Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

geenejä, jotka koodaavat rasvahapon desaturaasien (FADS1, 2, 3), paikallistaa syövän genomisen hotspot 11q13-lokuksen tarvitaan biosynteesiin 20 hiili- monityydyttymättömiä rasvahappoja (PUFA), jotka ovat suoria eikosanoidituotannon esiasteita. Useissa syöpäsolulinjoilla, FADS2 koodattu Δ6 ja Δ8 desaturaatioaika ei toimi.

Menetelmät /Principal Havainnot

Analysoidaan MCF7 solujen rasvahappoja yksityiskohtaisia ​​rakenteellisia massaspektrometrialla, osoitamme, että ilman FADS2 toimintaa, FADS1 tuote Δ5-desaturaasia toimii tuottaa 5,11,14-20:3 ja 5,11,14,17-20:4. Nämä PUFA puuttuvat 8-9 kaksoissidos eikosanoidituotannon signaloinnin esiasteiden arakidonihappoa (5,8,11,14-20:4) ja eikosapentaeenihapon (5,8,11,14,17-20:5). N heterologinen ilmentyminen FADS2 palauttaa Δ6 ja Δ8-desaturaasin aktiivisuutta ja normaaliin eikosanoidin esiaste synteesiä.

Johtopäätökset /merkitys

häviäminen FADS2-koodattu toiminta syöpäsoluissa sammuttaa normaalia PUFA biosynteesiä, poistamalla endogeeninen tarjonta eikosanoidin ja loppupään docosanoid esiasteita, ja korvaamalla ne epätavallinen butyleeni-keskeytyy rasvahappoja. Jos toisteta

in vivo

, normaali eikosanoidituotannon ja docosanoid soluviestitykseen miljöö olisi tyhjentynyt ja muuttaa vähenemisen ansiosta ja korvaaminen normaali substraattien epätavallinen substraattien arvaamattomia seurauksia matkapuhelinjärjestelmä.

Citation : Park WJ, Kothapalli KSD, Lawrence P, Brenna JT (2011) FADS2- Toiminto Hukka Cancer hotspot 11q13 Locus Siirtää Lipid Signaling esiasteet Synthesis epätavallisiin eikosanoidi Rasvahapot. PLoS ONE 6 (11): e28186. doi: 10,1371 /journal.pone.0028186

Editor: Daniel Tomé, Paris Institute of Technology for Life, Elintarvike- ja ympäristötieteiden laitos, Ranska

vastaanotettu: 16 syyskuu 2011; Hyväksytty: 02 marraskuu 2011; Julkaistu: 30 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Park et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Useat ihmisen sytogeneettisten ja hieno kartoitustutkimuksesta on PIN- terävä HSA 11q13-lokuksen merkittävänä hotspot useita ihmisen syövistä [1], [2], [3], [4], [5]. Lukuisat geneettisiä mekanismeja on raportoitu, mukaan lukien 11q13 poistot, Heterotsygotian menetys, translokaatioita ja alleeliset vahvistus [3], [5]. Rasvahappo desaturaasi klusteri (FADS), geenien koodaama

FADS1

,

FADS2

, ja

FADS3

, paikallistaa sisällä 100 kb alue ihmisen kromosomissa 11q12-13.1 [ ,,,0],6], [7]. FADS2- ja FADS1 koodaavat kriittisiä entsyymejä pitkäketjuisia monityydyttymättömiä rasvahappoja (LCPUFA) biosynteesiin käyttöön kaksoissidoksia välillä erityisiä hiiliatomia. Omega-3 (ω3 tai n-3) ja omega-6 (ω6 tai n-6) PUFA ovat keskeisiä ravintoaineita liittyy useimpien sairauksien ihmisten, erityisesti sydän- ja verisuonitautien (CVD), syöpä, diabetes ja metabolinen oireyhtymä, ja ne ovat ratkaisevia rakennekomponentit hermokudoksen [8], [9]. LCPUFA DGLA (20:3n-6), ARA (20:4n-6), EPA (20:5n-3) ja DHA (22:6n-3) ovat esiasteita soluviestitykseen eikosanoidien ja niiden muutosten biosynteettisillä estämällä loppupään aineenvaihdunta ovat erittäin arvokkaita lääkekohteita esimerkiksi syklo-oksigenaasin ja lipoksigenaasin estäjien, ja viime aikoina docosanoids jotka ovat lääkekandidaatteina [10].

