Krooninen sairaus

tiivistelmä

Thiacremonone (2, 4-dihydroksi-2, 5-dimetyyli-tiofeeni-3-oni) on antioksidantti aineen uutena rikkiyhdiste syntyy korkean lämpötilan-High-Pressure-käsiteltyjen valkosipuli. Peroxiredoxin 6 (PRDX6) on jäsen, peroksidaasit ja on glutationiperoksidaasin ja kalsium-riippumaton fosfolipaasi A2 (iPLA2) toimintaa. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että PRDX6 stimuloi keuhkosyövän solun kasvun korottamalla glutationiperoksidaasiaktiivisuuden. Laajennuspaikkatelakointiasema malli tutkimus ja vetää alas testi osoitti, että thiacremonone täysin sopii aktiiviseen kohtaan (cys-47) glutationiperoksidaasi of PRDX6 ja vuorovaikutuksessa PRDX6. Siten, tutkimme thiacremonone estää solujen kasvua estämällä glutationiperoksidaasi- of PRDX6 ihmisen keuhkosyövän soluja, A549 ja NCI-H460. Thiacremonone (0-50 ug /ml) esti keuhkosyövän solukasvun pitoisuus riippuvalla tavalla induktion kautta apoptoottisen solukuoleman mukana induktion katkaistun kaspaasi-3, -8, -9, Bax, p21 ja p53, mutta lasku XIAP , CIAP ja Bcl2 ilme. Thiacremonone edelleen esti glutationiperoksidaasiaktiivisuuden keuhkojen syöpäsoluja. Kuitenkin, solujen kasvua estävä vaikutus thiacremonone ei havaittu keuhkosyöpä transfektoitujen solujen mutantti PRDX6 (C47S) ja läsnä ollessa ditiotreitolia ja glutationin. Eräässä allograft in vivo -mallissa, thiacremonone (30 mg /kg) inhiboi myös kasvaimen kasvua mukana vähentäminen PRDX6 ilmaisun ja glutationiperoksidaasin aktiivisuus, mutta lisääntyneen ekspression pilkottiin kaspaasi-3, -8, -9, Bax, p21 ja p53 . Nämä tiedot osoittavat, että thiacremonone estää kasvaimen kasvun eston kautta glutationiperoksidaasiaktiivisuuden PRDX6 vuorovaikutuksen kautta. Nämä tiedot viittaavat siihen, että thiacremonone voi olla mahdollisesti hyödyllisiä vaikutuksia keuhkosyöpä.

Citation: Jo M, Yun H-M, Park K-R, Park MH, Lee DH, Cho SH, et al. (2014) Anti-Cancer vaikutus Thiacremonone kautta Down asetukseen Peroxiredoxin 6. PLoS ONE 9 (3): e91508. doi: 10,1371 /journal.pone.0091508

Editor: Peiwen Fei, Havaijin yliopiston Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 joulukuu 2013; Hyväksytty: 13 helmikuu 2014; Julkaistu: 11 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Jo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama Korean hallitus (MSIP) (nro MRC, 2008-0062275). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Peroxiredoxins (PRDXs) ovat perhe peroksidaasien antioksidanttina entsyymit [1] – [2]. PRDX perheeseen kuuluu kuusi jäsentä. Ne jaetaan kahteen luokkaan [3]. 2-Cys ryhmään kuuluvat PRDX1-5, kun taas PRDX6 on vain jäsenenä 1-Cys ryhmä. PRDXs ovat perheen peroksidaasit, jotka tuhoavat peroksidit käyttäen konservoitunutta kysteiinitähdettä on katalyyttisestä keskuksesta [4]. Niistä kuusi nisäkkäiden tämän perheen jäseniä, PRDX6 on ainoa jäsen, joka on glutationiperoksidaasi ja kalsium-riippumaton fosfolipaasi A2 (iPLA2) toiminta [5]. Kun taas muut PRDXs käyttää tioredoksiinia fysiologinen pelkistimenä, PRDX6 käytetään glutationi [6]. PRDX6 suojaa soluja kalvo, DNA, proteiinin vahingot, ja lipidiperoksidaation [7]. Antioksidantti vaste-elementti (ARE) on prdx6 promoottorialueen,

cis

LINJASÄÄTÖVENTTIILIT säädin elementti, aktivoituu oksidatiivisen stressin [8]. Transkriptio PRDX6 geeni säätelee tumatekijä erytroidi- 2 liittyvät tekijät 1, 2, ja 3 (Nrf1, Nrf2, ja Nrf3), kuten transkriptiotekijöiden sitoutumisen kautta ARE [9]. Niistä Nrfs, Nrf2 säätelee positiivisesti transkription PRDX6 geenin [10].

