Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aciculatin, luonnollinen yhdiste uutetaan lääkekasvi

Chrysopogon aciculatus

, osoittaa voimakas anti-syöpä teho. Tämä tutkimus on ensimmäinen, joka osoittaa, että aciculatin indusoi solukuoleman ihmisen syöpäsoluja ja HCT116 hiiri ksenograftit johtuen G1 pidätys ja myöhemmät apoptoosin. Ensisijainen syy solusyklin pysähtymiseen ja solukuolema oli p53 kertymistä seuraa lisääntynyt p21 tasolla defosforylointia Rb-proteiinin, PUMA ilme, ja induktio apoptoottisten signaalien kuten pilkkominen kaspaasi-9, kaspaasi-3, ja PARP. Olemme osoittaneet, että p53-alleeli-null (- /-) (p53-KO) HCT116-solut olivat resistenttejä aciculatin kuin solujen villityypin p53 (+ /+). Sama tulos saavutettiin kaatamalla p53 siRNA p53 villityypin soluissa, mikä osoittaa, että p53: lla on keskeinen rooli aciculatin aiheuttaman apoptoosin. Vaikka DNA-vaurio on yleisin tapahtuma johtaa p53 aktivaation, löydettiin vain heikkoa näyttöä DNA-vaurion jälkeen aciculatin hoidon. Mielenkiintoista, aciculatin aiheuttama downregulation MDM2 tärkeä negatiivinen säätelijä p53, osaltaan p53 kertymistä. Syövän vastaista aktiivisuutta ja merkitys p53 jälkeen aciculatin hoidon myös vahvistettiin HCT116 ksenograftimalleissa. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että aciculatin hoito indusoi solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin eston kautta MDM2 ilmaisun, aiheuttaen siten p53 kertymistä ilman merkittäviä DNA-vaurioita ja genomin myrkyllisyyttä.

Citation: Lai CY, Tsai AC, Chen MC, Chang LH, Sun HL, Chang YL, et al. (2012) Aciculatin indusoi p53-riippuvaista apoptoosia kautta MDM2 väheneminen in Human Cancer Cells

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 7 (8): e42192. doi: 10,1371 /journal.pone.0042192

Editor: Marie-Josée Boucher, University of Sherbrooke, Kanada

vastaanotettu 26. tammikuuta 2012 Hyväksytty: 04 heinäkuu 2012; Julkaistu: 13 elokuu 2012

Copyright: © Lai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Science neuvosto Kiinan tasavallan (NSC 99-2628-B-002-024-MY3 ja NSC 99-2320-B-400-008-MY3) (https://web1.nsc.gov. tw /). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Discovery ja kehittämisen syöpälääkkeet on loputon haaste biokemistien ja farmakologian maailmanlaajuisesti. Luonnolliset tuotteet ovat runsaasti lähteitä uusia ja sytotoksisen rakenteita, jotka saattavat olla lupaava johtoyhdisteinä antineoplastiset lääkkeet.

Aciculatin on luonnollinen yhdiste eristettiin lääkeyrtti,

Chrysopogon aciculatus

, joka käytetään laajalti hoidettaessa turvotusta, nuhakuumeen, kuume ja ripuli. Aciculatin raportoitiin ensimmäisen kerran vuonna 1991 osoittaa DNA-sitoutumisaktiivisuutta ja sytotoksisuuden

in vitro

[1], [2]. Tuore tutkimus osoitti, että aciculatin kiinnostavuus dual estovaikutusta indusoituvan typpioksidin (iNOS) ja COX-2 (COX-2) vuoksi sääntely NF-kappaB ja c-Jun N-terminaalinen kinaasi (JNK) /p38 [ ,,,0],3]. Kuitenkin tarkka mekanismi, jolla aciculatin kykenee sen kasvainta estävä vaikutus jää epäselväksi.

Kasvaimia estävät p53 on keskeinen rooli herättää vastauksena cellular rasituksia kuten hypoksiaa, DNA-vaurioita, ja onkogeeni aktivointi. Normaalitilanteessa p53 hajoaa nopeasti jonka E3-ubikitiinipromoottori ligaasilla hiiren kaksinkertainen minuutti 2 (MDM2); puoliintumisaika p53 on siten lyhyt ja sen proteiini taso on vaikea havaita [4]. Kun solut altistuvat edellä mainittujen korostaa p53 hajoaminen on sammutettu. Kertyneet p53 muodostaa sitten tetrameereja ja sitoutuu spesifisiin DNA-domaineja, mikä kopioinnin säätely geenien. Yleisimmät vaikutukset ovat DNA korjaukseen, solusyklin pysähtymisen, vanhenemista, ja apoptoosin. Alavirran soluvasteita p53 voisi tukahduttaa hallitsematon kasvu, ja tarvittaessa poistaa vaurioituneita soluja [5]. Tätä strategiaa on käytetty nykyisessä syöpähoitojen indusoimaan p53-riippuvaista apoptoosia käyttämällä esimerkiksi DNA-vaurioita aineita. Kuitenkin sivuvaikutuksia tämän hoidon ovat vakavia vuoksi genotoksisuuden. Lisäksi vaikka lähes 50% ihmisen syövistä ovat villityyppisen p53, jotkut säädelty reittejä lohkon p53-toiminto, kuten p14ARF puutos ja MDM2 vahvistus [6]. Siksi aineet, jotka voivat aiheuttaa tai palauttaa villityyppinen p53-toiminto ja korjaa epänormaali reitin pienemmillä sivuvaikutuksia ovat ihanteellisia ehdokkaita uusia syöpälääkkeitä [7], [8].

