( pCMV-SB) tai ei-aktiivinen auttaja plasmidia (pCMV-MSB). Kaikki syöpäsolulinjat pysyvät suhteellisen korkeampi pitkän aikavälin lusiferaasiaktiivisuus käyttäen SB jakelujärjestelmä hallinnassa hTERT-promootterin ja SV40-tehostaja verrattuna normaalien fibroblastien; ei ollut mitään muutosta kaksi normaalia fibroblastisolulinjat 10 päivää transfektion jälkeen (kuvio. 4). Nämä havainnot viittaavat siihen, että muunneltu SB jakelujärjestelmä on lupaava tapa parantaa terapeuttista tehokkuutta, kun pitkäaikainen ilmentyminen terapeuttisten tuotteiden tarvitaan.

Luciferase määrityksiä käytettiin määrittämään promoottorin toimintaa lusiferaasin ilmentävien plasmidin pT-HTP-Con seuraavat kotransfektioon joko aktiivisen auttaja plasmidia (pCMV-SB) tai ei-aktiivinen auttaja plasmidia (pCMV-MSB) in H358, H1299, PC3, DU145, OVCAR3, WI-38, ja IMR-90-soluissa . Kaikki syöpäsolulinjoissa, jotka sisälsivät SB-pohjainen geenin jakelujärjestelmä, valvonnassa hTERT-promootterin ja SV40-tehostaja, jatkuva suhteellisen korkeampi pitkän aikavälin lusiferaasin aktiivisuus kuin normaalien fibroblastien 10 päivää transfektion jälkeen. Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus standardoitu transfektion ohjaus- pGL3-promoottori plasmidin. Keuhkosyöpä solulinjoja (H358 ja H1299); eturauhassyövän solulinjoissa (PC3 ja DU145); munasarjasyövän solulinja (OVCAR3); fibroblastisolulinjat (WI-38 ja IMR-90). Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** P 0,01 ja *** P 0,001.

Modified SB jakelujärjestelmä lisää kasvainsolujen spesifisen sytotoksisuuden

Onnistunut syövän hoitoon käytetään geeniterapian pitkälti riippuu kustakin toimituksen terapeuttisen tuotteen sopiva kohde syöpäsoluja. Gene-suunnattu entsyymin aihiolääketerapia (GDEPT) on lupaava vaihtoehto perinteisille kemoterapiaa; GDEPT minimoi systeemisen toksisuudet tavanomaisten kemoterapia huumeiden käyttöön katalyyttinen entsyymit kasvainsoluihin; nämä entsyymit muuntavat matala- tai ei-myrkyllisiä aihiolääkkeet aineenvaihduntatuotteita [1]. Sen jälkeen muuntamalla geneettisesti kasvainsolujen ilmaista katalyyttinen entsyymit, systeeminen anto aihiolääke, joka on paikallisesti muunnettava entsyymin sytotoksisia aineenvaihduntatuotteita, johtaa selektiiviseen kasvainsolujen tappamista. Määrittää tuumorisolun tiettyjen myrkyllisten vaikutusta meidän SB-pohjainen geenin jakelujärjestelmä, syöpäsoluja ja normaaleja fibroblasteja kotransfektoitiin muokatun SB-järjestelmän (pT.hTp.HSV-tk.Con) yhdessä aktiivisen auttaja-plasmidin (pCMV SB) annon jälkeen 50 ug /ml gansikloviiri (GCV). Sitten suoritetaan TUNEL määrityksiä solujen 10 päivää transfektion jälkeen tunnistaa apoptoottiset solut, joille on tunnusomaista, että läsnä on tiheästi värjättyä pyöreä elimet, jotka edustavat hajanainen DNA apoptoottisten solujen. Kuten on esitetty kuviossa. 5, TUNEL-analyysit osoittivat, että modifioitu SB transfektoidut syöpäsoluja, oli huomattavasti lisääntynyt kuolleisuus verrattuna normaalien fibroblastien, kun läsnä on 50 ug /ml GCV. Edelleen vahvistaa tätä kasvainspesifisen solukuoleman SB-pohjainen geenin jakelujärjestelmä, solun elinkelpoisuus määritystä käytettiin arvioimaan syöpäsolun spesifisen sytotoksisuuden, että normaalien fibroblastien ja syöpäsolulinjoissa käsiteltiin GCV annoksesta riippuvalla tavalla. GCV yksinään ei ollut vähäinen vaikutus solujen elinkykyä (Fig. 6A), kun taas transfektio modifioidun SB (pT.hTp.HSV-tk.Con) järjestelmän antamisen jälkeen GCV merkittävästi vähentynyt syövän solujen elävyys annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio . 6B). Lisäksi, solukuolema määritettiin myös virtaussytometrialla tunnistaa solut, jotka värjättiin sekä anneksiini V /FITC ja propidiumjodidilla (PI). Tiedot TUNEL ja solujen elinkelpoisuuden määritykset olivat yhdenmukaisia ​​myös virtaussytometrialla tulokset (Fig. 7). Nämä tulokset viittaavat siihen, että SB-pohjainen geeninkuljetussysteemiä välitteistä kasvainsolun erityisiä terapeuttisia geeninsiirtovälineen, joka puolestaan ​​indusoi kasvainspesifisiä apoptoosin. Meidän in vitro tiedot osoittivat, että modifioitu SB transfektoidut syöpäsolut osoittivat merkitsevästi lisääntynyt kuolleisuus verrattuna normaaliin fibroblasteissa. Siksi tutkimme seuraavaksi, onko kasvaimen kasvu voidaan vaimentaa muutettu SB jakelujärjestelmä in vivo. Joissakin koeryhmään, kasvaimen kasvu onnistuneesti tukahdutti muutettu SB jakelujärjestelmä, kun taas muut ryhmät eivät näytä näennäisen kasvaimen vastaisen vaikutuksen (Fig. 8).

