PLoS ONE: Stathmin1 Toistaa onkogeeninen rooli ja on tavoite on MicroRNA-223 mahasyövän
tiivistelmä
Stathmin1 (STMN1) on ehdokas onkoproteiinia ja prognoosimarkkerina useissa syöpien. Tämä Tutkimuksen tarkoituksena oli analysoida sen ilmaisun ja biologisia toimintoja mahasyövässä. Ilmentyminen STMN1 arvioitiin qRT-PCR, western blot ja immunohistokemia. Biologisen toiminnan STMN1 määritettiin MTT proliferaatiomäärityksillä, yksikerroksinen pesäkkeiden muodostumisen ja solujen invaasiota, joissa käytetään pieniä interferenssi-RNA tekniikka mahasyövän solulinjoissa. Olemme myös tutkineet sääntelyä STMN1 ilmentymisen microRNA-223. STMN1 oli yläreguloituja mahasyövässä solulinjoissa ja ensisijainen mahalaukun adenokarsinooman. STMN1-positiivisia kasvaimia olivat todennäköisesti löytyy vuotiaiden ikäryhmässä ja liittyy p53 ydin- ilme. Vuonna hajanainen tyyppi mahalaukun adenokarsinooman, STMN1 ilmentyminen korreloi iän (
p
= 0,043), T vaiheessa (
p
= 0,004) ja imusolmuke etäpesäke (
p
= 0,046). Expression of STMN1 heikossa tyyppi mahalaukun adenokarsinooman oli yhteydessä huonoon tautikohtaisten selviytymistä yhden muuttujan analyysin (
p
= 0,01). STMN1 Knockdown in AGS ja MKN7 solulinjoissa tukahdutetaan lisääntymistä (
p
0,001), vähensi yksikerroksista pesäkkeiden muodostumisen (
p
0,001), esti solujen invaasiota ja muuttoliike kyky (
p
0,001) ja indusoi G1 vaiheen pysähtymisen. siSTMN1 voisi myös tukahduttaa solujen kasvua
in vivo
(
p
0. 01). Olemme vihdoin vahvistanut, että STMN1 on otaksuttu alavirtaan tavoitteeksi miR-223 mahasyövän. Meidän havainnot tukevat onkogeenisessä roolia STMN1 mahasyövän. STMN1 voisi toimia ennustetyövälineenä merkki ja potentiaalinen terapeuttinen kohde mahasyövän.
Citation: Kang W, Tong JHM, Chan AWH, Lung RWM, Chau SL, Wong työelämän laatu, et al. (2012) Stathmin1 Toistot onkogeeninen Rooli ja on tavoite on MicroRNA-223 mahasyövän. PLoS ONE 7 (3): e33919. doi: 10,1371 /journal.pone.0033919
Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat
vastaanotettu 17. lokakuuta 2011; Hyväksytty: 19 helmikuu 2012; Julkaistu: 28 maaliskuu 2012
Copyright: © 2012 Kang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä tutkimus tukee UGC yhteistyötä Research Fund (CUHK04 /CRF /08) ja rahoittaja verkkosivuilla on https://www.ugc.edu.hk/eng/rgc/fund/crf_202011_2012.htm. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä syöpäsairauksia ja toiseksi yleisin syy syöpään liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti. Se on korkein esiintyvyys Kiinassa, Japanissa, Koreassa ja Itä-Aasiasta. Yleinen ennuste on huono ja 5 vuoden pysyvyys alle 30% useimmissa maissa [1]. Useita mahdollisia riskitekijöitä ovat korkea suolaa ruokavalio, tupakointi, vähäinen saanti hedelmiä ja vihanneksia, krooninen gastriitti glandularatrophy ja suoliston metaplasiaa, ja
Helicobacter pylori (H. pylori)
infektio. Kliininen tulos
H. pylori
infektio on osoitettu vaikuttavan eri geneettisten tekijöiden, erityisesti
H. pylori
-virulence liittyvät geenit, kuten
CAG
A,
vac
A,
jään
A ja
bab
[2].
H. pylori
infektio tunnetaan myös indusoida proinflammatoristen syklo-oksigenaasi-entsyymin (COX-2), joka osoittaa ilmen- tymisen lisääntymisen ilmentymistä mahasyövän [3]. Aikaisemmat tutkimukset ovat dokumentoineet geneettisten ja epigeneettisten muutoksia onkogeenien, kasvaimen synnyssä ja yhteensopimattomuuden korjausjärjestelmän geenien mahasyövän. Protocadherin 10 [4], ja syöttämällä liittyvä proteiini kinaasi [5], erittyy frizzled-related protein [6] ja peroksisomiproliferaattorireseptorin gamma [7] on osoitettu olevan pienentää ilmentymisen ja kasvaimia estävä toiminto mahasyövän. Toisaalta, retinoiinihappo-säännelty ydin- matriisin liittyvä proteiini [8] ja kyllä-liittyvä proteiini 1 [9] olivat sekä voimistunut ja käyttää onkogeenisen funktion kasvaimen kehittymisen.