PRDXs ovat antioksidantteja, ne tukevat selviytymistä ja kasvaimen ylläpito solujen suojaaminen oksidatiivisen stressin indusoiman apoptoosin [11]. Tuoreessa tutkimuksessa yli ilmentyminen PRDX 6 vaimentaa sisplatiinin aiheuttaman apoptoosin ihmisen munasarjasyöpäsoluja [12]. Sen sijaan, vähentäminen PRDX6 ilmentymisen kasvoi peroksidi-indusoituvaa solukuolemaa maksasyövän soluihin [13]. Invaasio ja metastaasi edistää toimia PRDX6 on todettu keuhkosyövän solujen aktivaation kautta Akt aktivoimalla phosphoinositiede 3-kinaasi (PI3K) ja p38-kinaasin [4], [14]. Aktiivisuus PRDX6 myötävaikuttaa metastaattisen kyvyn keuhkosyöpään solujen stimuloimalla invaasio komponentteja kuten PI3K, Akt, ja uPA [4]. On myös raportoitu, että PRDX6 ilmentymistä keuhkosyövässä soluissa liittyi merkitsevästi kasvaimen etenemistä [15].

valkosipuli on käytetty perinteisen lääketieteen elintarvikkeiden komponentti estää syövän kehittymistä [16]. Thiacremonone (2,4-dihydroksi-2,5-dimetyyli-tiofeeni-3-oni) on antioksidantti aine, uutena rikkiyhdiste, joka on luotu korkean lämpötilan High-Pressure (HTHP) hoidettujen valkosipulia [17]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet syövän vastaisen vaikutuksen ja thiacremonone inhibition kautta glutationiperoksidaasiaktiivisuuden vuorovaikutuksen kautta keuhkojen syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

eristäminen ja karakterisointi thiacremonone

rakenne rikkiä eristetyn yhdisteen valkosipuli (nimeltään thiacremonone) on esitetty tulokset (Fig. 1A). Valkosipuli (Allium sativum L), kuumennettiin 130 ° C: ssa 2 tuntia. Lämmitetty näytteet juiced ja sitten se suodatettiin Buchner-suppilon vakuumissa. Lämmitetty valkosipuli mehu jaettiin peräkkäin erotussuppiloon käyttäen etyyliasetaattia. Yhdisteiden eristämiseksi etyyliasetaatti kerros kuumennetaan valkosipulin mehua ajettiin kolonnikromatografia silikageelillä. Tämä jae, joka sisälsi thiacremonone puhdistettiin preparatiivisella RP-HPLC: llä jälkeläisensä SP930D Instrument [17]. Thiacremonone erotettiin 0,01% dimetyylisulfoksidia, ja käsiteltiin pitoisuuksilla 10, 20 ja 50 ug /ml viljelmässä soluja.

(A) rakenne thiacremonone, joka on sulfurcompound eristetty valkosipuli. (B) Rekombinantti proteiini PRDX6 inkuboitiin thiacremonone-konjugoidun Sepharose 4B. (C) kaikkiaan solulysaateista NCI-H460 inkuboitiin thiacremonone-konjugoidun Sepharose 4B. Saostuksen jälkeen tasot sitoutuneen PRDX6 seurattiin Western blot-analyysi. (D) jälkeen saostamalla thiacremonone-konjugoidun Sepharose 4B, tasot sitoutuneen PRDX6 tai mutantti-PRDX6 C47S seurattiin Western blot -analyysillä. (E) Ribbon edustus telakointi malli thiacremonone kanssa PRDX6 (F) Molecular pinta edustus telakointi malli thiacremonone kanssa PRDX6.

