Krooninen sairaus

tiivistelmä

kilpirauhassyöpä on yleisin hormonitoiminnan pahanlaatuinen sairaus ja esiintyvyys kasvaa.

DACT2

todettiin usein metyloitavaa ihmisen keuhkosyövän ja maksasyövän. Tutkia epigeneettiset muutos ja rooli

DACT2

kilpirauhassyövän hoitoon, 7 kilpirauhassyöpä solulinjoissa, 10 tapausta ei-syöpä kilpirauhasen kudosnäytteistä ja 99 tapausta ensisijaisen kilpirauhassyövän näytteet mukana tässä tutkimuksessa. DACT2 ilmennettiin ja metyloitumaton K1, SW579, FTC-133, TT, W3 ja 8505C solulinjoissa. Menetys ilmaisun ja täydellinen metylointi havaittiin TPC-1-soluissa. Palauttaminen DACT2 indusoitiin 5-atsa-2’deoxycytidine hoitoon. Se osoittaa, että ilmaus

DACT2

säädeltiin promoottorialue metylaatio. Ihmisen ensisijainen papillaarinen kilpirauhassyöpä, 64,6% (64/99) oli metyloitu ja metylaation DACT2 liittyi imusolmuke etäpesäke (p 0,01). Re-ilmentyminen

DACT2

tukahduttaa solujen lisääntymistä, invaasiota ja maahanmuuttoa TPC-1-soluissa. Aktiivisuus TCF /LEF estyi DACT2 villityypin tai mutantti-β-kateniinin soluja. Aktiivisuus TCF /LEF korotettiin kotransfektoimalla DACT2 ja Dvl2 villityypin tai mutantti β-kateniinin soluissa. Yli-ilmentymisen villityypin β-kateniinin edistää solujen maahanmuuton ja hyökkäyksen DACT2 stabiilisti ilmaistu soluissa. Ekspression β-kateniinin, c-myc, cyclinD1 ja MMP-9 laskivat ja taso fosforyloidun β-kateniinin (p-β-kateniinin) lisättiin palautumisen jälkeen DACT2 ilmentymisen TPC-1-soluissa. Ekspression β-kateniinin, c-myc, cyclinD1 ja MMP-9 lisättiin ja taso p-β-kateniinin väheni sen jälkeen, kun pudotus on DACT2 on W3 ja SW579-soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että DACT2 vaimentaa ihmisen papillaarinen kilpirauhassyövän kasvua ja etäpesäkkeiden estämällä Wnt signalointia. Lopuksi

DACT2

usein metyloitu papillaarinen kilpirauhassyövän. DACT2 ilmentyminen säädeltiin promoottorialue metylaatio.

DACT2

tukahduttaa papillaarinen kilpirauhassyövän lisääntymistä ja etäpesäkkeiden estämällä Wnt signalointia.

Citation: Zhao Z, Herman JG, Brock MV, Sheng J, Zhang M, Liu B, et al. (2014) metylointi

DACT2

Edistää papillaarinen kilpirauhassyövän etäpesäke aktivoimalla Wnt Signaling. PLoS ONE 9 (11): e112336. doi: 10,1371 /journal.pone.0112336

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 25 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 08 lokakuu 2014; Julkaistu: 06 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustusta National Basic Research Program (973 Ohjelmanro 2012CB934002, 2010CB912802), National Key Scientific väline Special ohjelma Kiina (Grant nro 2011YQ03013405), National High-tech-T D-ohjelma (863 Ohjelmanro SS2012AA020314, SS2012AA020821, SS2012AA020303) ja National Science Foundation of China (Grant nro 81121004, 81071953, 81161120432). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kilpirauhassyöpä on yleisin hormonitoimintaa maligniteetti, ja sen esiintyvyys kasvaa nopeasti maailmanlaajuisesti [1]. Follikulaarinen epiteelisoluperäisen kilpirauhassyöpä luokiteltiin kolmeen histologisia tyyppejä, mukaan lukien papillaarinen kilpirauhassyöpä (PTC, 80%), follikulaarinen kilpirauhasen syöpä (FTC, 15%), ja anaplastinen kilpirauhassyöpä (ATC, 2-5%). Vaikka medullaarinen kilpirauhassyöpä (MTC), joka on kehitetty parafollicular C soluja, on hyvin harvinaista [2] – [4]. Vaikka ennuste kilpirauhaskarsinoomaa on paljon parempi, se on edelleen hyvin vaikea valita terapeuttinen menetelmä. Strategia PTC hoito sisältää lähinnä kirurginen resektio liitännäisseuraukset radiojodia ablaatio ja tyreotropiini tukahduttaminen. Laajuus kilpirauhanen ja imusolmukkeiden edelleen kiistanalainen [5]. Epigeneettiset muutokset voivat toimia etsivä, ennustetekijöitä ja terapeuttinen markkeri kilpirauhassyövän hoitoon.

