Krooninen sairaus

tiivistelmä

Nykyinen rajoitukset kemoterapia kuuluu myrkyllisyys terveitä kudoksia ja monilääkeaineresistenssin pahanlaatuisia soluja. Useat viimeaikaiset syöpälääkkeen strategioissa pyritään kohdistaminen mitokondrioiden apoptoottinen koneen aiheuttamaan kasvainsolun kuoleman. Tässä tutkimuksessa olemme perustaneet protokollia puhdistamaan toiminnallisia mitokondrioita eri ihmisen solulinjoista analysoimaan vaikutuksen peptidisiä ja xenobiotic kuvattuja yhdisteitä satamaan joko Bcl-2 eston ominaisuuksista tai myrkyllisiä vaikutuksia liittyviä mitokondrioita. Mitokondrioiden sisempi ja ulompi kalvon läpäiseväksi systemaattisesti tutkittu syöpäsolujen mitokondriot

versus

ei-syöpä mitokondrioita. Katkaistu (t-) Bid proteiini, synteettiset BH3 peptidejä Bim ja Bak, ja pieni molekyyli ABT-737 indusoi kasvainspesifisen ja OMP vapaan mitokondrio-toksisuutta, kun taas yhdisteitä, kuten HA-14,1, YC-137, kelerytriinistä, gossypolin, TW-37 tai EM20-25 eivät. Huomasimme, että ABT-737 voi indusoida Bax-aineen päästö apoptoottisten proteiinien (sytokromi c, Smac /Diablo ja Omi /HtrA2 muttei AIF) eri, mutta ei kaikkia syöpäsolun mitokondrioita. Lisäksi ABT-737 lisäksi eristetyn syöpäsolu mitokondriot aiheuttama oligomerointi Bax ja /tai Bak monomeerit jo asetettu mitokondrion kalvon. Lopuksi immunoprecipatations osoitti, että ABT-737 indusoi Bax, Bak ja Bim desequestration peräisin Bcl-2 ja Bcl-x L, mutta ei Mcl-1L. Tutkimuksessa selvitetään ensimmäistä kertaa vaikutusmekanismi ABT-737 monoterapiana yksittäisiä syöpäsolun mitokondrioita. Näin ollen tämä menetelmä perustuu MOMP (mitokondrion ulkokalvon läpäiseväksi) on mielenkiintoinen seulontatyökaluna, räätälöity tunnistaa Bcl-2-antagonisteja selektiivisten toksisuusprofiili vastaan ​​syöpäsolujen mitokondriot mutta vailla myrkyllisyyttä vastaan ​​terveitä mitokondrioita.

Citation: Buron N, Porceddu M, Brabant M, Desgué D, Racoeur C, Lassallen M, et al. (2010) käyttö Human Cancer Cell Lines Mitokondrioita voidaan tutkia BH3 peptiditekijät ABT-737 aiheuttama mitokondrion kalvon läpäiseväksi. PLoS ONE 5 (3): e9924. doi: 10,1371 /journal.pone.0009924

Editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Kanada

vastaanotettu: 15 tammikuu 2010; Hyväksytty: 01 maaliskuu 2010; Julkaistu: 31 maaliskuu 2010

Copyright: © 2010 Buron et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Agence Nationale pour la Valorisation de la Recherche (https://www.agence-nationale-recherche.fr) ja Theraptosis SA (https://www.theraptosis.com), jonka Theraptosis SA ja Mitologics SAS (http: //www.mitologics.com). Agence Nationale pour la Valorisation de la Recherche ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tekijät ABS, NB ja MP Julistan kilpailevat taloudelliset edut johtuen omistusosuuden Mitologics SAS. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Apoptosis säätelyhäiriötä on osoitettu sittämän useita patologiat, mukaan lukien syöpä [1], [2 ]. Se on vakiintunut, että erilaiset signalointi tapahtumien kuluessa apoptoosin lähentymässä mitokondriot, jotka läpikäyvät ulkokalvon läpäiseväksi (OMP) käynnistävät vapautumisen liukoisen apoptogenic tekijöiden päässä intermembrane tilaan kuten sytokromi c ja myöhemmin sarjan aktivaation joukko proteolyyttisten entsyymien kaspaasit johtavat apoptoottiseen purkamiseen solurakenne [3].

