Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ei-tavanomainen MHC-luokan I MIC molekyylit ovat vuorovaikutuksessa ei TCR: n kanssa, mutta NKG2D, joka on C-tyypin lektiini activatory reseptorin läsnä useimmissa NK, γδ ja CD8

+ αβ T-solut . Vaikka tämä vuorovaikutus on kriittinen syntyyn /kalibrointiin sytotoksista aktiivisuutta näiden solujen, todellinen laajuus

in vivo

osallistumista, ihmisessä, infektion, syövän tai autoimmuniteetin, on vielä arvioida. Jälkimmäinen on päässyt vauhtiin yhdessä raportoitu laajentamiseen oheislaitteiden CD4

+ CD28

-NKG2D

+ T-solujen nivelreuma (RA). Ensin aloitetaan laajentaa tämä raportti suurempaan kohortin paitsi Nivelreumapotilaissa vaan myös niitä, joita punahukan (SLE) ja Sjögrenin syndrooma (SS). RA ja SS, tämän ensimmäisen havainnon testattiin vielä kohdekudoksissa: yhteinen ja sylkirauhaset, vastaavasti. Lopuksi huolimatta satunnaista ja summittaisen laajentaminen aiemmin syytetyn T-solujen alaryhmästä, mitään korrelaatiota voitu havaita välillä CD4

+ CD28

-NKG2D

+ ja autoimmuunisairaudet. Lisäksi

in situ

läsnäolo NKG2D täsmäsi että CD8

+, mutta ei CD4

+ T-soluja. Samanaikaisesti koko kehon kudosten skannaus sekä

MICA

ja

MICB

transkriptio osoittaa selvästi, että vaikka alkuperäinen olettamuksia, ja lukuun ottamatta keskushermostoon, molemmat geenit ovat laajalti kopioida ja lukea sen vuoksi mahdollisesti käännetty ja kalvoon sitoutuneita. Laajentaminen tämän analyysin useiden ihmisen kasvainten ei havaittu johdonmukaista mallia ilmaisun vs. normaaleissa kudoksissa. Yhdessä nämä tiedot kyseenalaistaa edellinen oletukset, joka korreloi kudoksen-erityinen ilmaisu /induktion

MIC

sisään merkitystä autoimmuuni- tai kasvain prosesseja.

Citation: Schrambach S, Ardizzone M, Leymarie V, Sibilia J, Bahram S (2007)

In vivo

ekspressiokuviota MICA ja MICB ja sen merkitys Auto-immuniteetti ja syöpä. PLoS ONE 2 (6): e518. doi: 10,1371 /journal.pone.0000518

Academic Editor: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Julkinen-Santé, Luxemburg

vastaanotettu: 17 huhtikuu 2007; Hyväksytty: 7. 2007; Julkaistu: 13 kesäkuu 2007

Copyright © 2007 Schrambach et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Université Louis Pasteur, The Hopitaux Universitaires de Strasbourg, Association Française du Gougerot Sjögren et des oireyhtymiä sekuntia, Ligue contre le Cancer, Association pour la recherche sur le Cancer (ARC).

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Sytotoksiset CD8

+ ja auttaja CD4

+ αβ T-solut tunnistavat tavanomaisia ​​peptidi-ladattu major histocompatibility complex ( MHC) luokan I ja II molekyylien vastaavasti [1]. Vaikka ensin vuorovaikutus johtaa poistamiseen viruksen tartunnan tai tumorized kohdesoluihin, jälkimmäinen, auttaa monistaminen /säätelemään pääasiassa humoraalisen immuunivasteen ekso tai auto-antigeeneille [2], [3]. Vaikka tämä oppikirja määritelmä mukautuva immuunivaste on selvä, tosielämän toiminnallinen /vahingollisia vaikutuksia näiden vuorovaikutusten yhdessä toisen, synnynnäinen, toimijoiden immuniteetti, on kaukana yksinkertaista. Tämä on ehkä paras esimerkkinä autoimmuunireaktioille, missä riippuen taudin laji (ihmisen tai hiiren pohjimmiltaan) ja kokeellinen malli, eri osien immuunijärjestelmä on peräkkäin laittaa etualalle, johtaa loogisesti että lähes kaikki toimijat immuunijärjestelmän ovat mukana joko käynnistää ja /tai jatkumisen taudin [4] – [6].