Dapper, joka on Dishevelled liittyvä antagonisti β-kateniinin (dACT), eristettiin näytön proteiineille vuorovaikutuksessa Dishevelled, avaintekijä että Wnt signalointia. Dapper Dishevelled olivat yhdessä lokalisoitu solunsisäisesti ja muodostivat kompleksin ak- siini, GSK3 ja β-kateniinin [6]. Ihmisen DACT2 tunnistettiin Katoh et al. ja sijaitsee ihmisen kromosomissa 6q27 [7]. Waxman JS ja Li Xiao et al. havaitsivat, että DACT2 edistää Wnt signalointia kehitystä seeprakala ja hiiren hampaat [8], [9]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että DACT2 on Wnt /β-kateniinin signalointi estäjän keuhkojen ja maksasyövän [10], [11]. Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet epigeneettiset muutos ja toiminta DACT2 vuonna papillaarisen kilpirauhassyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus suoritettiin mukaisesti suuntaviivat 1975 Helsingin julistuksen ja sopusoinnussa paikallisten määräysten ja hyvän kliinisen ohjeita. Kaikki näytteet kerättiin hyväksyttyyn suuntaviivojen Pekingin Cancer sairaalan Institutional Review Board. Kaikki kilpirauhassyöpä solulinjat on kuvattu aikaisemmin [12] – [14]. Kokeelliset menetelmät hyväksyttiin eettisen komitean Kiinan PLA General Hospital (Luvan numero: +20.090.701-015 ja 20.140.423-001).

Ensisijainen ihmisen papillaarinen kilpirauhassyövän näytteiden ja solulinjojen

yhteensä 99 tapausta ensisijaisen papillaarinen kilpirauhassyövän ja 10 tapausta normaalin kilpirauhaskudoksen kerättiin tuore kudoksen Beijing Cancer Hospital. Kaikki näytteet kerättiin hyväksyttyyn suuntaviivojen Pekingin Cancer sairaalan Institutional Review Board. 7 kilpirauhassyöpä solulinjoissa (K1, TPC-1, SW579, FTC-133, TT, W3 ja 8505C) on mukana tässä tutkimuksessa. Kaikki kilpirauhassyöpä solulinjat aiemmin vahvistettu alkutuotannosta kilpirauhassyöpä. K1, TPC-1, SW579, FTC-133: n ja TT solulinjoja pidettiin yllä 90% RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), täydentämällä 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa 5% CO2. W3 ja 8505C solulinjoja pidettiin 90% DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), täydentämällä 10% naudan sikiön seerumia, 37 ° C: ssa 5% CO2. Solut siirrostettiin 1:03 kerran 80% konfluenssiin päästiin 75 cm2 kulttuuri pulloon (NEST Biotechnology, Shanghai, Kiina). Kaikki kilpirauhassyöpä solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa on raportoitu aiemmin [12] – [14].

5-atsa-2′-deoksisytidiinin hoitoja

kilpirauhassyöpä solulinjat jaettiin alhaisen tiheyden 12 tuntia ennen käsittelyä. Soluja käsiteltiin 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa) (Sigma, St Louis, MO, USA), jonka konsentraatio on 2 uM kasvualustassa, joka vaihdettiin joka 24. tunti kaikkiaan 96 tunnin käsittely . Lopussa hoitojakson, RNA eristettiin.

RNA: n eristys ja säännöllinen PCR

Yhteensä-RNA eristettiin käyttämällä Trizol reagenssia (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA). Agaroosigeelielektroforeesilla ja spektrofotometrinen käytettiin arvioitaessa RNA laatua ja määrää. Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin valmistajan ohjeiden. Yhteensä 5 ug kokonais-RNA: ta käytettiin syntetisoimaan ensimmäisen juosteen cDNA käyttäen Superscript III-käänteistranskriptaasia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Reaktioseos laimennettiin sitten 100 ul: ksi vedellä. 2,5 ui laimennettua cDNA: ta seosta käytettiin 25 ul: n PCR-reaktiossa. PCR-alukkeet ovat seuraavat: 5′-GGC TGA GAC AAC AGG ACA TCG-3 ’(F) ja 5′-GAC CGT CGC TCA TCT CGT AAAA-3′ (R). Pyöräilytietokone ehto on 95 ° C 5 min, (95 ° C 30 s, 64 ° C 30 s, 72 ° C 40 s × 3 sykliä, (95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 40 s ) x 3 sykliä, (95 ° C 30 s, 58 ° C 30 s, 72 ° C 40 s) x 3 sykliä, (95 ° C 30 s, 55 ° C 30 s, 72 ° C 40 s) × 24cycles, 72 ° C 7 minuuttia. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. alukkeiden sekvenssi ovat seuraavat: 5’- GAC CAC AGT CCA TGC CAT CAC-3 ’(F), ja 5’-GTC CAC CAC CCT GTT GCT GTA- 3 ’(R). Pyöräilytietokone tila on 95 ° C: ssa 5 min, (95 ° C 30 s, 63 ° C 30 s, 72 ° C 40 s) x 25cycles, 72 ° C: ssa 7 min.

