Krooninen sairaus

tiivistelmä

Erilaisia ​​histonien metylaatio on liittynyt syövän etenemiseen. Riippuen metylaatiokohdan vuonna histoniproteiineista, sen vaikutukset transkription ovat erilaisia. DPY30 on yhteinen jäsen SET1 /MLL histoni H3K4 metyylitransferaasi komplekseja. Kuitenkin sen ilmentyminen ja roolit mahasyövässä on huonosti tunnettu. Sen määrittämiseksi, ovatko DPY30 on patofysiologisia rooleja mahasyövän, sen ilme ja roolit tutkittiin. Immunohistokemia ja reaaliaikainen PCR osoitti säätely ylöspäin DPY30 ilmaisun joissakin mahasyövässä solulinjoissa ja potilaiden kudoksiin. Sen Knockdown siRNA laski proliferaatiota, migraatiota, ja invaasion mahasyövän solujen, kun taas sen yliekspressio osoitti päinvastaisia ​​vaikutuksia. Nämä tulokset osoittavat, että DPY30 on kriittinen rooleja solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion mahasyövän solujen, ja ehdottaa DPY30 voisi olla terapeuttinen kohde mahasyövän.

Citation: Lee YJ, Han ME, Baek SJ, Kim SY, Oh SO (2015) roolit DPY30 in leviämisen ja Liikkuvuus mahasyövän Cells. PLoS ONE 10 (7): e0131863. doi: 10,1371 /journal.pone.0131863

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 03 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 8 kesäkuu 2015; Julkaistu: 06 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Bio Medical Technology Development Program (# 2012M3A9C6050213, OSO) ja Basic Science Research Foundation (# 2012R1A1A3010521, HME) National Research Foundation (NRF) rahoittama Korean hallitus (MEST), ja jonka avustusta National R DPY30 siRNA duplex (3′-UTR) (Bioneer); 5′- CCG GAC AAC AGA ACC UAU UUU UGG A (dTdT) -3 ’, 5’GAG GCA GCU UUA AUU GCC Elokuu AUC A (dTdT) -3′; WDR5 siRNA duplex (Bioneer), 5’- GUC CUU GUG AAG CUC GUC U (dTdT) -3 ’, 5’GUC GUG AUC UCA ACA GCU U (dTdT) -3’, 5’CAG AUU CUA ACC UUC UUG U (dTdT) -3 ’; RBBP5 siRNA duplex (Bioneer), 5’- GUG UGA AAA GGG CUC AGU A (dTdT) -3 ’, 5’CAG AUU CUC AGG AUC UUG U (dTdT) -3’, 5’GUG GUU GAG AUU AGU AGA U (dTdT) -3 ’; ASH2L siRNA duplex (Bioneer), 5’- GUA UGA ACG GGU UUU GUU A (dTdT) -3 ’, 5’CUG AGA ACA CCU GAA AUC A (dTdT) -3’, 5’GUC UAC CUU UCA UGA CCA A (dTdT) -3 ’; sekaisin (SCR) siRNA (Thermo Scientific), 5’- GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3 ”.

DPY30 yliekspressio

DPY30 cDNA kloonattiin pLenti6.3 -V5 /DEST vektorin (lentiviraalinen kohde vektori) käyttäen

in vivo

rekombinaatio-pohjainen Gateway kloonausjärjestelmää (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Luovuttaja-vektoriin (pDONR221) kätkeminen cDNA-sekvenssin DPY30 ostettiin Ultimate ORF Clones (Invitrogen), ja yhdistettiin laskuri valittavissa

ccdB

geenin pLenti6.3-V5 /DEST kanssa käyttämällä LR-klonaasia entsyymiseosta (Invitrogen). Tyhjän vektorin pLenti6.3 /V5-DEST käytettiin mock ohjaus. Rekombinantti lentivirukset tuotettiin 293FT soluissa, ja käytettiin infektoimaan SNU216 ja SNU638 soluja, mukaan valmistajan ohjeiden (ViraPower Lentivirusvektorikonstruktit Expression System, Invitrogen). DPY30 yli-ilmentäviä stabiileja soluja perustettiin selektoimalla blastisidiinia (7,5 ug /ml) (Invitrogen).

