Krooninen sairaus

tiivistelmä

makrofaagianalyysi tunkeutuminen on negatiivinen ennustetekijä useimpien syöpien mutta ruoansulatuskanavan kasvaimet näyttävät olevan poikkeus. Vaikutus makrofagien syöpään etenemiseen riippuu niiden fenotyyppi, joka voi vaihdella M1 (proinflammatoristen, puolustava) M2 (tolerogeenistä, pro-kasvainten). Ruoansulatuskanavan syövät usein tullut kohdunulkoinen lähde gastriinien ja makrofagit läsnä reseptorit näitä peptidejä. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena on analysoida, gastriinien voi vaikuttaa rakenteessa makrofagien tunkeutuminen Kolorektaalituumorien. Olemme arvioineet suhdetta gastriini ilmaisun ja rakenteessa makrofagien tunkeutuminen näytteissä peräsuolen syöpä ja vaikutus näiden peptidien fenotyyppiin makrofagien erottaa ihmisen perifeerisen monosyyteistä in vitro. Kokonaismäärä makrofageja (CD68 + -solut), oli samanlainen kasvaimen ja normaali ympäröivää kudosta, mutta määrä M2 makrofageja (CD206 + -solut), oli merkittävästi korkeampi kasvaimen. Kuitenkin monet näistä kasvaimeen liittyvien M2 makrofagien korreloi negatiivisesti kanssa immunoreaktiivisuus gastriini- peptidien tuumorin epiteelisoluissa. Makrofagit erottaa ihmisen perifeerisen monosyyttien läsnä progastriini oli vähäisempää M2-markkereita (CD206, IL10) ja normaaleja määriä M1-markkereita (CD86, IL12). Progastriini indusoi samanlaisia ​​vaikutuksia kypsillä makrofagit hoidettiin IL4 saamiseksi M2-fenotyypin tai LPS plus IFNy tuottaa M1-makrofagit. Makrofagit eriytetty läsnä ollessa progastriini esitetty alennettu ilmentyminen Wnt-ligandien ja vähensi ja lisääntynyt solukuolema viljeltiin yh- peräsuolen syövän epiteelisoluja. Tuloksemme viittaavat siihen, että progastriini estää hankinta M2-fenotyypin ihmisen makrofageissa. Tämä vaikutus kohdistuu kasvaimeen liittyvät makrofagit voivat moduloida syövän etenemistä ja olisi otettava huomioon analysoitaessa terapeuttinen arvo gastriinin immunoneutralisaatio.

Citation: Hernández C, BARRACHINA MD, Cosín-Roger J, Ortiz-Masía D, Álvarez ç, Terrádez L, et ai. (2014) progastriini tukahduttaa Alternative aktivointi Ihmisen makrofagien ja Moduloi niiden vaikutus Colon Cancer epiteelisolujen. PLoS ONE 9 (6): e98458. doi: 10,1371 /journal.pone.0098458

Editor: Joseph Najbauer, Pécsin yliopisto Medical School, Unkari

vastaanotettu: 04 joulukuu 2013; Hyväksytty: 4. toukokuuta 2014; Julkaistu: 05 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Hernández et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Ministerio de Educación y Ciencia /FEDER [lupanumeroon SAF2007-064201], Ministerio de Ciencia e Innovacion [lupanumeroita SAF2010-20231, SAF2010-16030 ja RYC-2011-09571], Ministerio de Sanidad y Consumon [apurahan numero PI11 /00327], CIBERehd [lupanumeroon CB06 /04/0071] ja Valencian [lupanumeroon PROMETEO /2010/060]. Carlos Hernandez myöntää tukea ”Ramon y Cajal” ohjelma Ministerio de Ciencia e Innovación Espanjan (RYC-2011-09571). Jesús Cosín-Roger tukevat FPU apurahoja Ministerio de Educación, Cultura y Deporte. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Makrofageilla ovat merkittävä osa kasvaimien ja näyttää erilaisia ​​toimintoja riippuen paikalliseen ympäristöön. Ne voivat olla pro-inflammatorisia ja auttaa tuottamaan mukautuvan immuunivasteen (klassisesti aktivoitu makrofagit, M1) tai tolerogeenistä /anti-inflammatorinen (vaihtoehtoisesti aktivoida makrofageja, M2) [1], [2]. Kasvaimeen liittyvien-makrofagit (TAM) muistuttavat usein M2-makrofagit, ja näin ollen sen sijaan, että torjutaan syöpäsolujen, nämä leukosyytit edistää kasvaimen kasvua vaimentaa immuunivastetta ja läpi erityksen kasvua ja angiogeenisten tekijöiden sekä tarvittavia entsyymejä solun invaasio. Näin ollen, kun läsnä on TAM on korreloitu vähentynyt selviytymisen potilailla, joilla on esim. melanooma, rinta-, munuais- tai virtsarakon syöpä. Tilanne näyttää olevan erilainen joissakin syöpä vaikuttavat prosessit ruoansulatuskanavassa. Potilailla, joilla on peräsuolen tai syöpien korkeampaan makrofagien tunkeutuminen korreloi paremmin ennusteeseen [3]. Syynä tähän ero roolin makrofagien näissä tiettyjen sairauksien ole mitenkään selvää, mutta nykyisestä tieto voidaan päätellä, että peräsuolen /mahakasvaimen mikroympäristölle merkitsee eri tasapainon funktiona soluttautuneet M1 ja M2 makrofagit, jossa M2 makrofagien kohdistamaan viallisen oppositio oheisiin M1-fagosyyttien [4], [5]. Kuitenkin mekanismit vastuussa tästä vaikutus ei tunneta.