Toisin kuin edellä mainitun tavanomaisen MHC-I-molekyylit, MIC-molekyylit [7], [8] eivät vuorovaikutuksessa TCR

sinänsä

vaan tehdä niin NKG2D, C-tyypin lektiini activatory reseptoria ilmentyy NK, γδ ja CD8

+ αβ T-solujen [9], [10 ]. Tämä vuorovaikutus on osoitettu yli-ratsastaa estävä antama signaali Killer inhiboiva reseptorit (KIR) ja /tai CD94 /NKG2A /B-molekyylit, jotka havaitsevat vastaavasti HLA-ABC ja -E kohdesoluihin. Kun taas T-solut, NKG2D toimii kostimuloivana molekyylin [11], se voi aktivoida NK-soluja sekä IL-15-aktivoitu intraepiteliaalisia T-lymfosyyttien TCR riippumaton tavalla [12]. MIC-NKG2D sitoutuminen uskotaan olevan näin ollen kriittinen poistaa infektoiduissa soluissa ja /tai kasvaimia [13], [14]. Onko tämä vuorovaikutus on myös merkitystä autoimmuniteetin on kysymys enemmän korostaminen [15].

Nivelreuma (RA) on arkkityyppinen autoimmuunisairauden ja siten jatkaa nykyisen tietämyksen ja haasteita autoimmuniteetin [16 ]. Suurin ruumis työtä on tuottanut lukuisia hypoteeseja toimien aloittamisesta ja jatkumisen sairauden. Koko ajan, T-solujen tai B-solujen on kirjattu ensisijaisia ​​toimijoita taudin. N oletettu kudosspesifisiä tai systeemisiä autoantigeenillä (t) ihminen edelleen heikko, toisin kuin useita luonnollisia tai siirtogeenisiä /geenin kohdennettua eläinmalleissa, joissa useat itse antigeenejä on kirjattu siihen voi aloittaa sairauden [17]. Yksi viimeisimmistä otaksuttu toimijoiden RA synnyssä on toimitettu erillisenä populaatio CD4

+ T-solut, joista puuttuu kostimulatorista molekyyliä CD28 ja on raportoitu laajennetaan RA [18], [19]. Uudemmat tutkimukset raportoitu, että nämä T-solut ilmentävät, sen sijaan, että CD28, edellä kuvatun NKG2D [15]. Seuraava työ aloitettiin tämän oletuksen ja pyrittiin ensin jäljitellä näitä lähtötietoja suuremmassa, paremmin määriteltyjä, kohortti nivelreumassa. Se ulotettiin lisäksi kaksi muuta autoimmuunisairaudet: systeeminen lupus erythematosus (SLE) ja Sjögrenin oireyhtymä (SS). RA ja SS koetelleet potilailla oli myös mahdollista koetin

MIC

ekspressiotaso kohdekudoksissa, sekä lähetti-RNA ja proteiini tasolla. Lisäksi ääreisveren lisäksi että mitataan CD4

+ NKG2D

+ soluja sinänsä, me myös asettaa analysoida TCR β ohjelmistoon näiden solujen tietyt yksilöt (vrt

infra

). Lopuksi, ja ensimmäistä kertaa, kattava elin /kudos scan saa paljastaa, että toisin kuin alunperin oletettiin ja on sittemmin tullut oppikirjoja [20], ja lukuun ottamatta keskushermostoon,

MICA

ja

MICB

transkriboitiin lähes jokaisessa kudoksessa /elin tutkittiin. Laajennuksesta tämän analyysin tumorized näytteiden auttoi antaa paremman otteen

MIC

transkription sekä terveyden ja sairauden.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja valvonta

25 tervettä vapaaehtoista sekä 75 potilaat kärsivät RA (n = 35; 1988 American College of Rheumatology kriteerit) [21], SLE (n = 15; 1997 tarkistettu American College of Rheumatology kriteerit) [22] ja SS ( n = 25, 2002 Amerikan ja Euroopan kriteerit) [23] otettiin mukaan tässä tutkimuksessa (taulukko 1). Kaikki näytteet saatiin vapaaehtoisilta osallistuvat Rheumatology klinikan Strasbourgin yliopistollisen sairaalan ja kerättiin aikana rutiininomaisessa kliinisessä (diagnostinen /prognostinen /terapeuttista) menettelyt säädetty yksi tekijäkumppaneiksi, tohtori J. Sibilia. Kirjallinen suostumus saatiin kunkin yksittäisen kanssa Helsingin julistuksen ja Ranskan lainsäädäntö, jonka nojalla ei hyväksyntää eettisen komitean tarvittiin tässä tapauksessa. Kaikkien potilaiden ja verrokkien olivat liity.

virtaussytometria

Seuraavat vaihtelevasti konjugoitu (PE, FITC, PerCP, Cy5 tai APC) vasta-aineita käytettiin vuonna kolmen ja -four- väri virtaussytometria: anti -CD3, CD4, -CD5, -CD8, -CD16, -CD19, -CD28, -CD45, -CD45RA, CD45RO, -CD56, -CD94, -CD158a, -CD158b, -NKG2A, – TCR γδ. T-solu ohjelmistoon analysoitiin seuraavat PE ja FITC-konjugoitua anti-TCRV