pelastus määrityksiä, muutimme, minkä jälkeen protokolla ”RNAi häiriöön Precision Lenti ORF kokoelma” (https://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/precision-lentiorfs-rnai-rescue-appnote.pdf). Lyhyesti, solut infektoitiin rekombinantti-lentivirukset (pLenti6.3-V5 /DEST tai DPY30-over konstruktioita). 24 tuntia transduktion jälkeen, media, joka sisältää viruksen poistettiin ja korvattiin valmiissa elatusaineessa. Seuraavana päivänä, blastisidiinia lisättiin konsentraatiossa 7,5 ug /ml. Soluja ylläpidettiin valinta kuusi päivää, korvaa keskipitkällä tai viemällä 2-3 päivän välein tarpeen mukaan. Valitun populaatioiden ohjaus soluja tai soluja, jotka ilmentävät DPY30 käytettiin transfektiokokeista DPY30 siRNA suunnattu avoin lukukehys (ORF) tai 3′-alueen (UTR).

Reaaliaikainen PCR

otettiin kudosnäytteet 23 etuyhteydettömältä Korean ensisijainen mahasyöpäpotilaista että tehtiin kirurginen resektio at Pusan ​​National University Hospital ja Pusan ​​National University Yangsan Hospital ja edellyttäen kirjallinen lupa. Tutkimuksen hyväksyi Pusan ​​National University Hospital-Institutional Review Board (PNUH-IRB) ja Pusan ​​National University Yangsan Hospital-Institutional Review Board (PNUYH-IRB). Kokonais-RNA kudokset ja solut uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen) tai RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), mukaan valmistajan ohjeiden. Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (real-time PCR) käytettiin tarkistaa DPY30 mRNA-tasoja. cDNA syntetisoitiin MMLV-käänteistranskriptaasia (Promega, Madison, WI, USA), dNTP: tä, ja oligo-dT-alukkeita. Alukesekvenssejä olivat seuraavat: DPY30, 5′- AAC GCA GGT TGC AGA AAA TCC T -3 ’ja 5’TCT GAT CCA GGT AGG CAC GAG -3′; WDR5, 5′- TGT TAC TGG TGG GAA GTG GA -3 ja 5’- CTG TTG GGT GAC AAG CTG TT -3 ’; RBBP5, 5’- AGT GCA CAC ATC CAT CCA GT -3 ’ja 5′- TCA CAG TCG CCT GAA AGA AC -3′; ASH2L, 5’- TAC AAG AGC TGC ACG GTT TC -3 ’ja 5′- CCA GCC CAT GTC ACT CAT AG -3′; GAPDH, 5’- TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC -3 ’ja 5’CTC AGC CCG AGT GGA AAT GG -3’. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen LightCycler ™ 96 Reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Roche, Nutley, NJ) ja FastStart Essential DNA Green Master (Roche) mukaan valmistajan ohjeiden. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina.

immunohistokemia

immunohistokemiallinen värjäys kanin anti-ihmis-DPY30 polyklonaalista vasta-ainetta (Sigma-Aldrich) suoritettiin mahasyövän kudoksen array (n = 59) ostettu SUPER BIO CHIPS (Seoul) tai 4-pm osat parafinoidut yksilöitä. Lyhyesti, sen jälkeen, kun deparaffinization ja nesteytys, levyt käsiteltiin 0,3% vetyperoksidia 30 minuutin ajan estämään endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus, ja blokattiin 10% normaalia aasi seerumia (NDS) ja 1% BSA: ta 1 x fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). Leikkeitä inkuboitiin sitten yön yli 4 ° C: ssa estopuskurilla, joka sisälsi kanin anti-ihmis-DPY30 primaarisen vasta-aineen (1:80, Sigma-Aldrich). Sekundaarinen vasta-aine (HRP-konjugoitua) sitoutuminen suoritettiin laimennoksena 1: 200 estopuskurissa 2 tunnin ajaksi RT: ssä. Detection suoritettiin HRP (Vector Laboratories), ja dioja vastavär- käsittelemällä niitä 1 min hematoksyliinillä värjäyspuskurissa (Sigma-Aldrich).