Cell Culture

A549 ja NCI-H460 keuhkosyöpäsolua linjat hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). CCD-18Co paksusuolen normaali solulinja ja LL24 keuhkojen normaali solulinja hankittiin Korean solulinjasta pankki (Seoul, Korea). NCI-H460 ja LL24 normaaleja soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja penisilliiniä /streptomysiiniä (100 U /ml). A549 ja CCD-18Co normaaleja soluja viljeltiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja penisilliiniä /streptomysiiniä (100 U /ml). Sitten soluviljelmiä pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO2.

solunelinkykyisyysmääritys

määrittämiseksi solujen määrä, A549 ja NCI-H460-keuhkosyövän solut tai CCD- 18Co paksusuolen normaalin solulinjan ja LL24 keuhkojen normaali solulinja maljattiin 24-kuoppalevyille (5 x 10

4 solua /kuoppa). Subkonfluentit solut käsiteltiin seuraavaksi thiacremonone (10, 20, ja 50 ug /ml) 72 tunnin ajan. Käsittelyn jälkeen solut trypsinoitiin ja pelletoitiin sentrifugoimalla 5 minuutin ajan 1500 rpm: ssä, suspendoitiin uudelleen 5 ml: aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), ja 0,1 ml 0,2% trypaanisinisellä lisättiin syövän solususpensiota kuhunkin ratkaisuja (0,9 ml kukin). Sen jälkeen, pisara suspensiota laitettiin Neubauer kammion ja elävien syövän solut laskettiin. Solut, jotka osoittivat merkkejä värjäytymisen katsottiin kuollut, kun taas ne, jotka ulkopuolelle trypansininen pidettiin kannattava. Kukin määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Transfektio

Keuhkosyöpä solut (5 x 10

4 solua per kuoppa) maljattiin 24-kuoppalevyille ja transfektoitiin ohimenevästi PRDX6 siRNA ( Santa Cruz Biotechnology) tai pcDNA-PRDX6, (antelias lahjoja DR. Jhang Ho Pak, University of Ulsan College of Medicine, käyttäen eluenttina Prdx6 siRNA tai pcDNA-Prdx6 ja WelFect-EX PLUS reagenssina OPTI-MEN mukaan valmistajan ohjeiden (WelGENE, Seoul, Korea).

Luciferase Activity Assay

A549 ja NCI-H460 ihmisen keuhkosyövän solut transfektoitiin prdx6 promoottori-Luc-plasmidi käyttäen seosta, jossa plasmidin ja WelFect EX PLUS reagenssi OPTI-MEN mukaan valmistajan ohjeiden (WelGENE, Seoul, Korea). Kun 6 tunnin kuluttua solut käsiteltiin thiacremonone. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä lusiferaasimääritystä kit (Promega, Wisconsin, USA) valmistajan ohjeiden (WinGlow, Bad Wildbad, Saksa).

Western blot -analyysi

kalvoa inkuboitiin 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, jossa spesifisiä vasta-aineita: kanin polyklonaalinen ja PRDX6 ja cIAP2 (1 :1,000 laimennus, Abcam, plc. Cambridge UK), XIAP, Bcl2, kaspaasi-3, kaspaasi-9 (1:1,000 laimennus, Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA), Bax (1:500 laimennus, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) ja hiiren monoklonaalinen p53, ja kaspaasi-8 (1:1,000 laimennus, Cell Signaling Technology, Inc.), p21 (1:500 laimennus, Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Blottia inkuboitiin sitten vastaavan konjugoidulla anti-kani-anti-hiiri-immunoglobuliini G-piparjuuriperoksidaasi (1:2,000 laimennus, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Immunoreaktiivisia proteiineja ei havaittu ECL Western blotting tunnistusjärjestelmä.

glutationiperoksidaasiaktiivisuuden määritys

GPX co-substraatti-seosta, mukaan lukien nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatin (NADPH), glutationi ja glutationi-reduktaasi, käytettiin mitata glutationiperoksidaasi- aktiivisuutta in vitro. GPX Assay Kit hankittiin Cayman Chemical (Michigan, USA) ja menettelyt tehtiin mukaan valmistajan ohjeiden. Käsittelyn jälkeen solut, ne homogenoitiin, ja altistettiin määrityksen, ja absorbanssi arvo mitattiin 340 nm: ssä ja normalisoitiin proteiinin pitoisuus.