β (1, 2, 3, 4, 5,1, 5,2, 5,3, 7,1, 7,2, 8, 9, 11, 12, 13,1, 13,2 , 13,6, 14, 16, 17, 18, 20, 21,3, 22, 23) (Beckman Coulter) -vasta-aineita. Isotyypin kontrolleja käytetään kunkin värjäystä. NKG2D ilmentyminen analysoitiin käyttämällä PE-konjugoitua ON72 (Beckman Coulter) ja 1D11 (BD PharMingen), joko PE-konjugoitu tai biotinyloitu; Jälkimmäisessä havaita streptavidiinipalloihin-PC5 (BD PharMingen). Ääreisverisoluissa tutkittiin joko fraktioimatonta tai sen jälkeen Ficoll heysgradienttisentrifugoinnilla. Mononukleaariset solut eristettiin myös Ficoll tiheysgradienttisentrifugoinnilla päässä nivelen nesteiden saatu 1 RA, 3 nivelrikko ja 2 ei auto-immuuni sairastavilla potilailla. Virtaussytometria suoritettiin joko BD FACSCalibur ™ (Becton Dickinson) tai FC 500 (Beckman Coulter) järjestelmät.

immunohistokemia

Synovial kudokset saatiin 1 RA kyynärpää ja 1 nivelrikko potilaiden antamat aika polvipotilasta. Sylkirauhasten kudokset saatiin 4 SS ja 1 terveillä vapaaehtoisilla aikana rhinoplasty. Immunohistokemiaa, 4 um kryostaattileikkeitä valmistettu nivelkalvon kudoksista tai sylkirauhaset ja pikajäädytettiin nestemäisessä typessä. Peräkkäiset leikkeet kiinnitettiin asetonissa, ilmakuivattiin, rehydratoitiin PBS: ssa, ja estettiin 0,3% vetyperoksidia. Leikkeitä inkuboitiin anti: -NKG2D mAb 1D11 (BD PharMingen), -MIC mAb 6D4 (BD PharMingen), CD4, -CD8 1 h huoneen lämpötilassa. Sitovat havaittiin käyttäen biotinyloidun sekundaarisen anti-IgG ja streptavidiinin peroksidaasi. Osiot vastavärjättiin Harrisin hematoksyliinillä ja asennettu glysergeeliin.

Northern blotting

Ihmisen mRNA-blotit hankittiin Invitrogen (Invitrogen Northern alueet). Kalvot hybridisoidaan sarjassa

MICA, β-aktiini

ja

β

2-mikroglobuliinin (β

2m) B cDNA, altistetaan myöhemmin pesua korkean tiukkuuden (64 ° C , 0,1 x SSC, 0,1% SDS), ennen altistamista Kodak XOMAT (Eastman Kodak, Rochester, NY) ja vastaavasti 8 h -70 ° C: ssa, 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja 4 h -70 ° C: seen.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

Tarvikkeet sylkirauhasten koepaloja saatiin riippumaton sarja 20 (19 naarasta ja yksi uros, keski-ikä 51, mediaani 52) primaarisessa SS. Sylkirauhasten 5 potilaalla, joille orofacial leikkaus (itsenäiseen syitä) saatiin menettelyn aikana ja toimivat kontrolleina vaikka molemmat patologian sekä potilaan historia edelleen eliminoitu merkkejä autoimmuunisairaudet näissä verrokkiyksilöitä. Solun kokonais-RNA eristettiin TRIzol LS® (Invitrogen) valmistajan suositusten mukaisesti. Laatu uutettu RNA varmistettiin kautta geelielektroforeesilla. 1 ug kokonais-RNA: ta altistettiin käänteistranskriptiotuotteiden käyttäen oligo-dT ja IMPROM-II ™ Reverse Transcription System (Promega), ja noudattamalla valmistajan suositusten mukaisesti. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR suoritettiin ABI PRISM 7000 käyttäen seuraavia oligonukleotideja ja Taqman®-koettimia. Ilmentymistasojen

MICA

ja

MICB

kalibroitiin käyttäen, että talon pitää 18S RNA havaittiin käyttämällä seuraavia eteenpäin ja taaksepäin-alukkeita vastaavasti 3′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-5 ’, 3’-GCTGGAATTACCGCGGCT -5 ’ja SYBR Green.

MICA

transkriptit havaittiin käyttäen seuraavia eteenpäin, taaksepäin oligonukleotidit ja Taqman® koetin vastaavasti 3′-CAGCTGCAAACGCCTCATATC-5 ’, 3′-TGACCTATGAAACAGAGAAAATAAAAGC-5′ ja 3’-ACATTTTGCAGCCTCCAACAACAATAAATAAGTG-5 ’ja niitä on

MICB

F 3′-CACCCAGGCTGCAGTTCACT-5 ’, R 3′-CGGGAGTCTGAGGTACGAGAA-5′, 3’-ACCTCTGCCTCCCAGGTTCAAGCAC-5 ’samassa järjestyksessä kuin edellä. Positiivinen säätelyä

MIC

transkription varmistettiin HeLa-soluissa kasvatettu käsittelemättömän tai lämpösokki, kuten aikaisemmin on kuvattu [24].