MOMP on valvonnassa jäsenten Bcl-2-proteiinin perheen, joka sisältää (1) anti-apoptoottisten proteiinien, kuten Bcl-2, Bcl-x L, Bcl-w, Mcl-1 ja A1 /Bfl-1, joka sisältää kaikki neljä Bcl-2 homologiadomeenit (BH1-4), (2) pro-apoptoottisten proteiinien, kuten Bax, Bak, Bok josta puuttuu BH4-domeenin ja (3) pro- apoptoottista BH3-vasta proteiineja kuten Bid, Bim, Bad, BMF, Noxa ja Puma [4] – [8]. Suorassa aktivointi malli, induktio Bim tai Bid vaaditaan Bax tai Bak oligomeroitavan ja muodostavat huokosia ulomman mitokondrion kalvon (MOM) [9], [10]. Antiapoptoottista proteiinit voivat estää tätä prosessia MOM mukaan pääasiassa metalleja sitovia Bax /Bak proteiinit [11] – [13]. Välillisen aktivointi malli [14], [15], BH3-vasta proteiinit voivat antagonisoida antiapoptooppinen vaikutus ja vapauttaa Bax /Bak proteiineja. Se on edelleen keskusteltava siitä Bax ja Bak voivat olla vuorovaikutuksessa proteiinien kuten VDAC (jännite riippuvainen anioni kanava) ja /tai ANT (adeniinin nukleotidi translocator) säätelemiseksi läpäisevyyttä siirtyminen huokosten (PTP) [16]. Tällä mitokondrioiden tasolla, sytokromi c jakautuu kahteen eri allasta: 15-20% vuonna intermembrane tilan ja suuremman osan (80%) vuonna intracristae tilaan [17]. Siten BH3 mimeettipeptidin tarvitsee matriisi remontin vapauttaa toisen altaan sytokromin c [18]. Muut apoptoottinen tekijät, kuten Omi /HtrA2 ja Smac /DIABLO (kaspaasiriippuvaisen kuolema effektorit) tai apoptoosia indusoivan tekijän AIF ja EndoG (kaspaasi-riippumaton kuolema effektorit) vapautuvat MOMP.

mitokondrion kalvon läpäiseväksi ( MMP) prosessi on usein muutettu syöpäsolujen mahdollisesti seurauksena PTP komponentin yli-ilmentymisen [19], ilmentymisen lisääntyminen anti-apoptoottisen jäseniä Bcl-2-perheen ja /tai downregulation Bax [20]. Nämä sittämän lukuisia syövän strategioita kohdistaminen komponenttien ytimen solukuoleman koneen kasvainsolujen kuolemaa edistävällä tavalla [21], [22]. Nämä strategiat perustuvat käyttöön BH3-jäljitteleviä peptidejä [14], [23], antisense [24], tai RNA-interferenssi [25] vastaan ​​Bcl-2, ja luonnon tai synteettiset pienet molekyylit, jotka sitoutuvat spesifisesti Bcl-2-perheen proteiinien . Esimerkiksi seulomalla lähestymistapoja käyttäen ydinmagneettista resonanssia, rakenne-pohjainen suunnittelu ja kombinatoorista kemiallinen synteesi, johti tunnistamiseen ABT-737, pienimolekyylinen inhibiittori anti-apoptoottisten proteiinien Bcl-2, Bcl-x L ja Bcl-w, mutta ei Mcl-1 ja A1 /Bfl1 [26]. ABT-737 pidetään Bad kaltainen BH3 jäljittelevää koska sekä ABT-737 ja Bad BH3 peptidi sitovat saman alijoukon Bcl-2 pro-eloonjäämisen proteiinit [27] ja indusoi sytokromi c release mitokondrioita saatu ”pohjustettu kuolemalle ”tuumorisoluja [28]. Kuitenkin heikko affiniteetti ABT-737 pro-selviytymisen proteiinien Mcl-1 ja A1 /Bfl1 [26] voisi olla keskeinen tekijä tuumorisolujen vastustuskyky tämä yhdiste [29].

Olemme asettaneet jopa moniparametrisissä näytön puhdistettiin mitokondrioissa yhdisteiden tunnistamiseksi, joka indusoi OMP eristettyjä mitokondrioita syöpäsolulinjasta, mutta ei eristettyjä mitokondrioita ei-syöpäsoluja. Joukossa eri yhdisteiden (kemiallisista, peptidirakenteisia tai proteiinisekvenssin alkuperää) kuvataan kohdistaa mitokondrioita, huomasimme, että vain yhdistelmä-t-Bid, Bak BH3 ja Bim BH3 peptidejä, ja ABT-737 sisältyy välitön tuumorispesifisen mitokondrio-myrkyllisyyden ja aiheuttaa suhteellisen suuri OMP johtuen Bax ja Bak oligomeroinnissa. Edelleen tutkia ABT-737 aiheuttama OMP at soluttoman mitokondrioiden tasolla, huomasimme, että (1) syöpäsolun mitokondrioita eri lähteistä erosivat niiden herkkyyttä ABT-737 korreloi eri mallien (ulko) kalvoon liittyvä Bcl -2 perheenjäseniä ja niiden vuorovaikutusta, (2) ABT-737 indusoi Bax, Bak, ja Bim desequestration peräisin Bcl-x L ja Bcl-2, mutta ei Bcl-w tai Mcl-1.