MDM2 onkoproteiini E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla joka ohjaa p53 taso soluissa. MDM2 on negatiivinen säätelijä välittävä ubikitiinipromoottori hajoaminen p53; MDM2 myös estää transkription aktiivisuutta p53 ja helpottaa sen tumasta [9]. Yliekspressio MDM2 mikä heikentää p53-toiminto on havaittu monissa ihmisen kasvaimissa. Lisäksi MDM2 vuorovaikutuksessa eri tuumorisuppressoriproteiinia proteiineja kuten Rb, p21, p19 /14

ARF, E2F1, p73 ja MTBP [10], [11], [12], [13], [14].

tässä tutkimuksessa pyrittiin tunnistamaan kasvaimen vastaisen mekanismi aciculatin kanssa

in vitro

ja

in vivo

kokeellisesti HCT116 ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja. Tulosten perusteella tärkeydestä p53 ja sen loppupään tavoitteensa aciculatin aiheuttaman solusyklin pysähtymiseen ja kaspaasiriippuvaisen apoptoosin. Vaikutukset aciculatin on MDM2 vähentäminen ja siihen liittyvät p53 kertymiseen kuvataan myös. Samat tulokset vahvistettiin myös käyttäen A549, p53 villityypin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjassa. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että aciculatin on lupaava luonnontuote syöpähoidon.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Aciculatin uutettiin ja puhdistettiin

Chrysopogon aciculatus

professori CC Chen, Department of Biotechnology, Hungkuang University, Taiwan, jonka puhtaus yli 98%. RPMI 1640, naudan sikiön seerumia (FBS), penisilliiniä, streptomysiiniä, ja kaikki muut kudosviljelmässä reagenssit saatiin Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Parannettu kemiluminesenssidetektiolla pakki oli Amershamin. Trizol-reagenssi oli Invitrogen (Carlsbad, CA, USA); satunnainen pohjamaali ja M-MLV RT hankittiin Promega (Madison, WI. USA); pro-Taq oli peräisin Protech (Taipei, Taiwan). HRP polymeerikonjugaattia reagenssi SuperPictureTM oli peräisin ZYMED LABORATORIES INC. (San Francisco, CA, USA); Nuceolin vasta-aine, propidiumjodidi (PI), 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi, sulforodamiini B, ja kaikki muut kemialliset reagenssit saatiin Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA).

Soluviljely

paksu- ja peräsuolisyövän solulinjaa HCT116 ja ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä A549 hankittiin American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA , USA). p53-KO (p53 Knockout) HCT116-solut ystävällisesti Dr. B. Vogelstein (Johns Hopkins). Molemmat viljeltiin RPMI 1640, jossa oli 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (v /v) ja penisilliiniä (100 yksikköä /ml) /streptomysiiniä (100 ug /ml). Soluja pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2/95% ilmaa.

MTT-määritystä

Soluja inkuboitiin ajoneuvon (0,1% DMSO) tai yhdisteet 48 h. Pestiin kerran ja niitä inkuboitiin 0,5 mg /ml 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi 37 ° C: ssa 1 h. Inkuboinnin jälkeen solut lyysattiin DMSO ja absorbanssi saatiin käyttäen ELISA-lukijaa (550 nm). Tulokset laskettiin: solujen elävyys (%) = keskimääräinen O.D. Kaivojen /keskimääräinen O.D. kontrollikuoppia.