FADS2 koodattu Δ6-desaturaasi katalysoi ensimmäinen ja nopeutta rajoittava vaihe biosynteesin LCPUFA. Useissa syöpäsolut desaturation ei tapahdu, mikä voi johtua inaktivaatio desaturaasin tai alkupään (esim CoA tuotanto) tai alavirtaan (esim asyylitransferaasilla) vaiheita. Syynä vika on ehdotettu olla seurausta laajasta kromosomihäviämiä, mutta ei molekyyli todisteita on saatavilla [11], [12]. Δ8-desaturaation substraattien 20:2n-6 ja 20:3n-3 havaitaan usein, mikä viittaa siihen, että venymä vaihe on toiminnallinen [12], [13]. Viime aikoihin asti, Δ8-desaturation alustoille 20:2n-6 ja 20:3n-3 oli yleisesti pidetään dead-end-tuotteita, vaikka ne löydetty ihmisen plasmasta ja punasolujen sekä muita kudoksia. Osoitimme ensimmäinen molekyyli todisteita siitä, että FADS2 katalysoi Δ8-desaturation molemmilta substraattien, mikä vaihtoehtoinen reitti LCPUFA biosynteesiä nisäkkäillä, jossa ne muunnetaan eikosanoidin esiaste LCPUFA [14]. Tämä reitti voi olla käytettävissä, kun Δ6-desaturaasin aktiivisuutta vaarantuu.

epätavallinen menetyksen PUFA desaturaasin aktiivisuutta useissa syöpäsolujen sai meidät oletuksen, että ensisijainen vika asuu desaturaasi sinänsä, eikä muualla esimerkiksi aktivoituminen PUFA mukaan CoA synteesi tai synteesiin fosfoglyseridit vastaanottajina ja orastavan LCPUFA. Olemme vahvistaneet, että ihmisen rintasyövän MCF7-solut eivät omaa mitään valmiuksia biosynteesiä LCPUFA takia puuttumisen Δ6-desaturaasin aktiivisuus [12]. Tässä osoitamme palauttaminen tämän metabolisen vian, jonka heterologinen ilmentyminen FADS2, näyttöä uusia substraatin spesifisyyttä FADS1 välistä kilpailua FADS1 ja FADS2 saman substraattien, johtaen epätavallisen LCPUFA, jotka eivät ole substraatteja eikosanoidien tuotantoa.

tulokset ja keskustelu

FADS2- ja FADS1 transfektoitiin ohimenevästi MCF7-solut tutkittiin todisteita bioaktiivisuuden kohti 18:2n-6 ja 18:3n-3. FADS2- transfektoidut solut osoittivat aktiivisuutta sekä alustoista; kaasukromatografia-kovalenttinen addukti-kemiallinen ionisaatio tandem-massaspektrometrialla (GC-CACI-MS /MS) vahvisti uudet piikit voidaan 18:3n-6 ja 18:4n-3 (kuvio 1). Kuten odotettua, tuotteita ei havaittu, kun joko 18:2n-6 tai 18:3n-3 inkuboitiin FADS1 ja tyhjän vektorin valvontaa. Nämä tiedot ovat ensimmäisiä yksiselitteisesti molekyyli todisteita siitä, että metabolinen vika näissä soluissa voidaan palauttaa korvaamalla nopeutta rajoittava Δ6-desaturaasientsyymiä koodaama FADS2-.

V: Ei Tuotteen nähdään FADS1-transfektoiduissa soluissa. B: FADS2 transfektoituja soluja Δ6-desaturate 18:2n-6 → 18:3n-6 (9,12-18:2 → 6,9,12-18:2) ja 18:3n-3 → 18:4n-3 (9,12,15-18:3 → 6,9,12,15-18:4).