Molecular Modeling

kiderakenne PRDX6 (ATE koodi 1prx) käytettiin telakointi tutkimuksen. Thiacremonone rakennettiin käyttäen Maestro rakentaa paneeli. Yhdiste minimoitu käyttäen Impact moduuli Maestro Schrödingerin Suite -ohjelman. Lähtö- koordinaatti PRDX6 edelleen muutettu sitova ennustamiseen. Proteiini rakenne minimoitiin käyttämällä Protein valmistelu Wizard soveltamalla OPLS voimakenttä. Ruudukon sukupolven sitoutumiskohta määriteltiin painopisteen Cys 47 katalyyttiseen keskukseen PRDX6. Ligandin telakointi osaksi katalyyttiseen keskukseen PRDX6 suoritettiin käyttäen Schrödingerin telakka-ohjelman, Glide. Minimoitu konformaatio thiacremonone telakoitiin valmisteltuun reseptorin verkkoon. Paras-typistetty aiheuttaa valittiin ensimmäisen kovalenttiset mallin Cys 47 katalyyttiseen keskukseen PRDX6 kanssa thiacremonone. Kovalenttiseen kompleksit edelleen minimoida käyttämällä jyrkimmän laskeutumisen algoritmia. Molecular grafiikkaa kovalenttinen sitoutuminen malli thiacremonone tuotettiin käyttämällä PyMol paketti (https://www.pymol.org).

Pull Down Pitoisuus

Thiacremonone konjugoitiin syanogeenibromidilla ( CNBr) aktivoiduilla Sepharose 4B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Lyhyesti, thiacremonone (1 mg) liuotettiin 1 ml: aan kytkentäpuskuria (0,1 M NaHCO 3 ja 0,5 M NaCl, pH 6,0). CNBr-aktivoituun Sepharose 4B: paisutettiin ja pestiin 1 mM HCl: ää läpi lasisintterisuodattimella, pestiin sitten kytkimen puskurilla. CNBr-aktivoitu Sepharose 4B lisättiin thiacremonone sisältävä kytkentäpuskurissa ja inkuboidaan 4 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Thiacremonone-konjugoitu Sepharose 4B pestiin kolme sykliä vuorotellen pH pesun puskurit (puskuri 1, 0,1 M asetaatti ja 0,5 M NaCl, pH 4,0; puskuri 2, 0,1 M Tris-HCl ja 0,5 M NaCl, pH 8,0). Thiacremonone-konjugoituja helmiä tasapainotettiin sitten sitovan (0,05 M Tris-HCI: a ja 0,15 M NaCl, pH 7,5). Ohjaus- konjugoimattoman CNBr-aktivoituun Sepharose 4B valmistettiin kuten edellä on kuvattu ilman thiacremonone. Solulysaatti tai PRDX6 rekombinanttiproteiinia (Abnova, Taipei, Taiwan) sekoitettiin thiacremonone-konjugoitu Sepharose 4B tai Sepharose 4B 4 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Sitten helmet pestiin kolme kertaa TBST: llä. Sitoutuneet proteiinit eluoitiin SDS-latauspuskuria. Sitten proteiinit erotettiin SDS-PAGE seurasi immunoblottaus vasta-aineita PRDX6 (1:1,000 laimennus, Abcam, plc. Cambridge, UK).

Ethics lausunto

Kaikki kokeet hyväksyttiin ja suoritettava oppaasta Care ja eläinten käyttöä [Animal Care komitean Chungbuk National University, Korea (CBNUA-436-12-02)].

eläinkoetta

12- viikon ikäisten C57BL /6J-Tg (Prdx6) hiiret hankittiin Jackson Lab (Maine, USA) ja 12 viikkoa vanhoja C57BL /6-hiiriä hankittiin Koatech (Pyeongtaek, Korea). Hiiret jaettiin neljään ryhmään. Lewis-keuhkokarsinooma (LLC) solua injektoitiin s.c. (1,2 x 10

6 kasvainsolujen /0,1 ml PBS /eläin) kanssa 27 neula. Jälkeen 10 päivää, kaksi ryhmää hiiriä (n = 10) olivat i.p. ruiskutetaan thiacremonone (30 mg /kg PBS: ssä ja 0,01% DMSO: ta) kaksi kertaa viikossa 3 viikon ajan. Kontrolliryhmän hiirille (n = 20) sai vehikkeliä [PBS: llä ja 0,01% DMSO: ta (i.p.)]) kaksi kertaa viikossa 3 viikon ajan. Ihon alle kasvaimia suurin sallittu koko on 20 mm halkaisijaltaan hiirelle, joten me uhrattiin kaikki hiiret ennen maksimikoko Niskanmurto suoritettiin eutanasia.