Stathmin1 (STMN1), joka tunnetaan myös kuten onkoproteiinia 18, on tärkeä sytosolinen mikrohaaroihin epävakautta proteiinia, joka näyttelee kriittistä roolia prosessissa mitoosin kautta sääntelyn mikrotubulusdynamiikan, ja useita muita biologisia prosesseja [10]. Korkea STMN1 ilmentyminen liittyy huonoon ennusteeseen eri maligniteetteja, mukaan lukien rintasyövän [11], [12], eturauhassyöpä [13], pahanlaatuinen mesoteliooma [14], kohdunkaulan syöpä [15], ja ruokatorven okasolusyöpä [16] . Vuonna 2010 Jeon et al. Ensimmäinen raportoitu että STMN1 yli-ilmentyminen korreloi positiivisesti imusolmuke etäpesäke ja kehittyneet lavastus ja verisuonten invaasio, ja negatiivisesti uusiutumista elinaika hajanainen tyyppi mahakarsinoo- [17]. Sama ryhmä osoitti kasvaimia synnyttävän roolia STMN1 mahalaukun syövän
in vitro
lisäkasvun estäminen, siirtolaisuuden ja hyökkäyksen mahalaukun solulinjoissa lyömällä STMN1 alas käyttämällä siRNA, ja
in vivo
eston ksenograftin kasvaimen kasvua nude-hiirissä siRNA transfektiolla.
asetukseen STMN1 ilmentymisen miR-223 on osoitettu maksasolukarsinoomassa meidän edellisessä tutkimuksessa [18]. Mikro-RNA: t ovat ryhmä yksijuosteisia RNA-molekyylejä 21-23 emäsparin pituisia ja säätelevät kohdegeenien ilmentymistä erityisten emäspariutumisen vuorovaikutuksia miRNA ja transloimattomat alueet kohdennetun mRNA: iden [19]. MiRNA toimisi onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla ihmisen syövissä ja ovat mahdollisesti käyttää uusina ja ennustavia biomarkkereiden, ja terapeuttisia tavoitteita. Mahasyövän, useat miRNA lukien miR-143 ja -145 [20], miR-141 [21], miR-31 [22] ja miR-106 [23] ovat vaimentua, kun taas jotkut oncogenetic miRNA kuten miR-21 ja miR-27a [24] ovat voimistunut.
Tämän tutkimuksen tarkoituksena tutkia toiminnallista roolia STMN1 mahalaukun syövän kehittymisessä ja mekanismit sääntelyn STMN1 mahasyövän.
tulokset
Up-regulation of STMN1 mahasyövän solulinjoissa ja ensisijainen mahasyövän näytteet
ilmentyminen STMN1 mRNA oli korkeampi kaikki 9 mahasyövän solulinjoissa kuin normaali mahan kudoksessa, kuten on esitetty kuviossa. 1A. Western blot-analyysi vahvisti säätely ylöspäin STMN1 proteiinin 11 mahasyövän solulinjoissa (Fig. 1 B). Sääteli STMN1 proteiinin ilmentymistä havaittiin 4 out of 5 ensisijainen mahalaukun adenokarsinooman verrataan vastaaviin ei-tuumori- mahan limakalvon (Fig. 1 C). QRT-PCR suoritettiin tutkimaan STMN1 mRNA ilmaisun tasolla. Vuonna ensisijainen mahalaukun adenokarsinooman, 28 50 tapausta (56%) osoitti yli 1,5-kertaisesti säätely STMN1 mRNA ilmaisun kasvainkudoksessa verrattuna vastaavien muiden kuin tumorous limakalvoa. Keskimääräinen taso STMN1 mRNA: n ilmentyminen oli huomattavasti korkeampi Tuumorinäytteissä kuin, että ei-syöpä vastineet (
p
= 0,040, Fig. 1 D).
(A) STMN1 mRNA: n ekspression mahasyöpä solulinjoissa verrattuna normaaliin mahalaukun mRNA kaupallisesti saatavissa Ambion (AM7996). (B) STMN1 proteiinin ilmentymistä arvioitiin Western blot mahasyövän solulinjoissa ja normaali mahan limakalvoa potilaalle tehtiin painonpudotukseen mahalaukun leikkausta. (C) Western blot STMN1 pariksi mahasyövässä (T) ja viereisen ei-tuumori- limakalvokudosten (N). (D) STMN1 mRNA: n ekspression 50 paria mahalaukun adenokarsinoomaa ja viereisen ei-tuumori- limakalvon (
p
= 0,040).