tulokset

eristäminen ja toiminnallisen kuvauksen terveitä ja kasvaimen mitokondriot

mitokondrioita sekä terveessä kudoksessa (hiiren maksan) ja ihmisen kasvain (PC-3, eturauhasen) solulinjaa puhdistettiin isopyknisellä sentrifugoimalla tiheys kaltevuudet Percoll. Eristetty mitokondriot löytyivät erittäin ehjä osoituksena sytokromi c oksidaasi saavutettavuus määritys ja virtaussytometria FSC /SSC-analyysi [30]. Mikroskooppitutkimus vertailevat tutkimukset eristettyjen mitokondrioita maksa- tai PC-3 tuumorisolulinjassa paljastaa suhteellisen samanlainen matriisi /kristat järjestö huolimatta hieman erilainen tiheys välillä kasvain (low density) ja maksan (high density) mitokondrioita (Fig. 1A). Kalsium (50gM) indusoi laaja ulomman kalvon häiriöitä sekä tervettä kudosta ja tuumorisolulinja mitokondriot seuraa turvotus, joka estyy syklosporiini A (CsA), mikä osoittaa ehjä ja toimiva läpäisevyys siirtyminen huokosten kummassakin mitokondrioiden tyyppejä. Polarografista tutkimukset seuraavan suoritettiin maksan ja PC-3 mitokondrioiden (Fig. 1 B). Sukkinaatti hapetus oli olennaisesti riippuvainen ADP lisäksi ja hengityksen kontrolli-indeksi (RCI) 3 liittyy sukkinaatin hapettumista osoitti funktionaalisen eheyden mitokondrioita, mukaan lukien eristetty kasvain soluviljelmässä. Samoin eristettyjä mitokondrioita HT-29, HCT-116 ja Jurkat syöpäsolun linjat ja HME-1 ei-syöpä-solulinjasta esitteli korkea eheys ja toiminnallisuus (ei kuvassa).

. Mikroskooppitutkimus analyysi yksittäisiä mitokondrioita ja niiden kyky turvota. Nimikroskooppikuvia saatiin inkuboinnin jälkeen eristettyjä mitokondrioita terveen hiiren maksan, tai PC-3 kasvainsolulinjoja käsittelemättä (NT) tai käsiteltiin Ca

2+ (50 uM) tai 5 min-esi-inkubaatio syklosporiini A (CsA ; 10 uM) tai ruteniumpunaista (RR, 1 uM) ennen kalsiumin lisäys. Prosenttiosuus turvonneet mitokondrioita oli 10% kontrolliryhmässä ja 80% 30 min kuluttua Ca

2+ lisäksi (n = 3). Mittaviivat 1 pm. B. oksidatiivinen ominaisuudet yksittäisiä maksan ja PC-3 mitokondrioita. Jäljet ​​ovat hapenkulutus eristetty mitokondrioita (100 ug) lisäämisen jälkeen ilmoitettu reagensseja. Numerot pitkin jälkeäkään ovat nmol O

2 kulutetaan per minuutti per milligramma proteiinia. Hengitysteiden ohjaus indeksi (RCI) lasketaan kullekin mitokondrioiden kuten materiaalit ja menetelmät. C. arvioimiseksi mitokondrioiden turvotus ja ΔΨ

m menetys, mitokondrioita eristää terveistä hiiristä maksa- tai PC-3 solulinja jaettiin 96 kuopan mikrolevyille ja inkuboitiin 30 minuuttia joko Ca

2+ (100 uM) läsnä (keltainen) tai puuttumisen (vaaleanpunainen) CsA (10 uM), jossa

m

ClCCP (turkoosi, 50 uM) tai t-Bid (lila, 1 nM). Kvantitoimiseksi sytokromi c: n vapautumisen, eristetty mitokondrioita käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla t-Hintatarjousideat rekombinantti- ja mitokondrioiden supernatantti saatettiin ELISA-määritykset, antaa prosentteina vapautumisen verrattuna 20 ug /ml alamethicin (Ala; 100% sytokromi c release) (n = 3 itsenäistä koetta).

moniparametrisissä seulontamenetelmä on eristetty terveellinen ja kasvaimen mitokondriot

yksittäisiä mitokondrioita analysoitiin seulonta-alustan, joka mahdollisti määrällisesti mitokondrion kalvon läpäiseväksi (turvotus, Fig. 1 c; vasen paneeli) plus mitokondrion transmembraanisen potentiaali (ΔΨm; Fig. 1 c, keskimmäinen paneeli) käyttäen reaaliaikaista spektrofluorometrialla ja sytokromi c: n vapautumisen ELISA indeksinä MOMP (Fig. 1 c; oikea paneeli). Reaaliaikainen ΔΨm havaitseminen heijastuu sisäkalvon ja Hengitysketjun muutokset mutta ei salli tarkkailla viivästynyt ΔΨm vastauksena esiapoptoottisille yhdisteitä. Inkuboitaessa hypotoninen puskureissa, sekä normaalia ja kasvainten solujen mitokondriot teki turvota (tappio O.D. 550 nm: ssä), kun läsnä on kalsiumia CsA-riippuvaisella tavalla. Kuitenkin turvotus amplitudi pienennettiin tapauksessa kasvain mitokondrioiden kanssa pienimmillään tiheys verrattuna maksan mitokondrioita. Kalsium ja

m

ClCCP aiheuttama nopea ΔΨm tappio ominaista lisääntynyt fluoresenssi vastaa Rhodamiinilla 123 dequenching johtuen laskua väriaineen pitoisuus depolarisoituneiden mitokondrioissa. Meillä on siis havaittu, että rekombinanttiproteiini t-Bid ei ollut vaikutusta turvotusta ja ΔΨm mutta indusoi sytokromi c release erityisesti PC-3 (Fig. 1 C), HT-29, HCT-116 ja Jurkat (ei kuvassa) solu mitokondriot on pitoisuudesta riippuvasti, kuten on esitetty ELISA-analyysi supernatanteista.

