Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tausta ja menetelmät

Pim-proteiinit ovat onkogeenisten kinaasien osallisena useiden syöpätyyppien ja osallistuvat säätelyyn solujen lisääntymistä, eloonjääntiä sekä liikkuvuutta. Tässä olemme tutkineet kyky Pim kinaasien edistää metastaattista kasvua eturauhassyöpäsolujen kaksi ksenograftimalleissa ihmisen eturauhasen syöpä. Olemme myös arvioitiin tehoa Pim-selektiivisiä antagonisoida näitä vaikutuksia.

Tulokset

Osoitamme tässä, että kasvaimia aiheuttavasta kasvu sekä ihon alle ja ortotooppisesti ympättiin eturauhassyöpäksenografteista on parannettu stabiili yliekspressio joko Pim-1 tai Pim-3. Lisäksi Pim yli-ilmentäviä potilaalle tehdä eturauhasen kasvaimet ovat hyvin invasiivisia ja voi siirtyä ei vain lähellä eturauhasen tyhjennys imusolmukkeet, mutta myös keuhkoihin muodostaa etäpesäkkeitä. Kun ksenosiirrettyjä hiiriä päivittäin käsitelty Pim-selektiivinen DHPCC-9, sekä määrältään sekä metastaattisen kapasiteetti kasvaimet ovat huomattavasti vähentynyt. On mielenkiintoista, että Pim-edisti metastaattista kasvua potilaalle tehdä ksenografteista liittyy parannettu angiogeneesiin ja imusuonten. Lisäksi, pakko Pim ilmentyminen lisää myös fosforylaation CXCR4-kemokiinireseptorin, joka voi mahdollistaa kasvainsolujen siirtyä kohti kudoksissa, kuten keuhkoissa, jotka ilmentävät CXCL12 kemokiinin ligandi.

Päätelmät

tulokset osoittavat, että Pim yliekspressio parantaa invasiivisia ominaisuuksia eturauhassyöpäsolujen

in vivo

. Näitä vaikutuksia voidaan vähentää Pim-selektiivinen DHPCC-9, joka voi nousta tuumorikudoksista ilman vakavia sivuvaikutuksia. Siten Pim kohdistus hoitojen DHPCC-9 kaltaisia ​​yhdisteitä voi estää etenemisen paikallisten eturauhasen karsinoomien ja kuolettavasti etäpesäkkeistä syöpää.

Citation: Santio NM, Eerola SK, Paatero I, Yli-Kauhaluoma J, Anizon F, Moreau P, et ai. (2015) Pim-kinaasien edistää Migration ja Metastasoitunut kasvu eturauhassyöpäksenografteissa. PLoS ONE 10 (6): e0130340. doi: 10,1371 /journal.pone.0130340

Academic Toimittaja: Jeffrey K. Harrison, University of Florida, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 20 marraskuu 2014; Hyväksytty: 19. toukokuuta 2015 Julkaistu: 15 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Santio et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki Suomen Akatemia (avustus 121533 ja PJK myöntää 269541 PH), TULI ohjelma Turun yliopiston (PJK), Sigrid Juseliuksen säätiö (PH), FinPharma tohtoriohjelman (NMS), Emil Aaltosen säätiö (NMS), Cancer Järjestöt Länsi Suomen (NMS), Orion-Farmos tutkimussäätiö (NMS), Suomen Kulttuurirahasto (NMS), Turun yliopisto Foundation (SKE), ja Walter och Lisi Wahls Stiftelse för Naturvetenskaplig Forskning (JYK). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Johanna Tuomela työskenteli Pharmatest Services Ltd ajaksi tutkimuksen aikana. Pharmatest ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen merkitys JT on nivelletty ”kirjoittaja maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: Johanna Tuomela työskenteli Pharmatest Services Ltd ajaksi tutkimuksen aikana. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen, tai markkinoille tuotteita julistaa. Tämä ei muuta JT noudattaa hänelle kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Pirkko Härkönen on PLoS One toimitusneuvosto jäsen, mutta tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

pim

perhe geenejä tunnistettiin ensin provirus- integrointi sivustoja Moloneyn [1], mutta on myöhemmin osoitettu olevan osallisena inhimillisen imukudoksen maligniteettien sekä kiinteitä kasvaimia [2]. Proteiinit, joita koodaavat kolme

pim

perheen geenit ovat seriini /treoniini-erityisiä kinaaseja, jotka on osoitettu edistävän tuumorigeneesiin lisäämällä sekä leviämisen ja solujen eloonjääntiä [2,3]. Viime aikoina olemme ja muut ovat myös sekaantuneet niitä sääntelyssä maahanmuuton ja invaasion tarttuneiden syöpäsolujen [4-6], kun taas tulokset kliiniset tutkimukset osoittavat yhdistyksen poikkeuksellisen runsaasti Pim-kinaasien enemmän pahanlaatuisia syöpiä epiteelin alkuperä [7 -9].

