Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

eturauhassyövän antigeeni 3 (

pCA3 /DD3) B-geeni on erittäin spesifinen biomarkkereiden yläreguloituja eturauhassyöpä (PCA). Jotta ymmärtää merkityksen

pCA3

PCA tutkimme järjestämiseen ja kehitys

pCA3

geenilokuksesta.

Methods /Principal Havainnot

Olemme palkanneet cDNA-synteesi, RTPCR ja DNA-sekvensoinnilla tunnistaa 4 uutta transkription aloituspaikkoja, 4 polyadenylaatiokohtia ja 2 uutta erilailla saumattu eksonien laajennettu muodossa

pCA3

. Suunniteltuja alukkeita näitä uusia

pCA3

eksonit parantaa RT-PCR-tekniikkaan perustuva syrjiä PCa PCA etäpesäkkeitä ja BPH yksilöitä. Vertaileva genomista analyysit osoittivat, että

pCA3

on vasta äskettäin kehittynyt anti-sense suuntautuminen toinen geeni,

BMCC1 /PRUNE2

. BMCC1 on aiemmin osoitettu olevan vuorovaikutuksessa RhoA ja RhoC, tekijöihin solutransformaatioon ja etäpesäkkeiden, vastaavasti. Käyttämällä RT-PCR osoitimme, että mitä kauemmin

BMCC1-1

isoformi – kuten

pCA3

– ylössäädellään PCA kudosten ja etäpesäkkeitä ja PCA solulinjoissa. Lisäksi

pCA3

ja

BMCC1-1

tasot reagoivat dihydrotestosteroni hoitoon.

Johtopäätökset /merkitys

lisääntymisen merkkejä kahden uuden pCA3 isoformia PCA kudoksissa paranee syrjiä PCa ja BPH. Toiminnallinen merkitystä tämän spesifisyys on nyt erityisen kiinnostava tietyn

pCA3 n

päällekkäin yhdessä toisen geenin

BMCC1

, säätelijänä Rho signalointi. Säätelyä

pCA3

ja

BMCC1

PCA on mahdollisuudet parantaa diagnoosin.

Citation: Clarke RA, Zhao Z, Guo AY, Roper K, Teng L, Fang ZM , et ai. (2009) Uudet Perimän rakenne eturauhassyövän Erityiset Gene pCA3 sisällä BMCC1: vaikutukset eturauhassyövän Detection ja Progression. PLoS ONE 4 (3): e4995. doi: 10,1371 /journal.pone.0004995

Editor: Baohong Zhang, East Carolina University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 marraskuu 2008; Hyväksytty: 05 helmikuu 2009; Julkaistu 25 maaliskuuta 2009

Copyright: © 2009 Lavin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitusta tarjoamat Australian National Health ja Medical Research Council ja Cancer neuvoston Queensland. Zhongming Zhao tukee NIH avustus (LM009598) National Library of Medicine, Thomas F. ja Kate Miller JEFFRESS Memorial Trust Fund, ja Institutional Research Grant IRG-73-001-31 American Cancer Society. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisimmin diagnosoitu sisäinen syöpään miehillä ja toiseksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien. Etiologia PCa on epävarmaa ympäristön, hormonaalisten ja perinnöllisistä tekijöistä sekaantunut. Aloittaminen Eturauhassyövän (ts. Muodostamalla histologisesti tunnistettavissa leesio) on yleinen tapahtuma, että se havaitaan ruumiinavauksessa sarjan lähes kolmannes miehistä yli 45-vuotiaana [1]. Onneksi suurin osa näistä vaurioista ei edetä kliinisesti merkittäviä kasvaimia. Kuitenkin potilailla, joilla on kliinisesti havaittu tauti ja joiden katsotaan olevan niiden kasvain lokalisoitu eturauhasen, välillä 15% ja 40% on levitetty tauti, ei tunnistettavissa nykyisten kuvantamismenetelmiä, joille ei tällä hetkellä ole parantavaa hoitoa. Diagnoosi eturauhassyövän (maasta eturauhasen koepaloja) aloitetaan tavallisesti jälkeen liittyy seerumin mittauksia eturauhasen spesifisen antigeenin (PSA), proteiini erittyy normaalisti nimenomaan eturauhasen epiteelisolujen muodostamiseksi komponentin huudahtaa. PSA ei ole testi syövän ja ei ole olemassa rajaa taso tämän entsyymin tarjota suuri herkkyys ja spesifisyys, joissa on jatkumo riskin kaikkien PSA-arvot [2]. Kohonnut seerumin PSA niin usein sitoutuu miehiä invasiivisen ja epätarkka menettely transrectal ultraäänellä (TRUS) opastettu koepaloja [3], [4]. Toinen syyte rajoituksista PSA PCA havaitseminen on epäsuhta TRUS koepala havaintojen ja jotka tulevat eturauhasen entisen alle nimittely patologian [5].