STMN1 ilmaisu korreloi huonon ennusteen hajanainen tyyppi mahasyövän
Immunohistokemia suoritettiin arvioimaan STMN1 proteiinin ilmentymistä 111 ensisijainen mahalaukun adenokarsinooman näytteitä. STMN1 proteiinin ilmentyminen on pääasiassa sijaitsi sytoplasmassa kasvainsolujen (Fig. 2A). Positiivinen immunoreaktiivisuus havaittiin 96 mahalaukun adenokarsinooman (86,5%). Joukossa STMN1-positiivisia kasvaimia, 40 osoitti vahvaa (3+), 37 osoitti väli (2 +) ja 19 osoittivat heikkoa (1+) STMN1 värjäystä. Edellinen tutkimus on osoittanut, että STMN1 ilmentyminen säätelee negatiivisesti tuumorisuppressorigeenin TP53 [25]. Siksi arvioitiin ilmentymistä p53-proteiinin immunohistokemiallisesti ja tutkia sen korrelaatio STMN1 ekspressiotason. Poikkeava ydinaseiden p53 ilmentymistä havaittiin 51 (45,9%) mahalaukun adenokarsinooman ja useammin STMN1-positiivisten kasvain (50,0%) kuin STMN1-negatiivinen kasvain (20,0%) (
p
= 0,03). Ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia 111 mahalaukun adenokarsinoomaa sairastavien potilaiden ja yhdessä STMN1 ilme on esitetty taulukossa 1. STMN1-positiivisia kasvaimia olivat todennäköisesti löytyy vuotiaiden ikäryhmässä (
p
= 0,07) ja liittyy p53 ydinaseiden lauseke (
p
= 0,03), Univariate analyysi osoitti, että vanhuus (
p
0,036), histologia epämääräistä komponentti (
p
= 0,012), vaihe (
p
0,0001), T vaiheessa (
p
= 0,012), N vaiheessa (
p
0,0001), M vaiheessa (
p
0,0001) ja läsnäolo imusolmuke etäpesäke (
p
0,0001) korreloi huono tautikohtaisia selviytymistä. Monimuuttuja Coxin suhteellisen vaarat regressioanalyysi, vain ikä (
p
0,0001) ja vaihe (
p
0,0001) on itsenäisesti liittyy tiettyyn tautiin eloonjäämisen (taulukko 2). Vuonna hajanainen tyyppi mahalaukun adenokarsinoomaa, STMN1 ilmentyminen liittyi vanhuuteen (
p
= 0,043), T vaiheessa (
p
= 0,004) ja läsnäolo imusolmuke etäpesäke (
p
= 0,046). Expression of STMN1 heikossa tyyppi mahalaukun adenokarsinooman liittyi huonompi tautikohtaisia selviytymistä yhden muuttujan analyysin (
p
= 0,01, Fig. 2B).
(A) edustaja kuvia STMN1 immunohistokemia mahasyöpä, kotelo 37, suoliston tyyppi ja kotelo 112, hajanainen tyyppi (alkuperäinen suurennos x 100, lisäys x 400). (B) Kaplan-Meier käyrä tautikohtaisia eloonjäämisen mukaan STMN1 ilmentymistilanne heikossa tyyppi mahalaukun adenokarsinooman.
hiljentäminen STMN1 estää aggressiivinen fenotyyppi
in vitro
Usein säätelyä STMN1 mRNA ja proteiini mahalaukun kasvaimet ehdotti mahdollisen kasvaimia synnyttävän roolia tämän geenin. Knockdovvn STMN1 pienten RNA-interferenssi (siRNA) huomattavasti alennettu mRNA ja proteiini tasolla (Fig. 3A) ja vähensi merkittävästi solujen proliferaatiota AGS ja MKN7 solujen osoituksena MTT määritykset (
p
0,001, Fig. 3B). STMN1 siRNA-välitteisen kasvun estävä vaikutus varmistettiin lisäksi kiinnittymisestä riippuvaisia yksikerroksista pesäkemuodostusta. Merkittävä väheneminen pesäkemäärät havaittiin transfektoiduissa soluissa STMN1 siRNA verrattuna scramble valvontaa yksikerrosviljelmässä (alennettu 49,2% ja 68,4% salausmallin valvonnan AGS ja MKN7 vastaavasti;
p
0,001, kuva 3C).
