Krooninen sairaus

tiivistelmä

desmogleiini 3 (DSG3) on osa Desmosomi, joka antaa vahvan solu-soluadheesion. Aiemmin onkogeenisessä toiminta DSG3 on todettu pään kaulan syöpä (HNC). Täällä tutkimme miten tämä molekyyli vaikuttaa pahanlaatuinen fenotyyppi. Koska DSG3 liittyy plakoglobin, tutkimme, onko nämä fenotyyppiset muutokset olivat välittämien plakoglobin molekyyli. Immunosaostus ja immunofluoresenssivärjäyksen paljasti, että DSG3 hiljentäminen häiritsi sen vuorovaikutusta plakoglobin ja indusoitiin plakoglobin translokaatio sytoplasmasta tumaan. Knockdovvn DSG3 huomattavasti vuorovaikutusta plakoglobin kanssa transkriptiotekijä TCF ja tukahdutti TCF /LEF transkriptionaalisen aktiivisuuden. Nämä vaikutukset edelleen siirrettävä vähentää ilmentymistä TCF /LEF alavirran kohdegeenien, kuten c-myc, sykliini D1, ja MMP-7. Toiminnalliset analyysit osoittivat, että DSG3 hiljentäminen vähensi solujen kasvua ja pidätti solujen G0 /G1 vaiheeseen. Sitä paitsi, solujen vaeltamiseen ja invaasiota kyvyt olivat myös vähentynyt. Nämä solu tulokset vahvistettiin käyttämällä kasvaimen hiirissä, kun DSG3 hiljentäminen johti tukahdutetaan kasvaimen kasvua, plakoglobin translokaatio ja vähentää ilmentymistä TCF /LEF kohdegeenien kasvaimissa. Siksi meidän tutkimus osoittaa, että desmosomiproteiinin DSG3 lisäksi toimintoja säädellä pahanlaatuinen fenotyypit kautta ydin- signaloinnin. Lopuksi löysimme että DSG3 toimii onkogeenin ja helpottaa syövän kasvua ja hyökkäyksen HNC soluissa kautta DSG3-plakoglobin-TCF /LEF-reitin.

Citation: Chen YJ, Lee LY, Chao YK, Chang JT Lu YC, Li HF, et ai. (2013) DSG3 Helpottaa syöpäsolujen kasvua ja Invasion kautta DSG3-Plakoglobin-TCF /LEF-Myc /sykliini D1 /MMP signalointireitin. PLoS ONE 8 (5): e64088. doi: 10,1371 /journal.pone.0064088

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 7. joulukuuta 2012 Hyväksytty: 10 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 30, 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Chang Gung Memorial Hospital (lupanumeroita CMRPD1A0641 ja CMRPD190391-2) ja Department of Health of Taiwan (lupanumeroon DOH99-TD-C-111-006). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

desmogleiini 3 (DSG3) on yksi komponenteista Desmosomi. Desmosomit ovat nappimaisen olevia solujen välistä yhteyttä, jotka mahdollistavat kiinnittymisen solun tukirangan elementit plasmamembraanin paikoissa solu-solu. By ankkurointi stressistä kantavia väli säikeitä, desmosomeja antaa vahvan välistä adheesiota ylläpitää kudosten eheys ja homeostaasin [1] – [3]. Desmosomeja koostuvat proteiineista vähintään kolme erillistä geeniperheiden: kadheriinien (esim DSG1-4 ja DSC1-3), armadillo proteiineja (esim plakoglobin ja erilaiset plakophilins), ja plakins (esim desmoplakins, envoplakin, ja periplakin). Nämä desmosomiproteiinien ovat yhteensopivia ja liittyvät toisiinsa muodostaen Desmosomi. Tuloksena supracellular rakennustelineet avainasemassa tarjoamisessa mekaaninen eheys kudoksiin [1] – [3]. Lisäksi niiden rooli solujen-soluadheesiota, kadheriinin ja Armadillo proteiinit voivat toimia molekyyli anturit muuntaa solunulkoiseen tapahtuman solunsisäisiä signaaleja [4]. Esimerkiksi, hännän DSG3 on osoitettu sidottu plakoglobin [1] – [3]. Plakoglobin liittyy läheisesti p-kateniinin, joka on tunnettu loppupään efektorimolekyylin kanonisessa Wnt-signalointireitin [5]. Näin ollen, on mahdollista, että DSG3 voi transduce molekyyli- viestejä läpi plakoglobin signalointireitin.