Soluproliferaatiomääritys

Yhden päivän kuluttua solujen transfektoimiseksi siRNA, väliaine korvattiin 1% FBS: ia, ja neljä päivää myöhemmin, 10 ui Ez-Cytox (ITSBIO, Seoul) lisättiin ja inkuboitiin 0,5-2 tuntia. Jotta voidaan tarkistaa vaikutus DPY30 ilmentymisen vaikutus solujen proliferaatioon, solut ympättiin 10% FBS: ia, ja kolmen päivän viljelyn, 10 ui Ez-Cytox (ITSBIO) lisättiin ja inkuboitiin 0,5-2 tuntia. Elinvoimaisten solujen määritettiin mittaamalla absorbanssi 450 nm: ssä käyttäen VICTOR3 useita lukijoita (PerkinElmer, MA, USA).

Boyden kammion määritys

modifioitu Boyden transwell kammio (Neuro Probe, Gaithersburg, MD, USA) käytettiin. Alaosaan oli täytetty 50 ul: RPMI, joka sisälsi 10% FBS: ää. Tutkia vaikutuksia DPY30 tunnettuja alas, SNU1 ja SNU16 (tarttumattomat solut) transfektoitiin ORF-kohdistaminen siRNA. Yksi päivä transfektion jälkeen solut pestiin, suspendoitiin tiheydellä 5 x 10

5 solua /ml 50 ul: ssa RPMI: tä täydennettynä 0,5% FBS: ää, ja ympättiin ylempään kammioon. Vaikutukset poistavan leviämisen, mitomysiini C (0,01 ug /ml, Sigma-Aldrich) lisättiin. Sitten soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa 5% CO2. Lukumäärä siirtynyt solujen arvioitiin laskemalla solut pohjaan kuoppiin. Tutkia vaikutuksia DPY30 yliekspression, vakaa solut (kiinnittyneet solut, SNU216 ja SNU638) käytettiin. Solut (mock ja DPY30-over) trypsinoitiin ja ympättiin tiheydellä 1 x 10

5 solua /ml. Vaikutukset poistavan leviämisen, mitomysiini C: ssa lisättiin. Solujen annettiin kulkeutua neljä tuntia, kalvot kiinnitettiin ja värjättiin käyttäen Diff-quik ratkaisu (Sysmex, Kobe, Japani) ja pestään tislatulla vedellä. Solumäärät 10 satunnaisesti valittua kentät laskettiin valomikroskoopilla. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Matrigel invaasiomääritys

invasiivisen kyvyt syöpäsolujen arvioitiin käyttäen 8-um huokoista BioCoat matrigeelin kammio insertit (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Yksi päivä transfektion jälkeen SCR tai DPY30 siRNA, solut trypsinoitiin ja suspendoitiin tiheydellä 5 x 10

4 solua /ml 500 ul: aan RPMI: tä, johon oli lisätty 0,5% FBS: ää ja mitomysiini C: llä (0,01 ug /ml, Sigma -Aldrich). Sitten solut lisättiin kammioon insertit ja sijoitettiin kuoppiin täytettiin 0,7 ml: lla väliainetta, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, kuten kemoattraktantti. Kun oli inkuboitu 24 tai 48 tuntia, ei-tunkeutuvat soluihin päälle kalvon poistettiin kaapimalla ja invasiiviset solut pohjalle kalvon kiinnitettiin ja värjättiin Diff-quik liuosta (Sysmex). Solumäärät 10 satunnaisesti valittua kentät laskettiin valomikroskoopilla. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja vähintään 5 kentät laskettiin per koe.