Tulokset ja keskustelu

Huolimatta siitä, että alkuperäisen ” häiriö ”liipaisu autoimmuunisairaudet yleensä ja nivelreuma edelleen erityisesti enimmäkseen arvoituksellinen, vuosikymmenten tutkimukseen ovat koonneet yhteen useita mahdollisia skenaarioita taas aloittamisen yhteydessä, eri reitit ja kaskadeja yleensä enemmän tai vähemmän pahentavat automaattisen reaktiivista (T ja /tai B-solujen ajettu) voima, joka lopulta johtaa oireenmukaista patologian [6], [25] – [28]. Yksi viimeisimmistä syytetään T-solualapopulaatioiden sellaisenaan, on murto-osa CD4

+ auttaja-T-solut, jotka ilmentävät aktivoivan reseptorin NKG2D, mutta vailla kostimulatorista molekyyliä CD28 [15]. NKG2D, tyyppi-II trans-kalvon pinnan homodimeeri koostuu C-tyypin lektiini solunulkoinen domeeni, jota seuraa transmembraani- ja lyhyt sytoplasminen häntä, joilta puuttuu tietty signalointitoimintoa. Molekyyli signaloi todellakin (ainakin man) kautta vuorovaikutuksessa transmembraaninen sovitin proteiini DAP10 (DAP10 ja DAP12 in mus riippuen NKG2D isoformin) [29]. NKG2D tunnistaa erilaisia ​​kaukaista sukua kuin perinteisen MHC-luokan I molekyylien; Ihmisellä MIC [7] ja RAET1 [30] (ULBP) [31] ja hiiren RAE1 ja H60 [9], [29]. Alkuperäisenä tavoitteena Tämän työn tavoitteena oli parantaa tietämystä n mahdollista roolia MIC-NKG2D vuorovaikutus autoimmuniteetin ihmisellä. Jotta tällaiset olevan näin, (ainakin) kaksi ehtoa täyttyvät: (1) ensiksi ja ihannetapauksessa, elimet kohdistamiseen autoimmuniteetin (täten mahdollisesti kaikki elimet ja /tai kudosten), ei pitäisi ilmaista MIC pohjapinta tilassa, vuonna Toisin sanoen, MIC olisi vain havaita sairaissa kudoksissa tai patologisten tilojen. (2) toiseksi, että systeeminen ja /tai kudos-tunkeutunut autoreaktiivinen CD4

+ T-solut ilmentävät NKG2D ja on todellakin laajennetaan niin sairaus; alkusoittoa niiden mahdollisten toiminnallisten merkitystä.

Jälleen ja vaikka oppikirja määritelmä MIC ilmaus on, että lähes rajoituksen enterosyytteihin [20], [24], todellisuus on kaukana niin hakkuun ja tämä reduktionistinen näkymä yksinkertaisesti ei vastaa todellisuutta (katso alla). Todellakin ensimmäinen monoklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​MICA osoittautui tahra, ellei lähes yksinomaan ihmisen enterosyytit, poikkeuksena kateenkorvan epiteelin [24]. Tämä oli linjassa alkuperäisen Pohjois blottings esiin geenin transkription, ei solulinjoissa (transformoitu) on lymphohematopoeitic linjaa, vaan niissä epiteelin /fibroblastisia alkuperä [7]. Toisaalta, geeninsiirto kokeet ovat selvästi osoittaneet, uudestaan ​​ja uudestaan, että olipa sukujuuret vastaanottajan solulinjan, jos siirtogeeni (alle heterelogous promoottori, joka on) on oikein transkriptoidaan, MIC proteiini poikkeuksetta syntetisoitu ja saavuttaa solun pinnalla [24], [32] – [37], joten lukuun ottamatta cellular ”rajoitus elementti (t)”, kuten precedently osoitettu vaaditaan asianmukaisen pinnan ilmentyminen muiden klassiset MHC-luokan geenejä esim klassinen HLA signaalisekvenssi peptidien tapauksessa HLA-E /Q-1 in man /hiiri [38] tai bakteereissa johdettu N-formyloidut peptidien tapauksessa H2-M3 hiiren [39]. Siksi kriittinen kysymys on, jossa kudoksen /elimen

MICA

ja

MICB

todellakin transkriboidaan, jolloin voisi luottavaisesti olettaa niiden seurauksena pinnan ilme. Koska triviaali koska tämä kysymys saattaa tuntua, lähes 15 vuotta niiden tunnistaminen [7], järjestelmällistä transkription analyysi

MIC

geenejä on julkaistu tähän mennessä. Tässä esittelemme yksi ensimmäinen tällainen analyysi. Itse laaja Northern blottaus suuri määrä ihmisen kudokset ja elimet osoittaa selvästi, että toisin kuin aiempien väittää, sekä