koska niiden kehittyvien roolien syövän kehittymisessä, Pim-kinaasien on tullut erittäin houkutteleva terapeuttisina kohteina [10-12]. Myös fysiologisia ja rakenteellisista syistä perustella Pim kinaasien huumeiden tavoitteita. Ensinnäkin, inaktivointi Pim-kinaasien ei odoteta aiheuttavan vakavia sivuvaikutuksia, koska hiirissä, joilta puuttuu kaikki kolme Pim perheenjäsenet ovat elinkelpoisia [13]. Toiseksi ainutlaatuiset rakenteelliset ominaisuudet sisällä sarana-alueen, joka yhdistää N- ja C-terminaalista lohkoa ympäri ATP-sitova tasku tekevät Pim-kinaasien konstitutiivisesti aktiivisia ja mahdollistaa suunnittelun erittäin selektiivisiä [14]. Olemme viime aikoina tunnistettu tehokas ja selektiivinen Pim estäjät kahden rakenteellisesti etuyhteydettömältä yhdisteryhmissä tetrasyklisiä pyrrolokarbatsoleilla [15] ja trisyklisiä bentso [

cd

] atsuleenit [16]. Olemme myös toiminnallisesti validoitu niitä sekä

in vitro

ja Soluperäisissä analyyseissä [6, 17].

tuumoriksenografteja tarjoavat erinomaiset fysiologiset asetukset prekliinisissä proof-of-concept-tutkimukset, sekä tunnistaa hoitotavoitteet ja arvioida

in vivo

yhdisteiden tehokkuuden kohdistaminen niitä. Ihonalainen rokotus PC-3 syöpäsolujen yli-ilmentävät joko Pim-1 tai Pim-2 osaksi immuunivajaisiin hiiriin on aiemmin osoitettu johtavan suurempien kasvaimia [18], mutta vertailukelpoisia tietoja Pim-3 on puuttunut kuin myös suoraa näyttöä varten kyky Pim-kinaasien edistää muodostumiseen etäpesäkkeitä. Silti tietoa solupohjaisille liikkuvuutta määrityksiä sekä kliinisiä tietoja yhteyden säätelyä Pim-kinaasien syövän solujen vaeltamiseen, invaasiota ja pahanlaatuisten käytös [4-9]. Lisäksi Pim-1: n on osoitettu säännellä CXCR4 /CXCL12 kemokiini-reitin, jolla on tärkeä rooli siirtolaisuuden ja hyökkäys molemmat leukeemisten [4, 19] ja syöpäsolujen [20-23].

tässä tutkimuksessa olemme arvioineet vaikutuksia Pim-kinaasien ja niiden estäjiä käyttäen sekä ihonalainen ja potilaalle tehdä hiiri ksenograftimalleja ihmisen eturauhassyövän. Osoitamme, että yli-ilmentynyt Pim-1 tai Pim-3-kinaasien edistää paitsi kasvua PC-3-soluista peräisin ksenografteissa, mutta myös metastaattisen ominaisuuksia ortotooppisesti tuumoreita, ja että Pim-inhiboivia yhdisteitä voidaan estää näitä vaikutuksia. Lisäksi osoitetaan, että Pim-edistänyt metastaattista kasvua liittyy lisääntynyt angiogeneesiin, imusuonten ja CXCR4 fosforylaatiota.

Tulokset

Pim-3 kinaasi parantaa kasvua ja metastaattisen ominaisuudet eturauhassyöpäksenografteissa

tutkimiseksi kyky Pim-3 edistää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden kohdassa

in vivo

olosuhteissa, loimme vakaa PC-3 /Pim-3 eturauhassyöpäsolulinja ilmentävät ihmisen Pim-3 yhdessä tomaatti kuten fluoresoiva seuranta merkki. Jotta arvioida Tuumorigeenisuustutkimuksissa PC-3 /Pim-3 solulinja verrattuna valetransfektoidun PC-3 ohjaus solulinjan soluja inokuloitiin subkutaanisesti kateenkorvattomiin nude uroshiirillä. Aikana seuranta-ajan, enintään 24 päivän ajan, kasvainten tilavuudet mitattiin molemmissa paksuus ja loisteputki kuvantaminen tomaatin ilmaisua. Lopettamisen jälkeen kasvaimet ja kudosnäytteet leikattiin irti ja fluori ja morfometristä analyysejä. Nämä paljastivat, että Pim-3-yliekspressoivia ksenografteissa olivat kasvaneet huomattavasti nopeammin kuin mock-transfektoituja soluja, vaikka kasvaimet olivat edelleen paikallisia ilman merkkejä etäpesäkkeiden (kuvio 1A ja 1B). Manuaalisesti mitattu kasvainten korreloi alueet määritellään loisteputki kuvantaminen (S1 Kuva). Analysoida edelleen kasvua ominaisuuksia näistä kasvaimista, mitoottiset solut värjättiin peräisin parafinoidut kudosnäytteistä. Mielenkiintoista, osuus mitoosi soluissa oli selvästi suurempi Pim-3-yliekspressoivassa tuumorikudoksista kuin kontrolleissa (kuvio 1 C ja S1 kuviossa). Erot kasvaintilavuudet voidaan myös havaita koko kasvaimen skannaa käytetään analyysiin mitoosi solujen (S1 kuvio). Samanaikaisesti ihonalainen kokeissa soluja viljeltiin kolmen viikon ajan ilman antibioottiselektiota vahvistaa vakautta Pim-3 yliekspressio (S1 kuvio).