FACScan virtaussytometrialla

käsittelyn jälkeen ajoneuvon (0,1% DMSO) tai yhdisteiden osoitetun ajan kurssia, solut kerättiin trypsinoimalla, solusyklin analyysi, soluja kiinnitetään 70% (v /v) alkoholia 4 ° C: ssa yön yli. Sentrifugoinnin jälkeen soluja inkuboitiin 0,1 mol /L fosfaattia-sitruunahappo-puskuria [0,2 mol /l NaHPO

4, 0,1 mol /l sitruunahappoa (pH 7,8)] 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten solut sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen 0,5 ml: lla PI-liuosta, joka sisälsi Triton X-100 (0,1%, v /v), RNaasi (100 ug /ml), ja PI (80 ug /ml). DNA-pitoisuus analysoitiin FACScan ja CellQuest -ohjelmistoa (Becton Dickinson). Anneksiini V-FITC ja PI kaksinkertainen värjäys, FITC anneksiini V Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) suoritettiin. Solut sentrifugoitiin ja inkuboitiin näiden reagenssien välittömästi. Kun oli inkuboitu 15 min, fluoresoivasti leimattuja soluja analysoitiin sitten FACScan ja CellQuest-ohjelmaa.

TUNEL

Solut ympätään 8-kuoppaisille dia kammiot nälässä yön yli ja käsiteltiin vehikkelillä (0,1 % DMSO) tai aciculatin 24 tuntia. Solut ja kasvainkudoksen leikkeet kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja pestiin kahdesti PBS: llä. Apoptoottisten solujen havaittiin

in situ

käyttämällä terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasia siirtää biotiini-deoksiuridiini triphosphatase (TUNEL, Roch Diagnostics, Mannheim, Saksa) vapaan 3′-OH-pilkotun DNA: n. Katkaisukohdat leimattiin Biotiini ja visualisoidaan reaktiolla fluoreseiini konjugoidulla avidiinilla (avidiinilla fluoreseiini-isotiosyanaatti). Mikrovalokuvia saatiin Leica TCS SP2 konfokaali spektrin mikroskoopilla.

Western blot-analyysi

Western blotting varten kokosolulysaattia ja ydin- louhinta tehtiin kuten aiemmin raportoitu [15], [16] kanssa anti- p53, anti-pRb ja anti-kaspaasi-8 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA); anti-α-tubuliinin, anti-aktiini, anti-p21, anti-p27, anti-poly (ADP-riboosi) polymeraasi, anti-fosforyloitu H2AX (Ser139), anti-MDM2, anti-PUMA, HRP-konjugoitua anti-hiiri- ja anti-kani-IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); anti-kaspaasi-3 (IMGENEX, San Diego, CA, USA); anti-kaspaasi-9 ja fosfo-ser15-p53 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA).

RNA ja käänteistranskriptio polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) B

Yhteensä RNA uutettiin Trizol-reagenssilla valmistajan protokollan (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Käänteistranskriptio suoritettiin 5 ug mRNA: ta ja satunnaisesti aluketta 65 ° C: ssa 5 min, minkä jälkeen sekoitetaan Moloney-hiiren leukemiaviruksen käänteistranskriptaasia (RT) reagoida 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan, jolloin saatiin cDNA. Geenin monistuminen seurasi RT-polymeraasiketjureaktiolla (PCR). Aluke sekvenssejä käytettiin monistamiseen oli seuraava: GAPDH, 5′-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3 ’/5′-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3′; p53, 5’-CAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTAC-3 ’/5′-CTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATC-3′; MDM2, 5’-GGGAGATATGTTGTGAAAGAAGC3 ’- /5’-CCCTGCCTGATACACAGTAACTT. Standard vahvistus parametrejä käytettiin seuraavia menetelmiä: Jos p53, 94 ° C: ssa 3 min, 35 sykliä, joissa denaturaatio 94 ° C: ssa 30 s, pariutuminen 60 ° C: ssa 45 s, ja pidennys 72 ° C: ssa 1 min vihdoin 72 ° C: ssa 10 minuutin ajan. GAPDH: lle ja MDM2, 95 ° C: ssa 10 min; 35 sykliä (MDM2: 40 sykliä), jossa denaturaatio 95 ° C: ssa 15 s, pariutuminen 60 ° C: ssa 5 s, ja pidennys 72 ° C: ssa 12 s; seurasi lopullinen pidennys 75 ° C: ssa 15 s. PCR-tuotteet analysoitiin 1,5% agaroosigeelillä, kun läsnä on 1 ug /ml etidiumbromidia.

Ohimenevä transfektio

HCT116-soluja siirrostettiin 3,5 cm: n annoksia yli yön, ja sitten transfektoitiin TP53 siRNA tai MDM2 plasmidi käyttämällä Lipofectamine 2000 mukaan valmistajan protokollaa. TP53 siRNA ja Lipofectamine 2000: Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) ja MDM2 plasmidi (nro 16233) on peräisin Addgene (Cambridge, MA, USA). 6 tunnin kuluttua transfektion ja uudelleen seerumi, solut nälässä ja sitten käsiteltiin vehikkelillä (0,1% DMSO) tai aciculatin varten ilmoitettu kertaa. Solulysaatit kerättiin Western blot-analyysi.