Useimmat adenomatoottisen polyypit, peräsuolen ja mahalaukun kasvaimet ilmentävät ektooppisesti gastriini geeni. Nämä syöpäsolut eivät ole hormonitoimintaa luonteeltaan ja pääasiallisesti tiivistetään hormoni esiaste progastriini [6] – [8], joka on proliferatiivinen toimia syöpäsoluja [9]. Vaikka progastriini voivat sitoa alhainen affiniteetilla gastriinisoluista CCK-2-reseptoreihin ja tämä vuorovaikutus voi myötävaikuttaa jossain määrin sen biologista aktiivisuutta [10], progastriini n kasvua lisäävän vaikutuksen näyttää pääosin välittää kuin perinteisen reseptori äskettäin tunnistettu anneksiini II [9]. Olemme havainneet, että gastriini kykenee pro-inflammatorisen aktiivisuuden kautta CCK-2-reseptoreihin [11] – [13], jotka on ilmaistu makrofagien ja endoteelisolujen, kun anneksiini II ilmentyy voimakkaasti makrofagien pinnalla, jossa se toimii taudinaiheuttaja tunnistuselementtinä ja välittää makrofagiaktivaatio [14].

hypoteesi oli, että gastriini- peptidit paikallisesti tuotettua koolonikasvainten voivat vaikuttaa toimintaan soluttautuneet makrofagien ja tällä tavoin, moduloivat immuunivastetta taudin. Havaitsimme, että ilmaus mahalaukun peptidien kolorektaalisyöpäkasvainsoluja korreloi pienemmän soluttautuminen M2-makrofagien ja osoitti, että progastriini moduloi kypsymiseen ihmisen makrofagien in vitro, ja tukahduttaa hankinta M2-fenotyyppi. Progastriini vähensi myös eritystä Wnt-ligandien M2-makrofagien ja lisääntynyt kyky indusoida apoptoosia paksusuolen syövän epiteelisolujen.

Methods

Potilaat

Kaksikymmentäyksi parantavasti resekoitu kolorektaalisyöpää potilaat (taulukko 1) valittiin satunnaisesti potilaista toimi Hospital de Manises. Mikään niistä ollut ennen leikkausta radio /kemoterapiaa. Välittömästi sen jälkeen resektio, pala, joka sisältää kasvain ja ympäröivä normaali kudos fiksoitiin formaliiniin ja upotettiin parafiiniin. Kokeneet patologit dokumentoitu histopatologisen ominaisuuksia kasvaimia, mukaan lukien kasvain vaiheessa erilaistumisen laatu, koko, imusolmukkeiden /angioinvasion, hermoa invaasio ja imusolmuke osallistuminen. Kasvaimen vaiheessa määriteltiin mukaan TNM lavastus järjestelmää. Tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board of Hospital Manisesin (Valencia). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta.