PC-3-solulinjojen, jotka oli stabiilisti transfektoitu tyhjällä vektori (C) tai vektorina, joka ekspressoi Pim-3 (P3) on ihon alle tai ortotooppisesti injektoidaan kateenkorvattomiin nude-hiiriin. Kasvaimet ja eristetyt kudokset värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla visualisointiin niiden rakennetta. Muihin värjäykset suoritettiin anti-fosfo-histoni H3 vasta-aineen määrän visualisoinnin mitoottisten solujen. Ihonalainen kokeissa kasvaimen muodostumisen jälkeen fluoresenssin kuvantamisen tomaatin ilmentymisen (A) ja arvioitu kasvainten koot mitattiin tunnustelu eri aikapisteissä (B). Jälkeen 24 päivää, hiiret tapettiin ja niiden kasvaimet ja kudokset kerättiin. Esitetty ovat keskiarvoja kaikki täysin kuvattavan kasvaimen osastoja merkitty numerot (

n

) hiirten värjäyksen jälkeen mitoosi-solut (C). Kun potilaalle tehdä kokeita, stabiili PC-3-solujen annettiin kasvaa prostates kolme viikkoa. Sen jälkeen mitoosi soluissa (ruskea) analysoitiin näytekuvat (D), kun taas etäpesäkkeitä (merkitty nuolilla) laskettiin eturauhasen tyhjennys imusolmukkeiden ja keuhkojen (E).

Koska ihonalainen ksenografteja oli ei hyökkäsi kehoon, jatkoimme tutkimuksia, joiden potilaalle tehdä eturauhassyöpä malli, jossa kasvain mikroympäristön odotettiin olevan myönteisempi metastaattista kasvua [24-26]. Ensimmäisessä pilotti koesarjaa, ohjaus- tai Pim-3-yliekspressoivia soluja ortotooppisesti istutettiin prostates nude uroshiirillä. Kasvaimen kasvu seurasi aikana kolmen viikon ajan, jonka jälkeen eläimet tapettiin ja kasvaimet yhdessä valittujen elinten kerättiin. Tässä tutkimuksessa ei ole suuria eroja kasvainten havaittiin. Kuitenkin analyysi parafinoidut kudosnäytteistä paitsi paljasti suurempi mitoosi potentiaalin Pim-3-yli-ilmentävät solut, mutta myös niiden kyky tunkeutua keuhkoihin (kuvio 1 D ja 1 E). Sitä vastoin lievempi metastaattisen käyttäytymistä valetransfektoiduista säätökennoja vahvisti aikaisemmat havainnot siitä, pystyvätkö vanhempien PC-3-solujen hyökätä osaksi eturauhanen-tyhjennys imusolmukkeet, mutta harvoin kauempana elimiin [25-26].

Pim esto on siedetty zebrafish alkioiden ja aikuisten hiirten

lupaavia tuloksia invasiivisen Pim-3-yliekspressoivia potilaalle tehdä kasvaimet sai meidät suorittamaan toisessa koesarjassa, jossa testasimme myös vaikutuksia Pim eston jonka tetracyclic pyrrolokarbatsoleja DHPCC-9 [6] ja trisyklisiä bentso [

cd

] atsuleeni BA-1a [17]. Vertailun vuoksi myös perustettu toinen vakaa PC-3 solulinja yliekspressoivia ihmisen Pim-1.

Ennen eläinkokeiden, tehoa ja myrkyllisyyttä Pim-selektiivisiä testattiin soluun perustuvissa määrityksissä ja

in vivo

. Molemmat inhibiittorit tehokkaasti antagonisoi pro-muuttavien vaikutusten Pim-1 ja Pim-3, ja vähentynyt migraatio kaikki stabiilien solulinjojen samassa määrin (S2 kuvassa). Sisällä 24 h seurannan aikana haavan paranemista määrityksen, solujen elinkelpoisuuden häiriintyi vain hieman, kun taas molemmat estäjät vähentänyt dramaattisesti sen kaikissa solulinjoissa myöhemmällä 72 h ajan pisteen. Kun

in vivo

turvallisuuden estäjien analysoitiin zebrafish alkiot niiden vesiympäristöön sekä DHPCC-9 ja BA-1a olivat hyvin siedettyjä, kun taas meidän sytotoksinen ohjaus yhdiste BA-2c [17] johti massiivista kehityshäiriöitä ongelmia ja kuolema (S3 kuvassa ja S1 taulukko). Kuitenkin hieman kaareva hännät ja laajentuneen perikardiaalisen pusseja havaittiin alkioiden käsitellään 10 uM DHPCC-9 (S3 kuvassa), mikä viittaa siihen, että asianmukainen Pim toimintaa tarvitaan normaalia sikiön kehitystä. Kuitenkin nämä tiedot eivät anna luotettavaa päätelmät turvallisuudesta estäjien aikuisten organismeihin.