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmoitetaan keskiarvoina ± keskihajonnat (SDS) ja kolmen erillisen kokeen. Merkitykset erot määritettiin käyttämällä Studentin

t

-testi varten parittomia havaintoja.

P

arvoja 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

ilmentäminen DPY30 mahasyövän kudoksissa

tutkimiseksi DPY30 ilmentymisen ihmisen mahasyövän, suoritimme immunohistokemiallisesti ilman mahasyövän kudoksen array tai arkistointia parafinoidut kudosleikkeiden. Normaaleissa mahan kudoksissa, DPY30 ilmentyminen oli vaikea havaita (kuvio 1A), mutta syöpäkudoksiin DPY30 proteiini laajalti yli-ilmentyy (kuvio 1B-1D). Erityisesti DPY30 yliekspressoitiin tunkeutuvat mahasyövän soluja (kuvio 1 B-1 D). Lisäksi määritimme mRNA tasoilla DPY30 yhdessä kuolemattomaksi normaalissa mahalaukun epiteelisolujen linja (HFE145) ja kuusi mahasyövän solulinjat (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 ja NCI-N87) käyttäen reaaliaikaista PCR. MRNA taso DPY30 oli huomattavasti suurempi (fold muutos 5) in SNU1 ja SNU16 kuin HFE145 soluissa, kun taas ekspressiotaso DPY30 vuonna SNU216, SNU620 ja SNU638 oli samanlainen kuin HFE145 soluissa ja oli pienempi (kertainen muutos 10) NCI-N87 (kuvio 1 E). Olemme myös tarkastetaan mRNA tasoja DPY30 mahasyövän kudoksissa. DPY30 oli hyvin ilmaistu 15 tapauksessa (15/23, 65%), verrattuna normaaleihin kudoksiin (kuvio 1F). Nämä tulokset osoittavat, että DPY30 ilmentyy voimakkaasti joissakin ihmisen syöpien.

(A-D) immunohistokemiallinen värjäys osoitti yli-ilmentyminen DPY30 mahasyövän kudoksissa. Erityisesti sen yliekspressio oli luonnollisesti suuremmat tunkeutuvat syöpäsoluissa (B-D) kuin normaalissa mahan limakalvon (A). (E) mRNA-taso DPY30 mahasyövän soluissa (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 ja NCI-N87) ja normaalin mahalaukun epiteelisolujen (HFE145) määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä käyttäen spesifisiä alukkeita DPY30. GAPDH normalisointiin käytettiin tietoja. Esitetyt arvot ovat keskiarvoja ± SDS kolmen itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena. *,

p

0,01 (Opiskelijan

t

testi, versus HFE145). (F): n ekspressio DPY30 mahasyövän kudoksissa tutkittiin reaaliaikaisella PCR: llä käyttäen spesifisiä alukkeita DPY30. GAPDH normalisointiin käytettiin tietoja. Arvot ovat keskiarvoja ± SDS kolmen itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena. *,

p

0,01; **,

p

0,05 (Opiskelijan

t

testiä, ja normaalissa).