bisulfiittimodifikaatio, metylaatiospesifinen PCR (MSP) ja bisulfiitti-sekvensointi (BSSQ) B

genominen DNA valmistettiin proteinaasi-K-menetelmällä. genominen DNA bisulfiitti-modifioitu kuten aiemmin on kuvattu. MSP-alukkeet suunniteltiin genomiseen sekvenssejä noin transkription aloitus- sivustoja (TSS) ja syntetisoitiin (BGI, Peking, Kiina) havaitsemiseksi metyloimatonta (U) ja metyloitu (M) alleeleja. MSP-alukkeet ovat seuraavat: 5′-GCG CGT GTA GAT TTC GTT TTT CGC-3 ’( MF), 5’-AAC CCC ACG AAC GAC GCCG-3 ’(MR), 5′-TTG GGG TGT GTG TAG ATT TTG TTT TTTGT-3 (UF) ja 5′-CCC AAA CCC CAC AAA CAA CAC CA-3 ”(UR). Koko unmethylation PCR-tuotteen on 161 emäsparia ja metylaatio PCR-tuote on 152 bp. Ui bisulfiittikäsiteltyä DNA: ta monistettiin käyttäen BSSQ reunustavia alukkeita kohdealueilla, mukaan lukien MSP-alukkeita sivustoja ja transkription aloituskohdasta. Sekvensointi alukkeet olivat seuraavat: 5’-GGG GGA GGT YGY GGT GAT TT-3 ’(F) ja 5′-ACC TAC pisteluku RAT CCC AAC CC-3’ (R). Bisulfiitti sekvensointi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [11].

immunohistokemia (IHC) B

immunohistokemia (IHC) suoritettiin 5 um paksuja leikesarjojen johdettu formaldehydi-kiinteä parafiiniblokit papillaarisen kilpirauhassyöpä ja pariksi viereiseen kudokseen. Jälkeen deparaffinization ja nesteytys, endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus estettiin 30 minuutin ajan metanolissa, joka sisälsi 0,3% vetyperoksidia. Sen jälkeen antigeeni haku, harkinta-aika 20 min edelsi inkubaatio primaarisen vasta-aineen. DACT2 vasta-ainetta (Origene Tech, MD, USA): tä käytettiin 1/1000 laimennus yön yli 4 ° C: ssa. Värjäytyminen voimakkuus ja laajuus värjättyä alueen luokiteltiin mukaan NIS-ELEMENTS kuvankäsittelyohjelma (Nikon, Tokio, Japani) värjäys voimakkuus solulimaan (heikkoa värjäytymistä = 1; kohtalainen värjäytyminen = 2; vahva värjäytyminen = 3); laajuus värjättyjen solujen (0% = 0, 0-5% = 1, 5-10% = 2, 10-15% = 3, 15-20% = 4). Lopullinen immuno-reaktiivisen pisteet (0-12) määritettiin kertomalla intensiteetti pisteet laajuuteen värjätään solujen pisteet.

rakentaminen Lentivirusvektorikonstruktit DACT2 ekspressiovektorit

Ihmisen täyspitkän

DACT2

cDNA (GenBank NM_214 462) monistettiin pCMV-DACT2 vektori [11]. Alukkeet olivat seuraavat: 5′-TGA TCA ATG TGG ACG CCG GGC-3 ’(F) ja 5′-GTC GAC TCA CAC CAT GGT CAT GAC-3’ (R). PCR-tuote alakloonattiin sitten pLenti6-GFP-vektorilla. Insertit varmistettiin restriktiodigestiolla ja DNA-sekvensoinnilla.

Lentivirusvektorikonstruktit infektioita ja stabiilin ekspression solujen valinnan

293T-solulinja pidettiin 90% DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) täydentämällä 10% naudan sikiön seerumia, 37 ° C: ssa 5% CO2. DACT2 ilmaistuna Lentivirus transfektoitiin HEK293T-soluja (5 x 10

6 per 100 mm: n malja) käyttäen polyetyleeni-imiini (P.E.I.) liuokseen 3:01 suhde (P.E.I. massa: DNA massa). 48 tunnin kuluttua, viruksen supernatantti kerättiin ja suodatettiin. Sitten viruksen supernatanttia lisättiin kasvualustaan ​​TPC-1-soluja ja ekspressoivat stabiilisti solut valitaan Blasticidin (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) 0,2 ug /ml 2 viikkoa.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus mitattiin päivittäin 72 tuntia käyttäen MTT (3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi) Kit (KEYGEN Biotech, Jiangsu, Kiina) mukaisesti valmistajan ohjeita. Tulokset esitettiin graafisesti tarkoittaa ± SD.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

DACT2 pysyvästi ilmensivät TPC-1-soluja ja DACT2 uusia, TPC-1-solut laimennettiin ja siirrostettiin 200 solua kuoppaa kohti 6- kuoppaviljelylevyillä kolmena rinnakkaisena. Kasvualustaan, vakioitiin Blasticidin 0.2 ug /ml, vaihdettiin 24 tunnin välein. Kun 14 d, solut kiinnitettiin 75% etanolilla 30 minuuttia ja värjättiin 0,2% kristalliviolettia visualisointiin ja laskentaa.