Turvallisuutta testit suoritettiin sitten aikuisten hiirillä. Kuitenkin suuria pitoisuuksia tarvitaan näitä testejä, vain DHPCC-9 voi keskeyttää DMSO, kun taas BA-1a oli liukoinen ainoastaan ​​N, N-dimetyyliasetamidissa (DMA).

alkuvaiheen kymmenen päivän seurantajakson aikana, DHPCC-9 hoitojen (50 mg /kg) ei aiheuttanut merkittäviä muutoksia hiiri käyttäytymisen, imeytysalueen tai paino (S4 kuvio). Sitä vastoin, DMA-hoitoja (25 mg /kg) aiheutti rauhaton käyttäytyminen ja väheni hieman kehon paino. Lisäksi DMA näytti aiheuttavan arpikudoksen muodostumista pistoaluetta. Sen jälkeen, turvallisuuden testaus jatkettiin pienempiä määriä DMA (10-20 mg /kg), joka ei aiheuta näkyviä muutoksia pistosalueen hiiren käyttäytyminen tai painonnousu aikana 17 päivän seurannassa (S4 kuvio). Näiden tulosten perusteella, 50 mg /kg DHPCC-9 20 ul: aan DMSO: ta ja 20 mg /kg BA-1a 10 ui DMA päätettiin käyttää päivittäin testata niiden vaikutuksia potilaalle tehdä Pim-3-yli-ilmentäviä eturauhasen ksenografteissa.

Pim esto vähentää Pim riippuvan metastaattista kasvua potilaalle tehdä eturauhasen ksenografteissa

toinen joukko potilaalle tehdä kokeita, valetransfektoidun PC-3-solujen tai solujen vakaasti yli-ilmentävät Pim-1 tai Pim -3 olivat ortotooppisesti istutettiin prostates nude uroshiirillä. Hiiret, joissa Pim-3-yliekspressoivia ksenograftit satunnaistettiin 4 ryhmään ja annettiin päivittäin annoksia estäjien tai yhtä suuret tilavuudet DMSO tai DMA verrokkeina. Hiiren käytös ja painonnousu seurasi kokeen aikana, mutta ei suuria estäjä liittyviä muutoksia ei havaittu (S5 kuvio). Lopettamisen jälkeen kasvaimet leikattiin irti ja hiiret ilman kasvaimia jätettiin jatkotutkimuksiin (S2 taulukko). Vahvistaa vakautta solulinjojen,

ex vivo

skannaus suoritettiin havaitsemiseksi Tomato signaaleja kasvaimet (S6 kuvio), kun taas immunohistokemia visualisoida ksenosiirrettyjä ilmentävien tuumorisolujen Pim proteiinien V5-merkityt konstruktit ( S7 Kuva).

Kun kasvainten tilavuudet laskettiin, Pim-yliekspressoivia kasvaimet olivat jälleen merkittävästi suurempia kuin muodostetaan mock-transfektoiduissa soluissa (kuvio 2A ja 2D). Kuitenkin Pim-1 -ksenografteja ei voida suoraan verrata muihin, koska hiiret kuljettaa ne eivät ole saaneet mitään kemiallisia hoitoja. DHPCC-9 käsittely vähensi merkittävästi volyymin Pim-3-yli-ilmentävät kasvaimet, mikä viittaa siihen, että tämä yhdiste oli pystynyt saavuttamaan kasvainkudoksen ja estävät Pim-3 toimintaa siellä (kuvio 2B ja 2D). Sen sijaan, BA-1a ei ilmennyt mitään tehoa vähentämisen kannalta kasvaimen tilavuus (kuvio 2C ja 2D). Ilmeisesti tämä yhdiste ei ollut saavuttanut kohdekudokseen, kuten myös ehdotti läsnäolo keltainen sakka injektiokohdassa.

PC-3-johdettuja stabiilisti transfektoiduissa soluissa (Mock = C, Pim-1 = P1, Pim-3 = P3) on ortotooppisesti istutettiin prostates Kateenkorvattomien nude-hiirten. Hiiriä hoidettiin päivittäin joko DMSO: ssa tai DMA: ta (kontrolli hoidot) tai Pim estäjien (50 mg /kg DHPCC9 DMSO tai 20 mg /kg BA-1a DMA). Sen jälkeen, kun kolmen viikon hoidot, hiiret tapettiin ja niiden kasvainten tilavuudet mitattiin. Ensin volyymit verrattiin toisiinsa merkitty numeroita (

n

) hiirten ilman estäjää hoidot (A). Sitten määriä kasvaimia, jotka ovat peräisin estäjä-hoidettujen eläinten verrattiin kasvaimia eläimistä, valvotaan asianmukaisesti hoitoja DMSO (B) tai DMA: ta (C). Ennen kasvain kiinnitys, edustavat kuvat on otettu (D). Myöhemmin parafinoidut kasvaimen leikkeet värjättiin anti-fosfo-histoni H3 vasta-aine visualisoida mitoottisia soluja (ruskea). Esitetty ovat keskiarvoja yhdistetty kaikki täysin kuvata kasvaimen kudososat DHPCC-9-käsiteltyjen ja DMSO tai DMA-käsiteltyjen kontrolliryhmien sekä edustavan kuvia Pim-3-yli-ilmentäviä kasvaimia (E).