immunohistokemia analyysi

formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) kasvainkudoksen viipaleita poistettiin parafiini ksyleenillä ja rehydratoitiin luokiteltujen sarjojen etanolia. Upota kudos viipaleet 3% vetyperoksidia sammuttamiseksi endogeenisen peroksidaasin. Paljastamaan antigeeni, kudosleikkeitä kuumennettiin 95 ° C: ssa Tris-EDTA-puskuria (10 mM Tris-Base, 1 mM EDTA Solution, 0,05% Tween 20, pH 9,0) 30 minuutin ajan. Viipaleet blokattiin 4% rasvatonta maitoa 40 min ja inkuboitiin ilmoitetuilla vasta-aineella 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. HRP polymeerikonjugaatti reagenssia A (SuperPictureTM) levitettiin viipaleiksi ja reagenssi B myöhemmin peroksidaasiin katalysointia joka visualisoi sijainti antigeenin. Mayerin hematoksyliinillä ratkaisu oli counterstaining. Tulokset vangiksi Zeiss Axioskop-2 mikroskoopilla.

Kasvain ksenograftimalleja

Male sekamuotoinen immuunivajavuustila (SCID) hiiriin implantoitiin s.c. HCT116 syöpäsoluja. Kun kasvaimet saavuttivat keskimääräisen tilavuuden 90 mm

3, hiiret jaettiin kahteen ryhmään (

n

= 5), ja aine hoito aloitettiin. Ajoneuvon (Cremophor EL /etanoli, 01:01; 0,2 ml /hiiri) tai aciculatin (30 mg /kg) annettiin intraperitoneaalisesti (i.p.) viisi kertaa viikossa. Pituus (

L

) ja leveys (

W

) kasvain mitattiin joka 3-4 päivä, ja tuumorin tilavuus laskettiin

LW

2/2. Protokollia

in vivo

tutkimuksessa oli hyväksynyt eläinten hoidon ja käytön komitea National Taiwan University.

Tilastollinen

Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SEM merkitty numero erillisiä kokeita. Tilastollisessa analyysissä suoritettiin yksisuuntainen ANOVA, jonka jälkeen

t

testi, ja

p

0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

Aciculatin indusoi G0 /G1 pidätys ja myöhemmät apoptoottisen solukuoleman ihmisen syöpäsoluja

Aciculatin on uusi C-glykosidi flavonoidi johdettu

C. aciculatus

uute (kuvio 1A) kantavassa tiukka hiili-hiili tekee C-glykosidi vakaampi kuin O-glykosidi happamassa ympäristössä tai esiintyminen glykosidaaseille

in vitro

ja

vuonna vivo

. Käytimme sulforodamiini B määritys (SRB) osoittamaan, että aciculatin aiheutti kasvun estäminen, paitsi HCT116 ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinja (GI

50 = 2,81 gM), mutta myös muissa syöpäsolulinjoissa (taulukko S1). Sytotoksisuutta aciculatin in HCT116-soluissa määritettiin mitokondrion 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) bromidia vähentäminen määrityksessä IC

50 5,88 uM (kuvio 1 B) . Määrittämiseksi solusyklin jakautumisen, synkronoitu soluja käsiteltiin aciculatin ja analysoitiin FACScan-virtaussytometrillä ja propidiumjodidilla (PI) -värjäyksellä. Tulokset osoittivat, että aciculatin voi aiheuttaa G0 /G1 pidätys varten sekä osa-G1 vaihe solujen ajasta riippuva tavalla. Lisääntynyt G1 osuudet käsittelyn jälkeen ilmoitettuina ajankohtina esitetään käyrä kaavion (kuvio 1 C). Me seuraavaksi tutkittiin apoptoosin induktio aciculatin käyttämällä TUNEL-määritystä. Kuvio 1D esittää, että DNA: n fragmentoituminen lisääntynyt kuluttua 24 h 7,5 uM aciculatin hoitoa. Prosenttiosuudet TUNEL positiivisten solujen tässä määrityksessä laskettiin ja kvantifiointiin tietojen näytettiin. Nämä tiedot osoittavat, että aciculatin voidaan merkittävästi indusoida apoptoosia HCT116-soluissa.