MICA

ja

MICB

ovat laajalti puhtaaksi. Kuten kuviossa 1 (yläpaneeli), nämä selostukset löytyy lähes jokaisessa elimessä tutkittava poikkeuksena keskushermostoon (ylhäällä, äärimmäinen oikea paneeli, kuva 1). Tämä todellakin korreloi täydellisesti transkriptio kuvio klassisen MHC-I loci, osoituksena luotaa samoja kalvoja, joiden

β

2m

cDNA-koetinta (välilevyt, kuva 1). Kiinnittää entistä enemmän huomiota

MIC

ekspressiokuviota, yksi toteaa, että vaikka elin ”täynnä” kanssa lymphohematopoeitic solut – perna – ei ole vailla

MICA

selostukset ja sisältää

MICB

selostukset yhtä suurina määrinä kuin muihin elimiin (keuhko, munuainen …). Jälleen selvä puuttuminen

MIC myynnissä maassa keskushermostoon on merkittävä, ja todellakin odottamaton, koska se selvästi rinnastuu että klassisen MHC-I-geenien (

β

2m

paneeli ), ja tämä siitä huolimatta, että ainakin välittömästi promoottorialueet näiden lokusten (

MIC

ja tavanomaisen

MHC-I

) ei ole mitään ilmeistä sekvenssihomologiaa [24]. Lopuksi ja jotta se kattaisi perusteet mahdollisimman paljon suhteen

MIC

transkriptio, laajensimme tämä transkription kartoitus terveiltä ja tumorized kudoksiin. Useita kasvaimia eri kudostyyppien analysoitiin ja verrattiin terveiden viereisiin kudoksiin (kuvio 2). Jälleen

MIC

transkriptio oli laajalti läsnä, eikä yleinen malli induktio /tukahduttamisen voitiin havaita kasvaimissa vs. terveiden kudosten (kuvio 2), toisin kuin precedently ehdotti [13]. Näin ollen kaiken kaikkiaan

MIC

transkriptoidaan lähes joka tutkittavan kudoksen kanssa poikkeuksena keskushermostoon. Yleisen mallin kasvaimissa on osoitus ”löysä” transkriptio kuvio. Syy, miksi jotkut anti-MIC-vasta-aineita ovat ilmeisesti osoittaneet kuvaamaan rajoitetun kudosekspressiotutkimuksen kuvio on siis olevan toisaalla esim. geneettistä polymorfismia [40], erilaiset N-sidottu glykosylaatiorakenteita (MICA on 8 mahdollista N-liitettyjä glykosylaatiokohtia) [7], [24].

Paneeli edustaa RNA peräisin suurten ihmisen elimiä. Kukin paneeli sisältää keuhko-RNA sisäisenä standardina. Ylälevy hybridisoitiin

MICA

cDNA. Differentiaalinen transkriptio pituus

MICA

ja

MICB

johtuu aiemmin dokumentoitu suurempi 3’UT in

MICB

mRNA [50]. Keskimmäinen paneeli kuvaa ilmaus

β

2m

, osoitus β

2m sidottu tavanomaisen MHC-I ilmaisun. Lopuksi

β-aktiini

transkriptio toimii latauskontrollina. Tarkempia selitykset katso varsinainen teksti.

Sama disposition kuin kuvio 1 koskee, mutta tällä kertaa blotit sisältävät kasvain ja ohjaus (viereisen taudista vapaan kudosta) kaistaa.

Todettuaan, että

MIC

transkriboidaan ja siksi potentiaalisesti käännetty missään /joka kudos, asetamme nyt tutkia merkitystä

MIC

ja epäsuorasti, että MIC-NKG2D ilmentyminen auto- koskemattomuutta. Tällaisille kolme prototyyppiä autoimmuunisairaudet valittiin, koska niiden luontainen merkitys ymmärtää ihmisen autoimmuunisairaudet [25], [41], [42], kliininen /lääketieteellinen mielenkiintoa sekä se, että suhteen RA, edellinen data oli tuonut esiin MIC-CD4

+ NKG2D

+ vuorovaikutukseen sairauksien etiologia /patogeneesi [15].

tätä analyysiä seuraavaa kohortti yksilöitä kerättiin: 25 tervettä verrokkia ja 75 potilasta, jotka kärsivät edellä mainittujen autoimmuunisairauksien eli 35 RA, 15 SLE ja 25 SS (taulukko 1). Näistä alaryhmä lukien 10 verrokeilla, 10 RA, 2 SS ja 2 SLE potilasta laajasti immunophenotyped laaja paneeli vasta, eri yhdistelminä, jotta arvioida sisäiset standardit ennen täyden mittakaavan vaivaa (katso materiaalit ja menetelmät varten täydellinen luettelo vasta-aineita). Tällä tavoin eri T, B ja NK-solujen populaatioita tutkittiin. Ei havaittu merkittävää eroa potilaan ja kontrollipopulaatioissa (tuloksia ei ole esitetty). Tarkemmin jakauma NKG2D pinnalla αβ CD8