Virtaussytometrianalyysi

12 tunnin jälkeen synkronoinnin seerumin nälkään, DACT2 pysyvästi ilmensivät TPC-1-soluja ja DACT2 uusia, TPC-1-soluja viljeltiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 24 tunnin ajan. Solut kiinnitettiin 70% etanolilla ja värjättiin 50 ug /ml propidiumjodidia (Keygen Biotech, Jiangsu, Kiina). Sitten solut lajitellaan FACS Caliber (BD Biosciences, San Jose, CA) ja analysoitiin Modfit ohjelmisto.

Haavan paranemista määritys

TPC-1-soluja kasvatettiin konfluentteja yksisolukerroksiin 6.- kuoppalevyille ja pipetin kärjen luotiin lineaarisia tyhjästä haavoja. Medium ilman naudan sikiön seerumia käytettiin estävät solujen proliferaatiota. Haavan Kuvat on otettu digitaalikameralla asennettu valomikroskooppi 0, 36 ja 72 tuntia. Haava kuilu leveydet mitattiin Image J ohjelmisto.

TranswellTM määritys

Migration: TPC-1-soluja lisättiin ylempään kammioon 8,0 um huokoskoko TranswellTM laite (Corning, NY, USA ) tiheydellä 4 x 10

4 solut (100 ui) per säiliö ja inkuboitiin 13 tunnin ajan, jonka jälkeen poistetaan solut, jotka jäivät yläkammiossa vanutupoilla. Invasion: Ylempi kammio päällystettiin matrigeelin (BD Biosciences, San Jose, CA). TPC-1-soluja lisättiin ylempään kammioon tiheyteen 6 x 10

4 solut (100 ui) per säiliö ja inkuboitiin 36 tunnin ajan, jonka jälkeen poistetaan solut, jotka jäivät yläkammiossa vanutupoilla. Solut, jotka tunkeutui alempaan kalvon pinnan fiksoitiin 4% paraformaldehydi, värjättiin 0,2% kristalliviolettia, ja laskettiin suuritehoinen aloilla (100 x) kanssa valomikroskoopilla.

Dual-lusiferaasireporttiterilla määritys

Tpc-1-solut ympättiin 8 x 10

4 solua per kuoppa 24-kuoppaisille viljelylevyille 24 h ennen transfektiota. Tutkia transkriptionaalinen aktiivisuus johtui TCF /LEF, Tpc-1-solut transfektoitiin 100 ng /kuoppa TOP flash reportteri-vektoriin (TCF /LEF-reagoiva toimittaja), 10 ng /kuoppa PRL-TK ja pCI-neo-β-kateniinin ilmentävien vektori (150 ng /kuoppa) käytettiin aktivoimaan reportterigeenin; Negatiivisena kontrollina, toinen ryhmä Tpc-1-solut transfektoitiin 100 ng /kuoppa Fopflash toimittaja vektori, 10 ng /kuoppa PRL-TK kontrollivektorilla ja β-kateniinin ilmentävällä vektorilla (150 ng /kuoppa). Sitten yhä suurempia määriä 150 ng /kuoppa DACT2 vektoria ja 150 ng /kuoppa Dvl2 vektori transfektoitiin soluihin yhdessä Topflash toimittaja vektori, PRL-TK kontrollivektorilla ja pCI-neo-β-kateniinin arvioida säätelevä funktio DACT2 in Wnt signalointireitin.

48 h transfektion jälkeen, suhteellinen lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin Dual Luciferase Reporter Assay (Promega, Shanghai, Kiina) mukaan valmistajan protokollaa. Kutakin koetta lusiferaasireportteri määritys suoritettiin kolme kertaa [35].

DACT2 pudotti siRNA

Yksi valittu siRNA (siRNA618) [11] kohdistamista DACT2 ja RNAi Negative Control Duplex olivat tässä tutkimuksessa käytetyt. Sekvenssit olivat seuraavat: siRNA duplex (sense: 5-GUC GGU.ta UGA UGA GAC UAC UTT-3; antisense: 5-AGU AGU CUC AUC AAC CGA CTT-3); RNAi negatiivinen kontrolli duplex (sense: 5-UUC UCC GAA RTY GUC ACG UTT-3, antisense: 5-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3). RNAi-oligonukleotidin tai RNAi negatiivinen kontrolli duplex (Gene Pharma Co, Shanghai, Kiina) transfektoitiin W3 soluihin mukaan valmistajan ohjeiden.

Protein valmistelu ja Western blotting

Transfektoidut solut hajotettiin RIPA lysis Buffer (Beyotime Biotech, Jiangsu, Kiina). Proteiini lysaatit erotettiin sitten SDS-PAGE: lla ja elektro-blotattiin PVDF-membraaneille. Kun oli salvattu 5% rasvatonta maitoa ja 0,1% Tween-20 TBS: ssä, kalvoja inkuboitiin vasta-aineiden kanssa. Vasta-aineet olivat seuraavat: DACT2 (Origene Tech, MD, USA), cyclinD1 (Bioworld Tech, MN, USA), c-myc (Bioworld Tech, MN, USA), MMP-9 (Bioworld Tech, MN, USA), β-kateniinin (Bioworld Tech, MN, USA), fosfori-β-kateniinin (Bioworld Tech, MN, USA) ja β-aktiini (Beyotime Biotech, Jiangsu, Kiina) kantavassa blotit visualisoidaan tehostetun kemiluminesenssin (Beyotime Biotech, Jiangsu , Kiina).

tilastollinen analyysi

yhdistyksen DNA metylaatio ja klinikan-patologinen tekijöitä ihmisen papillaarinen kilpirauhassyövän analysoitiin

χ

2

testi riippumattomuus dikotominen muuttujat ja t-testiä jatkuvien muuttujien. Tulokset arvioitiin olevan tilastollisesti merkitsevä p 0,05 (*), p 0,01 (**), p 0,001 (***). Kaikki analyysit tehtiin SPSS 19.0 ohjelmistolla.