parantamiseksi havaitsemiseen ja hoitoon PCa, tutkimukset on ollut käynnissä tunnistaa geenien aloittamista ja taudin etenemistä. Perinnöllisistä tekijöistä katsotaan suurempi rooli synnyssä Eturauhassyövän kuin missään muussa maligniteetti. Genominen laajuinen yhdistys tutkimukset ja kandidaattigeenifragmenttikloonien näytöt osoittavat, että perintö liittyy useita pieniä yhdistyksiä valtaosa jotka eivät ole tiedossa lisäksi mahdollisesti monimutkaisia ​​epigeneettiset tai geeni-geeni vuorovaikutusta. [6] – [12]. Differential näyttö tekniikkaa on käytetty menestyksekkäästi tunnistamaan muutoksia geeni-ilmentymisen liittyy siirtymistä normaalista kasvain, joka sisältää geenien rasva-signalointi ja aineenvaihduntaa; rasvahappojen synteesi; solusyklin säätelyssä; soluadheesiota ja strooman sääntely; angiogeneesi; ionikanavan sääntely, ja signaalitransduktion [13], [14]. Käyttämällä ero näyttö Bussemakers et al [15] tunnistaneet cDNA, myöhemmin nimeltään eturauhasen syöpä antigeeni 3 (

pCA3 /DD3

), joka oli yläreguloituja 53 56 prostatasyövistä verrattuna hyvänlaatuisen eturauhasen kudosta.

pCA3

geeni (25 kb – kuvio 1A), joka on eri tavalla saumatut, on tiheä lopetuskodonit kaikissa lukukehyksessä että ehdotettu se oli ei-koodaava RNA (ncRNA). Lisäksi ei ollut mitään näyttöä ilmentymisen pCA3 proteiini [16]. Säätelyä suuret ~ 2 kb

pCA3

transkriptio, mikä sulkee pois eksonin 2 (kuvio 1A), osoitettiin olevan herkkä ja spesifinen markkeri diagnoosia Eturauhassyövän [15], [16]. Ilmaisu polyadenyloidun transkriptien

pCA3

ehdotettu, että se voi olla toiminnallinen rooli, joka on tuettu jossain määrin sen lokalisoinnin tumaan ja epäonnistuminen voidaan havaita sytoplasmassa [16]. Tähän mennessä ei ole mitään merkitystä syövän on kuvattu

pCA3

mutta on ehdotettu, että se voi toimia geenin ilmentymisen säätelemiseksi tai osallistua geeninsiirrot [16]. ncRNAs on äskettäin löydetty yllättävän runsaasti, joilla on uusia luokkia ja odottamattomia roolit välittävä evoluutio, järjestämällä kromosomi verkkotunnuksia, chromatin remontin ja transkription säätelyyn (sekä aktivoinnin ja vaimennus) [17], [18]. Sen lisäksi, että

pCA3

, välistä vertailua hyvänlaatuinen eturauhasen hypoplasia (BPH) ja PCa näytteet osoittivat 14 51 muiden ncRNAs, jotka ilmentyvät differentiaalisesti myös yläreguloituja PCa [19], [20]. On myös hyvin tunnettua, että luokan hyvin pieniä ncRNAs tunnetaan MikroRNA muuttuvat eri kasvaintyypeissä ja voivat toimia onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille [19], [21], [22].

(A ) Osittainen

pCA3

geenin rakenne alun perin raportoinut Bussemakers et al. [15] 4 eksonia (avoimet laatikot ~ ei mittakaavassa) kanssa vaihtoehtoisen silmukoinnin eksonin 2 ja kolmen varajäsenen transkription terminaatiokohtia eksonin 4 5 ’RACE kokeita (täydennyskuvio. S1) tunnistaa 4 novel

pCA3

transkriptionaloituskohdat (isoformit 1-4 merkitty pystysuora nuolet osoittavat alaspäin nukleotidisekvenssin alla sijaitsee 1150 emäsparia, 699 emäsparin, 640 emäsparin ja 136 bp ylävirtaan alkuperäisestä aloituspaikan (nimettiin tässä isoformin 5). 3 ’RACE tunnisti neljä uutta polyadenylaa- sivustoja (yhteensä 7 *), joka sijaitsee eksonissa 4 koko eksoni 1 on laajennettu alkuperäisestä 120 bp 1270 bp. isoformi 4 (

PCA3-4

) on eniten ilmaistuna neljä uusien isoformit. Neljä päällekkäin ORF aloittaa yhdestä ”ATG” aloituspaikan (pystysuora nuoli osoittaa ylöspäin) sisällä