(A) transfektointi STMN1 siRNA onnistuttu vähentämään STMN1 mRNA ja proteiini ilmaisun AGS ja MKN7 soluja (**,
p
0,001). (B) MTT määritykset ehdotti pudotus STMN1 merkittävästi tukahdutti lisääntymistä AGS ja MKN7 (**,
p
0,001). (C) Yksikerroksinen pesäkkeiden muodostumisen määritykset ehdotti transfektio siSTMN1 voisivat vähentää kiinnittymisestä riippuvaisia pesäkkeenmuodostusta AGS ja MKN7 solujen (**,
p
0,001). Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja virhepalkit edustavat standardipoikkeamaa. (D) Kuvat ovat soluja tunkeutuu läpi Matrigel-päällystetty kalvo alapuolelle mikrohuokosten on esitetty. Vähentää merkittävästi invasiivisen kyvyn näkyi STMN1 taintumisen (**,
p
0,001). Solujen lukumäärä laskettiin 5 random näkymä kentät ja virhepalkkien edustettuina standardipoikkeamat.
solun liikkuvuus määrityksissä merkittävä väheneminen invasiivisia fenotyypin kautta Matrigel päällystetty Boyden kammio (
p
0,001, Fig. 3d) osoitettiin STMN1 siRNA-transfektoiduissa AGS ja MKN7 soluja (alennettu 51,6% ja 46,8% salausmallin valvonnan AGS ja MKN7 vastaavasti). Vuonna solumigraation määrityksissä käyttäen TranswellTM Permeable tukee merkittävä lasku solujen määrä vaeltavat läpi mikrohuokoisen kalvon (
p
0,001, kuva S1) todettiin STMN1 siRNA transfektoiduissa AGS ja MKN7 soluja (alennettu 65,9% ja 42,7% sekoituskoodin valvonnan AGS ja MKN7, vastaavasti), mikä viittaa siihen, siSTMN1 voi estää migraation kyky mahalaukun syöpäsoluja.
Koska kasvua estävä vaikutus havaittiin siSTMN1 transfektoiduissa soluissa, olemme analysoineet transfektantit solusyklin parametreja virtaussytometrialla. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen, kerääntyminen G1-solujen havaittiin siSTMN1 transfektanttien verrattuna sekoituskoodin siRNA kontrolleihin (Fig. 4A). Solut G1 vaiheessa nostettiin 47,5%: sta 53,7%: in AGS, 38,0%: sta 43,4%: in MKN7, ja 30,1%: sta 40,1%: in SGC7901 soluissa. Ja tämä oli mukana lasku S-vaiheen soluja. Noudattaen solukierron pysähtymisen löytyy virtaussytometrianalyysissä havaitsimme merkittävä väheneminen fosfo-Rb (S807 /811) in siSTMN1 transfektanteista (Fig. 4B). Lisäksi siSTMN1 voivat aiheuttaa myöhässä apoptoosin neljässä mahasyövässä tutkituissa solulinjoissa, AGS, MKN1, BGC823 ja SGC7901, joka edusti kasvua pilkkoa-PARP (Fig. 4B). Ei kuitenkaan havaittu merkittävää eroa tason p-AKT (S473) ja p-Stat3 (T705) välillä siSTMN1 ja negatiivinen kontrolli transfektoitu.
(A) virtaussytometrinen analyysi paljasti kertyminen solujen G1 vaihe 24 tunnin kuluttua siSTMN1 hoidon. Edustavia tietoja kahdesta toisistaan riippumattomasta kokeesta näytettiin. (B) Western blot-analyysi osoitti p-Rb (S807 /811) vähentäminen ja kasvu pilkkoa-PARP jälkeen STMN1 knockdown. p-AKT (S473) ja p-Stat3 (T705) ei osoittanut mitään eroa. (C) siSTMN1-SGC7901 muodostunut pienempi ksenograftikasvaimissa kuin siScramble-SGC7901 3 viikkoa injektion jälkeen (
p
0,01).
siSTMN1 estää niiden kasvun mahakasvaimen
in vivo
tutkimiseksi edelleen vaikutuksen STMN1 on
in vivo
kasvun mahakasvaimen, siSTMN1 ja scramble-transfektoidut mahasyövän solua injektoitiin ihon alle oikealle ja vasemmalle selkä kylki nude-hiirten, vastaavasti. Koska AGS ja MKN7 solut eivät muodosta nude-hiirissä, käytimme SGC7901 solujen
in vivo
tutkimuksessa. siSTMN1-transfektantti muodostettu pienempiä kasvaimia oikealla selkä kylki kuin ryntäily valvonnan vasemmalla selkä kylki 3 viikkoa injektion jälkeen (
p
0,01, Fig. 4C).
STMN1 on alavirtaan tavoite miR-223 mahasyövän
ennustaa Targetscan, mahdolliset miR-223 sitoutumiskohta oli löydetty STMN1 3’UTR (asema 12-18 of STMN1 3’UTR). Expression of miR-223 säädeltiin vähentävästi 9 mahasyövässä solulinjoissa verrattuna normaaliin mahalaukun epiteelin kudosten (Kuva. 5A). Expression of miR-223 oli negatiivinen korrelaatio STMN1 proteiinin ilmentymisen (
p
= 0,05). Olemme edelleen arvioinut STMN1 proteiinin ilmentymistä immunohistokemiallisesti ja taso miR-223 by qRT-PCR 31 ensisijainen mahasyövässä näytteitä. Kasvaimet korkeamman STMN1 immunoreaktiivisuus (pisteet 2+ ja 3+) osoitti ei-merkitsevä suuntaus kohti alempaa miR-223 ekspressiotason (
p
= 0.137, kuvio. 5B).