Tulokset

DACT2

on vaiennetaan promoottorialue hypermetylaation kilpirauhassyövän syöpäsoluissa

tutkia ilmaisu on

DACT2

kilpirauhassyövän hoitoon, säännöllinen PCR palveluksessa.

DACT2

ilmentymistä löydettiin ihmisen kilpirauhasen syöpä solulinjaa K1, SW579, FTC-133, TT, W3 ja 8505C säännöllisesti PCR. Menetys

DACT2

ekspressiota havaittiin TPC-1-solulinjassa (kuvio. 1A). Tutkimme seuraavaksi

DACT2

metylaatio käyttäen metylaatiospesifinen PCR (MSP) näissä solulinjoissa. Täydellinen metylaatio havaittiin TPC-1-soluissa ja unmethylation löydettiin K1, SW579, FTC-133, TT, W3 ja 8505C solulinjoissa (Fig. 1 B). Menetys

DACT2

ilmentyminen korreloi promoottorialueen hypermetylaation. Edelleen vahvistaa

DACT2

ilmentyminen säädeltiin promoottorialueen metylaation, kilpirauhassyöpä solulinjoja käsiteltiin 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa). Re-ilmentyminen

DACT2

löytyi TPC-1 solulinja eikä ilmentyminen muuttuu paljastui K1, SW579, FTC-133, TT, W3 ja 8505C solulinjoissa jälkeen 5-atsa hoitoa (Fig. 1A ). Nämä tulokset osoittavat, että

DACT2

ilmentymistä säätelee promoottori-alueen metylointi. Nähdä tehokkuuden metylaatiospesifisen PCR (MSP) alukkeita ja metylaation tiheys

DACT2

promoottorialueen, suoritimme bisulfiitin sekvensointi (BSSQ; Fig. 1 C). MSP tulokset ovat yhdenmukaisia ​​bisulfiitti sekvensoinnin tuloksiin hyvin ja

DACT2

promoottorialue tiheään metyloitavaa TPC-1-soluissa. Spare metylaatiokohtia promoottorialueella löytyivät K1, W3 ja SW579-soluissa.

DACT2

ilmentyminen analysoitiin säännöllisesti PCR ennen (-) ja jälkeen (+) 5-atsa hoitoon. K1, TPC-1, SW579, FTC-133, TT, W3 ja 8505C ovat kilpirauhassyöpä solulinjat. H2O: kahteen kertaan tislattua vettä. GAPDH: sisäinen valvonta. B: MSP tulokset osoittavat

DACT2

metylaatiostatuksen. IVD (in vitro metyloitua DNA) toimi metylointi ohjaus. NL (normaali lymfosyytin DNA) toimi unmethylation ohjaus. M: metyloitu alleelit; U: metyloitumattomien alleelien. C: Havainnollinen bisulfiitti sekvensointi johtaa

DACT2

promoottorialueen. Kaksipäinen nuoli edustaa MSP vahvistusta alueella. Täytetyt ympyrät edustavat metyloitu CpG sivustoja ja avoimet ympyrät tarkoittavat metyloimattoman CpG sivustoja. TSS: transkription aloituskohdasta.

DACT2

usein metyloitu ensisijainen papillaarinen kilpirauhassyövän ja metylaation DACT2 liittyy imusolmuke etäpesäke

Tutkitaan metylaatiomuutokset in

DACT2

kilpirauhassyövän hoitoon kehittämiseen, 99 tapausta ensisijaisen papillaarisen kilpirauhassyövän havaittiin MSP. 64 tapausta kehittyneiden kilpirauhassyövän (64,6%) olivat metyloituja (Fig. 2A). Ei metylaatio havaittiin 10 tapauksessa ei-syöpä kilpirauhasen kudosnäytteistä (Fig. 2B). Kuten on esitetty taulukossa 1, metylaatio

DACT2

liittyi imusolmuke etäpesäke merkittävästi (p 0,01). Ei assosioitunut

DACT2

metylaatio ja ikä, sukupuoli, tupakointi, alkoholin, suvussa ja säteilyaltistusta historiaa. Tulokset viittaavat siihen, että metylaatio on

DACT2

liittyy kilpirauhassyöpä etäpesäkkeitä. Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että metylaatio on

DACT2

voivat toimia etsivä ja metastasoituneen markkeri papillaarisen kilpirauhassyöpä.