seulonta oletetun Bcl-2-perheen inhibiittorit

vieressä arvioitiin vaikutusta Bcl-2: n estäjien on mitokondrioita eristettiin hiiren maksasta, ihmisen ei-syöpä (HME-1) ja syöpä- (PC-3-soluja) käyttäen 3 parametreja: turvotus, ΔΨm ja sytokromi

c

vapautumisen (Fig. 2A). Rekombinantti t-Bid-proteiinin aiheuttamaa sytokromi c release (turvotusta ja ΔΨm tappio) PC-3 mitokondriot mutta ei ollut vaikutusta maksaan ja HME-1 mitokondriot 100 nM. Jotkut BH3 peptidejä (johdettu Bak, Bim, Bax, Bad, Bid, Noxa ja Puma) ihmisen tai hiiren lähteitä testattiin myös. Näistä vain ihmisen Bak BH3 ja Bim BH3 (Fig. 2A) indusoi mitokondrio-myrkyllisyys kasvainsolun (PC-3) mitokondrioita, samalla aktiivinen 100 uM maksaan ja HME-1 mitokondrioita. Huomionarvoista, vaikka vastaava hiiren BH3 sekvenssit eivät ole aktiivisia hiiren maksan mitokondrioissa, ilman virheellistä tulkintaa takia lajikohtaisuus (ei kuvassa). Toisin kuin muut pienimolekyylisiä estäjiä arvioitu tässä tutkimuksessa, vain ABT-737 näkyvissä kasvain mitokondrioita spesifisyys, joka indusoi sytokromi c release PC-3 mitokondrioita mutta ei maksasta ja HME-1 mitokondrioita. Sytokromi c vapautumista PC-3 mitokondrioita käsiteltiin t-Bid ja ABT-737 tapahtui ilman turvotusta (Fig. 2A ja elektronimikroskopian, ei esitetty) tai ΔΨm tappio (Fig. 2A) aikana 45 min-hoito, joka osoittaa, että näissä olosuhteissa tapahtuu tiettyä OMP. Sitten laajennettu tutkimuksen ABT-737 tehosteita mitokondrioita eristettiin HCT-116, HT-29 ja Jurkat syöpäsolulinjoja (Fig. 2B) ja havaittiin eri herkkyys ABT-737. Todellakin, HT-29 mitokondriot olivat vähemmän herkkiä ABT-737 kuin PC-3, HCT-116 ja Jurkat, nämä kolme laters esittää samantasoiset herkkyyttä ABT-737. Nämä tiedot osoittivat, että ABT-737 indusoi sytokromi c release eri muttei kaikkia eristettyjä mitokondrioita syöpäsolujen.

. Eristettyjä mitokondrioita hiiren maksasta, ihmisen ei-syöpä (HME-1) ja syöpä- (PC-3), soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla t-Bid, Bak BH3, HA-14,1, YC-137, kelerytriinistä, Gossypolin, TW- 37, EM20-25 ja ABT-737 ennen arviointia mitokondrioiden turvotus ja ΔΨ

m menetys. Vaihtoehtoisesti mitokondrioiden supernatantti alistettiin ELISA-määritykset kvantifiointiin sytokromin c vapautumisen. Tehokas pitoisuus joka indusoi 50% maksimaalisesta vaikutuksesta (EY

50) annetaan turvotusta (100% vaikutuksen kanssa 50 uM Ca

2 +), ΔΨ

m tappio (100% vaikutuksen kanssa 50pM

m

ClCCP) ja sytokromi c release (100% vaikutus 20 ug /ml alamethicin) (n = 3 itsenäistä koetta). B. mitokondrioita eristettiin hiiren maksasta tai HME-1, PC-3, HCT-116, HT-29 ja Jurkat-solulinjoja inkuboitiin 45 min 30 ° C: ssa kasvavien pitoisuuksien kanssa ABT-737 ja supernatantit altistettiin sytokromi c immunoblot (NT: hoitamaton, Ala: alamethicin 20 ug /ml).

ABT-737 aiheuttama MOMP syöpäsolujen mitokondriot liittyy Bak ja /tai Bak oligomerisaatioon

Tämän jälkeen olemme tutkineet jos ABT-737 aiheuttama OMP oli valikoiva sytokromi c tai saattaa mahdollistaa vapauttaa muiden apoptogenic mitokondrioiden tekijät (Fig. 3). Eristetty hiiren maksa, PC-3 ja Jurkat mitokondrioita käsiteltiin Bak BH3, ABT-737 tai t-Bid ja supernatantit altistettiin immunoblottauksella. Smac /DIABLO (23 kDa) ja Omi /HtrA2 (37 kDa) vapautettiin PC-3 ja Jurkat mitokondrioita taas AIF (56 kDa) ei ollut (Fig. 3), mikä viittaa siihen, että nämä yhdisteet indusoi mitokondrioiden remodeling ei riitä AIF julkaisu. Seuraavaksi me käytetään eristyksissä mitokondriot päässä Bax ja /tai Bak knock-out HCT-116-solulinjoja, joissa ilman Bax ja /tai Bak tarkastettiin immunoblottauksella (Fig. 4A). Huomasimme, että ABT-737 aiheuttama sytokromi c vapautumista Bax +/- ja Bak – /- mitokondrioita mutta ei Bax – /- tai Bax /Bak kaksinkertainen knock-out mitokondrioiden (Fig. 4B). Tämä data korosti keskeistä asemaa Bax että vaikutusmekanismi ABT-737. Lisäksi t-Bid ja ABT-737-indusoidun MOMP kontrolloitiin ylimäärä Bcl-xL: n (Fig. 4C) tai Bcl-2 (ei esitetty) yhdistelmä-DNA-proteiineja, tukee oletusta, joka muodostuu tietty kanava ulko- kalvo [31].