roolit DPY30 in leviämisen mahasyövän solujen

Sen määrittämiseksi mahdollisia rooleja DPY30 vuonna mahalaukun syöpäsolut, ensin tippuu alas DPY30 käyttäen ORF-kohdistaminen DPY30 siRNA ja valvotaan sen knockdown tehokkuutta reaaliaikaisella PCR (Kuva 2A). ORF-kohdistaminen DPY30 siRNA (100 nM) vähensi mRNA taso DPY30 vuonna HFE145, SNU1, SNU16, SNU216, ja SNU638 soluja verrattuna salattu siRNA (SCR) 78%, 89%, 79%, 76%, ja 88%, vastaavasti. Viisi päivää transfektoimalla soluja SCR tai ORF kohdistaminen siRNA, suoritimme lisääntymismäärityksissä. Knockdovvn DPY30 esti proliferaatiot on HFE145, SNU1 ja SNU16 verrattuna SCR 31%, 69% ja 71% vastaavasti, kun taas pudotus ei vaikuttanut proliferaatioita ja SNU216 ja SNU638 (kuvio 2B), jossa ilmentymisen taso DPY30 oli matala (kuvio 1 E). Seuraavaksi tuotetaan DPY30-yliekspressoivassa solulinjoissa (DPY30-over) käyttäen HFE145, SNU216 ja SNU638 soluja, ja sitten verrataan DPY30 mRNA tasot mock soluissa (ohjaus) ja DPY30-soluihin nähden. Reaaliaikainen PCR-tuloksiin osoitti, että ilmentymistaso DPY30 oli 4,2, 3,5 ja 3,2 kertaa suurempi DPY30 yli-ilmentäviä HFE145, SNU216 ja SNU638 soluja kuin mock-solut, vastaavasti (kuvio 2A). DPY30 yli-ilmentyminen tehosti proliferaatiot on HFE145, SNU216 ja SNU638 soluja versus mock-solut 1,9, 2,2 ja 1,6-kertaisesti, vastaavasti (kuvio 2B).

(A) Reaaliaikainen PCR: ää käytettiin tehokkuuden määrittämiseksi pudotus tai yliekspressio DPY30 in HFE145, SNU1, SNU16, SNU216 ja SNU638 soluja. Knockdown tehokkuus määritettiin jälkeen transfektoimalla soluja 100 nM DPY30 siRNA kohdistaminen ORF tai salattu siRNA (SCR). Yliekspressio tehokkuus määritettiin DPY30-yliekspressoivassa ja mock soluja. (B) vaikutus DPY30 Knockdown tai ilmentymisen vaikutus soluproliferaatioon. Solu elinkelpoisuuden määritystä käytettiin solujen proliferaation mittaamiseen, kun läsnä on 1% FBS: ää. Sillä DPY30 pudotus kokeissa solujen elinkelpoisuuden määritykset suoritettiin viiden päivän kuluttua transfektoimalla 100 nM DPY30 siRNA tai SCR. Kolmen päivän viljelyn solujen elinkelpoisuuden määritykset suoritettiin DPY30-over ja mock soluja. (C) Expression analyysin DPY30 jälkeen tunnettujen alas tai yliekspressio jonka siRNA tai DPY30 ORF vastaavasti. ORF-kohdentamiseen tai 3′-UTR-kohdistaminen siRNA käytettiin seurannaisvaikutuksia alas. (D) Ulkoisia DPY30-ORF pelasti proliferaation esto, jonka 3′-UTR-kohdistaminen DPY30 siRNA. Mock tai DPY30 yli-ilmentäviä soluja transdusoitiin kahdenlaisia ​​DPY30 siRNA (3′-UTR-kohdistamista tai ORF-kohdistaminen), sitten solunelinkykyisyysmäärityksen tutkittiin. Arvot ovat keskiarvoja ± SDS kolmen itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena. *,

p

0,01 (Opiskelijan

t

testi, verrattuna SCR tai Mock).