V: edustaja MSP tulokset

DACT2

ihmisen ensisijainen papillaarisen kilpirauhassyöpä . B: Havainnollinen MSP tulokset

DACT2

normaalissa kilpirauhasessa kudoksissa noncancerous potilaista. C: Havainnollinen DACT2 värjäytymistä tuloksia papillaarinen kilpirauhassyövän ja viereisten kudosten määräytyy IHC. (A, b, 200 x, c, d, 400 x). D: DACT2 ilmaisun tulokset esitetään rasiakuvaajien, vaakaviivat edustavat mediaanipisteet; pohja- ja laatikoiden edustavien 25. ja 75. prosenttipisteet, vastaavasti; pystypalkit edustavat erilaisia ​​ilmaisun. DACT2 ilme on merkittävästi erilainen 50 tapauksessa sovitetun kasvain ja vieressä kudosnäytteet, p 0,001. E: yhdistys menetys /vähentäminen DACT2 ilmaisun ja promoottori hypermetylaation analysoitiin

x

2

testin 50 tapauksessa sovitetun ensisijainen kilpirauhasen papillaarikuvioiden syöpä ja viereisen kudosnäytteistä. (P 0,05).

Jotta tutkia yhdistyksen DACT2 ilmaisun ja promoottorialue hypermetylaation perusterveydenhuollossa papillaarinen kilpirauhassyöpä, DACT2 ilmentyminen arvioitiin immunohistokemiallisesti (IHC) 50 tapausta käytettävissä Hyväksytty papillaarinen kilpirauhassyövän ja viereisen kudosnäytteistä. DACT2 värjäytyminen havaittiin etupäässä solulimassa, kuten on raportoitu muissa syövissä. Olemme havainneet, että DACT2 ilmentyminen väheni papillaarinen kilpirauhassyövän kudoksiin verrattuna viereisen kudosnäytteet (p 0,001, Fig. 2C ja D). Ja vähensi ilmentyminen liittyi DACT2 promoottorialueen hypermetylaation merkitsevästi (p 0,05; Fig. 2E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että DACT2 ilmentymistä säätelee promoottorialue hypermetylaation perusterveydenhuollossa papillaarinen kilpirauhassyövän.

Palauttaminen DACT2 ilmaisun estää solujen kasvua ja indusoi G1 pidätys kilpirauhasen syöpäsoluja

vaikutuksen arvioimiseksi DACT2 kilpirauhasen syövän synnyn, solujen elävyyden ja pesäkkeiden muodostumista arvioitiin ennen ja jälkeen palauttamisen DACT2 ilmentymisen TPC-1-solut (Fig. 3A). Solujen elinkelpoisuus ja pesäkkeenmuodostusta tukahdutettiin jälkeen uudelleen ilmentäminen DACT2 in TPC-1-soluissa (kuvio. 3B ja C, p 0,01). Tulokset osoittavat, että DACT2 estää kilpirauhassyöpä soluproliferaatiota. Edelleen ymmärtää mekanismia, virtaussytometrialla määrityksessä käytettiin. Jakautuminen solun vaiheiden DACT2 ilmaisemattoman ja uudelleen ilmaisseet TPC-1cells olivat seuraavat: G0 /1 vaihe: 32.24 ± 1,61%

vs.

55.49 ± 3,09% (p 0,001); S vaihe: 38.06 ± 2,34%

vs.

25.23 ± 1,15% (p 0,05); G2 /M vaiheessa: 29.70 ± 3,38%

vs

. 19.27 ± 2,32% (p 0,05). Tulokset viittaavat siihen, että G0 /1 vaihe nostettiin, S-vaiheessa ja G2 /M-vaiheen vähenivät jälkeen palauttamisen DACT2 ilmentymisen TPC-1cells (Fig. 3d). Kuten kuviossa S1, ei apoptoosia indusoitiin DACT2 TPC-1-soluja (p 0,05).

: Re-ilmentyminen DACT2 havaittiin transfektion jälkeen DACT2 ekspressiovektorin TPC-1-soluissa. B: MTT tulokset: DACT2 tukahduttaa elinkelpoisuutta TPC-1-solut (p 0,001). C: Pesäkkeenmuodostusta tulokset ennen ja jälkeen uudelleen ilmentymisen DACT2 in TPC-1-soluissa. Jokainen koe toistettiin kolme kertaa (p 0,01). Valkoinen bar: tyhjän vektorin; musta palkki: DACT2 ekspressiovektoriin. D: G1 pidätys aiheutettiin DACT2 in TPC-1-soluissa. Jokainen koe toistettiin kolme kertaa (p 0,001). Valkoinen bar: tyhjän vektorin; musta palkki: DACT2 ekspressiovektoriin.

Palauttaminen DACT2 ilmaisun estää solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen papillaarinen kilpirauhassyövän

Kuten DACT2 metylaatio liittyy papillaarinen kilpirauhassyöpä etäpesäke, vaikutus DACT2 solun invaasio ja muuttoliike analysoitiin papillaarinen kilpirauhasen syöpäsoluja. Haavan paranemista ja siirtokuoppaan määrityksessä käytettiin tässä tutkimuksessa. Kuten on esitetty kuviossa. 4A ja 4B solumigraatio inhiboituu ilmeisesti jälkeen uudelleen ilmentymisen DACT2 TPC-1-soluja (p 0,001). Vuonna transwell määritykseen ilman ECM päällysteen määrä siirtynyt solujen kunkin suuritehoinen kenttä oli 354,50 ± 47,44

vs.