eristetty mitokondrioita hiiren maksasta, PC-3 ja Jurkat-solut olivat käsittelemättömiä (NT) tai inkuboitiin joko alamethicin (Ala; 20 ug /ml; positiivinen kontrolli), Bak BH3 peptidi (10 uM), ABT-737 (1 uM) tai yhdistelmä-t-Bid (1 nM) 45 minuutin ajan. Mitokondrioiden supernatantit altistettiin immuunidetektio sytokromi c, Smac /DIABLO, Omi /Htra2 ja AIF (Länsi-blotit ne edustavat 3 itsenäistä koetta). Huomaa, että sytokromi c (15 kDa), Smac /DIABLO (23 kDa), ja Omi /Htra2 (37 kDa), mutta ei AIF (56 kDa) vapautetaan syöpäsolun mitokondrioissa.

. Yhteensä solu otteita HCT-116 Bax +/-, Bax – /-, Bak – /- ja Bax /Bak – /- (DKO) solulinjat tehtiin Bax ja Bak immunoblot valvoa niiden Bax ja Bak sisältöä. B. mitokondrioita eristettiin HCT-116 Bax +/-, Bax – /-, Bak – /- ja Bax /Bak – /- (DKO) solulinjoja inkuboitiin kasvavien pitoisuuksien kanssa ABT-737 ja supernatantti alistettiin immunoblot havaitseminen sytokromi c: n (NT: hoitamaton, Ala: alamethicin 20 ug /ml). C. Sytokromi c vapautumisen aiheuttama t-Bid ja ABT-737 inhiboi ylimäärä yhdistelmä-Bcl-xL. PC-3 mitokondrioita inkuboitiin ABT-737 (1 uM) tai t-Bid (1 nM) ja 45 min sen jälkeen, kun 5 min-esikäsittely rekombinantti Bcl-xL: n (100-400 nM) ja supernatantti alistettiin anti- sytokromi c: n immunoblot (NT: hoitamaton, Ala: alamethicin 20 ug /ml). Huomaa, että Bcl-x L voimakkaasti vähentää sekä t-Bid ja ABT-737 aiheuttama sytokromi c release (n = 2 itsenäistä koetta).

Todettuaan, että Bax pysyi sitoutuneena mitokondrioiden OM jälkeenkin pestään alkalisella homogenointipuskuria (pH 11,6) (ei esitetty), mikä viittaa siihen lisätään Bax kalvoon [32], olemme edelleen halusimme tutkia, jos ABT-737 voi aiheuttaa oligomerointi Bax ja Bak altaat jo liitetty kasvainsolun mitokondriot . Samanlainen t-Bid ja Bim tai Bak BH3 peptidejä, ABT-737, aiheuttama Bax ja /tai Bak oligomerisaatioon PC-3 ja Jurkat mitokondrioita, koska objectived käyttäen silloitusainetta 1,6-bismaleimidoheksaani (BMH, Fig. 5 ). Mutatoitunut [L78A; D83A] Bak BH3 peptidi oli tehoton aiheuttamaan sytokromi c release ja Bax /Bak oligomerointia kun lisätään PC-3 mitokondrioiden (Kuva. 5A). PC-3 mitokondriot, jotka sisältävät sekä Bax ja Bak, heikko Bak oligomerisaatioon tapahtui BH3 peptidien tai ABT-737 viittaa merkittävä rooli Bax puhkeamisessa kanavien muodostuminen tässä solulinjassa (Fig. 5A, keskimmäinen paneeli). Me seuraavaksi käytetään (±) -1- (3,6-dibromocarbazol-9-yyli) -3-piperatsin-1-yyli-propan-2-oli tunnistaa Bombrun ja työtoverit [33] kuten Bax salpaaja ( BCB) kykenee estämään t-Bid aiheuttama sytokromi c release [33], [34] (Fig. 5A). Esikäsittely syöpäsolujen mitokondriot tällä BCB esti sytokromi c release laukaisi Bak BH3, Bim BH3, t-Bid tai ABT-737 käsittely (Kuva. 5A). Lisäksi olemme havainneet, että BCB esti Bax /Bak oligomerointia vastauksena käsittelyt ABT-737, sekä t-Bid ja Bak tai Bim BH3 peptidejä (Fig. 5A ja 5B).

eristettyjä mitokondrioita PC-3 (A) ja Jurkat (B) solulinjoja inkuboitiin tai ei ole BCB, joka on Bax salpaaja (2 uM (±) -1- (3,6-dibromocarbazol-9-yyli) -3-piperatsin- 1-yyli-propan-2-oli) ennen käsittelyä ja 1 uM Bim BH3, 10 uM Bak BH3, 10 uM mutatoitua Bak BH3, 1 nM t-Bid tai osoitettujen konsentraatioiden ABT-737. Supernatantit analysoitiin sytokromin c vapautumisen (alempi paneeli, NT: käsittelemätön; Ala: alamethicin 20 ug /ml) ja mitokondrioiden pelletit hoidettiin peruuttamaton silloittimen BMH (1 mM). Neljäkymmentä ug proteiinia kustakin reaktiosta ajettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblotattiin anti-Bax (A) tai anti-Bak (A, B) vasta-aineita. Bax /Bak oligomerisaatioon mukana ABT-737 aiheuttama sytokromi c release jota estetään BCB.

Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittivat, että ABT-737 laukaisi vapauttamaan apoptogenic proteiinien syöpäsolun mitokondriot muodostamalla multimeerisiä Bax /Bak kanavia, kuten on esitetty korrelaatio Bax ja Bak oligomerointi ja sytokromi c release (Fig. 5).

ABT-737 aiheuttama MOMP syöpäsolujen mitokondriot liittyy erityisesti monimutkaisia ​​häiriöitä riippuen mitokondrioiden tyypin

Koska eroja herkkyydessä ei havaittu useiden mitokondrio-tyyppejä käytetään tässä tutkimuksessa olemme analysoineet pro- ja anti-apoptoottisten Bcl-2-perheen jäseniä liittyy mitokondrion kalvojen (Fig. 6). Niistä anti-apoptoottiset proteiinit, Bcl-2 oli läsnä vain PC-3, Jurkat ja HCT-116 mitokondrioita, kun taas Bcl-w: n, Bcl-xL: n ja A1 havaittiin kaikissa mitokondrion tyypit (Fig. 6A). Mielenkiintoista, Bcl-x L oli määrällisesti tärkeämpää syöpäsolun mitokondriot kuin heidän terveet vastine. Antiapoptooppinen Mcl-1L oli läsnä suuri määrä PC-3 ja Jurkat mitokondrioita ja pienempi määrä HT-29 mitokondrioita. Koskee pro-apoptoottisten proteiinien, kun Bak oli läsnä kaikissa mitokondrion tyyppejä, Bax oli läsnä PC-3, HT-29, HCT-116 ja HME-1 mitokondriot, mutta ei Jurkat ja maksan mitokondrioita. Niistä BH3 vain aktivaattorit, Bim havaittiin syöpäsolujen mitokondriot, mutta ei niillä, HME-1 ja maksan (Fig. 6B), kun taas Bid ei voi havaita millään näistä mitokondrion tyypit (ei esitetty). Niistä BH3 vain herkistimiä, Bad havaittiin PC-3, HT-29 ja Jurkat mitokondrioiden kalvot (Fig. 6B), kun taas Puma, Noxa, HRK, Bik Bok ja BMF ei (ei esitetty). Bcl-2, Bcl-x L ja BH3 vain herkistävät aineet (ex Bim) saattaa hyvinkin olla keskeisiä toimijoita, vaikka sitä on vaikea tällaisista proteomiikka analyysi selittää eroja herkkyydessä ABT-737. Onkin huomionarvoista, että HME-1 mitokondriot joilla ei ole Bim, eikä Bcl-2 ja vain vähäinen Bcl-x L, jotka saattavat erottaa ne herkkiä syöpäsolun mitokondrioissa.

Yhteensä solu-uutteita (TE) ja mitokondrioiden uutteet (M) PC-3, HT-29, Jurkat ja HCT-116 syöpäsolulinjoissa tai terveistä HME-1-solulinjassa ja hiiren maksan analysoitiin Western blot havaitsemiseen anti-apoptoottinen (A) Bcl-2- , Bcl-x L, Bcl-w, Mcl-1L ja A1 proteiineja ja pro-apoptoottinen (B) Bak, Bax, Bim, Bad ja Mcl-1 s-proteiineja.

ABT-737 on joka tekee monimutkaisia ​​häiriöitä välillä pro- ja anti-apoptoottiset proteiinit, tutkimme seuraavaksi joitakin monimutkaisia ​​häiriöitä samanaikainen immunosaostus PC-3, HT-29 ja Jurkat mitokondrioita käsiteltiin ABT-737 (Fig. 7). Riippumatta solulinja Olemme havainneet samanlaisia ​​sidokset: Bcl-x L ja Bax ja Bak, Bcl-2 Bax ja heikosti Bak, Mcl-1 vain Bak (Fig. 7) ja Bcl-w ja Bax (ei esitetty). Havaitsimme, että ABT-737 aiheuttama sytokromi c: n vapautumisen korreloi Bax, Bak (Fig. 7) ja Bim (ei esitetty) vapautumisen Bcl-xL: n ja Bcl-2. Kuitenkin ABT-737 ei ollut vaikutusta Bak ja Bim sitominen Mcl-1 (Fig. 7), tai Bax sitominen Bcl-w (ei kuvassa), nämä kompleksit jäljellä käsittelyn jälkeen. Nämä tulokset viittaavat siihen, Bax, Bak ja Bim vapautumisen Bcl-2 ja Bcl-x L vastauksena ABT-737 oli vastuussa kanavien muodostumista ja sytokromi c release PC-3 (Fig. 8) ja Jurkat mitokondrioita. Sen sijaan, HT-29 mitokondriot sisältävät vähemmän Bim ja puuttuisivat Bcl-2 oli vähemmän herkkiä ABT-737 käsittelyä, mikä viittaa tärkeä rooli Bcl-2 ja Bim in ABT-737 herkkyyttä.