PCA3-4

ja päättyvät yksi vaihtoehtoisesti liitettyjä eksonit (2a tai 2b tai 2c) tai eksonissa 3 . (B) RT-PCR-monistus BPH PCA ja PCa etäpesäkkeiden näytteitä alukkeena eteenpäin sisällä romaani

PCA3-4

transkription aloituskohdasta ja käänteinen aluketta novel eksonista 2a. (C) Täydellinen rakenne

pCA3

geeni. Varjostus tunnistaa vasta tunnistettu alueilla

pCA3

geeni, joka on 6 eksonit kanssa vaihtoehtoisen silmukoinnin eksonin 2a (93 bp) ja eksonin 2 b (93 bp) ja eksonin 2 c (alkuperäinen eksoni 2, 165 emäsparia). ja (D) RT-PCR-monistus pCA3 käyttäen samaa forward-aluketta ja reverse-aluketta päässä uusi eksoni 2b ja (E) RT-PCR-monistus pCA3 käyttäen eteenpäin aluketta

PCA3-5F

(sisällä alkuperäinen transkription aloituskohdasta) ja käänteinen aluke ulottuu eksonit 1 ja 3 [15].

jotta ymmärtää edelleen, kuinka tärkeää on

pCA3

geeni PCA suoritimme enemmän yksityiskohtaista tutkimusta tämän geenin ja sen kromosomilokuksen. Tämä tutkimus viittaa huomattavasti monimutkaisempi transkriptionaalinen yksikkö

pCA3

kuin alun perin raportoitu [15], [16] kuten ylimääräisiä romaani eksonit. Kuvaamme useita uusia

pCA3

silmukoitumisvariantit tarkempia ilme PCA kudosten ja etäpesäkkeitä. Osoitamme myös, että

pCA3

on upotettu intronin toisen geenin,

BMCC1

, geenin osallisena säätelyssä onkogeenisen transformaation [23] ja että molemmat geenit osoittivat lisääntynyttä ilmentymistä PCa ja etäpesäkkeitä .

tulokset

tunnistaminen uusien pCA3 selostukset ja kokemusta PCa

puuttuminen TATA elementti ihmisen geenin promoottori on liittynyt siveetön transkription aloittamisen.

pCA3

geeni ei sisällä ylävirtaan TATA-sekvenssin ja sen vuoksi oli kiinnostavaa määrittää, onko muita transkriptionaloituskohdat olemassa

pCA3

(kuvio 1A, yläosa). Suoritimme 5 ’RACE käyttäen PCa kudosta ilmentäviä

pCA3

etsimään uusia aloituspaikkoja.

Tämä lähestymistapa osoitti, että eksoni 1 on 1150 emäsparin pidempi kuin aiemmin on raportoitu (nyt 1270 bp) ja sisältää 4 novel transkription aloituspaikkoja (täydennyskuvio. S1 Fig. 1A, alaosa). Nämä uudet transkription aloituspaikkoja sijaitsevat 1150, 699, 640 ja 136 emäsparin (kutsutaan

pCA3

isoformit 1-4, vastaavasti) ylävirtaan aikaisemmin raportoitu käynnistyspaikkaa

pCA3

[15]. Alkuperäinen transkriptio on kutsutaan tässä

pCA3

isoformin 5 (

PCA3-5

). Läsnäoloa enää transkriptien kasvaimissa oli kääntäen verrannollinen transkriptin pituus (tuloksia ei esitetty). Transkriptiota novel aloituskohdasta 4 (

PCA3-4

), rinnakkain välittömästi alavirtaan FP2 sisältävä alue 3

SRY

konsensus sitoutumiskohtia (täydennyskuvio. S2), oli merkittävästi korkeampi kuin muut kolme ylävirran aloituskohdat arvioituna qPCR (tuloksia ei esitetty). Transkription aloituskohdasta 1 (

PCA3-1

) havaittiin 5 ’RACE vain muutamia näytteitä.

suorittaa 3′ RACE tutkia enempää monimutkaisuus 3’päähän transkriptin. Neljä ylimääräistä polyadenylaatiokohtia havaittiin käyttämällä 3′-RACE-jolloin kokonaismäärä polyadenylaatiokohtia seitsemän, joka sijaitsee nukleotidin 411, 542, 873, 1583, 1600, 2146 ja 3545 vastaavasti eksonin 4 (Fig. 1A, alempi osa). Niistä 4 ylimääräistä polyadenylaatiopaikat vain kaksi liittyi määritelty polyadenylaatiosignaalisekvenssit, AATAAA ja ATTAAA vastaavasti. Havaitsimme, että alukkeena eteenpäin perustuu uuteen sekvenssiin (