+ ja γδ T-lymfosyytit sekä NK-soluissa, aluksi testattu käyttäen yhteensä ääreisverenkierron soluvalmisteilla, ei paljastanut, odotetusti, ole mainittavaa eroa potilaiden ja verrokkien. Sitten kääntyi keskitymme väestölle kiinnostavaan ts CD4

+ NKG2D

+ T-solut (kuva 3). Suhde NKG2D ilmentymisen CD4

+ T-solujen havaittiin olevan yhtä samanlainen kaikissa terveillä vapaaehtoisilla (0,8-8,5%, keskiarvo 2,7%, keskihajonta 2), kaikki RA (0,4-9,7%, keskiarvo 2,1%, keskihajonta 1,9), kaikki SLE (0,3-7,8%, keskiarvo 2,4%, keskihajonta 2) ja kaikki SS potilasta (0-36,2%, keskiarvo 4%, keskihajonta 7,6) (kuva 4). Kaksi SS potilasta todettiin saavan on korkeampi NKG2D ilme CD4

+ T-soluja (18,6% ja 36,2% vastaavasti) (katso jäljempänä analyysi) (kuviot 4 ja 3.

Huom

: Kuva 3 esittää todellakin yksi tällainen potilas). Koska ennakkotapaus tutkimuksessa, joka oli löytänyt huomattavasti korkeampi CD4

+ NKG2D

+ T-solut RA vs. valvontaa, oli käyttänyt toinen anti-NKG2D mAb eli 1D11 (BD PharMingen) (vs. edellä käytetyt ON72 klooni , Beckman Coulter), testasimme myös tämä vasta-aine. Vertailu NKG2D värjäyksen joko vasta-CD4

+ T-solujen 3 terveillä vapaaehtoisilla, 4 RA, 1 SLE ja 2 SS ei havaittu merkitsevää eroa (keskimääräinen ero: 0,21; keskihajonta: 0,24). Lisäksi vertasimme myös tämän Immunofenotyypitys verrataan yhteensä ääreisveren vs. mononukleaarisissa soluissa, käyttäen ON72 mAb. Tämä arvioitiin 1 terveillä vapaaehtoisilla, 2 RA ja 2 SS ilman vihjaten mitään eroa (keskimääräinen ero: 0,33; keskihajonta: 0,52). Lopuksi ja jotta täysin vahvistaa setup, yksilökohtaiset vakaus NKG2D ilmaisun CD4

+ T-lymfosyyttien varmistettiin ajan 2 terveillä vapaaehtoisilla on vastaavasti päivinä 1/14 ja 1/120, 1 RA potilaalle d1 /D120 ja 2 SS potilaille d1 /D150. Ei merkittäviä eroja (keskiarvo: 0,31; keskihajonta: 0,5) havaittiin eri lymfosyyttien alapopulaatioiden ja etenkin CD4

+ T-solut ilmentävät NKG2D. Koska samaa edellä mainitun kertomuksen oli vihjasi induktioon NKG2D ilmaisun CD4

+ T-solujen päälle adjunction TNFa (

in vitro

), RA potilaita anti-TNFa-hoitoa ei ole sisällytetty tähän tutkimuksessa, vaikka alustavan analyysin kolme RA infliksimabia saaneilla potilailla ei havaittu merkitsevää eroa, kun taso NKG2D ilmaisun CD4

+ T-lymfosyyttien (tuloksia ei ole esitetty). Siten kaiken kaikkiaan emme pystyneet löytämään mitään merkittävää eroa CD4

+ NKGD

+ väestöstä terveillä verrokeilla vs. RA, SS tai SLE-potilaiden. Lopuksi, kuvio 5 antaa kokonaiskuva CD4

+ T-solu-altaan suhteen NKG2D ja /tai esiintyminen tai puuttuminen CD28.

Tämä esimerkki, joka on otettu toinen SS potilasta (Mrs XET) kätkeminen erityisen korkea suhde CD4

+ NKG2D

+ T-soluja (36,2%) esittää menetelmää käytetään, jotta luetella näiden solujen kaikki yksilöt (tarkastukset ja potilasta) sisältyvät tähän työhön rutiini 50 000 tapahtumaa analyysi.

Tämä kuva esittää CD4

+ NKG2D

+ T-solujen sisällä koko reuna-CD4-allas ohjaus, RA, SLE ja SS yksilöitä. Vaihtelua SS potilailla johtuu 2 henkilöille, joille ovat epätavallisen korkea suhde (katso varsinainen teksti selityksen). Mikään erot on merkittävä arvioituna Wilcoxonin tekstillä: p = 0,1658 kontrollille vs. RA; p = 0,9547 valvontaa vs. SLE ja p = 0,5012 valvonnasta vs. SS.