eristettyjä mitokondrioita PC-3 (A), HT-29 (B) ja Jurkat (C) solut olivat käsittelemättömiä (NT) tai käsiteltiin t-Bid (Bid; 2 nM) tai ABT-737 (ABT, 1 uM), ennen kuin on immunosaostettiin vasta-aineet on suunnattu Bcl-2, Bcl-x L ja Mcl-1 anti-apoptoottisia proteiineja. Mitokondrioiden yhteensä uutteet (TE; positiivinen kontrolli ja immunoblot; 25 ug) käytettiin kontrollina, kun taas mitokondrio lysaattia suoritettiin immunosaostus prosessin ilman vasta-ainetta (C, negatiivinen kontrolli ja immunosaostus). Siten Western blot -analyysi suoritettiin sen määrittämiseksi, siteet välillä anti-apoptoottisia proteiineja ja pro-apoptoottisten Bax ja Bak proteiinit (tyypillinen Western blotit 3 itsenäistä koetta).

. Bax, Bak ja Bim ovat sequestred by Bcl-2, Bcl-x L ja Mcl-1 ulomman mitokondriokalvon. B. Vastauksena ABT-737, Bax, Bak ja Bim proteiinit vapautuvat Bcl-2 ja Bcl-x L, mutta ei Mcl-1L. Näin Bim voi suoraan parantaa Bax ja Bak oligomerisaatioon liipaisu MOMP muodostuminen (C) ja vapautuminen proapoptoottisten proteiinit, kuten sytokromi c sytosoliin.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa, käytimme laadukkaita ohjataan yksittäisiä mitokondrioita verrata vaikutuksia oletettujen Bcl-2-estäjiä ja yrittää tutkia vaikutusmekanismi ABT-737. Käytimme viisi eri parametrien arvioida niiden eheys ja functionnality: sytokromi-c-oksidaasi saatavuutta eksogeenisen sytokromi c (ei kuvassa), hengityksen valvonta-arvot, kapasiteetti matriisi turvotusta, transmembraaninen potentiaali arvoja ja vapauttamaan apoptogenic tekijät, kuten sytokromi c (OMP) (kuvio . 1). Vertailu yhdisteiden vaikutus kullakin mitokondrioiden tyypin vaatii samalla korkea puhtaus ja eheys mitokondrioiden valmisteiden riippumatta lähteistä (viljellyistä soluista tai tervettä kudosta). Tämä ratkaistiin suurten soluviljelmiä ja puhdistamalla mitokondrioita differentiaalisessa sentrifugointeja plus Percoll tiheys kaltevuus. Käyttämällä tätä menetelmää, sekä eristetty hiiren maksa ja syöpäsolujen mitokondriot esillä olevan samanlainen laatu ja vastauksena kalsiumin (Fig. 1).

Yllättäen useimmat yhdisteet tunnistettiin Bcl-2: n estäjien havaittiin toimimaan terveillä mitokondrioita ainakin yhdellä eheys parametrin. Esimerkiksi havaitsimme, että HA-14.1, kelerytriinistä, gossypol ja EM20-25 aiheuttama MMP hiiren maksassa mitokondrioita, kun taas muut Bcl-2-perheen inhibiittorit havaittiin olevan inaktiivinen (YC-137 ja TW-37). Appart t-Bid, Bak BH3, Bim BH3 jotka ovat prote- alkuperää, vain ABT-737 osoitti selektiivinen kasvaimen mitokondrio-kohdistamisesta merkitty OMP ja vapautuminen proapoptoottisten tekijät (Fig. 2). Aiemmat havainnot ovat osoittaneet, että ABT-737 voi aiheuttaa OMP joko mitokondrioita peräisin soluista ”pohjustetaan” kuoleman signaaleja (esimerkiksi IL-3-riistää lymfosyytit [28], tai TNF-pulssi HeLa-soluissa [35]), tai eristettynä mitokondriot ovat yhteistyössä käsitellään BH3 peptidi (esimerkiksi kanssa Noxa BH3 on MEF mitokondrioissa [13]). Ensimmäistä kertaa, osoitimme, että ABT-737 voi itse aiheuta OMP siitä eristettyjä mitokondrioita pohjustamaton tuumorisolulinjoissa. Koskevat t-Bid, meidän eristetty maksa ja HME-1 terve mitokondriot eivät olleet herkkiä rekombinanttiproteiinin t-Bid. Tämä puute vaikuttaa maksan mitokondrioissa voidaan selittää erittäin puhdasta ja vakautta meidän mitokondrioiden valmisteluja. Bcl-2-perheen proteiinit havaitaan normaaleissa ja syöpäsolujen mitokondrioita (Fig. 6) muistuttaa jälkeen läsnä alkali- pesun (ei esitetty) osoittaa, että ne eivät ole yhteydessä sähköstaattisten vuorovaikutus mitokondrioiden kalvot, ja niitä ei ole peräisin jäljellä sytosoliin tai solulimakalvostoon .