( A) MiR-223 ekspressiotaso 9 mahasyövän solulinjoissa määritettynä qRT-PCR. Rajatapaus korrelaatiota ei havaittu STMN1 proteiinin tason ja vähentää miR-223 lauseke (
p
= 0,05). (B) MiR-223 ilmentymisen 31 ensisijainen mahalaukun adenokarsinooman ositettu STMN1 proteiinin taso. (C) MiR-223 alassäädetty endogeenisen STMN1 mRNA ja proteiinin ilmentymisen (**,
p
0,001) AGS ja MKN7 soluja. (D) alaspäin säätely STMN1 proteiinin ilmentymisen miR-223 helpotti miR-223 eston MKN7. (E) lusiferaasireporttiterilla määritykset ehdotti STMN1 oli otaksuttu kohteena miR-223 (**,
p
0,001). Villityypin: lusiferaarikonstrukti sisältävä villityyppisen STMN1 3’UTR siemen sekvenssi; Mutant 1: siemen sekvenssi poistettiin; Mutant 2: 4-nukleotidin mutaatiot siemenen sekvenssin.
osoitus mahdollisista estävä vaikutus on miR-223 STMN1 ilmaisun, transfektoimme miR-223 mahalaukun syövän solulinjojen AGS ja MKN7 . MiR-223 tukahdutetaan STMN1 mRNA ja proteiinin ilmentyminen molemmissa solulinjoissa (
p
0,001, Fig. 5C). Lisäämällä miR-223 salpaaja pelasti STMN1 proteiinin ilmentymistä MKN7 soluissa, mikä viittaa estävä vaikutus oli nimenomaan aiheuttama miR-223 (Kuva. 5D). Dual lusiferaasireportteri- analyysit suoritettiin tutkia vuorovaikutusta miR-223 ja STMN1 3’UTR (Fig. 5E). Reportteri konstruktit sisältävät ennustetun tai mutatoituja sitoutumiskohdat olivat kotransfektoitiin miR-223 matkivat ja MKN28 soluja, mahasyövän solulinja on suhteellisen alhainen endogeenisen STMN1 ilmentymistä. MiR-223 aiheutti voimakas estävä vaikutus STMN1 3’UTR (49,7%,
p
0,001). Estovaikutus on poistettava, kun siemenet alue on poistettu (mutantti 1), tai lievittää kun 4 nukleotidia siementen alue mutatoitiin (67,6%,
p
0,001, Mutant 2).
keskustelu
tässä tutkimuksessa osoitimme ylös-säätely STMN1 ilmaisun sekä mRNA ja proteiini tasoilla mahalaukun adenokarsinooman tavanomaiseen verrattuna mahalaukun epiteelin. Tuloksena ehdotti, että STMN1 voisi olla kasvaimia synnyttävän toiminnon mahalaukun kasvainten synnyssä. STMN1 on raportoitu olevan prognostinen biomarkkereiden useita syöpiä, kuten peräsuolen syöpä [26], ruokatorven okasolusyöpä [16], maksasyövän [27], [28], [29], [30] ja suun squamous-cell carcinoma [31]. Olemme osoittaneet, että STMN1 ilmaisu liittyy vuotiaiden ikäryhmässä, kehittyneet T vaiheessa läsnäolo imusolmuke etäpesäke, ja lyhyempi tautikohtaista säilymiseen aika hajanainen tyyppi mahalaukun adenokarsinoomaa. Sopusoinnussa tämän toteamuksen, Jeon et al. kertoi, että STMN1 voisi ennustaa huonon ennusteen diffuusi tyyppi mahasyövän ja korreloi verisuoni- invaasiota [17].
STMN1 säätelee mikrotubulusdynamiikan edistämällä depolymeroitumisen mikrotubuleiksi ja estää polymeroitumisen tubuliinin heterodimeerejä. Inhibitio STMN1 ilmaisun johtaa kertyminen solujen G2 /M vaiheita ja liittyy vakavia sukkularihmaston poikkeavuuksia ja vaikeuksia irtautuminen mitoosin [10]. STMN1 välittää myös vaikutukset p27 (Kip1) on solun liikkuvuus [32]. In sarkooma soluihin [33] ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [34], STMN1 stimuloi solun liikkuvuus ja sen kautta soluväliaineen
in vitro
ja lisäsi metastaattisen potentiaalin
in vivo
. Huonosti eriytetty mahasyövän solulinjoissa SNU638 ja SNU16, siRNA aiheuttama STMN1 tukahduttaminen voi tukahduttaa solujen lisääntymistä
in vitro
ja
in vivo
[17]. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että siRNA knockdovvn STMN1 esti solujen lisääntymistä ja kiinnittymisestä riippuvaisten pesäkkeiden muodostumisen, heikentynyt hyökkäyksen ja muuttoliike kyky, aiheuttama G1 pidätyksen ja myöhään apoptoosin mahasyövässä solulinjoissa. Olemme lisäksi osoittaneet, että siSTMN1 esti
in vivo
kasvun mahasyövän solulinjan SGC7901. Toiminnallinen esto STMN1 helposti laski solujen lisääntymisen ja invasiivisia fenotyyppi, mikä viittaa protumorigenic roolia STMN1 mahasyövän.