mitoosi hinnat mitattiin myös alkaen kudosleikkeiden johdettu potilaalle tehdä kasvaimia. Kun taas ihonalaisen kokeita ja ensimmäiset potilaalle tehdä kokeita, olisi ollut selvästi enemmän mitoosi oleviin soluihin muodostama Pim-3-yli-ilmentävät solut verrattuna mock-transfektoiduissa soluissa (kuvio 1 C ja 1 D), toisessa potilaalle tehdä sarja erot olivat pienempiä (kuvio 2E). Kuitenkin hoito DHPCC-9 oli vähensi mitoosi solujen Pim-3-ksenografteissa (kuvio 2E).

Koska Tomato johdettu fluoresenssi ei ollut tarpeeksi vahva selvästi paljastaa mikrometastaasien (S6 kuviossa), histologiset analyysit tehtiin kudososat munuaisissa, pernassa, maksassa, keuhkoissa sekä eturauhasen tyhjennys imusolmukkeet. Värjäyksen jälkeen hematoksyliinillä ja eosiinilla, etäpesäkkeitä haettiin eri kudosnäytteistä, mutta erityisesti imusolmukkeisiin ja keuhkoihin. Kiehtovan, kun taas yli puolet valetransfektoidun ja useimmat Pim-1 tai Pim-3 ksenografteissa olisi voinut etäispesäkkeitä eturauhaseen-tyhjennys imusolmukkeet, vain Pim yli-ilmentäviä soluja olivat tunkeutuneet niin pitkälle kuin menee keuhkoihin (Kuva 3A- 3C, S3 taulukko). Vielä kiinnostavaa, DHPCC-9 käsittely oli tehokkaasti esti muodostumista etäpesäkkeiden molemmissa elimissä. Sekä metastasoitunut ja nekroottista alueilla mitattiin, mutta ei ollut selkeä yhteys Pim aktiivisuutta (S6 kuvio), mikä viittaa siihen, että kun etäpesäkekasvainten muodostuu, kasvain solut voivat hankkia muita ominaisuuksia lisäksi Pim toiminnan tukemiseksi niiden kasvua.

eri elimiä kerättiin hiiristä, joilla ortotooppisten eturauhassyövän ksenografteissa muodostettu PC-3-solut stabiilisti yli-ilmentävät tyhjän vektorin (C), Pim-1 (P1) tai Pim-3 (P3). Parafinoidut kudosleikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla, ja niistä analysoitiin etäpesäkkeiden. Esitetyt tulokset edustavat kuvia (A) imusolmukkeesta ja keuhkojen kohdissa (kasvainsolut osoitettu nuolilla). Metastaattista ominaisuudet ksenograftien käsiteltyjen hiirien DHPCC-9, BA-1a tai niiden liuottimet analysoitiin myös. Näkyy ovat prosenttiosuuksia hiirten positiivisia joko imusolmukemetastaaseja (B) tai keuhkojen etäpesäkkeet (C) kussakin ryhmässä.

visualisoimiseksi verisuoniston potilaalle tehdä kasvaimet, verisuonet ja imusuonten värjättiin. Sen jälkeen, kun kvantitatiiviset analyysit, merkittävä kasvu havaittiin alueilla verisuonten per kasvain ksenografteissa muodostettu Pim yli-ilmentäviä soluja verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 4A). Hieman pienempiä eroja havaittiin myös alueilla imusuonten (kuvio 4B). Kuitenkin hoidon jälkeen Pim estäjän DHPCC-9, alueet sekä veri sekä imusuonten merkittävästi vähentynyt (kuvio 4A-4D).

angiogeenisen ominaisuudet potilaalle tehdä eturauhasen ksenografteissa (Mock = C, Pim-1 = P1, Pim-3 = P3) analysoitiin immunohistokemiallisella värjäyksellä parafinoidut kudosleikkeiden anti-CD34 (verisuonten) ja anti-m-Lyve-1 (imusuonten) vasta-aineita. Näkyy ovat keskimäärin alueita kaikkien analysoitiin veren (A) ja imusuonten (B) yhdessä edustavat kuvat (alusten ruskea) (CD) alkaen täysin kuvattavan kasvainkudossektioista.