, rakenne aciculatin: 8- (2,6-dideoxy-

β

–

ribo

– heksopyranosyyli) -5-hydroksi-2- (4-hydroksifenyyli) -7-metoksi-4H-1-bentsopyran-4-oni seskvihydraattia. B, HCT116-soluja inkuboitiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla aciculatin (5-10 uM) 48 tuntia. Solujen elinkyky määritettiin sitten MTT-määrityksellä. C, HCT116-soluja ilman ravintoa yön yli ja inkuboitiin sitten vehikkeliä (0,1% DMSO) tai aciculatin (10 uM) ja ilmoitetun ajan. DNA pitoisuus analysoitiin sen jälkeen PI-värjäyksellä käyttäen FACScan virtaussytometrianalyysin määrityksessä. Käyrä kaaviossa näkyy, että aciculatin lisäsi G1 populaatio soluja ajasta riippuva tavalla. Keskiarvo ± SE-arvot 3 erilliselle kokeelle. *

P

0,05 ja ***

P

0,001, verrattuna ei-käsiteltyihin soluihin. D, HCT116-soluja käsiteltiin ajoneuvo (0,1% DMSO) tai aciculatin (7,5 uM) ja sitten kaksinkertainen värjättiin TUNEL ja DAPI. Lisääntynyt vihreä fluoresenssi osoitti, että solut koki apoptoosin jälkeen aciculatin hoidon (TUNEL, oikea paneeli). Tumat värjättiin DAPI (vasen paneeli). Pylväskaaviosta näkyy osuudet TUNEL positiivisten solujen kussakin käsitellyssä normalisoitu DAPI. ***

P

0,001.

Aciculatin indusoi solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin avulla säätely ylöspäin p21

WAF1 /CIP1 ja induktio kaspaasiaktiivisuus

vieressä tutkittiin, mikä vaikutus aciculatin on G0 /G1 pidätys solusykliä sääteleviä proteiineja. Sykliiniriippuvaisen estäjät p21 ja p27 ovat ratkaisevia säätelijöitä G0 /G1 pidätykseen. Kuten kuviossa 2A on esitetty, p21 oli merkittävästi voimistunut ja retinoblastoomaproteiinia (Rb) defosforyloitiin ilman näkyvää muutosta p27 jälkeen 4 h aciculatin hoitoon. Sekä luontainen (kaspaasi-9) ja ulkoisen (kaspaasi 8) apoptoottisia reittejä havaittiin 8 h hoidon, ja loppupään apoptoottisten efektori kaspaasi-3 myös aktivoitu (kuvio 2B). Pitoisuudesta riippuvainen apoptoosin lisääntyminen tunnistettiin myös 24 tunnin kuluttua aciculatin hoidon (kuvio 2C). Nämä tulokset osoittavat, että aciculatin hoito voi laukaista HCT116 solusyklin pysähtyminen G0 /G1 vaiheeseen ja tämän jälkeen indusoida apoptoosia.

A, HCT116-soluja käsiteltiin aciculatin (10 uM) ja osoitetut ajanjaksot ja sitten korjattu havaitsemiseen G0 /G1 pidätys liittyviä proteiineja (p21, pRb, ja p27) immunoblottauksella. B, HCT116-soluja käsiteltiin aciculatin (10 uM) ja osoitetut ajanjaksot ja sitten talteen havaitsemiseksi kaspaasin aktivaation ja PARP pilkkominen. C, HCT116-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla aciculatin (5, 7,5 ja 10 uM) 24 tunnin ajan. Jälkeen aciculatin hoito, apoptoottiset proteiinit havaittiin kussakin käsittelyssä pitoisuuksia. Tähti merkitsee epäspesifinen bändi.

Aciculatin lisäsi ilmentymistä p53-proteiinin ja sen loppupään efektorien kautta proteasomin välittämän hajoamisreitit