PCA3-4) B yhdessä käänteisen Primeri eksoni 2 erittäin tehokkaasti monistaa

pCA3

PCA (7/8) ja etäpesäkkeitä näytteitä (7/8), mutta ei havainnut

pCA3

BPH näytteistä (0/8) (kuvio 1 B). Kliiniset tiedot näistä potilaista annetaan Täydentävä taulukossa S1. Nämä alukkeet ei vain monistettu cDNA-fragmentti odotettu koko (265 emäsparia), mutta myös 2 suuremman molekyylipainon koko bändejä joissakin näytteissä (kuvio 1 B, täydennyskuvio. S3). Ylimääräinen juovat leikattiin irti geelistä ja sekvensoitiin paljastaa läsnä oli 2 uusia

pCA3

eksonia sekä 93 bp koko (kuvio 1C). Nämä kaksi eri tavalla saumattu eksonia (2a ja 2b), joilla on bona fide konsensus liitoskohdat päistään olivat niiden ilmentyminen varmistettiin RT-PCR-monistuksella käyttäen uusia eksonin spesifisiä alukkeita monistaminen

pCA3

käyttäen PCA3-4F aluketta yhdessä aluketta, joka vastasi eksonia 2a havaitaan 5/8 PCa ja 4/8 metastaattisen näytteet ja jälleen tarjosi erinomaiset syrjintä BPH (kuvio 1 D). Samanlaisia ​​tuloksia osoittaa käyttäen PCA3-4F ja reverse-aluketta ja eksonissa 2b (tuloksia ei esitetty). Tämä parantaa käytöstä alkuperäisen alukesettiä palveluksessa Bussenmakers et al [15], joka havaitsi myös vähemmän voimakas signaali useimmissa BPH tapauksissa on ilmeistä saadut here (Fig. 1 E). Tunnistaminen eksonien 2a ja 2b tuo 6 kokonaismäärä

pCA3

eksonit (Fig. 1 C). Nämä tulokset osoittavat, että useita uusia selostukset

pCA3

ilmentyvät eri PCA.

nukleotidijaksoanalyysi tunnistettu neljä otaksutun ORF aloittamista yhdestä ATG sijaitsee 54 nukleotidin sisällä romaani

PCA3- 4

isomuodon (kuvio 1A, alaosa). Ensimmäinen näistä, 70 aminohappoa (aa) pitkä, laajennettu kautta eksonit 1 ja 4 aa osaksi romaani eksoni 2a. Toinen, 82 aa pituinen laajennettu kautta eksonin 1, ohitetaan eksonin 2a, ja laajennettu 16 aa osaksi eksoni 2b. Kolmas, 76 aa pituudeltaan, myös pidentää ottamalla eksonia 1, ohitetaan eksonit 2a ja 2b ja laajennettu 10 aa osaksi eksonin 2c. Neljäs, 73 aa pituudeltaan, myös pidentää ottamalla eksonia 1, ohitetaan eksonit 2a ja 2b ja 2c ja laajennettu 7 aa osaksi eksonissa 3. Nämä ORF aloittaa 83 nukleotidia ylävirtaan alkuperäisestä transkriptin (

PCA3-5

) ovat kuvanneet Bussemakers et al. [15] ja ei olisi voitu ennustaa aikaisemmissa analyyseissä alkuperäisen transkriptin joita ei havaittu merkittävää ORF. On kiinnostavaa määrittää, ovatko nämä ORF koodaa proteiineja.

pCA3

on upotettu introni 6

BMCC1

geeni

Ymmärtää parempi läheinen korrelaatio

pCA3

geeniekspressiotasot ja eturauhassyöpää tutkimme kehitystä ja organisaatio

pCA3

geenilokukseen (kuvio 2A). Käytimme

pCA3

mRNA-sekvenssin (3923 emäsparia, AF103907) ja etsi homologisia sekvenssejä muissa genomien. Käyttäminen sulku E-arvo 1 x 10

-4 BLAST haku merkittäviä osumia löytyi vain nisäkkäiden genomeja. Eksoni 4 on kaikkein konservoituneen alueen geenin. Yksi segmentti (403 emäsparia) eksonissa 4 löydettiin kaikki käytettävissä olevat nisäkkäiden genomit (evolutiivinen säilyneitä alue- (ECR_ex4c nuolella B kuvioissa 2B ja 3A Arrow ”A” (ECR_in1, 277 bp) on erittäin konservoitunut ei-koodaava sekvenssi, jossa 91%: n samankaltaisuutta ihmisen ja opossumin, joka on sijoitettu introni 1

pCA3

; Arrow ”B” (ECR_ex4c, 403 emäsparia) ECR sijoitettu

pCA3

eksoni 4, joka on konservoitunut kaikissa nisäkkäiden ja näyttää olleen keskipisteenä lineaarisen kehityksen

pCA3

-geenin (katso Fig. 3); Arrow ”C” (361 bp) on kaikkein erittäin konservoitunut ECR (konservoitunutta ei-koodaava sekvenssi 99% samankaltaisuus ihmisen ja opossumi) sisällä

BMCC1

(introni 6) välittömästi alavirtaan

pCA3

.