Pim-1 ja Pim -3 parantaa fosforylaation ja ilmentyminen solun pinnalla CXCR4

CXCR4-kemokiinireseptorin proteiini on aikaisemmin liitetty PC-3 solujen vaeltamiseen ja vuorovaikutuksen endoteelisolujen [20-23]. Lisäksi hematopoieettisten solujen Pim-1: n on osoitettu fosfory- CXCR4 at Ser339, ja siten edistää ilmentyminen solun pinnalla CXCR4 ja sen vuorovaikutusta CXCL12 kemokiinin ligandin [4]. Lisäksi olemme aiemmin osoittaneet Pim estoa tai hiljentäminen tehokkaasti vähentää hyökkäys PC-3-solujen kohti MG-63 luusarkoomasolulin- kunnostetun alustan, jossa suurin kemoatrak- on CXCL12 [6, 23]. Selvittää Pim /CXCR4 vuorovaikutus on tärkeä rooli myös meidän eturauhassyöpäksenograftista mallia, ensin arvioinut oli eroja fosfory- tilan CXCR4 välillä stabiilit solulinjat. Western blottauksella, havaitsimme huomattava lisääntyminen Ser339-fosforyloitu CXCR4 tasot sekä Pim-yli-ilmentävät stabiilit solulinjat verrattuna kontrolliin-solulinjassa (kuvio 5A). Lisäksi lasku fosforyloidun CXCR4 tasoilla havaittiin hoidon jälkeen vanhempien PC-3-solujen kanssa Pim inhibiittorin DHPCC-9 (kuvio 5B).

fosforylaatio CXCR4 on S339 sekä Pim tasot analysoitiin western blotting tallissa Pim-1 (P1), Pim-3 (P3) tai kontrollivektorille (C) yli-ilmentäviä PC-3-solut tai emo PC-3 solulinja käsiteltiin 0,1% DMSO: ssa tai 10 uM DHPCC-9. On esitetty tulokset yhdestä edustavasta kokeesta lastaus valvontaa ja molekyylipaino (kDa) merkkiaineet (A-B). Kyky Pim perheenjäsenten fosfory- CXCR4

in vitro

analysoitiin inkuboimalla GST-merkitty Pim-1 (P1), Pim-2 (P2) tai Pim-3 (P3) proteiinit GST-fragmenttien, jotka villityypin (WT) tai Ser339 Ala (SA) mutantti ihmisen CXCR4. Fosforyloidut CXCR4 havaittiin fosfo (Ser339) -CXCR4 vasta-aineella ja proteiini lastaus Ponceau S värjäys. On esitetty tulokset yhdestä edustavasta kokeesta (C). Lokalisointi ja signaalin intensiteettiä fosforyloidun vs. yleinen CXCR4 ilmentyminen analysoitiin immuunifluoresenssivasta (IF) värjäys stabiilisti transfektoitujen solujen käsitelty joko 0,1% DMSO: ssa tai 10 uM DHPCC-9. Koe ohjataan rinnakkaista näytettä värjättiin ainoastaan ​​sekundaarisen vasta-aineen (-ab). Värjäykset toistettiin kahdesti ja pinot Kuvat on otettu konfokaalimikroskopiaa vähintään 30 solua näytettä kohti koetta kohti. Näkyy ovat signaalin voimakkuudet fosfo-CXCR4 värjäykset verrattuna yleiseen CXCR4 tasolle yhdessä edustajan kuvia fosfo-CXCR4 ja CXCR4 värjäykset (D-E). Fosforylaatiota ja paikallistaminen CXCR4 analysoitiin myös immunohistokemiallisella värjäyksellä parafinoidut kudososat orthopic eturauhasen kasvaimia. Näkyy on suhteellinen kasvu määrän fosfo-CXCR4-positiivisten solujen vs. yleinen CXCR4 ilmentyminen mitattuna koko kasvain skannauksen. PBS sijaan primaarista vasta-ainetta käytettiin negatiivisena kontrollina. Kuvat ovat otettu visualisoida erot fosfo-CXCR4 (tummanruskea) värjäykset (F).

Koska vakaa yli-ilmentymisen joko Pim-1 tai Pim-3 selvästi parannettu CXCR4 fosforylaatio, halusimme vertaamaan

in vitro

kaikkien kolmen Pim perheenjäseniä kohtaan CXCR4. Siksi me inkuboitiin GST-merkityn Pim proteiinit yhdessä GST-merkitty C-terminaalin 46 aa fragmentit CXCR4 (WT) tai sen mutatoitua S339A muodossa (SA), jossa seriinitähde on korvattu alaniinitähteellä. Kun

in vitro

fosforyloidun fragmentteja havaittiin anti-fosfo (Ser339) -CXCR4 vasta-, kävi ilmi, että sekä Pim-1 ja Pim-3, mutta ei Pim-2 voi fosforyloida CXCR4 Ser339 ( kuvio 5C). Samanlaisia ​​eroja havaittiin myös PC-3-solujen jälkeen ohimenevää Pim yliekspressio, kun taas Pim estäjä DHPCC-9 tehokkaasti esti CXCR4 fosforylaatiota siellä (S8 kuvio).