ilmiöt etukäteistä paljastivat ovat uskotaan liittyvän tuumorisuppressoriproteiinia p53. Näin ollen p53: n tutkittiin useita ajankohtina. Kuten kuviossa 3A on esitetty, aciculatin merkittävästi indusoi p53 ilmentymistä ajan riippuvalla tavalla. P53 jatkojalostustuotteen MDM2, joka on myös tärkeä säätelijä ubikitiinipromoottori-välitteisen p53 hajoamista, havaittiin voimistuvan jälkeen kertymistä p53. Kiinnostavaa oli laskua MDM2 aikana muutaman ensimmäisen tunnin aciculatin hoidon. Sitten vahvisti korrelaatio aciculatin ja DNA-vaurioita. Meidän tiedot osoittavat, että aciculatin vain hieman lisääntynyt fosfo-ser15-p53, joka on alavirtaan vaikutus DNA-vaurioita. DNA double-lohkon murtuma markkeri fosforyloitua histoni 2AX (γ-H2AX) ilmestyi vasta myöhemmissä vaiheissa aciculatin hoitoa. Lisäksi tarkistaa DNA yhden ja kahden hengen katkeamisen, yksisoluiset geelielektroforeesilla määritys (COMET määritys) suoritettiin. Tulokset osoittivat, että niillä ei ole selkeää DNA-vaurioita 6 h hoito 10pM aciculatin romaani DNA-vaurioita agentti QS-ZYX-1-61 (julkaisija ryhmämme aiemmin) positiivinen kontrolli [17]. (Kuva S1). Nämä tulokset osoittavat, että DNA-vaurio ei ole selvää, varhainen vaikutus aciculatin hoidon. Olemme kuin todentaa tämän p53-riippuvainen vaikutus toisessa p53 villityypin syöpäsoluja A549. Aciculatin aiheuttanut myös p53 kertymistä, varhaisen MDM2 loppuminen (3 h) ja sen jälkeen apoptoosireittiä lukien pilkottiin kaspaasi-9 ja halkaistut PARP A549. Tutkia proteiinin taso transkriptiotekijän p53 kertyneitä tumassa jonka aciculatin, ydin- fraktiot uutettiin ja analysoitiin. Kuvio 3B esittää, että p53 on kasvanut ydin on aika-riippuvaisella tavalla, kun aciculatin hoidon. Määrittää mekanismi aciculatin indusoiman p53 kertymistä, ensin määritetään mRNA: n taso p53. Kuvio 3C esittää, ettei näkyvä muutos p53 mRNA tasolla. Normaalitilanteessa p53-proteiini on hyvin lyhyt puoliintumisaika (noin 15-30 min) pikaisen proteasomin hajoamista. Niinpä määritettiin onko aciculatin kasvaa puoliintumisaika p53. Kun sykloheksimidi käytettiin estämään proteiinien biosynteesiä, me havaitsimme, että aciculatin aiheuttama p53 vakiintunut ja oli pidempi puoliintumisaika (kuvio 3D). Lisäksi otimme käyttöön proteasomin estäjä MG132 estää hajoamisen kautta. Kuvio 3E osoittaa, että proteiinin taso p53 ei lisääntynyt aciculatin hoidon jälkeen MG132 esikäsittelyn HCT116 ja A549-soluja. Nämä tulokset osoittivat, että proteasomin-välitteinen hajoaminen reitti on tärkeä aciculatin aiheuttama p53 kertymistä.

A, HCT116 ja A549-soluja käsiteltiin aciculatin (10 uM) ja osoitetut ajanjaksot ja sitten talteen havaitsemiseen p53 -aiheiset proteiineja. Tasot p53, fosfo-ser15-p53, γ-H2AX, ja p53 on alavirrassa oleva kohde MDM2 Sitten määritettiin HCT116-soluissa. Tasot p53, MDM2, γ-H2AX, halkaistut kaspaasi-9 ja PARP määritettiin A549-soluja. Tähti merkitsee epäspesifinen band. B, Nuclear louhinta HCT116-solujen tehtiin jälkeen aciculatin kohtelun ilmoitettuina ajankohtina. Aciculatin aiheuttama tumakertymään p53: n osoitettiin olevan ajasta riippuva. C, HCT116-soluja käsiteltiin aciculatin (10 uM) eri ajankohtina ja sen jälkeen uuttamalla kokonais-RNA. P53 mRNA yhteistyössä monistettiin GAPDH. D, HCT116-soluja esikäsiteltiin aciculatin (10 uM) 3 tuntia, mitä seuraa käsittely sykloheksimidillä (20 ug /ml) kanssa tai ilman aciculatin (10 uM) ja osoitettujen aikoja. E, HCT116 ja A549 solut ko-käsiteltiin 10 uM MG132 ja 10 uM aciculatin 6 tuntia ja sitten korjattu p53 havaitsemiseen immunoblottauksella.

Aciculatin pienenee MDM2 on transkription tasolla, joka on kriittinen p53 kertyminen

meidän edellisessä tutkimuksessa mitään selvää DNA-vaurioita signaalit on havaittu. Tämä saattaa merkitä sitä, että tämä reitti ei ole ainoa mekanismi edistää p53 kertymistä. MDM2 välittää p53 ubikitinaatiosta mikä proteasomaalisten hajoamista p53. MDM2 myös valvoo omaa hajoamista automaattinen ubiquitylation [18]. Tässä tutkimuksessa, MDM2 ehtyminen havaittiin alkuvaiheessa aciculatin hoidon (kuvio 3A). Niinpä seuraava arvioitiin mekanismi MDM2 ablaation, onko tämä vähennys oli mukana aciculatin aiheuttaman p53 kertymistä. Sen jälkeen yhteistyössä hoidon aciculatin ja MG132, proteasomin estäjälle MDM2-proteiinin taso edelleen vähentynyt merkittävästi vuonna HCT116 ja A549-soluja (kuvio 4A). Nämä tulokset osoittavat, että muut proteasomin riippumattomat säätelyreittejä ovat aktiivisia. Sitten tutki mRNA-tasolla ja totesi, että MDM2 mRNA alkoivat laskea kuluttua 1 h aciculatin hoitoa. Sama tulos voidaan saavuttaa p53-KO HCT116, viittaa siihen, että aciculatin indusoi MDM2 väheneminen ei ole p53-liittyvä vaikutus (kuvio 4B). Tunnistaa tärkeyden MDM2 p53 kertymistä, tutkimme aciculatin aiheuttamaa p53 kertymistä jälkeen yli-ilmentävien MDM2 in HCT116-soluissa. Sen jälkeen aciculatin hoito, yli-ilmentyminen MDM2 päinvastaiseksi p53 tasolla (kuvio 4C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että aciculatin voi aiheuttaa kertymistä p53 kautta MDM2-mRNA: n vähenemistä.