Kaksi mRNA-sekvenssit (AB050197 ja BC019095) alun perin selityksin ylävirtaan ja alavirtaan

pCA3

. Nämä kaksi mRNA-sekvenssit yhdistettiin äskettäin ja selityksin kahtena isoformia

BMCC1

geeni (kutsutaan myös

PRUNE2

, NCBI Gene ID: 158471). Näiden kartoitus paikkoihin,

pCA3

geeni sijaitsee introni 6 pidemmän

BMCC1

isoformin 1 (

BMCC1-1

). Tämän vahvistaa etsittiin

pCA3

sekvenssit muualla ihmisen perimän ja saatu vain yksi osuma, joka juuri jäljittelee oikean

BMCC1

geenilokuksesta.

BMCC1

geeni on ~295 kb pituudeltaan ja on vastakkainen geeni suunnan

pCA3

. Viimeaikaiset ilmaisu tutkimukset osoittavat, että

BMCC1

käsittely on monimutkaisempaa kuin aluksi ajateltiin ja käsittää neljä varianttia isoformia, joita ei täysin selityksin päälle NCBI (Build 36,2). Kuva. 2A havainnollistaa rakenteellinen suhde

pCA3

ja

BMCC1

geenejä.

BMCC1

isoentsyymiselektiivisiä 2 (

BMCC1-2 /PRUNE2-2 Twitter /BC019095 /NM_138818) käsittää ensimmäisen 6 eksonia

BMCC1

kuin annotated päälle NCBI (Build 36,2) .

BMCC1-2

päättyy välittömästi ennen

pCA3

geeni. Isoformi-3 (

BMCC1-3 /BMCC1 Twitter /ABO50197) raportoimat Machida et al. [23] ei ole päällekkäinen

BMCC1-2

vaan käsittää 13 erillistä eksonia (eksonit 7-19) on sijoitettu välittömästi alavirtaan

pCA3

. Transkription aloituspaikan isoentsyymiselektiivisiä 4 (

BMCC1-4 Twitter /KIAA0367 /BNIPXL /AY43213) raportoimat Soh ja alhainen [24] sijaitsee edelleen alavirtaan toisen eksonin on

BMCC1-3

. Isoformi-1 (

BMCC1-1 /PRUNE2-1 Twitter /NM_015225) toisaalta, on hiljattain laskennallisesti kehitetyn referenssin geeni, joka käsittää 19 eksonia (NM_015225) johdettu sulautuvat

BMCC1-2

ja

BMCC1-3

ja joka oli tähän saakka puuttunut täyden transkriptio tukea. Tässä käytimme RT-PCR-alukkeet kattavat

BMCC1-2

ja

BMCC1-3

(Fig. 2A) ja nukleotidisekvenssin analyysi (tuloksia ei esitetty) todennettava, että

BMCC1-1

otteen ja vahvisti sen ilmentymistä PCA kudoksissa (katso Fig. 4A). Suurempi koko

BMCC1-1

on sopusoinnussa myös -12 kb mRNA-transkripti tunnistettiin Machida et al. [23].

pCA3

paikantaa sisällä intronin 6 (~110 kb) on

BMCC1-1

.

pCA3

edustaa noin 25 kb tämän intronin mutta se on päinvastainen suunta on

BMCC1

. Kolme BMCC1 proteiini-isoformit BMCC1-1 (3088 aa – NM_015225), BMCC1-3 (2724 aa) [23] ja BMCC1-4 (769 aa) [24] on eri koodaus aloituspaikat, mutta kaikki kolme ovat in- runko ja sisältää alavirran BCH koodaus verkkotunnus.

(A) Vista juoni näyttää konservoituneen rakenteet

pCA3 geenin

. Vain kädelliset näyttää olevan täydellinen

pCA3

geeni. Kaksi evoluution säilyneitä alueita jakavat

BMCC1

ja

pCA3

(kts. 2B)

ovat nuolella

(nuoli A ~ ECR_ex4c ja nuoli B ~ ECR_in1). Molemmat ecrs näkyvät konservoituneet nisäkkäillä (identiteetti 90%). ECR_in1 on myös läsnä tässä sivuston kanaa ja lisko muttei kalan, sammakon, tai selkärangattomien. (B) ECR_ex4c näyttää polttovälin lineaarisen kehittyvän rakenne

pCA3

. (C) Yhteenveto nisäkkäisiin

pCA3

eksonit jakaa Suojeluarvoiltaan verrattuna ihmisen. Geeni rakenne huomautus perustui Bussemakers et al. [15]. Taso säilyttämisen

pCA3

eksonit aikana nisäkkäiden evoluution kasvaa 3 ’→ 5’ perustuu läsnäolo mielekästä ecrs kussakin eksonissa. Tarkka identtisyys täydellistä eksonin ihmisen ja muiden lajien esitetään Täydentävä taulukossa S2. On tärkeää huomata, että ei ole ECR päässä

pCA3

eksonien havaittiin ei-nisäkäslajeista tässä analyysissä.