Inmunohistochemistry

Serial osat (4 pm) sisältävien näytteiden kasvain ja normaali limakalvo kunkin potilaan värjättiin gastriini, Wnt1, CD68 kuten makrofagimarkkeri CD86 kuin M1-makrofagimarkkeri tai CD206 kuin M2-makrofagimarkkeri. Näytteet altistettiin eri menetelmiä antigeenin haku riippuen epitoopin (taulukko 2). Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus tukahdutettiin upottamalla 0,3% vetyperoksidia. Kun käyttäjä on estetty 5% hevosen seerumia, leikkeitä inkuboitiin yli yön (4 ° C), jossa vastaavan primaarisen vasta-aineen (taulukko 2). Hevonen anti-hiiri /kani biotinyloitua vasta-ainetta (Vector Laboratories, CA, USA, 1:200) käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. Vectastain Elite ABC-järjestelmän Kit (Vector Laboratories, CA, USA), jonka jälkeen DAB-Enhanced Liquid alustan System for immunohistokemia (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) käytettiin kehittämiseen. Kaikki kudokset vastavärjättiin hematoksyliinillä ja spesifisyyden immunovärjäyksellä vahvistettiin, jos analoginen kudosleikkeiden osoitti värjäytymisen puuttuminen, kun käytetään ei-immuuni immunoglobuliinin saman isotyypin ja samassa pitoisuudessa kuin ensisijainen vasta-aine tai sen jälkeen, jättämällä pois sekundaarisen vasta-aineen.

edustaja alue (tavoite 40X, 6 aloilla, 0,22 mm

2) kasvainkudoksen tai viereiseen normaaliin rauhaskudoksen valittiin kvantitatiivinen analyysi makrofagien tunkeutumista. Gastriini värjäystä kussakin näytteessä arvioitiin ja pisteet intensiteettiä 1-4 annettiin. Vain syövän epiteelisolujen reagoi gastriini-vasta-aineen ja Värjäytymisen intensiteetti oli hyvin homogeeninen läpi koko epiteelituumori osastoon. Kaikki näytteet käsitellä rinnakkain ja tarkkailija, tietämätön potilasnumero ja erilainen henkilö käsiteltiin ja analysoitiin makrofagi immunovärjäyksin, osoitetaan pisteet kullekin potilaalle, joka perustuu värjäytymisen intensiteetti havaittiin kolme kuvaa edustavat eri puolilla kasvain.

Soluviljely

Ihmisen perifeerisen veren mononukleaarisia soluja eristettiin terveiltä luovuttajilta Ficoll tiheysgradienttisentrifugoinnilla. Monosyytit ympättiin kudosviljelylevyille ja kypsytetään makrofagien viljelemällä X-Vivo 15-alustassa (BioWhittaker), jota oli täydennetty 1% ihmisen seerumia ja 20 ng /nl rekombinanttia ihmisen M-CSF: ää (Peprotech) 37 ° C: ssa, 5% CO

2 enintään 6 päivää. Jotta saadaan M1 polarisaatio, soluja inkuboitiin 1 ug /ml LPS: ää (Escherichia coli 0111: B4, Sigma-Aldrich) sekä 20 ng /ml ihmisen rekombinantti-IFNy (Peprotech) viimeisen 24 tunnin aikana. M2 polarisaatio saatiin käsittelemällä soluja 20 ng /ml ihmisen rekombinantti-IL4: ää (Peprotech) viimeisen 48 tunnin viljelyn aikana. Kypsytyksen sekä aktivoinnin käsittelyt suoritettiin läsnä ollessa tai ilman eri pitoisuuksia progastriini (10

-11-10

-7M, Abgent).

Caco-2-soluja (American Type Culture Collection, VA, USA) viljeltiin MEM-väliaineessa (Sigma-Aldrich), jota oli täydennetty 20% inaktivoidulla naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 2 mM L-glutamiinia, 100 mM natrium- pyruvaattia ja 1% ei-välttämättömiä aminohappoja.

Caco-2-soluja viljeltiin yhdessä monosyyteistä peräisin makrofagien käyttämällä Transwell-insertit (Corning Incorporated, MA, USA), jossa on 0,4 um: huokoisen membraanin [12] . Monosyytit ympättiin seuraavilla insertit ja eriytetään makrofagien läsnä ollessa tai ilman eri pitoisuuksilla progastriinia. 6. päivänä ymppäyksen jälkeen insertit päälle Caco-2-soluja (t = 0) ja pidettiin yhdessä viljelemisen 24 tuntia.

läsnäolo pintamolekyylien CD86 (M1) ja CD206 (M2) viljellyissä makrofageissa analysoitiin fluoresenssimikroskopialla (mikroskoopilla IX81, Olympus, Hampuri, Saksa). Makrofageja inkuboitiin Hoescht tunnistaa ytimet ja fluoresoivasti leimattuja vasta-aineita näihin tavoitteisiin (taulukko 2). Fluoresenssi analysoitiin staattisen cytometry ohjelmisto ScanR ( 5000 solua /kuoppa) kantavassa pitoisuus sytokiinien IL12 (Th1) ja IL10: n (Th2, anti-inflammatorisia) solusupernatanteissa määritettiin ELISA: lla (Diaclone).

määrä Caco-2-soluissa, sen jälkeen co-viljelmää laskettiin Newbauer kammiossa. Apoptoosin näissä soluissa tutkittiin virtaussytometrialla bivariate anneksiini V /PI-analyysi (apoptoosin Detection Kit, Abcam).