tasot solun apoptoosin arvioitiin käyttäen TUNEL-määritys transfektion jälkeen SB-järjestelmän (pT.hTp.HSV-tk.Con aktiivisen auttaja-plasmidi) ja annon jälkeen 50 ug /ml GCV on 3 päivää transfektion jälkeen. TUNEL-positiiviset solut ominaista voimakkaasti värjätty pyöreä elimet, jotka edustavat hajanainen DNA apoptoottisten solujen. SB transfektoidut syöpäsolut, oli huomattavasti lisääntynyt määrä TUNEL-positiivisia soluja verrattuna normaalien fibroblastien, kun läsnä on 50 ug /ml GCV. Keuhkosyöpä solulinjoja (H358 ja H1299); eturauhassyövän solulinjoissa (PC3 ja DU145); munasarjasyövän solulinja (OVCAR3); fibroblastisolulinjat (WI-38 ja IMR-90). Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** P 0,01 ja *** P 0,001.

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen MTT kanssa tai ilman transfektiota SB-järjestelmän (pT.hTp.HSV- tk.Con aktiivinen auttaja-plasmidi) annon jälkeen 10, 30, tai 50 ug /ml GCV on 3 päivää transfektion jälkeen. GCV yksin oli vähäinen vaikutus vaikutusta solujen elinkykyä (A), kun taas transfektion SB-järjestelmän (pT.hTp.HSV-tk.Con aktiivisella auttaja plasmidilla) antamisen jälkeen GCV vähensi syöpäsolun elinkelpoisuuden annoksesta riippuvaisella tavalla (B). Keuhkosyöpä solulinjoja (H358 ja H1299); eturauhassyövän solulinjoissa (PC3 ja DU145); munasarjasyövän solulinja (OVCAR3); fibroblastisolulinjat (WI-38 ja IMR-90). Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** P 0,01 ja *** P 0,001.

Cancer solulinjojen ja normaalien fibroblastien transfektoitiin SB-järjestelmän (pT.hTp.HSV-tk.Con aktiivisella auttaja plasmidilla). Sitten solut altistettiin 50 ug /ml GCV, minkä jälkeen anneksiini V-FITC /PI-värjäyksen ja FACS-analyysi 3 päivää transfektion jälkeen. Keuhkosyöpä solulinjoja (H358 ja H1299); eturauhassyövän solulinjoissa (PC3 ja DU145); munasarjasyövän solulinja (OVCAR3); fibroblastisolulinjat (WI-38 ja IMR-90).

Keuhkosyöpä solut (H358) (A), eturauhassyöpä-solulinjaa (DU-145) (B), ja munasarjasyöpä soluja ( OVCAR3) (C) kerättiin trypsinoimalla, ja 1 x 10

5 elävien solujen (määritettynä trypaanisiniekskluusiolla) kokonaistilavuudessa 200 ui injektoitiin ihon alle. Kaksi päivää kasvaimen kylvö, eläimet injektoitiin suonensisäisesti kautta häntälaskimoiden 100 mg /kg gansikloviiri (GCV) yhdessä joko kotransfektoimalla tyhjä plasmidi (pT. HTP. Con) aktiivisen auttaja plasmidin (pCMV-SB) tai kotransfektion SB-järjestelmän (pT.hTp.HSV-tk.Con) aktiivisen auttaja plasmidin (pCMV-SB). Hiiret tapettiin 28 päivää sen jälkeen, kun kasvaimen injektion jälkeen ja vaikutus muutettu SB järjestelmän kasvaimen kasvuun arvioitiin mittaamalla kasvaimen koko.

Keskustelu

Monet yleisesti käytetty kemoterapialääkkeillä puuttuu kasvainspesifisyys , ja tarvittavat annokset päästä terapeuttista tasot kasvain ovat usein myrkyllisiä ympäröiviin normaaleissa kudoksissa. Siksi aihiolääke-käynnistysjärjestelmissä jotka sisältävät itsemurha geeniterapia ovat lupaavia vaihtoehtoja perinteisille kemoterapiaa; Näiden järjestelmien minimoida systeemisiä toksisuuksia tavanomaisten kemoterapiaa huumeita. Kliiniseen käyttöön, itsemurha geenit on täytettävä seuraavat kriteerit: a) nämä geenit on joko ei ilmaista eikä läsnä erittäin alhaiselle tasolle vastaanottavassa;