Vahvista spesifisyyden DPY30 siRNA, suoritimme pelastus kokeita. Pelastamiseen kokeissa, käytimme DPY30 siRNA kohdistaminen 3′-UTR sijasta ORF, koska ORF-kohdistaminen siRNA voi myös heikentää eksogeenisen DPY30 ORF DNA otimme käyttöön. Yli-ilmentää DPY30, me transdusoitu SNU1 ja SNU16 kanssa viruspartikkelien, pLenti6.3-V5 /DEST (kontrolli) tai DPY30-ORF-over konstruktioita. DPY30 yli-ilmentyvä SNU1 tai SNU16 solut osoittivat korkeampi ilmentyminen DPY30 2,1 tai 2,5 kertaa korkeampi kuin mock-solut, vastaavasti (kuvio 2C). ORF-kohdistaminen siRNA johti alas-säätely DPY30 ilmentymisen tasoja yli 75% vuonna mock sekä DPY30 yli-ilmentäviä soluja. 3′-UTR-kohdistaminen siRNA alas-säännelty DPY30 ilmentyminen yli 85% vuonna mock soluissa, kun taas, että DPY30 yli-ilmentäviä soluja, se vähensi DPY30 ilmaus tasolle samanlainen kuin SCR siRNA-transfektoiduissa soluissa ( kuvio 2C). Tämä tulos osoittaa, että eksogeenisen DPY30-ORF-DNA on vastustuskykyinen 3′-UTR-kohdistaminen siRNA ja ilmaistaan ​​samalla tasolla kuin endogeenisen DPY30 mRNA. ORF-kohdistaminen siRNA esti solujen lisääntymisen riippumatta eksogeenisen DPY30 lauseke (kuvio 2D). Leviämisen myös inhiboi 3’UTR-kohdistaminen siRNA mock-soluissa, mutta se oli osittain inhiboitui DPY30 yli-ilmentäviä soluja. In DPY30 yli-ilmentäviä soluja, ORF-kohdistaminen siRNA laski leviämisen SNU1 ja SNU16 verrattuna SCR siRNA 74% ja 66%, vastaavasti, mutta 3′-UTR-kohdistaminen siRNA laski 20% ja 8%: lla . Tämä tulos osoittaa, että eksogeeninen DPY30 pelastaa proliferaation esto indusoi 3′-UTR-kohdistaminen siRNA, ja fenotyypit aiheuttama DPY30 erityisiä siRNA eivät ole pois kohde-vaikutuksia.

Koska DPY30 on osa osastoilla tutkimme ilmaisuja ja rooleja muiden komponenttien osastoilla. Reaaliaikainen PCR osoitti, että mRNA-tasot WDR5 ja RBBP5 in SNU1, SNU16, SNU216 ja SNU638 olivat samanlaisia ​​kuin HFE145. Kuitenkin mRNA-tasolla ja ASH2L olivat merkittävästi korkeampia (kertainen muutos 3) on SNU1 ja SNU16 kuin HFE145-soluissa (kuvio 3A), kuten DPY30 kuviossa 1E. Sen tutkimiseksi, onko WRAD komponentit liittyvät leviämisen mahalaukun syöpäsolujen, me knockdowned kukin WRAD komponentti käyttämällä erityistä siRNA ja seurataan knockdown tehokkuutta reaaliaikaisella PCR (Kuva 3B). Jokainen siRNA (100 nM) vähensi mRNA tasot SNU1 ja SNU16 soluja verrattuna SCR 65% -75%. Knockdovvn WDR5 ja RBBP5 inhiboivat SNU1 ja SNU16 soluja verrattuna SCR 30-48% (kuvio 3C). Kuitenkin ASH2L inhiboivat SNU1 ja SNU16, jossa ilmentymisen taso ASH2L oli korkea verrattuna SCR 85% ja 75%, vastaavasti.

(A) mRNA-tasot WDR5, RBBP5 ja ASH2L in HFE145, SNU1, SNU16, SNU216 ja SNU638 solut määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä, käyttäen alukkeina WDR5, RBBP5 ja ASH2L. GAPDH normalisointiin käytettiin tietoja. (B) Knockdown tehokkuus määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä. Knockdown tehokkuus määritettiin jälkeen transfektoimalla soluja 100 nM WDR5, RBBP5 ja ASH2L siRNA tai salattu (SCR). (C) Effects of WDR5, RBBP5 ja ASH2L knockdown soluproliferaatioon. Solu elinkelpoisuuden määritystä käytettiin solujen proliferaation mittaamiseen, kun läsnä on 1% FBS: ää. 24 tuntia transfektion jälkeen solujen elinkykyisyys määritykset suoritettiin. Arvot ovat keskiarvoja ± SDS kolmen itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena. *,

p

0,01 (Opiskelijan

t

testi, versus HFE145 (A) tai SCR (BC)).