rekombinantti t-Bid-proteiinin, Bak BH3, Bim BH3 ja ABT-737 aiheutti vapautumisen apoptogenic proteiinien PC-3 ja Jurkat mitokondrioita muodostamalla kanavia tarpeeksi suuri vapauttavat proteiineja, kuten Omi /HtrA2 (37 kDa) (Fig. 3). OMP tulee riippumaton PTP, koska se ei inhiboi tunnetuilla PTP-inhibiittorit, kuten ADP: n, syklosporiini A: ta ja bongkrekic happo (ei esitetty). Koska mitokondrion kalvon muutoksia (ei turvotusta ja ΔΨm tappio) (Fig. 2A) ja vapauttaa pienimmän apoptoottisten tekijöiden mukaan hoidon (Fig. 3), ehdotti, että ABT-737 indusoi muodostumista tietyn kanavan eikä mitokondrion kalvon repeämä, samoin kuin Bax [53-86] BH3 peptidi Polster

et al.

[36]. Niinpä erotteleva vapauttamaan apoptogenic tekijöiden on jo esitetty eristetty HeLa mitokondrioita käsiteltiin t-Bid [37]. Tämä havainto on sopusoinnussa edellisen selityksen perusteella apoptosome riippuvan silmukka, jossa alavirtaan caspases tarvitse aktivoida laukaisemaan mitokondrioiden vapautumista AIF ja EndoG, toissijainen vapauttaa sytokromi c, Omi /HtrA2 ja Smac /DIABLO [37]. Solujen mallissa, ΔΨm menetys ja sytokromi c: n vapautumisen lisättiin samanaikaisesti havaittiin vasteena ABT-737 [38], [39] toisin havaittiin meidän olosuhteissa soluvapaassa järjestelmässä. Meidän seulontamenetelmä näyttää olevan reaaliaikainen prosessi, jonka avulla havaitseminen suorat ja varhaisen vaikutukset yhdisteiden mitokondrioissa häiriöittä aiheuttama soluliman lokero.

Olemme myös osoittaneet, että (1) HCT-116 leivonta- /-, mutta ei Bax – /-, mitokondriot ovat herkkiä ABT-737 (Fig. 4A), (2) ABT-737 aiheuttama sytokromi c: n vapautumisen PC-3 mitokondriot ohjataan ylimäärä Bcl-xL: n (kuvio. 4C) ja (3) inhibitio Bax ja Bak oligomerointi mukaan BCB on riittävä estämään sytokromi c release (Fig. 5A ja B). Nämä havainnot osoittavat, että tasapaino proapoptoottisten ja antiapoptoottisia jäseniä Bcl-2-perheen olennainen rooli ABT-737 vaikutusmekanismi.

Olemme siis osoittaneet, että Bax ja Bak oligomeroinnin klo PC-3 mitokondrion kalvon aiheutetaan Bak ja Bim BH3 peptidejä, t-Bid tai ABT-737 hoitoja (Kuva. 5A), Bax ja Bak molemmat työnnetään kuin monomeerisen muodon käsittelemättömissä normaali (HME-1) ja kasvaimen (PC -3) solujen mitokondrioita. Kuitenkin lukuisat tutkimukset on tehty osoittavat Bax oligomerisaatioon ja myöhemmät kalvo paikoilleen käyttäen yhdistelmä Bax ja yksittäisiä mitokondrioita tai liposomit [40] – [42]. Nämä tutkimukset ovat johtaneet vastakkaisiin päätelmät kineettinen Bax huokoset aktivointia. Kuitenkin viime aikoina on osoitettu, että oligomerointi Bax tapahtuu mitokondrion tasolla sen sijaan, että sytosoliin [43] – [45]. Näin ollen, käyttämällä c-myc null-soluissa, Annis ja työtoverit osoittivat, että Bax-indusoidun mitokondrioiden läpäiseväksi tulokset oligomerointi transmembraani- monomeerien sijaan insertion kuin muotoon oligomeerit [43].

Jotkut Bcl-2-perheen proteiinit, kuten BH3 vain aktivaattorin Bim tai anti-apoptoottisten proteiinien Bcl-2 ja Mcl-1L ovat erityisen läsnä syöpäsolun mitokondrioissa. Toisin kuin aiempien huomautusten [28], [29], [46], Mcl-1L ilmentymisen mitokondriot ei riittänyt meidän käsissämme estämiseksi MOMP muodostumisen vastauksena ABT-737. Esimerkiksi PC-3 ja Jurkat mitokondriot ovat herkkiä pieninä pitoisuuksina ABT-737, vaikka korkean Mcl-1L sisältöä (kuviot 2 ja 6), kun taas HT-29-mitokondrioita, joissa alhainen Mcl-1L ovat suhteellisen resistenttejä ABT- 737. Osoitamme tässä, että molekyylitasolla, ABT-737 mahdollistaa pro-apoptoottisten proteiinien Bcl-2 ja Bcl-x L, mutta ei Mcl-1L eikä Bcl-w vapauttaa Bax, Bak ja Bim (kuviot 7 ja 8).