A, HCT116 ja A549-soluja yhdessä käsiteltiin 10 uM MG132 ja 10 uM aciculatin 6 h (HCT116) ja 3 h (A549) sitten talteen havaitsemiseksi MDM2 immunoblottauksella. B, HCT116 ja p53-KO HCT116-soluja käsiteltiin aciculatin (10 uM) eri ajankohtina ja sen jälkeen uuttamalla kokonais-RNA. MDM2 mRNA yhteistyössä monistettiin GAPDH. C, The MDM2 plasmidi vietiin HCT116-solujen indusoimiseksi yli-ilmentymisen MDM2-proteiinin; sitten solut käsiteltiin aciculatin 3 tuntia. Proteiini tasot p53 ja MDM2 havaittiin Western blottauksella.

rooli p53 aciculatin välittämä solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin

Seuraavaksi pyrimme tunnistamaan rooli p53 aciculatin aiheuttama HCT116 solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin. Ensinnäkin, vertasimme sytotoksisuus aciculatin on HCT116 p53-WT (villin tyypin) ja p53-KO (Knockout) järjestelmä. Kuten on esitetty kuviossa 5A, löysimme merkittävää eroa IC

50 välillä 2 solulinjoissa; WT-solut (IC

50-arvo, 5,88 uM) olivat herkempiä aciculatin kuin p53-KO soluissa (IC

50-arvo, 9,13 uM). Lisäksi osuus aciculatin aiheuttaman G0 /G1 pysähtymisen WT-soluissa oli noin 3 kertaa suurempi kuin, että p53-KO soluissa, sen jälkeen 18 h aciculatin hoitoa (kuvio 5B). Sitten käytettiin western blotting tutkia p53 ja apoptoottisten proteiinien p53-WT ja p53-KO HCT116-solujen aikana aciculatin hoidon. Kuvio 5C esittää, että p53-KO solut ilmensivät pienempi kaspaasi-3 ja halkaistut poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP). Induktio osa-G1 tutkittiin myös sen jälkeen, kun aciculatin hoidon ja tulokset osoittavat, että p53-KO solut olivat vastustuskykyisempiä aciculatin aiheuttama sub-G1 lisäys (alempi pylväsdiagrammi). P53 suoraan transkription tavoitteita, p21 ja PUMA (p53 voimistunut modulaattori apoptoosin) liittyvät kasvun pysähtymiseen ja apoptoosiin. Molemmat olivat voimistunut kuluttua 24 h ja 48 h aciculatin hoidon pitoisuudesta riippuvalla tavalla. (Kuva 5D). Kuvio 5D osoittaa myös Knockdown p53-proteiinin tason siRNA p53 villityypin soluissa HCT116 ja A549; Tämä johti merkitsevän eston p53 ilmaisun jälkeen aciculatin käsittelyn vaikutus, joka kesti jopa 24 tuntia. Tämä p53 ehtyminen johti kumoamisen aciculatin aiheuttaman p21 ja defosforylointia Rb; Lisäksi apoptoottiset proteiinit PUMA, kaspaasi-9, kaspaasi-3 ja PARP. Sen jälkeen solut kaksinkertainen värjättiin anneksiini V-FITC ja PI apoptoosin ja nekroosin, tulokset osoittivat, että p53 knock-down HCT116 ja A549-solut olivat molemmat vastustuskykyisempiä aciculatin aiheuttaman apoptoosin kuin villityypin soluissa (kuvio 5E). Näiden tietojen perusteella ehdotamme, että p53 on keskeinen välittäjäaine aciculatin aiheuttaman apoptoosin.