immunohistokemia

Kaikki kudosnäytteet kiinnitettiin formaliiniin ja parafiinin suljettu tutkittavaksi. Luvuissa 4 pm paksu värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Sidonta välillä thiacremonone ja PRDX6

vuorovaikutus arvioitiin avattavassa määritys käyttäen thiacremonone- Sepharose 4B, ja sen jälkeen PRDX6 havaittiin immunoblottauksella anti-PRDX6. Tulokset osoittivat, että thiacremonone sidottu rekombinantti PRDX6 proteiinin tai solulysaateista, jotka sisältävät PRDX6 proteiinia ihmisen NCI-H460-keuhkosyövän soluja. (Fig. 1 B ja C). Identiteetin sitoutumiskohdan thiacremonone ja PRDX6, teimme laskennallinen telakointi malli thiacremonone kanssa PRDX6 alle Schrödingerin telakka-ohjelman, Glide. Tulokset telakka-tutkimukset viittaavat siihen thiacremonone voi sitoutua kovalenttisesti Cys 47 tähteen PRDX6 katalyyttisen. Nauha edustus telakointi malli thiacremonone kanssa PRDX6 osoitti, että seuraavat vuorovaikutukset ovat mahdollisia katalyysikohdan; sivuketju Thr 44, Met 127 ja Val 46 PRDX6 (Fig. 1 E). Löysimme myös vähentynyt sitoutuminen thiacremonone mutantti PRDX6 C47S verrattuna PRDX6 (Fig. 1 D). Kuten on esitetty kuviossa. 1F, molekyylipinnalla esitys telakointi malli, jossa sitova tasku thiacremonone muodostuu PRDX6.

vaikutus Thiacremonone on PRDX6-Lusiferaasiaktiivisuutta ja Expression ja aktiivisuus PRDX6

Voit testata, onko vuorovaikutus välillä thiacremonone ja pRDX6 voisi vaimentaa prdx6-välitteistä promoottorin aktiivisuuden ja ilmentymisen jälkeen solut käsiteltiin thiacremonone (10, 20, ja 50 ug /ml) 6 tuntia A549 ja NCI-H460 ihmisen keuhkosyövän soluja, jotka on transfektoitu prdx6 riippuva lusiferaasireportterilla konstrukti. Lusiferaasiaktiivisuus syöpäsolujen transfektoitu prdx6 promoottori-Luc-plasmidi oli yli 5 * 10

4 RLU /mg proteiineja, ja käsittely thiacremonone aiheutti tukahduttaminen lusiferaasiaktiivisuuden syöpäsoluissa (Fig. 2A). Yhdenmukainen estävä vaikutus lusiferaasiaktiivisuuden ilmentyminen PRDX6 myös laski thiacremonone syöpäsoluissa (Fig. 2B). Olemme edelleen vahvistaneet suhteellinen glutationiperoksidaasi aktiivisuutta thiacremonone. Thiacremonone esti glutationiperoksidaasiaktiivisuuden sekä keuhko- syöpäsoluja, 72 tuntia käsittelyn jälkeen thiacremonone kuten on esitetty kuviossa. 2C. Nämä tulokset viittaavat siihen, että sitoutumisen thiacremonone on PRDX6 johtaa inhibitioon PRDX6 ilmentymisen ja aktiivisuuden.

(A) Keuhkosyöpä solut transfektoitiin prdx6-lusiferaasiplasmidin, ja sitten käsiteltiin thiacremonone 6 tunnin ajan. Lusiferaasiaktiivisuus määritettiin sitten, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. (B) Keuhkosyöpä soluja käsiteltiin thiacremonone 72 tuntia. Solu-uutteet analysoitiin western-blottauksella. Jokainen kuva ja bändi on tyypillinen kolmen erillisen kokeen. (C) tasot glutationiperoksidaasiaktiivisuuden keuhkosyövän soluja mitattiin käyttäen määritystä sarjat, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. (D) Solut kerättiin trypsinisaatiolla ja värjättiin 0,2% trypaanisinisellä. Arvot (A, C ja D) ovat keskiarvoja ± S.D. * P 0,05 verrattuna merkittävästi erilaisia ​​kuin käsittelemätön kontrolli soluista.