cDNA valmistettiin potilaan kudosnäytteistä, kuten kahdeksan BPH, PCa tai PCa etäpesäkkeitä, vastaavasti, käytettäväksi seuraavissa PCR-reaktioissa. (A). RT-PCR suoritettiin BPH PCA ja etäpesäkkeitä (MET) eri sarjaa alukkeita

pCA3

ja BMCC1 Ylärivi;

BMCC1-2

RT-PCR: llä käyttäen eteenpäin-aluketta ja

BMCC1

eksoni 5 (BMCC1-Ex5F) ja reverse-aluke on spesifinen pidennetylle muodossa eksonin 6 (BMCC1-Ex7R) ainutlaatuinen

BMCC1-2

toinen rivi;

BMCC1-1

erityisiä RT-PCR: llä käyttäen alukkeita

BMCC1

eksonissa 6 (BMCC1-Ex6F) ja eksonia 7 (BMCC1-Ex7R). 3. rivi;

BMCC1

-BCH aluekohtainen RT-PCR: llä käyttäen alukkeita BCHF ja BCHR. 4. krs;

pCA3

monistettiin (35 sykliä) alukkeilla spesifisiä

pCA3

isoformi 5 eksonia 1 (PCA3-5F ja Ex1 /3R pohjamaali). 5

nnen rivin; β

2microglobulin kontrolli-PCR (B). RT-PCR vertaileva ilmentymisen analyysi

pCA3

,

BMCC1-1

ja

BMCC1

-BCH alueella ALVA41, DU145, LNCaP ja PC3 eturauhassyövän linjat, RPWE1 normaalin eturauhasen solulinja, JHP ohjaus lymfoblastoidisolulinjaan, RM654 lymfoblastoidisolulinjaan potilaalta, jolla AOA2 ja MCF7 rintasyöpä solulinjassa. RT-PCR suoritettiin kanssa alukesarjoja spesifinen

pCA3

isoformin 5 (PCA3-5F) ja eksonin 1/3 (Ex1 /3R) ja

BMCC1-1

ja

BMCC1

-BCH alueella, kuten edellä. (C) Semi-kvantitatiivinen PCR-analyysi

pCA3

ja

BMCC1-1

ilmentymistä LNCaP solulinjassa vastauksena dihydrotestosteroni. Tulokset normalisoitiin suhteessa tasoja β

2microglobulin. Neljä soluviljelmiä ruokittu seerumin 2 päivää ennen inkubointia dihydrotestosteroni (ug /ml). Tulokset normalisoitiin ja ilmaistaan ​​keskiarvona kertainen lisäys verrattuna ilmentymisen taso ennen hoitoa. Virhe palkit ovat keskihajonnat ja p-arvot määritettiin vertaamalla käsittelemättömiä näytteitä käyttäen Studentin t-testiä.

Onko BMCC1 geeni ollut valinta?

Koska

pCA3

on upotettu tai sisäkkäin

BMCC1

oli kiinnostavaa tutkia evoluution muutoksia tämän geenin. BLAST hakuja paljasti, että

BMCC1

homologit ovat läsnä nisäkkäillä, kanaa ja lisko muttei Afrikkalainen sammakko, kalaa tai selkärangattomien (kuvio 2B). Käytimme VISTA ohjelmisto suorittaa globaali linjaus

BMCC1

homologi geenejä. Linjaus Kuviossa 2B osoittaa, että

BMCC1

vain konservoitunut ihmisen ja koiran /hiiri lukuun ottamatta useita erittäin konservoituneiden ECR jotka ulottuvat ihmisen ja lisko (myös nuolet A ja C kuvassa. 2B ).