MiR-223 on evoluutiossa säilyneitä miRNA joka alun perin ilmoitettiin granulopoieesin ja myelooisen eriyttäminen [35]. Ekspression miR-233 voidaan ajaa myeloidisolu- transkriptiotekijät, PU.1 ja C /EBPs [36]. Se voisi säädellä useita kohdegeenien kuten MEF2C [37], joka on transcriptive edistävä tekijä myelooisesta esisolujen lisääntymistä. Se myös keskeinen rooli aikana osteoklastien [38], ja voitaisiin palvella mahdollisena biomarkkeri toistuvat munasarjasyöpä [39] ja sepsis [40]. Me raportoitu aiemmin, että STMN1 on otaksuttu alavirtaan tavoitteeksi miR-223 maksasolukarsinoomassa [18]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme alhaisen miR-223 ekspressiotaso mahasyövän solulinjoissa ja käänteinen suhde miR-223 ja STMN1 proteiinin ilmentymiseen. Lusiferaasin toimittaja määrityksissä, olemme vahvistaneet välistä spesifistä vuorovaikutusta miR-223 ja STMN1 3’UTR mahalaukun syöpäsoluja. Negatiivinen modulaatio vaikutus miR-223 oli edelleen perusteltuja merkitsevästi vähäisempi STMN1 proteiinin taso mahasyövän solulinjoissa jälkeen miR-223 re-ilmaisua. Tulokset tukivat että STMN1 on otaksuttu kohteena miR-223 mahalaukun syöpäsoluja. Kiehtovan, yli-ilmentyminen miR-223 ei muuttanut solujen lisääntymisen ja apoptoosin (kuvio S2A 2B), mutta merkittävästi indusoi solun liikkuvuus mahasyövän soluissa (kuvio S2C). Sopusoinnussa tämän toteamuksen, tuore tutkimus osoitti, että miR-223 edistänyt soluliikkuvuus läpi transkription jälkeisen downregulation tuumorisuppressorin EPB41L3 mahasyövän soluissa [41]. Vaikka yksittäinen miRNA voi kohdistaa useita geenejä, useita miRNA voi säädellä yhden geenin. Tarkka molekyylipaino mekanistinen tunnistaminen, miten tietyn miRNA edistää fenotyypin muutosten edelleen heikko.
inaktivointi tuumorisuppressorigeenin TP53 on yleisin ja eniten tutkittu molekyylitason tapahtumia ihmisen syövässä. On raportoitu, että p53-välitteisen tukahduttamisesta STMN1 promoottorin aktiivisuutta, joka johtaa negatiiviseen säätelyyn STMN1 ilmaisun ja G2 /M pidätykseen solusyklin [25], [42]. On yleisesti hyväksytty, että villityypin p53-proteiini ei ole havaittavissa immunohistokemiallisesti, koska se on epästabiili ja sillä on suhteellisen lyhyempi puoliintumisaika. Mutantti p53-proteiini kertynyt ydin on suhteellisen vakaa ja sillä on pidempi puoliintumisaika, mikä tekee siitä havaittavissa immunohistokemiallisesti. Siis vahva ja hajanainen immunoreaktiivisuus on yleensä osoitus mutantti p53 [43]. Olemme arvioineet p53 tilan mahalaukun adenokarsinooman immunohistokemiallisesti ja totesi, että poikkeava p53 immunoreaktiivisuus liittyy korkeampi STMN1 ilme. Siksi on todennäköistä, että yliekspressio STMN1 saattaa osittain johtuu inaktivoitumisen tuumorisuppressorigeenin p53 mahasyövistä.
Yhteenvetona olemme osoittaneet säätely ylöspäin STMN1 mahalaukun adenokarsinoomaa ja ilmentyminen korreloi kehno tautikohtaiset selviytymisen hajanainen tyyppi mahasyövän. Kasvaimia synnyttävän ominaisuus STMN1 mahalaukun kasvainten synnyssä vahvistettiin toiminnalliset tutkimukset. Olemme lisäksi osoittaneet, että ilmaus STMN1 negatiivisesti säännellään miR-223 mahalaukun syöpäsoluja. Meidän havainto ehdotti, että STMN1 voisi toimia ennustetyövälineenä merkki ja potentiaalinen terapeuttinen kohde hajanainen tyyppi mahalaukun adenokarsinooman.