Tämän jälkeen suoritimme immunofluoresenssivärjäyksessä visualisoida lokalisoinnin CXCR4 proteiinin stabiili PC-3-solulinjojen, jotka oli käsitelty 24 h DMSO tai DHPCC-9. Vaikka CXCR4 ilmentyy kaikkialla, sen fosforyloitua hyväksymässä muodossa anti-fosfo (Ser339) -CXCR4 vasta-näyttöön lisää kalvoon liittyvä ilmaisu DMSO-käsiteltyjen näytteiden, vaan hajallaan ja heikompi sytoplasmista ekspressiota DHPCC-9-käsiteltyjen näytteiden (kuvio 5D ja 5E). Vaikka molemmat Pim-1 ja Pim-3 tehosti fosfo-CXCR4 signaaleja verrattuna yleiseen CXCR4 tasolle, Pim esto tehokkaasti pienentää niitä, jolloin myös hieman vahvempi ydin- ilmaus CXCR4 (kuvio 5D ja 5E).

analysoida rooli CXCR4 fosforylaation meidän

in vivo

kokeissa käytettiin immunohistokemia mitata suhteelliset määrät ortotooppisten eturauhaskasvainsoluissa positiivisia fosforyloidun CXCR4. Vertailu fosfo-CXCR4 signaalien keskimääräinen CXCR4 signaalit kunkin kasvaimen ilmi, että sekä Pim-1 ja Pim-3 oli huomattavasti suhteelliset määrät fosfo-CXCR4, kun Pim inhibitio DHPCC-9 oli laskenut se jopa alle havaittu taso että valetransfektoidun näytteistä (kuvio 5F). Kaikkiaan sekä

in vitro

ja

in vivo

tiedot viittaavat siihen, että kasvaimia yli-ilmentävät Pim-1 tai Pim-3 voi hyödyntää CXCL12 /CXCR4 kemokiinin polku levitä muihin elimiin, kuten keuhkoihin.

keskustelu

Tässä osoitamme, että PC-3 syöpäsolujen yli-ilmentävät joko Pim-1 tai Pim-3-kinaasien suuremmiksi ksenograftikasvaimissa kuin vanhempien PC-3-solut. Nämä tulokset ovat hyvin linjassa aiempien havaintojen kykyyn Pim-1 ja Pim-2 kasvun edistämiseksi PC-3-soluista peräisin ihonalainen eturauhassyöpävieraslajisiirteissä [18], kun taas tässä osoitamme, että Pim-3 on myös yhtä tehokas . Enemmän kiehtovan, kun ortotooppisesti ympättiin hiiren prostates, solut yli-ilmentävät Pim-1 tai Pim-3 on lisääntynyt kyky etäispesäkkeitä eturauhasen perustuvien kasvainten muihin elimiin, kuten keuhkoihin. Lisäksi yksi testatuista Pim-inhiboivia yhdisteitä, DHPCC-9, voi vähentää Pim riippuvainen kasvaimen kasvun sekä muodostumista etäpesäkkeiden ilman vakavia sivuvaikutuksia, viittaa siihen, että se pystyy tunkeutumaan kasvainsoluihin inaktivoimiseksi Pim kinaasien siellä.

Vaikka olemme aiemmin osoittaneet, että Pim kinaasit pystyvät edistämään liikkuvuutta eturauhassyöpäsolujen [6], esillä oleva tutkimus on ensimmäinen, osoittaa samanlaisia ​​vaikutuksia myös alle

in vivo

olosuhteissa . Tämä on kiinnostava, koska ortotooppisesti ympättiin PC-3-solujen on aiemmin osoitettu siirtyä eturauhasen paikalliseen eturauhasen tyhjennys oka ja suoliluun imusolmukkeet, mutta harvoin missään muualla [24-26]. Nämä havainnot vahvistettiin tutkimuksissamme, jossa metastaattista kasvua havaittiin eturauhasen tyhjennys imusolmukkeet useimpien kasvain kantavien hiirten. Kuitenkin vain Pim yliekspressoivia ksenografteissa pystyivät etäispesäkkeitä keuhkoihin, kun taas mitään etäpesäkkeitä havaittu muissa kerätystä kudoksesta.

Vastatakseen kasvaimia mekanismit ohjaavat Pim kinaasien ja vastusti Pim esto, kudosnäytteitä ensisijainen ksenograftikasvaimissa analysoitiin immunohistokemiallisesti merkkiaineista mitoosi toimintaa, angiogenicity ja invasiivisuus. Lievä Pim riippuvaisia ​​nousuja havaittiin osuus mitoosi soluissa ja aloilla imusuonten, kun taas merkittävämpi säätelyyn ylöspäin havaittiin muodostumiseen kasvaimen verisuoniston ja fosforylaatio ja ilmentymisen solun pinnalla CXCR4. Sen sijaan, kaikki nämä parametrit olivat voimakkaasti laski Pim-selektiivinen DHPCC-9. Siten nämä havainnot voidaan selittää paitsi tehostettua kasvainten kasvua yli-ilmentävät Pim-kinaasien, mutta myös metastasoituneeseen ominaisuuksia.