Tämä lisää lukuina, analysoi suhde CD4

+ T-solujen kätkeminen tai ei CD28 ja /tai NKG2D, vai ei. Mikään erot on tilastollisesti merkitsevä.

end-tavoite RA ollessa yhteinen, ryhdyimme vieressä analysoida CD4

+ NKG2D

+ ilmaisun tasoilla mononukleaarisolujen nivelen neste sadon Ficoll heysgradienttisentrifugoinnilla yhdestä RA kyynärpää ja 5 kontrollia (kolme polven nivelrikko ja kaksi ei autoimmuuni- polven niveltulehdus) potilasta. Jälleen mitään merkittävää eroa ilmaus NKG2D CD4

+ T-solujen korostettiin välillä valvonnan ja RA yhteisiin nesteissä, ja välillä ääreisverenkierron ja nivelnesteen yhdessä RA potilaalla (tietoja ei esitetty). Tutkimaan edelleen merkitystä ilmaisun NKG2D CD4

+ ja CD8

+ T-solujen

in situ

, nivelkalvon kudosta analysoitiin immunohistokemiallisesti, jotta määrällisesti läsnä CD4, NKG2D, CD8 ja MICA /B ilmentävien solujen. Tämä suoritettiin yhdessä RA (lonkkanivelen) ja yksi nivelrikon ohjaus (polvileikkaus) yksilön. Valvonnassa yksittäisten NKG2D havaittiin ilmentyvän 3,8% periferaalisen veren CD4

+ T-lymfosyytit vs. 2,5% näistä löytyy nivelnesteessä. Koska tämä yksilö ei tehnyt mitään aktiivista sisäistä niveltulehdus, ei ollut yllättävää, ei havaita huomattava infiltraatio CD4

+, CD8

+ +/- NKG2D

+ lymfosyyttien (MIC ekspressio havaittiin joko tässä potilasryhmässä). Vuonna RA potilas, NKG2D ilmentyi 0,9% verenkierron CD4

+ T-soluja (ei nivelvoidevalmistetta voitaisiin noutaa RA lonkan leikkauspotilaiden). Kudoksen soluttautua RA (kuvio 6A) oli pääasiassa CD4

+ (kuvio 6B), kun taas CD8 ilme oli pienempi (kuvio 6C). NKG2D ilme oli selvästi ilman CD4 ja paremmin kuin CD8 (kuvio 6D) (Huom .: nämä ovat erillisiä kudosleikkeiden, joten ei päällekkäin on mielekästä). Lopuksi, MICA /B ilmentyi sidekudosta /epiteelisolujen eikä tulehduksellisten infiltraattien (kuvio 7A ja B).

(A) Väri tahra värjäys hematoksyliini-eosiinilla. Immunohistokemiallista analyysiä käyttäen (B) CD4 (C) CD8 ja (D) NKG2D vasta-aineita. Suodoksesta on selvästi lymfosyyttisen alkuperää enemmistö CD4-T-solujen.

immunohistokemiallinen analyysi (A) (B) RA synoviitti ja (C) (D) SS lisävaruste sylkirauhasten värjättiin anti-MICA monoklonaalinen vasta-aine. MIC ilmaisu on selvästi epiteelin /fibroblastisia luonto molemmissa kudoksissa /elimiin.

Vaikka tuloksemme RA ovat ristiriidassa joidenkin aiemmin julkaistut tiedot, selkiyttää jälkimmäinen voisi auttaa laittaa tuloksemme ja itse asiassa koko kysymys näkökulmasta. Ennen tekemässä tällaista, me emme selvästi toistavat työn Groh et al. suhteen laajentamisen CD4

+ NKG2D

+ RA vaikka teimme parhaamme pysyä niiden protokollan esim käyttämällä samaa anti-NKG2D vasta-aineita jne. [15]. Saattaa olla järkevä selityksiä tällaiseen, joista toinen on puute mitään yksityiskohtaisia ​​tietoja suhteessa niiden potilasryhmää, esimerkiksi osa alle anti-TNFa-hoito jne syvempi analyysi kirjallisuuden osoittaakin, että laajentuminen tällä kertaa, CD4

+ CD28

– T-soluja, ei ole niin patognomisia RA kuin miltä se näytti alkaessa [18]. Itse uudempi analyysi riippumattoman kohortin potilaista osoittaa selvästi, että puolet potilaista RA (n = 94) (mukaan tekijöille niille vailla nodular RA ja sicca oireyhtymä) ei ollut merkittävää kasvua niiden reuna-CD4

+ CD28

– T-solu-allas suhteen säätimet (katso kuva 1 [43]. Lopulta Saez-Borderias ym. tuovat uuden käänteen ongelman ilmoittamalla induktio CD4