Kokonais-RNA makrofagien tai Caco-2-solujen eristettiin käyttäen reagenssipakkausta (Illustra RNAspin Mini GE HealthCare Life Science) ja cDNA saatiin Prime Script RT reagenssipakkauksen (Takara Biotechnology). Reaaliaikainen PCR suoritettiin Prime Script Reagent Kit Perfect Real Time (Takara Biotechnology) kanssa Thermo cycler LightCycler (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa). Erityiset oligonukleotidit suunniteltiin mukaan sekvenssit esitetään taulukossa 3. Suhteellinen geenin ilmentyminen ilmaistaan ​​kuten aiemmin on kuvattu [15].

Tilastollinen analyysi

Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. ja verrattiin analysoimalla varianssi (meno-ANOVA) Newman-Keuls post-hoc-korjaus monivertailuja tai t-testillä, kun tarkoituksenmukaista. P-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Kliiniset korrelaatiot ihmisten analysoitiin käyttämällä Pearsonin korrelaatiokerroin.

Tulokset

M2 makrofagien määrä on lisääntynyt kasvaimen alueella

Ensin analysoidaan määrän ja fenotyypin makrofagit ei-kasvain ja kasvaimeen alueilla kolorektaalisyövän potilaalla. Immunohistokemiaallisesti CD68 (makrofagimarkkeri), CD86 (M1 makrofagimarkkeri) ja CD206 (M2 makrofagimarkkeri) suoritettiin otetuissa kolorektaalikarsinooma poisleikatuista. Huomattavaa on, että makrofagien määrä oli samanlainen kasvaimen ja normaalissa ympäröivää kudosta, mutta määrä M1 ja M2 makrofagit oli merkitsevästi erilainen kahden alueen välillä (kuva 1). Kasvaimen strooman sisälsi pienempi määrä CD86: n (+) soluja kuin lamina propriassa normaalia kudosta. Sitä vastoin suurempi määrä CD206 (+) solujen kohdattiin kasvainkudokseen verrattuna normaaliin ympäröivään kudokseen, mikä viittaa siihen, että kasvaimen kehitys suosii erilaistumisen monosyyttien M2 makrofageissa.

immunoreaktiivisuus ja CD68 (MF markkeri, A-B), CD86 (M1-MF merkki, C-D) ja CD206 (M2-MF merkki, E-F) analysoitiin kolorektaalisyövässä (B, D, F) ja terve ympäröivä limakalvo (A, C, E ). (G) kvantitatiivinen analyysi positiivisten solujen näiden molekyylien edustaja alueella 0,22 mm

2 (Mittakaava = 0,2 mm). Pylväät edustavat keskiarvoa ± SEM (n = 21). ** P 0,01 ja *** P 0,001 vs. vastaava arvo normaalissa limakalvolla.

Gastriini ilmentyminen lisääntyy kasvaimen mutta negatiivisesti korreloi määrä M2 makrofagien

etsivät välittäjäaineita, jotka voivat moduloida fenotyypin makrofagien kasvaimeen tutkittiin rooli gastriini- peptidien ilmentymisen eri makrofagimarkkereiden otettujen koepalojen. Koska gastriini-vasta tässä tutkimuksessa käytetyt tunnistaa sekä gastriini ja gastriini esiasteita, kuten progastriini, emme voi syrjiä eri gastriini peptidien, mutta havaitsimme laaja immuunivaste kasvain epiteelisoluissa koepaloja analysoitu. Värjäys kussakin näytteessä arvioitiin ja pisteet intensiteettiä 1-4 määrättiin (kuvio 2A). Ei havaittu korreloivan gastriinitasoja kasvaimissa ja kokonaismäärän (CD68 + solut) tai M1 (CD86 + solut) makrofagien joko kasvain tai normaalissa kudoksessa (kuviot 2B ja 2C). Yllättäen määrä M2 makrofagien kasvaimen ja normaalin kudoksen korreloivat negatiivisesti gastriini ilme. Tämä korrelaatio oli merkittävä kasvaimen, jossa peptidi on syntetisoitu. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että gastriinin peptidit syntetisoida kasvainsolujen määrä vähenee M2 makrofagien, ilman että se vaikuttaa koko makrofagien määrä.