vaikutus Thiacremonone solujen kasvuun eri syöpäsolujen lukien Keuhkosyöpä Cells

Koska PRDX6 on sekaantunut keuhkojen syöpäsolujen kasvua, tutkimme, onko vuorovaikutus thiacremonone ja PRDX6 voi estää PRDX6 aktiivisuutta, ja siten estävät syöpäsolujen kasvua. Arvioida inhiboivaa vaikutusta thiacremonone solujen kasvuun keuhkosyövän soluja, A549 ja NCI-H460, analysoitiin solujen elävyys suoralla solujen laskenta. Solut käsiteltiin useita pitoisuuksia thiacremonone (10, 20, 50 ug /ml) 72 tuntia. Kuten kuviossa 2D, thiacremonone esti solujen lisääntymisen keuhkosyövän soluja konsentraatiosta riippuvalla tavalla. Seitsemänkymmentä kahden tunnin hoidossa thiacremonone estivät A549 kasvua IC

50 arvoon 46 ug /ml, ja NCI-H460-solujen kasvun IC

50-arvot 42 ug /ml, vastaavasti. Morfologiset havainto osoitti, että solut vähitellen koko pienenee ja muuttunut pieni pyöreä yksittäinen solu muotoinen hoitoon thiacremonone A549-soluissa ja NCI-H460-soluissa. Olemme vahvisti normaalien solujen kasvun esto käyttäen CCD-18 paksusuolen ja LL24 keuhkojen normaalien solujen. Kuitenkin, thiacremonone ei havaittu sytotoksista vaikutusta normaaleihin soluihin (kuvio S1).

vaikutus Thiacremonone on apoptoottisen solukuoleman ja ilmentäminen apoptoottinen Regulatory Proteins

Apoptoosi on prosessi, ohjelmoitu solukuolema joka on tärkeä rooli syövän vaikutukset kemoterapeuttisten [18]. Määrittämään, että solujen kasvun inhibitio, jonka thiacremonone johtui induktion apoptoottisen solukuoleman, arvioimme muutokset kromatiinin solujen morfologian avulla DAPI värjäyksessä, mitä seurasi TUNEL värjäys määrityksissä. Kaksinkertainen leimatut solut analysoitiin sitten fluoresenssimikroskoopilla. Käänteisesti solun kasvun estäminen, DAPI-värjätty TUNEL-positiiviset solut lisääntyneet huomattavasti thiacremonone käsitellyissä soluissa. Hoitoon thiacremonone johti noin 45% ja 65% induktio apoptoottisen solukuoleman A549 ja NCI-H460 syöpäsolujen, vastaavasti (Fig. 3A). Aktivointi solukuoleman säätelevien proteiinien, mukaan lukien kaspaasit-9 ja-3, samoin kuin Bax, johtaa apoptoosin syöpäsoluissa [19]. Selvittää ilmentymisen solukuoleman sääntelyn proteiinien thiacremonone, ilmaus apoptoottisen solukuoleman liittyvät proteiinit tutkittiin Western blot-. Ilmentymisen pro-apoptoottisten proteiinien, Bax ja pilkottu muoto kaspaasi-3, -8, -9, ja p21 ja p53 olivat kasvoi hoito thiacremonone. Kuitenkin ilmaus Bcl2, XIAP, ja cIAP2 pieneni käsittelemällä thiacremonone (Fig. 3B).