64,83 ± 4,48 ennen ja jälkeen uudelleen ilmentymisen DACT2 TPC-1-solut (Fig. 4C , p 0,001). Alle invaasio havaitseminen, invasiivista solujen määrä kunkin suuritehoinen kenttä oli 1091,40 ± 119,55

vs.

31.58 ± 16.36 ennen ja jälkeen palauttamisen DACT2 ilmaisun (Fig. 4C, p 0,001). Se osoittaa, että DACT2 estää solujen invaasiota ja muuttoliikkeen kilpirauhassyöpä. Edellä esitetyt tulokset vihjaavat, että DACT2 estää kilpirauhassyöpä etäpesäke.

V: Cell muuttoliikettä tukahdutettiin DACT2 merkittävästi TPC-1-soluilla haavan paranemista havaitsemiseen. B: Sininen viiva haavan paranemista tulos tyhjän vektorin ryhmästä ja punainen viiva haavan tulos DACT2 uudelleen ilmaistuna ryhmä TPC-1-soluissa 72 tuntia (p 0,001). C: Cell muuttoliikettä ja invaasiota tukahdutettiin DACT2 in TPC-1-soluilla Transvvell- tutkimuksessa (p 0,001).

DACT2 estää Wnt /β-kateniinin signalointi kilpirauhassyöpä

kanonisessa Wnt /β-kateniinin signalointireitin, lisääntynyt β-kateniinin sytoplasmassa edistää translokaatiota β-kateniinin tumaan. β-kateniinin ytimet sitoutuu TCF /LEF useissa syöpien transkription aktivoituminen alavirran geenien, kuten cyclinD1, c-myc ja MMP [15] – [21], joka tärkeitä rooleja syövän synnyn ja etäpesäkkeitä. Tutkia vaikutuksen DACT2 on Wnt signalointia ihmisen kilpirauhassyöpä, Topflash ja (TCF /LEF) toimittaja järjestelmä käytettiin. Kuten on esitetty kuviossa 5A, aktiivisuus TCF /LEF merkittävästi inhiboi DACT2. Se on samanlainen edellisessä raportissa ihmisen keuhkosyövän [11], aktiivisuus TCF /LEF korotettiin kotransfektoimalla DACT2 ja Dvl2 villityypin tai mutantti-tyypin β-kateniinin. Edelleen vahvistaa vaikutuksen DACT2 solun muuttoliikettä ja invaasiota, β-kateniinin yliekspressoitiin DACT2 pysyvästi ilmensivät TPC-1-soluissa. Lukumäärä siirretty solujen kunkin suuritehoinen kenttä oli 646 ± 158

vs.

867 ± 118 ennen ja jälkeen yli-ilmentyminen β-kateniinin DACT2 pysyvästi ilmensivät TPC-1-soluissa (kuvio. 5B, p 0,05) . Määrä invasiivisia solun kunkin suuritehoinen kenttä oli 35 ± 32

vs.

100 ± 50 ennen ja jälkeen yli-ilmentyminen β-kateniinin DACT2 pysyvästi ilmensivät TPC-1-soluissa (kuvio. 5B, p 0,05) . Lisäksi tulokset viittaavat siihen, että DACT2 tukahduttaa solumigraation ja invaasiota estämällä Wnt signalointia ihmisen kilpirauhassyöpä. Fosforyloitua β-kateniinin (p-β-kateniinin) on merkittävä komponentti edustaa β-kateniinin hajoamiseen. Tutkimuksessamme ilmentymisen c-myc, cyclinD1 ja MMP-9 väheni, ja taso p-β-kateniinin nostettiin sen jälkeen uudelleen ilmentymisen DACT2 TPC-1-soluissa (kuvio. 5C). Edelleen vahvistaa vaikutuksen DACT2 on Wnt signalointia, siRNA knockdown tekniikkaa käytettiin. Ekspression c-myc, cyclinD1 ja MMP-9 lisättiin, ja taso p-β-kateniinin pienennettiin DACT2 ilmaistuna W3 ja SW579-soluissa (kuvio. 5C). Edellä esitetyt tulokset viittaavat siihen, että DACT2 tukahduttaa kilpirauhasen syöpä solujen lisääntymisen ja etäpesäkkeiden estämällä Wnt signalointia.