kokonaismäärän makrofageja (CD68 + -solut, B), M1-makrofagit (CD86 + solut, C), ja M2-makrofagien (CD206 soluja, D), kasvain ja normaali ympäröivää kudosta analysoitiin suhteessa gastriinisoluista ilmentymistä kasvainkudoksen (A, pisteet 1-4, asteikko bar = 0,2 mm). Negatiivinen ja merkittävä korrelaatio on havaittu intensiteetti gastriini värjäyksen ja lukumäärä M2-makrofagien normaalissa limakalvon ja kasvainkudoksen (D).

progastriini vähentää erilaistumista makrofagien kohti M2 fenotyyppiä

Oletimme, että progastriini voisi olla vastuussa vaikutuksia havaittu makrofagi fenotyyppiin, koska koolonkarsinoomasoluissa puuttuu tarvittavia entsyymejä täydellinen gastriinin kypsymisen [7]. Tutkia progastriini voivat moduloida erilaistumista makrofagien on M1- tai M2-fenotyyppiä käsittelimme ihmisen perifeerisen monosyytit saatu terveiltä vapaaehtoisilta useita pitoisuuksia progastriini ja jätti heidät erottamaan. Staattinen cytometry kokeet suoritettiin spesifisillä fluoresoivilla vasta-aineilla osoitti, että progastriini vähensi ekspression M2-markkerin CD206 monosyyteistä johdettujen makrofagien jopa pienin pitoisuus analysoitiin. Sen sijaan mitään muutoksia ekspression M1-markkerin CD86 havaittiin. Lisäksi olemme mitattu konsentraatio IL-12 ja IL-10 supernatantista monosyyteistä peräisin makrofagien jälkeen 6 päivää erilaistumisen, kun läsnä on kasvavia annoksia progastriinia. Gastriiniprekursoria herättänyt merkittävästi vähentää IL-10 eritystä, mutta ei muuttanut IL-12 tasoa (kuva 3). Meidän tiedot osoittavat, että progastriini estää ilmentymisen M2-merkkiaineiden aikana makrofagien erilaistumista vaikuttamatta ilmentymisen M1-markkereita.

Ihmisen perifeerisen monosyyttejä saatiin makrofagien läsnä ollessa tai poissa ollessa progastriinia ja fenotyypin tuloksena makrofagit arvioitiin analysoimalla seuraavat parametrit: ilmentymisen CD86 (A, C, n = 3); ilmaus CD206 (B, D, n = 3); eritystä IL12 (F, n = 4); ja erittymisen IL10: n (G, n = 4). Pylväät edustavat keskiarvo ± SEM. * P 0,05 ** P 0,01 vs. vastaava arvo ajoneuvojen käsiteltyjä soluja.

Jotta vaikutuksen tutkimiseksi progastriini on IL4 välittämän erilaistuminen makrofagien kohti M2-fenotyyppi inkuboimme täysin eriytetty monosyyteistä peräisin makrofagien IL-4 ja eri annoksilla progastriini kaksi päivää. Basal makrofagit käsiteltiin IL-4 osoitti merkittävää kasvua CD206 ilmaisun, ei-merkittävän kasvun IL-12 eritystä ja vastaavat IL-10: n tuotantoa kuin kontrolleilla. Progastriini vähensi induktion CD206 IL-4 ja lisääntynyt IL-12-eritystä ovat merkittävästi korkeammat kuin kontrollisoluissa, kun eritystä IL-10 pysyi ennallaan. Kuitenkin eriyttäminen makrofagien kohti M1-fenotyyppi ei vaikuttanut progastriini. Käsittely LPS plus IFNy lisäsi ilmentymisen CD86, ja eritystä sekä IL12 ja IL10: n makrofageissa, mutta progastriini ei muokata millä tahansa näistä muuttujista (kuvio 4).