roolit DPY30 maahanmuuttoprosessissa ja invaasion mahalaukun syöpäsolujen

Me seuraavaksi tutkittava, onko DPY30 säätelee muuttoliike mahalaukun syöpäsoluja. Knockdovvn DPY30 pienensi FBS aiheuttama vaellukset SNU1 ja SNU16 soluja versus SCR 35% ja 45%, vastaavasti (kuvio 4). Sen sijaan DPY30 yliekspressio lisäsi FBS aiheuttama vaellukset SNU216 ja SNU638 soluja versus mock solut 2,5 ja 2,2 kertaiseksi (kuvio 4). Nämä tulokset johtivat meidät tutkimaan roolia DPY30 vuonna hyökkäyksen mahalaukun syöpäsoluja. Matrigel invaasiomääritys, DPY30 siRNA esti FBS aiheuttama hyökkäykset SNU1 ja SNU16 soluja versus SCR siRNA 65% ja 84%, tässä järjestyksessä (kuvio 5A ja 5C). Lisäksi DPY30 yliekspressio lisäsi FBS aiheuttama hyökkäykset SNU216 ja SNU638 soluja versus mock solut 3,2 ja 2,9 kertaiseksi (kuvio 5B ja 5C). Nämä tulokset osoittavat, että DPY30 edistää muuttoliikkeen ja invaasion mahalaukun syöpäsoluja.

(A) Boyden kammion määritystä käytettiin mittaamaan muuttoa mahalaukun syöpäsoluja. 10% FBS synnyttämiseen käytettiin muuttoliikettä, ja mitomysiini C (0,01 ug /ml) lisättiin vaikutusten poistamiseksi leviämisen. Kaksi päivää transfektion jälkeen 100 nM ORF-kohdistaminen DPY30 siRNA tai salattu (SCR) siRNA, muuttoliike määritykset (Boyden chamber määritys) suoritettiin. Migration määritykset tehtiin DPY30-over ja mock solujen viljelyn jälkeen yhden päivän. Bar = 100 pm. (B) Siirtyvät solut laskettiin, ja tulokset esitetään pylväskaaviona. Arvot ovat keskiarvoja ± SDS kolmen itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena. *,

p

0,01 (Opiskelijan

t

testi, verrattuna SCR tai Mock).

(A-B) Matrigel invaasiomääritys käytettiin mittaamaan mahalaukun syöpäsoluinvaasiota. Esitetty tulokset edustavat tuloksista. 10% FBS: ää on käytetty indusoimaan hyökkäyksen, ja mitomysiini C: llä (0,01 ug /ml) lisättiin poistamaan vaikutukset proliferaation. Invasion määritykset suoritettiin kahden päivän kuluttua transfektiosta 100 nM ORF-kohdistaminen DPY30 tai SCR siRNA. Viljelyn jälkeen yhden päivän, invaasiomääritys suoritettiin varten DPY30-over ja mock soluja. Bar = 100 pm. (C) Invasiiviset solut laskettiin ja tulokset näytetään pylväskaaviona. Arvot ovat keskiarvoja ± SDS kolmen itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena. *,

p

0,01 (Opiskelijan

t

testi, verrattuna SCR tai Mock).

Keskustelu

roolit DPY30 syöpäbiologiassa on huonosti tunnettu, vaikka sen roolit erilaistumiseen talous- ja sosiaalineuvostot ja hematopoieettisten esisolujen oli raportoitu [10, 12]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, uusia rooleja DPY30 mahasyövän. DPY30 monistetaan (tuloksia ei ole esitetty) ja erittäin ilmaistuna (kuvio 1) joissakin mahasyövän kudoksissa. Lisäksi sen knockdown tai yliekspressio säännelty lisääntymistä, muuttoliike ja invaasion mahalaukun syöpäsoluja. Muutokset ilmaisua, kromosomitranslokaation ja somaattiset mutaatiot koodaavien geenien alayksiköiden SET1 /MLL komplekseja on raportoitu monissa syövissä. Nämä tulokset tukevat kriittiset roolit jäsenten SET1 /MLL kompleksin syövän etenemiseen.