(EN) keuhkosyövän soluja käsiteltiin puuttuessa (

vasemmanpuoleiset paneelit

) ja läsnäolo thiacremonone (50 ug /ml,

oikeus pannels

) 72 tunnin ajan, ja sitten merkitty DAPI ja TUNEL ratkaisu. Solujen kokonaismäärä tietyllä alueella määritettiin käyttämällä DAPI tumavärjäystä (fluoresenssimikroskoopilla). Vihreä väri kiinteän soluissa merkitsee TUNEL-leimattuja soluja. Kvantifiointiin, kolme satunnaisesti valittua alueilla arvioitiin. Apoptoottiset-indeksi (%) määritettiin (TUNEL-positiivisten solujen määrä /yhteensä DAPI värjätään solujen määrä) x 100 (suurennus, 200 x). Arvot ovat keskiarvoja ± S.D. * P 0,05 verrattuna merkittävästi erilaisia ​​kuin käsittelemätön kontrolli soluista. (B) toinen keuhkosyövän soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla thiacremonone (10, 20, ja 50 ug /ml) 72 tuntia. Ilmentyminen apoptoosin säätelevien proteiinien määritettiin käyttämällä Western blot -analyysiä. Jokainen kuva ja bändi on tyypillinen kolmen erillisen kokeen.

Käänteinen of inhiboiva vaikutus Thiacremonone Cancer Cell Growth transfektoimalla Mutant PRDX6 (C47S) B

Sen tutkimiseksi, solujen kasvua oli inhiboi vuorovaikutuksen thiacremonone ja PRDX6, keuhkosyöpä solut transfektoitiin C47S-prdx6. Inhiboivaa vaikutusta thiacremonone on syöpäsolujen kasvua käännetään mutantti PRDX6 (C47S), ja ilmaisun ja toimintaa PRDX6 on myös käänteinen (Fig. 4). Nämä tulokset viittaavat siihen, että vuorovaikutus PRDX6 kanssa thiacremonone saattaa olla merkitystä keuhkosyövän solujen kasvua, ja thiacremonone estää keuhkojen syöpäsolujen kasvua (Fig. 4A) kautta suppression PRDX6 ilmentymisen (Fig. 4B) ja glutationiperoksidaasiaktiivisuuden (Fig. 4C) . Lisäksi DTT ja GSH tukahdutti estäviä vaikutuksia thiacremonone solun kasvuun, PRDX6 ilmaisun ja glutationiperoksidaasiaktiivisuuden (Fig. 5). Nämä tiedot osoittivat, että thiacremonone esti solujen kasvun inhibition kautta glutationiperoksidaasin aktiivisuutta ja ekspressiota PRDX6.

(A) Keuhkosyöpä solut transfektoitiin pcDNA-prdx6 tai pcDNA-prdx6 C47S, ja sitten, thiacremonone käsiteltiin ( 50 ug /ml) vielä 72 tunnin ajan. Solut kerättiin trypsinisaatiolla ja värjättiin 0,2% trypaanisinisellä. (B) Solu-uutteet analysoitiin western-blottauksella. Jokainen kuva ja bändi on tyypillinen kolmen erillisen kokeen. (C) tasot glutationiperoksidaasiaktiivisuuden keuhkosyövän soluja mitattiin käyttäen määritystä sarjat, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Arvot ovat keskiarvoja ± S.D. #, P 0,05 merkittävästi erilainen käsittelemätön kontrolli soluista. *, P 0,05, merkitsevästi erilainen käsittelemätön kontrolli transfektoitujen solujen pcDNA-prdx6 C47S.

, p 0,05, merkitsevästi erilainen pcDNA-prdx6 ja pcDNA-prdx6 C47S käsiteltiin thiacremonone.

(A) Keuhkosyöpä solut yhdessä käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla DTT ( 10 ja 100 nM) tai GSH (100 ja 200 uM) kanssa thiacremonone (50 ug /ml) 72 tuntia. Solut kerättiin trypsinisaatiolla ja värjättiin 0,2% trypaanisinisellä. (B) Solu-uutteet analysoitiin western-blottauksella. Jokainen kuva ja bändi on tyypillinen kolmen erillisen kokeen. (C) tasot glutationiperoksidaasiaktiivisuuden keuhkosyövän soluja mitattiin käyttäen määritystä sarjat, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Arvot (A ja C) ovat keskiarvoja ± S.D. #, P 0,05 verrattuna merkitsevästi erilainen käsittelemättömien solujen thiacremonone. *, P 0,05, poikkeavat merkittävästi käsittelemättömien solujen DTT tai GSH ..