Ihmisen monosyytti-johdetut makrofagit stimuloitiin LPS plus IFNy saamiseksi M1-fenotyypin tai IL4 saada M2-makrofagien läsnä ollessa tai puuttuessa progastriinia, ja tuloksena fenotyypin arvioitiin analysoimalla seuraavat parametrit: ilmentymisen CD86 (A, n = 3); ilmaus CD206 (B, n = 5); eritystä IL10: n (C, D, n = 5); ja erittymisen IL12 (E, F, n = 5). Pylväät edustavat keskiarvo ± SEM. * P 0,05 vs. vastaava arvo ajoneuvojen käsiteltyjä soluja;

+ P 0,05 ja

++ P 0,01 vs. vastaava arvo hallinnassa soluissa.

progastriini alas-Wnt ligandien makrofageissa ja lisää solukuolemaa yhteistyössä viljellyissä Caco2 soluissa

Seuraavaksi analysoinut, modulaatio makrofagien fenotyyppi progastriini voi vaikuttaa ympäröivään syöpäsoluja. Olemme äskettäin raportoitu, että M2-makrofagit syntetisoivat ja erittävät Wnt ligandeja, jotka voivat moduloida viljeltiin yh- epiteelisolujen toimintaa [16] ja esillä olevassa tutkimuksessa havaittu immunoreaktiivisuus Wnt1 soluissa kasvaimen strooman. Laadullinen arviointi ilmaus tästä Wnt ligandia tarkoittaa, että määrä positiivisten solujen pienenee gastriinin tuotanto syöpäsoluissa kasvaessa (kuvio 5A). Syy-yhteyttä molempien tekijöiden huomautetaan meidän in vitro -tutkimukset osoittavat, että makrofagit hittyneenä läsnäollessa progastriini esittää vähensi mRNA ilmentymistä kolmessa eri Wnt ligandeja (Wnt1, Wnt3a, ja Wnt5, kuviot 5B-5D). Toiminnallinen merkitys alas-säätely kolmen Wnt ligandien makrofageissa on osoituksena se, että Caco2 soluja viljeltiin yhdessä progastriini saaneilla makrofagien ilmaistuna vähemmän Lgr5 mRNA kuin Caco2 soluja viljeltiin yhdessä ohjaus makrofagien (kuvio 5E). Nämä tiedot viittaavat siihen, että vaikutukset progastriini makrofagien johdettu Wnt-ligandien moduloida Wnt-signalointireitin ympäröiviin tuumorisoluihin.

immunoreaktiivisuus on Wnt1 stroomassa kolorektaalisyövän suhteessa ilmentymisen gastriinin saman kudostyypin (asteikko bar = 0,2 mm) (A); ja vaikutukset läsnäolo progastriini erilaistumisen aikana ihmisen perifeerisen monosyyttien ja makrofagien on mRNA: n ilmentymisen kolmen eri Wnt-ligandien näissä makrofagit (B-D, n = 5) ja mRNA: n ilmentyminen Lgr5 yhteistyössä viljeltyihin Caco-2-solut (E , n = 7). Pylväät edustavat keskiarvo ± SEM. * P 0,05 ** P 0,01 vs. vastaava arvo ajoneuvojen käsiteltyjä soluja.

Lisäksi co-kulttuuri Caco-2 progastriini käsiteltyjen makrofagien johti merkittävään vähenemiseen kokonaismäärän määrä epiteelisolujen yhdessä korotettua apoptoosin (kuvio 6).

vaikutukset ihmisen monosyyteistä peräisin makrofagit saatiin läsnä tai poissa ollessa progastriini määrän (A) ja apoptoosin ( B) Caco-2-soluja analysoitiin yhdessä viljelemisen järjestelmä (24 h, n = 4). Pylväät edustavat keskiarvo ± SEM. * P 0,05 vs. vastaava arvo ajoneuvojen hoidetuilla makrofagien

+ P 0,05 ja

++ P 0,01 vs soluja inkuboidaan tyhjällä insertti (w /o MF).

keskustelu

Tämä tutkimus osoittaa, että makrofagit soluttautuminen Kolorektaalituumorien on erilainen fenotyyppinen profiili kuin ne, jotka ovat läsnä normaalissa ympäröivään kudokseen syöpä vaurio, jossa on korkeampi osuus tulehdusta M2-makrofagien ja merkittävästi alempi numerot klassisesti aktivoitua M1-makrofagit. Mielenkiintoista, tuloksemme osoittavat, että gastriini ilmentymistä kasvainkudoksen kykenee negatiivinen vaikutus määrä kasvaimen M2-makrofagit.