, p53-KO HCT116-soluja inkuboitiin aciculatin (5-10 uM) 48 tunnin ajan. Solujen elinkyky määritettiin sitten MTT-määrityksellä. Tuloksia verrattiin villityypin HCT116-soluissa. Keskiarvo ± SE 3 erilliselle kokeelle. *

P

0,05 ja **

P

0,01. B, p53-KO HCT116-soluja ilman ravintoa yön yli ja inkuboitiin sitten vehikkeliä (0,1% DMSO) tai aciculatin (10 uM) eri ajanjaksoina. DNA osuus analysoitiin sen jälkeen PI-värjäyksellä. Solu sykliä p53-WT ja p53-KO HCT116-solujen käsittelyn jälkeen 18 h näkyvät. G1 osuus molemmissa solulinjoissa verrattiin. Keskiarvo ± SE-arvot 3 erilliselle kokeelle. *

P

0,05 ja ***

P

0,001. C, p53-WT ja p53-KO HCT116-soluja inkuboitiin aciculatin (10 uM) 24 tunnin ja 48 tunnin ja sitten talteen havaitsemiseksi p53, kaspaasi aktivointi, ja lohkaisu PARP (ylempi). p53-WT ja p53-KO-soluja käsiteltiin vehikkelillä (0,1% DMSO) tai aciculatin (10 uM) 24 tunnin ajan ja analysoitiin sen jälkeen PI-värjäyksellä. Induktio osa-G1 vaiheessa kunkin ryhmän määritettiin (alempi pylväsdiagrammi). **

P

0,005. D, HCT116-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla aciculatin (5, 7,5 ja 10 uM). Sen jälkeen, kun 24 tunnin ja 48 tunnin aciculatin hoidon tasoja p53, p21, pRb ja PUMA määritettiin sitten (ylempi). p53 siRNA käytettiin kaataa p53 taso HCT116 ja A549-soluja, jotka sitten käsiteltiin aciculatin 24 tuntia. Solut kerättiin havaitsemiseksi p53 ja apoptoottisten liittyvät proteiinit (alempi). E, p53 knock-down HCT116 ja A549-soluja käsiteltiin aciculatin (10 uM) 40 tunnin ja sitten kaksinkertainen värjättiin anneksiini V-FITC ja PI. Prosenttiosuudet fluoresoivasti leimatut solut määritettiin virtaussytometrialla.

Aciculatin inhiboi HCT116 kasvainsolujen kasvua hiiren ksenograftimalleissa

tutkimiseksi

in vivo

anti -cancer aktiivisuus aciculatin perustimme HCT116 johdettuja ksenograftimalleja in severe combined immuunivajausta (SCID) hiiriä. Sekä vertailu- että hiiret tapettiin, ja HCT116-ksenosiirrettyjä kasvaimen kudokset tutkittiin. Kuten on esitetty kuviossa 6A, tuloksemme osoittivat, että intraperitoneaalisesti aciculatin (30 mg /kg) kerran päivässä esti merkitsevästi tuumorin kasvua päivästä 8, ilman painon menetys; Tämä viittaa siihen, että ei ollut selvää sytotoksisuutta

in vivo

. Olemme myös värjätään HCT116-ksenosiirrettyjä kasvainkudoksissa hematoksyliinillä ja eosiinilla (kuvio 6B-a, b), p53-vasta-ainetta (kuvio 6B-c, d) ja Ki-67 (kuvio 6B-e, f). Tulokset paljastivat, että hoito aciculatin lisäsi merkittävästi p53 ilmaisun ja soluproliferaation merkki Ki67. Nämä havainto korreloi

in vitro

tutkimuksissa. Kasvainkudoksen viipaleet värjättiin myös TUNEL reagenssin ja tulokset osoittavat, että aciculatin-kasvaimen teki apoptoosiin (kuvio 6C).

HCT116-soluja injektoitiin subkutaanisesti kyljet severe combined immuunivajaisiin hiirillä. Hiiret jaettiin kahteen ryhmään (

n

= 5), ja kun kasvaimet saavuttivat keskimääräisen tilavuuden (90 mm

3) hoito aloitettiin. Hiiret tapettiin päivänä 12 sen jälkeen. A, Käyrät esittävät keskiarvo (± SE) kasvainten koot mitattiin kussakin ryhmässä. Erot kasvaimen koon välillä valvonta- ja käsitellyissä hiirissä olivat tilastollisesti merkitseviä (*

P

0,05). Ruumiinpaino mitattiin päivittäin päivästä 1 hallinnon. Ei ollut mitään merkittäviä eroja hoidon jälkeen mikä tahansa ryhmistä (tuloksia ei ole esitetty). B, käsitellyn ja käsittelemättömän kasvaimen viipaleiksi arvioitiin H 0,01.

Keskustelu

tuumorisuppressoriproteiinia p53 on lupaava kohde syövän hoitoon vuosikymmeniä. Se on keskeinen rooli solukierron säätelyssä ja apoptoosin. Täällä, osoitimme, että aciculatin on vakuuttava p53 indusoija ja aktivoi alavirran efektoreja p53. p21, tunnettu transkription kohteena p53, on tärkeä säätelijä G0 /G1 solusyklin vaihe. Kuten kuviossa 2A ja 5D, p21 ekspressio lisääntyi ja pRb on hypophosphorylated jälkeen aciculatin hoidon.