, p 0,05, merkitsevää eroa käsiteltyjen solujen kanssa thiacremonone ja yhteistyössä käsiteltyjen solujen DTT tai GSH ja thiacremonone.

thiacremonone Inhibioitu kasvaimen kasvua in vivo allograft

selventämiseksi kasvaimen vastainen vaikutus thiacremonone in vivo, kasvaimen kasvu allograftin kantavien hiirten seuraavat thiacremonone hoitoja tutkittiin. LLC siirteen tutkimuksissa thiacremonone oli ylläpitäjä vatsakalvonsisäisesti kahdesti viikossa 3 viikon ajan hiirille. Kasvaimen tilavuus mitattiin viikoittain, ja kaikki hiiret tapettiin kokeen lopussa, kun kasvaimet leikeltiin ja painotettu. Inhiboivaa vaikutusta thiacremonone kasvuun keuhkojen kasvain oli merkittävä sekä allograftin malleja käyttäen C57BL /6J-hiirissä sekä PRDX6 yliekspressoitu hiirillä. Suhteellinen kasvaimen kasvu mitattiin sen jälkeen, kun hoito thiacremonone (30 mg /kg, n = 10). Kasvaimen kasvua C57BL /6J (kasvaimen tilavuus; 8000,4 ± 2000,7 mm

3, kasvain painaa, 4,7 ± 0,82 g) hiirillä oli merkitsevästi väheni thiacremonone (kasvaimen tilavuus; 4543,6 ± 731,1 mm

3, kasvaimen paino; 3,45 ± 0,31 g, Fig. 6A). Tämä inhiboiva vaikutus havaittiin PRDX6 yli-ilmentynyt hiirissä (kasvaimen tilavuus; 10060,5 ± 1039,6 mm

3 (Tg-kontrolli) vs. 5048,9 ± 737,9 mm

3 (Tg-thiacremonone), tuumorin paino; 4,9 ± 0,21 g (Tg -Säätimet) versus 3,44 ± 0,78 g (Tg-thiacremonone), Fig. 6B). Immunohistokemia analyysi kasvaimen osio H 0,05 merkittävästi erilainen kuin käsittelemättömän hiirillä. (C) kasvaimen osat normaaleissa hiirissä analysoitiin H 3,6 ng /ml [26], ja IC

50 7,3 ug /ml isät [34]. IC

50 S-allylcysteine ​​(SAC) ihmisen metastaattista soluissa oli noin 5,3 mg /ml päivänä 3 [28]. Hoidon jälkeen 24 tunnin ajan, solujen kasvun eturauhassyövän solut 9 ug /ml sulforaphane (SFN) oli 10,2 ± 3,1% verrattuna kontrollisoluissa (100%) [29]. Vaikka pitoisuudet yhdisteitä johtavat syöpäsolujen kasvun estäminen ovat erilaisia, se riippuu solutyypistä ja yhdisteet käsitellään, johdettujen yhdisteiden valkosipulia, mukaan lukien thiacremonone on syövän vastaisen vaikutuksen. Kuitenkin tarkka toiminta mekanismit ovat vielä epäselviä.

Kuten PRDX6 kaivella peroksidia, kuten pienten H

2O

2, se tukee selviytymistä syöpäsolujen ja kasvaimen kunnossapito [30]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että PRDX6 edistää ja metastaasit erilaisia ​​syöpäsoluja, kuten keuhko-, rinta-, ja munasarjan syöpäsolujen [4], [12], [31]. PRDX6 ilmentyy kaikissa tärkeimpien elinten, jossa on erityisen korkea keuhkoissa [32]. Lisäksi PRDX6 havaittiin korkeammilla tasoilla keuhkojen okasolusyöpä potilaista [33]. Yliekspressio PRDX6 lisääntynyt keuhkosyövän solujen kasvua kautta aktiivisuus PRDX6 [4]. Näin ollen, PRDX6 tiettyjen yhdisteet voivat olla tehokkaita keuhko kasvaimen kasvun eston kemoterapeuttiset. PRDX6 on kaksi entsyymiä, kuten glutationiperoksidaasi ja iPLA2 [32]. Glutationiperoksidaasi- edistää syöpäsolujen kasvua estämällä apoptoosin ja suurempi todennäköisyys tai pahenemisvaiheita, mukaan lukien keuhkojen etäpesäkkeiden ja paikallisen uusiutumisen [34]. Glutationiperoksidaasi- estää sisplatiinin indusoiman apoptoosin kautta alas-säätely Bcl2 NCI-H460 ihmisen keuhkojen syöpäsoluja [35].