ilmentyminen gastriinin kasvainsolujen epiteelisolujen negatiivinen korrelaatio määrä kasvaimen M2-makrofagien ja meidän in vitro tulokset viittaavat kausaalista suhdetta molempien tekijöiden. Ihmisen makrofagien on saatu viljelemällä reuna monosyyttien läsnä ollessa progastriini osoittivat alentuneen ilmentymisen CD206. Lisäksi tämä peptidi merkittävästi esti ilmaus CD206 kun kypsät makrofagit stimuloidaan Th2 sytokiini IL4 indusoimaan M2-fenotyyppi. Sen sijaan, progastriini ei vaikuttanut ekspressioon kostimulatorista molekyyliä CD86 joko lepotilassa tai makrofageissa stimuloidaan LPS: llä plus IFNy kehittää M1-fenotyyppi. Progastriini vaikuttaa myös kuvio sytokiinierityksen. Makrofagit hittyneenä läsnä tämän peptidin julkaissut pienempiä määriä anti-inflammatoristen sytokiinien IL10 samalla ylläpitää normaalia vapautumisen Th1 indusoijan IL12. In IL4-stimuloitujen makrofagien vaikutukset sytokiinierityksen olivat erilaisia, mutta samaan suuntaan. Tällöin IL10 julkaisu oli ennallaan, kun taas peptidi helpotti IL12 eritystä. Siten on odotettavissa, että nämä makrofagit, jotka ovat vaikutuksen alaisena progastriini vuonna syöpäkudoksen esittää pyöristetty tulehdusta, immunosuppressiivisia profiilin.

Tämä vaikutus on linjassa aiemmin kuvattu tulehdusta edistäviä toimia gastriinin [11 ] – [13]. Havaitsimme, että gastriini edistää tulehduksen aiheuttama Helicobacter pylori rotilla luultavasti kautta CCK-2-reseptorin aktivaation makrofagit kun stimulaatio tämän reseptorin aktivoi ihmisen endoteelisolujen edistää monosyyttien tarttumista. CCK-2 reseptorit voivat sitoa kaikki gastriinisoluista peptidit, vaikka niiden affiniteetti kypsä gastriini on merkittävästi suurempi kuin osoitettu progastriini. Toimet voidaan jälkimmäinen vaihtoehtoisesti lähettämä äskettäin tunnettu kuin perinteisen reseptori anneksiini-II [9]. Molempien reseptoreita on läsnä makrofageissa, ja molemmat reitit edistää makrofagiaktivaatio [14]. Siten esillä tulokset vahvistavat käsitystä, että gastriini- peptidit taipumus edistää tulehdusta vaikkakin eri mekanismilla voi olla mukana kussakin tapauksessa.

vaikutus makrofagien syövän etenemiseen johtuu niiden vaikutusta immuunivastetta kasvain mutta myös suora paikallinen vaikutus ympäröivään epiteelisyöpäsolujen. Makrofagit voivat olla lähde Wnt-ligandien [17], onkogeeninen reitti aktivoituu useimmissa peräsuolen syöpien ja vaikuttaa merkittävästi syöpäsolun stemness [18], [19]. Eritys näistä tekijöistä on erityisen tärkeää alipopulaatio TAMeja jotka näyttävät on erityinen tehtävä kasvaimen invasiivisuus edistämällä angiogeneesiä ja kasvaimen solujen maahanmuuton Wnt-signaloinnin [20], [21]. Wnt1 havaittiin kasvaimen soluja strooman ja sen läsnäolo oli taipumus vähentyä, kun taso gastriini kasvain kasvoi. Olemme viime aikoina havaittu, että eritystä Wnt-ligandien on nimenomaan lisääntynyt M2 makrofageissa, jotka edistävät Wnt /β-kateniinin signalointireitin ja siitä johtuva lisääntymisaktiivisuus yhteistyössä viljellyissä koolonsyöpäsoluihin [16]. Nykyinen tulokset osoittavat, että makrofagit hittyneenä läsnäollessa progastriini ilmaista pienempiä määriä kolmea eri Wnt ligandeja ja aiheuttaa merkittävän määrän väheneminen yhteistyön viljeltyihin Caco-2-soluihin. Tämä vaikutus tapahtuu samanaikainen lasku ilmentymistä näissä paksusuolen solujen Lgr5, Wnt- kohdegeenin [22], joka tehostaa Wnt /β-kateniinin signalointi [18]. Lisäksi makrofagit hittyneenä läsnäollessa progastriini taipumus lisätä apoptoosin kurssi Caco-2-solut, vaikutus, joka saattaa liittyä myös alentunut Wnt signalointia [23]. Siten fenotyypin aiheuttamien muutosten Progastriini makrofageihin muuttaa niiden vaikutus paksusuolen syövän epiteelisolujen tuloksena on vähentynyt määrä näitä soluja todennäköisesti yhdistelmä vähentynyt proliferaatio ja lisääntynyt apoptoottisen solukuoleman. Lisäksi, tuotannon vähenemisen Wnt-ligandien indusoimaa progastriini voi myös edistää kuvattu fenotyypin aiheuttamien muutosten tämän peptidin koska autokriininen vaikutus Wnt5a makrofageissa vähentää ilmentymistä IL12 vasteena bakteeri-tuotteita on kuvattu [24].