CXCL12 /CXCR4 kemokiinin reitti on välttämätöntä lymfosyyttiliikennettä ja erityisesti itseohjautuva hematopoieettisten kantasolujen luuytimen [19, 27]. Lisäksi CXCL12 kemokiini ilmentyy useissa muissa elimissä, kuten imusolmukkeissa ja keuhkoissa, ja voi näin houkutella paitsi hematopoieettisia soluja, mutta myös vaeltavat syöpäsolut, jotka osoittavat usein korkeita ilmentymisen tasoja CXCR4 reseptoriin solun pinnalla. Lisäksi CXCR4 voi tukea kasvainten selviytymistä esim edistämällä kasvaimen verisuonten muodostumista.

Pim-1 yli-ilmentyminen on liitetty ilmen- tymisen lisääntymisen ilmentyminen solun pinnalla CXCR4 hematopoieettisia maligniteetteja kuten akuutti myelooinen leukemia [4], diffuusi suuri B-solujen lymfooma [28] ja krooninen lymfaattinen leukemia [29]. Solunsisäinen pyrstö CXCR4 voidaan fosforyloitua

in vitro

at Ser339 by Pim-1 kinaasia [4] sekä Pim-3, kuten kuvassa, mutta ei Pim-2. Mielenkiintoista on, että Ser339 on useiden seriinitähteiksi kohteena G-proteiini-reseptorikinaasit (GRKs), jolloin reseptorin endosytoosin [30]. Sen sijaan Pim-riippuvainen fosforylaatio CXCR4 on raportoitu lisäisi ulkoistamisen reseptorin, jonka avulla solut voivat siirtyä kohti CXCL12 kaltevuus [4]. PC-3-solut, CXCR4 pinta on suhteellisen alhainen, ellei soluja käsitellään CXCL12 ligandin, joka myös lisää selvästi invasiivisia ominaisuudet näiden solujen [20-23]. Näin ollen, vaikka lisätutkimuksia vaikutuksista Pim kinaasien CXCR4 PC-3-solut viljeltiin ilman tai läsnä CXCL12 olisi kiinnostava, voidaan jo spekuloida, että Pim-CXCR4 vuorovaikutus on auttanut Pim-yliekspressoivia potilaalle tehdä kasvainsolut muodostaa etäpesäkkeitä eturauhaseen tyhjennys imusolmukkeissa ja keuhkoissa, kun taas kasvaimen mikroympäris- ympäri ihonalainen kasvaimia ei ehkä ole salliva tarpeeksi edistää hyökkäystä.

Koska CXCL12 /CXCR4-reitti on houkutteleva terapeuttinen kohde useita pienimolekyylisiä yhdisteitä on kehitetty, että joko estävät vuorovaikutusta kemokiinin kanssa sen reseptoriin tai estävät signalointia alavirtaan reseptoria [19, 27]. Lupaavia tuloksia on jo saatu kliinisistä tutkimuksista, joissa on pyritty lisäämään kemosensitiivisyys hematopoieettisen maligniteettien mutta CXCL12 /CXCR4-inhibiittorit voivat myös auttaa vähentämään metastaattisen potentiaalin kiinteiden syöpien. Eräs ongelma näissä estäjien on, että ne saavat aikaan vastavaikuttajahormonivasteet säätelyä CXCR4 solun pinnalla, jolloin vain lyhytaikainen vastauksia. Siksi voisi olla tehokkaampaa estää ulkoistamista CXCR4 reseptorin Pim-selektiivisiä estäjiä, jotka voivat myös olla vähemmän haitallisia sivuvaikutuksia.

Tässä olemme osoittaneet alustavia

in vivo

tietoa turvallisuudesta ja tehokkuudesta yhden Pim-estäjä, The pyrrolokarbatsoleja DHPCC-9, kun taas bentso [

cd

] atsuleeni BA-1a osoittautui liian liukenemattomia. DHPCC-9 ei ilmennyt mitään sytotoksisia vaikutuksia hiirillä, vaikka jotkin epämuodostumia havaittiin alkuvaiheen seeprakalan alkioita. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ainakin lyhyellä aikavälillä inhibitiota Pim aktiivisuutta, voidaan hyvin siedetty aikuisten organismeja, ja että se voi jopa olla mahdollista käyttää suurempia annoksia tämän inhibiittorin suurentaa havaittuja vaikutuksia. Se voi myös olla edullista yhdistää Pim inhibition muiden hoitojen kanssa, jotka vaikuttavat solujen eloonjäämistä tai liikkuvuutta.

Data solusta-pohjainen haavan paranemista kokeet osoittavat, että DHPCC-9 pystyy estämään motiliteettia PC-3 eturauhasen syöpäsolujen [ ,,,0],6].