Nämä ECR sijaitsevat pääosin välillä

BMCC1

introni 6 ja eksonin 9 (myös

pCA3

). Vertasimme aminohapposekvenssejä perustuu ihmisten ja simpanssien

BMCC1-1

CDS sekvenssit. Yhteenlaskettu aminohappo pituus on 3088 (ihmisen) ja 3089 (simpanssi). Kun olemme linjassa ihmisen ja simpanssin sekvenssit, löysimme 40 ei-synonyymejä mutaatioita ja 21 synonyymi mutaatioita. Koko alueen suhde ei-synonyymejä yli synonyymi korvannut (dN /dS) on 0,90. DN /dS suhde on suurempi kuin 1 koodausalueen usein ehdottaa positiivinen valinta. Eksonin 8 on pisin eksonin

BMCC1

ja on 6598 emäsparin, joka koodaa 2199 aminohappoa. Löysimme suurin osa ei-synonyymejä mutaatiot ovat eksonissa 8 ja joka määrää ei-synonyymejä mutaatioita [25] on lähes kolme kertaa suurempi kuin synonyymi mutaatioita [12]. DN /dS suhde oli 1,38, mikä viittaa äskettäin positiivisen valinnan tällä osa-alueella. Lisäksi huomasimme, että 39 40 ei-synonyymi substituutioiden

BMCC1

geeni olivat eksonien 8 ja 9, joissa oli vain 14 synonyymi vaihdot. Oli vain yksi korvaaminen, joka on synonyymi, eksonissa 7. Kun tutkimme eksonit 8-9 tai eksonit 7-9, me johdonmukaisesti havaittu, että dN /dS suhde oli suurempi kuin 1 (eksonit 8-9, 1,30; eksonit 7 -9, 1,22), mikä viittaa positiivisen valinnan lähialueella

pCA3

.

pCA3

syntynyt nisäkkäiden ja äskettäin kehittynyt kädellisillä

pCA3

ei ole niin hyvin säilynyt nisäkkäillä kuin

BMCC1

ja ei havaittu aikaisemmin jyrsijöillä [15]. Voit selvittää alkuperän

pCA3

vertasimme

pCA3

geenisekvenssien eri lajeissa. Suoritimme globaali linjaus 15 nisäkkäiden

pCA3

ortologeihin. Kuva. 3A näyttää VISTA juoni konservoituneiden alueiden sisällä

pCA3

geenialueen. Yksityiskohtaisempi VISTA juoni keskittyy

pCA3

eksonien 2-4 annetaan kuvassa. 3B. Kuten on kuvattu,

pCA3

-geeni on erittäin konservoitunut kädellisillä. Esimerkiksi, kun verrataan ihmisen

pCA3

sekvenssi, kaikki neljä eksonisekvenssit ja suurin osa intronisekvenssien neljän kädellisillä on korkea identtisyys ihmisen (Fig. 3A).

Comparison sekvenssin säilyttäminen näistä 15 nisäkkäiden, paljasti viivakuvio muutoksen suhteessa nämä neljä eksonia aikana nisäkkään evoluution. Eksoni 4 on ylivoimaisesti suurin eksonin (3454 bp) ja vertailun vuoksi eksoni 4 on jaettu (5 ’→ 3’) otetaan 3 alueilla [a, b ja c, jotka vastaavat kolmea terminaatiokohtia kuvanneet Bussemakers et al. [15]. ECR_ex4c, konservoitunutta segmentti eksonin 4c kuvattu aiemmin (osoitettu nuolella B kuvassa. 2B ja Fig. 3) näkyy kaikissa 15 nisäkkäillä mukaan lukien opossumi, joka on out-ryhmä 14 eutherians. Vaikka opossum on vain tämä yksi konservoitunut alue suhteessa 4

pCA3

eksonit, jyrsijät ovat 1-2 pieni ylimääräinen ecrs eksonissa 4b (Fig. 3A ja 3B). Eksoni 4a ilmestyi ensimmäinen kani. Eksoni 3 havaittiin elefantti, Tupaijat, lehmä, koira, sika, hevonen, ja kaikilla kädellisillä, muttei kani, jyrsijät, tai opossumi. Mukaan VISTA tontin mielekäs eksoni 2 on läsnä vain sika, hevonen ja kaikkien kädellisten (Fig. 3B).

Lopuksi eksoni 1 on läsnä kädellisten vain (Fig. 3A). Tämä lineaarinen evoluution kuvio geenin muodostumisen on koottu kuvioon. 3C jossa tulokset viittaavat siihen, että: (1) jäänteitä

pCA3

geeni syntyi nisäkkäillä; (2) nämä jäänteitä jälkeen tehtiin lineaarikuvion evoluution: eksonin 4c → eksoni 4c /4b → eksoni 4c /4b /4a → eksonit 4/3 → eksonit 4/3 /2 → eksonit 4/3/2/1; ja (3)

pCA3

näyttää kypsyä kädellisillä kaikkien jakaminen täysi eksonien (Fig. 3C). Tarkka identtisyys jokaisen täydellisen ihmisen

pCA3

eksonit verrattuna muiden lajien esitetään Täydentävä taulukossa S2.