meidän tulokset voimme päätellä, että gastriinien, estämällä hankkimista M2-fenotyyppi paikallisissa makrofageissa, voivat säädellä syövän etenemistä. On selvää, että M2 makrofagit stimuloivat kasvua paksusuolen syövän epiteelisolujen in vitro ja kokeelliset tutkimukset osoittavat, että M2-makrofagien kasvaimen edistää paksusuolen syövän hiirillä [25] – [27]. Ihmisen paksusuolen syövän vaikutusta M2-makrofagien näyttää monimutkaisempi ja vaikuttavat useat tekijät, kuten niiden maantieteellinen jakautuminen [4], suhteellinen määrä M1 makrofagien [5] tai vaiheessa tauti [4]. Vaikka niiden läsnäolo on pidetty negatiivisena ennustetekijä jotkut kirjoittajat [28], toiset taas näkevät M2 makrofagit on vähemmän vaarallista vaikutus ihmisen kolorektaalisyövän kuin muut asetukset ja yhteys siihen ajatukseen, että jotkut paikalliset tekijä nimenomaan läsnä tämänkaltaisessa kasvainten voi olla alaspäin säätäminen niiden kasvain edistävä vaikutus [4], [5], [29]. Pitäen mielessä, että M1 ja M2 makrofagit eivät kloonaamalla erilaista solujen mutta äärimmäiset laaja kirjo väli- fenotyyppien ja että luokittelu solun kuin M2 makrofagi voidaan taivuttaa jonka molekulaarinen merkkiaine valitaan kussakin tapauksessa, me käynnistää ajatus siitä, että nämä makrofagit tunnistettiin M2 näissä tutkimuksissa saattavat olla vähemmän vahingollisia, koska progastriini.

suora proliferatiivista funktio progastriini epiteelisolujen on selvästi osoitettu eristetyissä soluissa ja hiiret ja kokeelliset tutkimukset, joissa siirtogeenisiä eläimiä ehdottaa että yliekspressio gastriinit, kun läsnä on DNA: ta vaurioittavien aineiden parantaa syövän synnyssä. Nämä todisteet on saanut useita farmakologisia strategioita neutraloivat gastriinisoluista peptidien, kanssa hyviä tuloksia hiirimalleja mutta valitettavasti harvat ja toistaiseksi tulokset potilailla [30]. Tulosten perusteella näyttää, että ainakin ihmisillä, progastriini voi olla monipuolinen rooli etenemistä Kolorektaalituumorien, koska sen proliferatiivinen aktiivisuus epiteelisolujen vastustaisi jota mahdollisesti kasvaimia torjuvaa toimintaa kohdistuu makrofageihin. Tämän merkitystä vaikutuksen immuunisolujen maailmanlaajuisen toiminnan progastriini odottaa arvioinnin tulevaa tutkimusta.

Johtopäätökset

Tutkimuksemme osoittaa, että gastriini- peptidit syntetisoida koolonkarsinoomasoluissa on makrofagien niiden tavoitteita ja luultavasti vaikuttaa tulehdussuodoksen kasvaimen, mikä puolestaan ​​vaikuttaa syövän etenemiseen. Esto M2-polarisaatio indusoi progastriini olisi neutralisoimaan proliferatiivinen aktiivisuus ja, vaikka se on vaikea arvioida suuruuden tämän vaikutuksen, tämä havainto on otettava huomioon analysoitaessa terapeuttinen arvo gastriinin immunoneutralisaatio [31].

Kiitokset

Kiitämme Brian Normanly hänen Englanti kielen muokkaus ja Hematologia Service sairaalan Clínico Universitario de Valencia louhinta verinäytteiden.