Up-regulation of DPY30 ilmentymisen havaittiin vain SNU1 ja SNU16 mahalaukun syöpäsolujen joukossa kuusi mahalaukun syöpäsolut olemme tutkineet. Kuitenkin sen ylössäätöä havaittiin yli puolet mahasyövän kudosten olemme tutkineet (kuvio 1). On vaikea selittää tätä eroa. On kuitenkin selvää, että määrä mahasyövän kudosten olemme tutkineet ei riitä. Joten, laaja ilmaisu, jossa käytettiin paljon enemmän useissa eri kudoksissa on arvioida kliinisen arvon tulevaisuudessa.

roolit SET1 /MLL H3K4 metyylitransferaasin monimutkainen syöpäbiologiassa on monimutkainen. Regulatory alayksiköt SET1 /MLL komplekseja, kuten WRAD, sisältävät sekä voimakas onkoproteiineja ja tuumorisuppressoreilla. Esimerkiksi MEN1 geeni koodaa Menin, joka on olennainen alayksikön MLL1 ja MLL2, ja se on mutatoitunut potilailla, joilla on useita endokriinisia neoplasia tyypin 1 (MEN1) [18, 19]. Lisäksi Menin säätelee p18 (CDKN2C) ja p27 (CDKN1B) rekrytoimalla MLL1 monimutkaisia ​​[20]. Sen sijaan, WDR5, osa WRAD monimutkainen, on raportoitu toimia onkoproteiini eturauhassyövän, jossa se on yli-ilmentynyt, ja ratkaiseva androgeenin indusoiman kasvainsolujen lisääntymistä [21]. ASH2L, joka on toinen osa WRAD monimutkaisia ​​ja voivat olla vuorovaikutuksessa onkoproteiinia MYC [22], on ratkaisevan tärkeää MYC /Ha-RAS-riippuvainen muutos rotan alkion fibroblasteissa. Lisäksi se yliekspressoituu monenlaisia ​​kasvaimia ja on kriittinen kasvainsolujen proliferaatiota [23]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, roolit DPY30 kuin onkoproteiini mahalaukun syöpä.

Mitä molekyylitason mekanismit roolit DPY30 mahasyövän? Vaikka emme paljasta, useita hypoteeseja voidaan ehdottaa perustuu aiempiin tutkimuksiin. Yksi mahdollinen hypoteeseja on, että DPY30 yli-ilmentyminen johtaa overexpressions onkogeenien kautta lisääntynyt H3K4MT toimintaa. Ehtyminen DPY30 tai ASH2L johtaa vähenemiseen H3K4me3, kun taas WDR5 ja RBBP5 ovat ratkaisevia kaikkia kolmea H3K4 (H3K4me1, H3K4me2, ja H3K4me3) [6, 8, 10, 11]. Lisäksi, yliekspressio DPY30 yksin voi lisätä H3K4MT toimintaa [10]. Koska H3K4me2 /3 on aktiivinen merkki transkriptio [3, 24], lisääntynyt H3K4MT voi suoraan upregulate monia geenejä, kuten onkogeenien tai vaihtoehtoisesti epäsuorasti alas-säädellä tuumorisuppressoreilla. Yksi edellisen raportin Tätä hypoteesia tukevat että ASH2L, kriittinen osa SET1 /MLL monimutkainen, on osoitettu pelata kuin onkoproteiinia [25, 26]. Toinen edellisen raportin on, että DPY30 suoraan aktivoi ilmentymiä ID proteiinien kautta H3K4 metylaatio [13, 27]. ID-proteiinit inhiboivat toimintaa ETS1 ja ETS2 joka voi indusoida yksi kasvainsuppressorigeenin, p16. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että komponentit WRAD (WDR5, RBBP5 ja ASH2L) voi inhiboida mahalaukun syövän soluissa (kuvio 3), mikä viittaa siihen, että DPY30 toimi läpi lisääntynyt H3K4MT toimintaa. Lisää tutkimuksia tarvitaan paljastaa mekanismit roolit DPY30 mahalaukun syöpäsoluja.