BMCC1 ylössäädellään PCA ja androgeenien indusoituvia

Koska

pCA3

ylössäädellään PCA ja koska osoitimme tässä, että tämä geeni on upotettu toisen geenin

BMCC1

, sekaantuneet soluproliferaatioon päätimme onko

BMCC1

oli myös säädellään eri tavalla PCA. Käytimme joukko RT-PCR-alukkeita, jotka ulottuvat että alue

BMCC1

geeni (eksonien 6 ja 7), joka on spesifinen täyspitkän

BMCC1-1

transkriptio. Expression of

BMCC1-1

näkyi normaalissa eturauhasessa ja BPH yksilöitä ja sen yläreguloituja PCa ja etäpesäkkeitä (kuvio 4A, täydennyskuvio. S4). Tämä vahvistettiin käyttämällä alukkeita, jotka vastaavat BCH C-terminaalinen alue BMCC1 ja BMCC1-2. Itse vahvistusta tämän isoformin antoi paremman syrjiä PCa ja BPH (Fig. 4A, yläpaneeli). Laajentaminen Näissä kokeissa PCA ja muut solulinjat osoitti, että molemmat geenit olivat erittäin ilmaistaan, erityisesti PCA LNCaP (Fig. 4B). Lisäksi

BMCC1-1

havaittiin toisessa PCa solulinjassa DU145 mutta alemmilla tasoilla.

pCA3

ilmenee myös DU145 mutta vaaditaan jatkoneuvottelukierrosten vahvistus havaitsemiseen. Lyhyempi

BMCC1

isoformeja (

BMCC1-3

ja /tai

BMCC1-4

) havaittiin myös (käyttämällä alukkeita, jotka ovat spesifisiä BCH alue) kanssa EBV-transformoituja lymfoblastoidisolulinjassa (JHP), mutta pidempi

BMCC1-1

isoformi ei havaittu (kuvio 4B). Aiemmat tiedot ovat osoittaneet, että taso

pCA3

voidaan indusoida LNCaP-soluissa hoidon jälkeen dihydrotestosteroni, joka jäljittelee vaikutuksia sitovat androgeenireseptorin (DHT) [16]. Me määrittää, onko

BMCC1-1

oli myös reagoivien hormonaalista induktion. Tulokset on esitetty. 4C osoittaa, että molemmat

pCA3

ja

BMCC1

ovat maksimaalisesti indusoituu LNCaP solulinjassa pitoisuutena 0,5 mM DHT.

Keskustelu

Olemme paljasti täällä useita uusia havaintoja varten

pCA3

biomarkkereiden geeni, joka on dramaattisesti upregulated PCA. Bussemakers et ai. [15] oli aiemmin osoittaneet, että

pCA3

koostui 4 eksonista ja että erilaiset transkriptit nousi johtuen vaihtoehtoisen silmukoinnin eksonin 2 ja läsnäolo 3 polyadenylaatiopaikat eksonissa 4. Tuloksemme osoittavat, että transkription yksikkö

pCA3

on huomattavasti monimutkaisempi kuin tämä. Lisäksi transkription aloituskohdasta raportoineet Bussemakers et al. [15] olemme tunnistaneet 4 ylimääräistä transkription aloituspaikkoja ulottuu vastavirtaan yli 1 kb, mikä lisää kokoa eksonin 1-1,27 kb. Selostukset aloittamista näitä uusia sivustoja ilmentyvät eri kanssa lyhyempi isoformi 4 (

PCA3-4

) korkeammin ilmaistuna PCA ja etäpesäkkeitä. Schalken et ai. [16] vahvistettiin, että fragmentti 500 bp välittömästi ylävirtaan alkuperäisestä transkription aloituskohdasta (kuvataan tässä

PCA3-5

) on kaikki kriittiset aktivaattori ja repressori sivustot ajaa

pCA3

ilme . Meidän kuvaus ylimääräisiä

pCA3

käynnistää sivustoja edelleen ylävirtaan kaksi lyhyempää isoformia (

PCA3-4

ja

PCA3-5

) sisältyy osana laajempaa transcriptome ja että se on todennäköistä, että muut ohjauselementit olemassa edelleen vastavirtaan. Tämä järjestely transcriptome ei ole uusi, koska monien geenien on järjestetty monimutkainen päällekkäisiä ja lomitettu kuviot eukaryoottisissa genomien [26]. Kyseisessä raportissa ohittaminen mekanismit vedotaan käsittelyyn 3’päähän transkriptio. Tämä voi olla myös tapauksessa 5′-päässä. Kuvaamme myös 2 uutta erilaisesti saumattu eksonit (eksonit 2a ja 2b)

pCA3

jotka sijaitsevat välillä eksonissa 1. ja alkuperäinen eksonin 2 (nyt eksoni 2c) [15]. [16]. [16].