Kun FADS1-transfektoituja soluja inkuboitiin 20:2n-6 ja 20:3n -3, CACI-MS /MS osoittaa vahvistuksen synteettistä toiminto tuottaa kaksi uutta buteeni-keskeytyy PUFA huiput: 5,11,14-20:3 ja 5,11,14,17-20:4, vastaavasti (kuvio 2) . Nämä kaksi LCPUFA ovat analogeja arakidonihappoa (5,8,11,14-20, 4) ja eikosapentaeenihapon (5,8,11,14,17-20:5), vastaavasti. Tuloksemme osoittavat, että oleellisesti ilman Δ8-desaturaasin aktiivisuutta (FADS2), The Δ5-desaturaasin (FADS1) toimii 20:2n-6 ja 20:3n-3. Δ6-desaturaatio (FADS2-) on yleensä noin 10 kertaa aktiivisempi kuin Δ5-desaturation (FADS1), joten on todennäköistä, että aikana solutransformaatiota FADS1 aktiivisuuden jatkuisivat kun FADS2- on aktiivinen. Kuitenkin edullinen substraatit FADS1 eivät ole välttämättömiä rasvahappoja (18:2n-6 ja 18:3n-3), mutta niiden murtovenymä tuotteet 20:2n-6 ja 20:3n-3. FADS1 toimii näiden substraattien tuottaa epätavallisia buteeni-keskeytyy hiili tuotteiden ja tulokset osoittavat, että nämä harvinaiset rasvahappoja voidaan valmistaa syöpäsoluissa. Tämä on ensimmäinen molekyyli todisteita, jotka osoittavat uusien FADS1 substraatin spesifisyyttä 20:2n-6 ja 20:3n-3-rasvahappoja. Lisäksi FADS2-transfektoidut solut osoittavat vakuuttavasti, että

FADS2-

geenituotteen Δ8-desaturoi 20:2n-6 ja 20:3n-3 20:3n-6 (DGLA) ja 20:4n-3 (ETA ) vastaavasti, mikä vastaa meidän tuloksia hetero- transformoitu hiiva [14].

V: FADS1-transfektoidut solut Δ5-desaturate 20:2n-6 → 5,11,14-20:3 ja 20:3n- 3 → 5,11,14,17-20:4. B: FADS2 transfektoituja soluja Δ8-desaturate 20:2n-6 → 20:3n-6 ja 20:3n-3 → 20:4n-3.

Lisäksi, vaikka on tunnettua, että molemmat n-3 ja n-6 PUFA alustoille kilpailevat samoilla entsyymeillä, nykyinen tietojen FADS1 ja FADS2- kilpailevat samoista substraattien (kuva 2). Net seuraus on korvata inaktiivisen 5,11,14-20:3 ja 5,11,14,17-20:4 ARA (5,8,11,14-20:4) ja EPA (5, 8,11,14,17-20, 5), tässä järjestyksessä, jossa arvaamattomia seurauksia eikosanoidin välittämä solu-solu paracrine signalointi. Dysregulaatio eikosanoidien signaloinnin liittyy kasvaimen kehitys, angiogeneesin ja metastaasin eläinmalleissa [15]. Kaksoissidos asemassa 8 vaaditaan cyclooxygenase (COX), lipoksigenaasin (LOX) ja tromboksaani biosynteesiin, ja siten puuttuminen kaksoissidoksen asemassa 8 tekee 5,11,14-20:3 ja 5,11,14, 17-20:4 aktiivinen substraatteina biosynteesin useimpien eikosanoidien [16], [17], [18]. Lisäksi, mahdollinen toiminta buteeni-keskeytyy PUFA kilpailevina inhibiittoreina ja eikosanoidien biosynteettisten entsyymien on tuntematon, sillä on aktiivisuus muiden keskeisten eikosanoidien synteettisiä entsyymejä (esim sytokromi P450), jonka toiminta on normaalia osien epätavallinen rasvahappojen johtaisi tuotteiden tuntematon activit (t).

villityksiä geenejä, jotka koodaavat entsyymejä tarvitaan PUFA biosynteesiin nousi evoluutiossa mukaan geenikahdennustapahtuman tapahtumia. Huolimatta keskeinen merkitys FADS2 ja menetys sen toiminta useissa syöpäsolujen molekyyli yksityiskohtia ja seurauksia FADS2 menetys ei ole kuvattu eikä tutkittu. FADS2 tiedetään olevan aktiivisuutta vähintään seitsemän substraatteja (18:2n-6, 18:3n-3, 20:2n-6, 20:3n-3, 24:4n-6, 24:5n-3, 16: 0). Menetys FADS2-koodattu toiminta syöpäsoluissa täysin sammuttaa klassisen ja vaihtoehtoisten PUFA väyliä, poistamalla eikosanoidin ja docosanoid esiaste biosynteesissä päässä kasviperäisen PUFA linolihapon ja linoleenihapon ja rajoittaa siten solu-solu signalointi (kuva 3). Monissa tutkimuksissa on todettu vahva yhdistysten välillä yhden emäksen monimuotoisuus sisällä FADS geenin klusterin ja monimutkainen fenotyyppien liittyvien kroonisten sairauksien, sekä pitkäketjuisia PUFA tasoilla [19], [20]. Lisätutkimuksia tarvitaan ymmärtää täysin seuraukset FADS geenien toiminnan menetys ja /tai modulaatio perustuu SNP kasvain. Varhaiset tutkimukset osoittivat, että mikro-soluvälitteistä siirto HSA11 osaksi MCF7 soluihin vähennetään tuumorigeenisyyteen, viittaavia mahdollisten tuumorisuppressorigeeneille tässä kromosomissa [21].