+ NKG2D

+ T-solujen vastauksena ihmisen sytomegalovirus (HCMV), joka johtaa kuvitella, että edellinen raportoitu laajennuksia voidaan joutua uudelleen arvioitava HCMV serologisen tilan potilaiden ja verrokkien. Tämä avaa myös avenue tämän alaryhmän tunnistaa, kuin HCMV, muut mikrobit, kohta ei testattu aiemmissa (ja on) tutkimuksissa [44].

koetin mahdollisen merkityksen CD4

+ NKG2D

+ T-solujen immunopatologia SS, immunohistokemia suoritettiin sylkirauhasten kudoksia pyrittäessä toteamaan CD4, NKG2D, CD8 ja MICA /B. Kolme SS sylkirauhasten kudokset saatiin biopsialla sairaalahoidon aikana, kun taas yksi ohjaus sylkirauhasten kudosta saatiin muuten terveillä vapaaehtoisilla yksittäisen aikana nenän itsenäiseen syistä. Vuonna ohjaus yksilön, immunohistokemia ei paljastanut läsnäolo mainittavia määriä CD4, CD8 ja /tai NKG2D ilmentävien solujen sopusoinnussa puuttuessa tulehdussuodoksen; tämä oli yhtä tapauksessa MICA /B ilmentyminen (dataa ei esitetty). SS, NKG2D ilmentyi vastaavasti 0,4, 0,9, 2% perifeerisen veren CD4

+ T-lymfosyytit. Immunohistokemia (kuvio 8A), focalized on tulehduksellisten infiltraattien, osoitti, että kaikki 3 potilaille, CD4-T-solut olivat yleisimpiä, jälleen toisiaan poissulkevia CD8 värjäytymistä (kuvio 8B ja C). Määrä ja jakautumista NKG2D ilmaisun tuntui olevan verrattavissa CD8 mutta ei CD4 (kuvio 8D, C ja B). Lisäksi MICA /B ilmentymistä havaittiin epiteelisolujen rauhastilavuus kanavia, mutta ei lymfaattisen infiltraatit (kuvio 7C ja D).

(A) Väri tahra värjäys hematoksyliini-eosiinilla. Immunohistokemiallista analyysiä käyttäen (B) CD4 (C) CD8 ja (D) NKG2D vasta-aineita. Suodoksesta on selvästi lymfosyyttisen alkuperää enemmistö CD4-T-solujen.

Mitä tulee SS, koska dokumentoitu ilmaus MIC geenien ja proteiinien epiteelisoluissa [24], otaksuttu osallistuminen erilaisten virusten SS patofysiologiassa [45] ja suhteellisen helppo päästä kohdekudokseen eli sylkirauhaset; Meidän tavoitteena oli määrittää tasolle

MIC

transkriptio terveillä ja SS kärsivät sylkirauhasten. Tähän päästiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR-analyysi

MICA

ja

MICB

selostukset. Ennen tekee sellaisiksi rauhanen RNA, käytetty menetelmä validoitu HeLa-soluissa; dokumentoitu olla kätkeminen

MICA /MICB

selostukset merkittävillä tasoilla, jossa nämä säätelevät solujen stressiä esim. lämpöshokin [7], [24]. Lämpöshokki suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [24]. Mitä tulee

MICA

oli 8x induktio 15 minuutin kuluttua ja 3,5 × varten

MICB

. 60 minuutin kuluttua induktio pysyi 4,5 × varten

MICA

ja 2 × varten

MICB

. Tyypillisiä qRT-PCR käyrää kuvassa 9A ja B. Within sylkirauhasen kudoksissa, vaikka ilme näkyy selvästi yksilöiden välisten erojen, ei merkittävää eroa voitu havaita välillä potilaiden ja verrokkien (kuvio 10A ja B).

KIILTEESTÄ

(A) ja

MICB

(B) mentymisprofiili analysoituna RT-qPCR. ▪ Näytteet 15 minuutin lämpöshokin jälkeen, ♦ Näytteet 60 minuutin lämpöshokin jälkeen, ▴ käsittelemättömiä kontrolleja.

suhteellinen ilmentymistaso

KIILTEESTÄ

(A) ja

MICB

(B) Sjögrenin syndrooma potilailla verrattuna terveisiin kontrolleihin. Erot potilaiden ja verrokkien eivät ole merkittäviä arvioituna Mann-Whitney

U

testi (α = 0,27

MICA

ja α = 0,53

MICB

).

Kuten edellä on vihjattu, kaikkien 75 potilasta analysoitiin kaksi SS potilasta (Mrs. XET ja XRL, tässä järjestyksessä tässä kohdassa) todellakin aiheuttavat erityisen korkea CD4

+ NKG2D

+ T-lymfosyyttien perifeerisen veren (vastaavasti 36,2% ja 18,6%).