Materiaalit ja menetelmät
Solun viiva ja soluviljelmissä
Yksitoista maha- syöpäsolulinjoissa, MKN28, KATO III, MKN45, SNU16, SNU1, MKN7, MKN1, NCI-N87, AGS, BGC823, SGC7901, saatiin joko American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA), RIKEN Cell Bank (Tsukuba, Japani) tai lahjana Institute Digestive Disease (IDD) Prince Wales Hospital. Nämä solulinjat kasvatetaan RPMI 1640: ssä (GIBCO), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, EU GIBCO), 100 U /ml penisilliiniä ja 10 ug /ml streptomysiiniä: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO
2 37 ° C.
Kliininen mahalaukun adenokarsinooman näytteitä
yhteensä 111 mahalaukun adenokarsinooman näytteet noudetaan kudospankki Anatomical ja Cellular Pathology, Prince of Wales sairaalan, Shatin, Hong Kong. Toinen 5 paria primaarikasvainten ja viereisen ei-syöpäkudoksissa kerättiin leikkauksen aikana potilailta ilman neoadjuvant hoitoa. Näytteet jäädytettiin välittömästi -80 ° C: ssa vielä molekyylitason analyysia. Biopsianäytteet 50 paria mahasyövän ja vastaavat ei-syöpä limakalvon oli ystävällisesti IDD Prince Wales Hospital. Tutkimus on hyväksynyt yhteisen Kiinan University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research eettiselle toimikunnalle, Hong Kong (CREC Ref. No. 2009,521) ja kaikki osallistujat kirjallinen lupa varten otetaan näytteitä ja myöhempää analysointia.
RNA, qRT-PCR ja microRNA qRT-PCR
Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen) valmistajan ohjeita. RNA-pitoisuus mitattiin NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) käytettiin cDNA: n synteesiin. Kvantitatiivista RT-PCR: llä (qRT-PCR), Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) on haettu STMN1 (Sense: GAGGTCACGTGCCTCTGTTTG Antisense: CTGACCACACTCTGAGCACCAA; Probe: Applied Biosystems, +185.528.556-1, FAM-CGCTTTTGTGCGCGC). Suhteellinen ilmentymistaso oli normalisoitunut glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), ja se lasketaan käyttäen 2∧ (delta Delta Ct) menetelmällä. Taqman miRNA määritykset (Applied Biosystems) käytettiin määrittämään ilmentymisen tasot kypsän miR-223. Kokonais-RNA kään- transkriptoidaan MultiScribe (Applied Biosystems) on reaktioseos, joka sisältää miR-specific varsi-silmukka-reverse transcriptive aluketta. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina ja vedessä aihioista Negatiivisina verrokkeina mukaan.
Western blot ja immunohistokemia
Proteiini uutettiin mahasyöpä solulinjoista ja pariksi ensisijainen kudoksia käyttäen RIPA lyysipuskuria proteinaasi estäjä. Proteiinipitoisuus mitattiin Bradfordin menetelmällä (Bod-Rad) ja 20 ug proteiinia sekoitetaan 2 x SDS-latauspuskuria lisättiin kaistaa kohti, erotettiin 12% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. STMN1 proteiini havaittiin polyklonaalisella anti-STMN1 vasta-ainetta (Cell Signaling, # 3352, 1:1000). Muut vasta-aineet ovat peräisin Cell Signaling kaupallisesti, halkaistut PARP (Asp214) (# 9541, 1:1000), fosfori-Rb (Ser807 /811) (# 9308, 1:1000), fosfori-AKT (S473) (# 9271, 1 :1000) ja fosfo-Stat3 (T705) (# 9145, 1:2000).
Immunohistokemia suoritettiin 4 pm paksu osastoja formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut yksilöitä. Sen jälkeen de-vahaus ksyleenissä ja arvostellaan etanolia, leikkeitä inkuboitiin 3% H
2O
2 ratkaisu 25 minuuttia endogeenisen peroksidaasin salpaamiseksi toimintaa ja sen jälkeen tehtiin microwaving sitraattipuskurissa antigeenin haku. Primaaristen vasta-aineiden (1:25 ja STMN1 peräisin Cell Signaling ja 1:100 p53 päässä DAKO) inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli ja kromogeenina kehittäminen suoritettiin käyttäen EnVision järjestelmän (DAKO). Sytoplasmisen ilmentyminen STMN1 arvioitiin määrittämällä suhteessa pisteet ja intensiteetti pisteet. Osuus tilanne oli mukainen osuus kasvainsolujen positiivisella sytoplasmista värjäytymistä (0, ei mitään, 1, = 10%, 2, 10 = 25%, 3, 25 50%, 4, 50%). Intensiteetti pisteet annettiin keskimääräisen intensiteetin positiivisia kasvainsoluja (0, ei mitään, 1, heikko; 2, väli-, 3, vahva). Sytoplasmisen pisteet STMN1 oli tuote osuuden ja intensiteetin tulokset, välillä 0 12. sytoplasminen ilmentyminen luokiteltiin negatiiviseksi (pisteet 0), 1+ (pisteet 1-3), 2 + (pisteet 4-6), ja 3+ (pisteet 7-12). Nuclear p53 ilmentymistä 10% kasvainsolujen pisteytettiin poikkeava yliekspressio.