V: tulokset TCF /LEF lusiferaasireportterilla määritys. β-kateniinin ekspressiovektori oli ko-transfektoitiin TCF /LEF Topflash toimittaja tai sen mutantti, Fopflash TPC-1-soluissa. Lusiferaasiaktiivisuudeksi normalisoida Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus (suhde tulikärpäsen lusiferaasi Renilla lusiferaasi) tukahdutettiin DACT2. Koe toistettiin kolme kertaa (* p 0,05). Lisääntynyt lusiferaasiaktiivisuus indusoitiin transfektoimalla DACT2 ja Dvl2. Koe toistettiin kolme kertaa (* p 0,05). B: Cell muuttoliikettä ja invaasiota lisääntyi β-kateniinin DACT2 pysyvästi ilmensivät TPC-1-soluilla Transvvell- tutkimuksessa. Koe toistettiin kolme kertaa (p 0,05). C: n ilmentyminen β-kateniinin, c-myc, cyclinD1 ja MMP-9 laskivat ja taso fosforyloidun β-kateniinin (p-β-kateniinin) lisättiin palauttamisen jälkeen DACT2 ilmentymisen TPC-1-soluissa. Ilmaisu on β-kateniinin, c-myc, cyclinD1 ja MMP-9 korotettiin ja taso p-β-kateniinin aleni jälkeen kaataa DACT2 vuonna W3 ja SW579-soluissa.

Keskustelu

on toivottavaa hallita kilpirauhassyöpä henkilökohtaisesti perustuu biomarkkereita. Toistaiseksi ei ole olemassa luotettavia biomarkkereiden löytynyt ennustamiseen ennustetta ja radio- tai Chemo-herkkyyden kilpirauhassyöpä [22], [23]. Epigeneettiset muutoksia havaittiin usein ihmisen syövissä, mukaan lukien kilpirauhasen syöpä [24] – [29]. DNA: n metylaatio saattaa olla diagnostista, prognoosi-, Chemo-herkkä ja radio-herkkiä markkereita [30] – [35]. Vaiennetaan ilmentymisen keskeinen osa, jonka DNA: n metylaation syöpään liittyvissä signalointireitin voi tulla terapeuttinen kohde [34] – [37].

Xenopus hienompi ja Xenopus Frodo ovat Dishevelled sitovia proteiineja, jotka osoittavat 89%: n kokonaispinta-amino -happamaan identiteetti [38]. Xenopus Dapper väitetään estävän β-kateniinin reitin sekä JNK-reitin, kun Xenopus Frodo väitetään aktivoida β-kateniinin reitin [6], [39]. DACT1 ja DACT2 ovat ihmisen homologeja Xenopus Dapper Frodo, jotka ovat Dishevelled-sitovia proteiineja. DACT1 ja DACT2 geenejä, joka koostuu neljästä eksonia, havaittiin koodaavan DACT1 proteiinia (799-amino-happoja) ja DACT2 proteiini (774-amino-happoja), vastaavasti. DACT1 ja DACT2 osoitti 28,8% koko aminohapon identiteetti. Seitsemän Daph verkkotunnuksia, kuten DAPH2 (Leusiinivetoketju), DAPH3 (seriini rikas) ja DAPH7 (PDZ sitova), oli konservoitunut DACT1 ja DACT2. DACT1 ja DACT2 geenit kartoitettiin ihmisen kromosomiin 14q22.3 ja ihmisen kromosomiin 6q27, vastaavasti [7]. Ihmisen kromosomi 14q22.3-32.1 Poistetaan astrosytoomassa [40]. Ihmisen kromosomi 6q27 on alue usein Heterotsygotian menetys ihmisen syövissä [41] – [47]. Joka perustuu evolutiivinen ja toiminnallinen säilyttäminen Wnt signalointimolekyylien sekä ihmisen kromosomaalinen lokalisointi, DACT1 ja DACT2 geenien ennustetaan olevan tehokkaita syöpään liittyvien geenien. Tuore tutkimus ehdotti, että DACT2 estää Pitx2 aktivoimalla Wnt signalointia alkion hampaiden kehitykseen [8]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että DACT2 usein metyloitu keuhkojen ja maksan syöpä, ja metylaation DACT2 aktivoi Wnt signalointia [10], [11]. Edelleen ymmärtää rooli DACT2 kilpirauhassyövän hoitoon, havaitsimme promoottorialueen metylaation papillaarinen kilpirauhassyövän ensin. DACT2 usein metyloitu ihmisen papillaarinen kilpirauhassyövän ja metylaation DACT2 liittyy imusolmuke etäpesäke. Nämä havainnot viittaavat siihen, että DACT2 metylaatio voivat toimia etsivä sekä varoituksia markkeri papillaarisen kilpirauhassyöpä. Haavan paranemista ja siirtokuoppaan määrityksessä käytettiin arvioimaan vaikutusta DACT2 on kilpirauhassyöpä etäpesäkkeitä. Kuten odotettua, uudelleen ilmentäminen DACT2 estää solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen TPC-1cells. Ekspression MMP-9 pienennettiin palautumisen jälkeen DACT2 ilmentymisen TPC-1cells ja lisääntynyt sen jälkeen, kun pudotus on DACT2 on W3 ja SW579-soluissa. Kuten DACT2 ilmentyminen säätelee promoottorialue hypermetylaation in papillaarinen kilpirauhassyöpä, DACT2 metylaatio saattaa liittyä kilpirauhasen syövän synnyn. Näihin kysymyksiin, toiminta DACT2 tutkittiin edelleen. Solujen lisääntyminen ja pesäkkeiden muodostus estyi, ja G1 vaiheen pysähtymisen aiheutettiin DACT2 kilpirauhasen syöpäsoluja.