Δ6- ja Δ8-desaturation vaiheet ovat poissa MCF7, joka johtaa Δ5-desaturaatio 11,14-20:2 jotta 5,11,14-20:3 kun FADS1 on toimiva. Analogisen väyliä n-3 LCPUFA muuntaa 11,14,17-20:3 → 5,11,14,17-20:4 (ei esitetty). FADS2- uskotaan myös olla mukana C22 LCPUFA biosynteesissä (ei kuvassa).

tulokset osoittavat, että ensisijainen molekyyli vika MCF7-soluissa sijoittuu FADS2 aiheuttava geeni menetyksiä FADS2-koodattuja Δ6-desaturaasia aktiivisuutta. Korvaus FADS2- toimintoon FADS1 johtaa tuotannon 5,11,14-20:3 ja 5,11,14,17-20:4, molemmat pääasiassa umpikujaan rasvahappo tuotteita, jotka eivät voi olla esiasteita useimmille eikosanoidien ja ovat todennäköisesti kilpailevat inhibiittorit. Fysiologinen merkitys butyleeni keskeytynyt PUFA syöpäsoluissa vaatii edelleen yksityiskohtainen tutkimus. Nykyinen tulokset antavat sysäyksen paremmin ymmärtää roolin rasvahapon desaturaasien, erityisesti FADS2 tuumorisuppressorina in kasvainhäiriöt.

Materiaalit ja menetelmät

Plasmidivektori rakentaminen

proteiinia koodaavan sekvenssit FADS1 (GenBank # EF531577) ja FADS2- (GenBank # EU780003) kloonattiin pcDNA3.1 ekspressiovektoriin käyttäen cDNA vastasyntyneelle paviaanin maksakudosta. CDNA saatiin kallisteta otetuista näytteistä tutkimuksesta hyväksymästä Cornell University Institutional Animal Care ja Käytä lausunnon (IACUC, protokolla # 02-105). Analyysi ja vertailu aminohapposekvenssin paviaani FADS1 osoitti 95% identiteettiä ja 97% positiivisia ihmisen FADS1 (AF084558), kun taas, paviaani FADS2 osoitti 98% identiteettiä ja 99% positiivisia ihmisen FADS2 (NM_004265). Aiemmin olemme osoittaneet uusia Δ8-desaturation funktion paviaani FADS2- [14].

MCF7 soluviljelmissä ja rasvahappojen

transfektiokokeis- MCF7-soluja kasvatettiin MEM-α median 10 % Lipid vähennetty FBS (media ja seerumi saadaan HyClone) 37 ° C: ssa kostutetussa ympäristössä, jossa 5% CO

2. Ihmisen rintasyövän MCF7-soluja (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD) oli ystävällinen lahja Dr. Rui Hai Liu, Cornell University. FADS1 ja FADS2 rakenteet transfektoitiin MCF7-soluihin käyttämällä Lipofectamine LTX (Invitrogen, USA) kohti valmistajan suositusten mukaisesti. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen MCF7-solut, jota oli täydennetty 100 uM albumiiniin sitoutuneen 18:2n-6, 18:3n-3, 20:2n-6 ja 20:3n-3-rasvahappojen ja inkuboitiin vielä 24 tuntia.

Rasvahappoanalyysi

inkuboinnin jälkeen rasvahappojen kanssa, solut pestiin kaksi kertaa 1x PBS: lla ja poistettiin trypsinoinnilla. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla ja solupelletti käsiteltiin rasvan uuttamiseen. Rasvahapon metyyliesteriä Valmistus suoritettiin käyttämällä modifioitua yhden askeleen menetelmän Garces ja Manchan [22]. Analyysi oli kaasukromatografialla-liekki ionisaatiodetektiota (GC-FID) [8] ja huippu tunnistus varmistettiin GC-kovalenttinen adduktin kemiallisen ionisaation tandemmassaspektrometrian (GC-CACI-MS /MS) [14], [23].