STMN1 funktionaalisia määrityksiä
transfektio STMN1 siRNA ja sekoituskoodin ohjaus (QIAGEN) suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ( Invitrogen). Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega) valmistajan ohjeiden. Pesäkkeiden muodostumisen määritykset yksikerrosviljelmissä, jotka on transfektoitu STMN1 siRNA tai sekoituskoodin ohjaus viljeltiin 10 päivää. Solut kiinnitettiin 70% etanolissa 15 minuutin ajan ja värjättiin 2% kristalliviolettia. Pesäkkeitä, joissa on enemmän kuin 50 solua pesäkettä laskettiin. Kokeet toistettiin kolme kertaa.
soluinvaasiota analyysit suoritettiin käyttäen BD BioCoat matrigeelin Invasion Chambers (BD Biosciences). Transfektoidut solut siirrostettiin päällä kammion viljelyväliaineessa, joka sisälsi 1% FBS: ää, jossa on täydellistä kasvualustaa (joka sisälsi 10% FBS: ää), lisättiin alaosaan. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 24 tuntia 37 ° C: ssa, solut, jotka tunkeutuivat läpi matrigeeliä kalvon kiinnitettiin 100% metanolissa 2 minuuttia ja värjättiin 1% toluidiinisinisellä vielä 2 minuuttia. Tilastollisten analyysiä varten solut alapuolella kalvon laskettiin 5 random mikroskooppikentäs- (alkuperäinen suurennos x 400). Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja keskiarvo on ilmaistu 2 itsenäisestä kokeesta.
solumigraation analyysit suoritettiin käyttämällä Transwell läpäisevä tukee (Corning, NY). Solut kerättiin viljelymaljoihin 24 tuntia transfektion jälkeen, pestiin kolme kertaa elatusaineella ja uudelleen suspendoidun. Sitten 300 ui solususpensiota (5 x 10
4-soluja) lisättiin osaksi siirtoaltaat, 500 ul: aan kasvatusliuosta, joka sisälsi 10% FBS: ää alemmassa kammiossa. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 24 tuntia 37 ° C: ssa, soluja, jotka voivat kulkeutua läpi mikrohuokoisen membraanin kiinnitettiin 100% metanolissa 2 minuuttia ja värjättiin 1% toluidiinisinisellä vielä 2 minuuttia. Tilastollisten analyysi, laskimme liitteenä solujen määrän 3 näkymä aloilla kunkin kammion satunnaisesti ja otti keskimääräinen solujen määrä kunkin kentän.
Virtaussytometrianalyysi solusyklin pidätyksen
solusyklin analyysi, AGS, MKN7 ja SGC7901 soluja kerätä tuolloin 24 tunnin kuluttua transfektiosta 6 cm levyille. Ennen transfektion solut tehtiin nälkään 12 tuntia synkronointia varten. Solut kerättiin käyttäen kylmällä PBS: llä ja kiinnitettiin 70% kylmällä etanolilla yön yli 4 ° C: seen ja käsiteltiin 1 ng /ml RNaasi A: lla 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solujen DNA värjättiin 15 ng /ml propidiumjodidia (PI) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa pimeässä. Sitten solut lajiteltiin FACS Calibur -virtaussytometrillä (Becton Dickinson, CA) ja solusyklin profiilit määritettiin käyttäen ModFitLT ohjelmistoa (Becton Dickinson, San Diego, CA). Kokeet toistettiin kaksi erillistä kertaa.
In vivo
tuumorigeenisyyden tutkimuksen
SGC7901 soluja (2 x 10
6cells suspendoitiin 0,1 ml: aan PBS: ää) transfektoitiin ohimenevästi siScramble ja siSTMN1 injektoitiin ihonalaisesti selän kylkeen yhdeksän 4-viikkoa vanhoja Balb /c-nude-hiirissä (siSTMN1 oikealla puolella ja negatiivinen kontrolli solut vasemmalla). Ksenografteja otettiin pois ja kasvaimen halkaisija mitattiin ja dokumentoitu lopussa viikon 3. Kasvaimen tilavuus (mm
3) arvioitiin mittaamalla pisin ja lyhin halkaisija kasvaimen ja laskemalla seuraavasti: tilavuus = (lyhin halkaisija )
2 × (pisin halkaisija) x 0,5.