Useat raportit ovat havainneet, että desmosomiproteiinien on poikkeuksellisen ilmaistaan ​​erilaisissa syövissä. Vaikka jotkut tutkijat ovat raportoineet, että ilmaisu desmosomiproteiinien on vähentynyt syövät, muut ovat havainneet, että ekspressio on lisääntynyt. Esimerkiksi on raportoitu alassäädetty of DSc2 kolorektaalisyövässä [6], DSC3 rinta- ja suuontelon syöpä [7], [8], ja DSG2 mahasyövän [9], [10]. Kuitenkin yli-ilmentyminen DSG2 tai DSG3 on myös osoitettu useissa syövissä, mukaan lukien ihon, eturauhasen, keuhkojen ja pään ja kaulan syöpä [11] – [14]. Kaikki nämä tutkimukset osoittavat, että dysregulaatio desmosomiproteiinien on merkitystä aikana syövän synnyn. Johdonmukaisia ​​muiden raporttien, olemme aikaisemmin havainneet, että DSG3 toimii onkogeenin pään ja kaulan alueen syöpä ja liittyy kehittynyt kliinisessä vaiheessa [15]. Tässä tutkimuksessa olemme edelleen tutkitaan, miten tämä molekyyli vaikuttaa syövän muodostumisen. Tuloksemme osoittivat, että DSG3 edistää syöpäsolujen kasvua ja invaasiota kautta plakoglobin välittämän signalointireitin. Nämä vaikutukset johtivat muuttaminen TCF /LEF transkriptionaalisen aktiivisuuden ja siten muuttanut ilmauksia loppupään molekyylejä, kuten c-myc, sykliini D1, ja MMP-7, joka voi johtaa pahanlaatuisen fenotyypit.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat, shRNA rakentaminen, ja solujen transfektio

Kaksi pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja, OECM1 ja SAS [16], käytettiin. OECM1 soluja pidettiin RPMI 1640 media, ja SAS-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-media. Kaikki media on täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja antibiootteja (100 U penisilliiniä /ml, 100 U /ml streptomysiiniä, ja 0,25 g /ml amfoterisiini B: tä), ja solulinjoja viljeltiin kostutetussa atmosfäärissä 37 ° C: ssa 5% CO

2.

shRNA sekvenssin kohdistaminen DSG3 (shDSG3), joka on aiemmin kuvattu [15], subkloonattiin pCI-neo-plasmidin ja käytetään muodostamaan shDSG3 stabiilisti transfektoitujen solujen . Plakoglobin kohdennettu shRNA oli suunniteltu 22-nt sense- ja antisense-hiusneula, joka oli komplementaarinen plakoglobin mRNA-sekvenssin 5′-GGA TGC CCA GCG CCA CGT AGC-T-3 ’, ja kloonattiin pTOPO-U6 plasmidivektori, kuten aiemmin on kuvattu [15].

plasmidin transfektion jälkeen solut ympättiin tiheydellä 5 x 10

5 100 mm: n malja ja niitä viljeltiin 16 tunnin ajan. Kun solut saavuttivat 60% konfluenssin, ne transfektoitiin 6 gg shRNA plasmidin tai tyhjän vektorin plasmidiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) Opti-MEM seerumivähennysväliainetta (Invitrogen, Carlsbad, CA). 16 tunnin kuluttua, Opti-MEM elatusaine korvattiin tuoreella täydellä kasvatusliuoksella. Vakaa transfektoidut solujen kloonit valittiin käyttäen neomysiinin reagenssia, G418 antibioottiliuosta (Sigma, St. Louis, MO, USA).

Potilaat ja määrittäminen proteiinin ilmaisuja kliinisissä kudoksissa

Tutkimus oli hyväksymä Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital, ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta osapuolilta. Yhdeksän koepala kudoksia pään ja kaulan syöpäpotilasta vieraili Head-Neck Surgery klinikoiden Chang Gung Memorial Hospital (Taoyuan, Taiwan) saatiin, joista neljä törkeän normaali limakalvo ja viisi syöpänäytteissä. Tissue proteiinit uutettiin ja suoritettiin immunoblot-analyysi määrittämiseksi DSG3, plakoglobin, c-myc, sykliini D1, ja MMP-7, kuten alla on kuvattu.

Cellular proteiini uuttamalla, immunosaostus ja immunoblot-analyysi

menetelmiä proteiinin uutto, immunosaostus ja immunoblot suoritettiin samalla tavalla kuin aikaisemmin on kuvattu [17], [18]. Lyhyesti, soluja homogenisoitiin CHAPS lyysipuskuria, inkuboitiin jään päällä 30 minuutin ajan, ja sentrifugoitiin, jolloin saatiin solujen proteiineja. Fraktiointiin ydinaseiden proteiinien commencial NE-PER ydin- ja sytoplasman uuttoreagenssit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) käytettiin, mukaan valmistajan ehdottaman menetelmän. Valmistella immunosaostusta helmiä, 30 ui proteiini A /proteiini G Sepharose-helmiä, jotka on konjugoitu 4 ug spesifisten vasta-aineiden (klooni 5H10 varten DSG3, klooni H80 ja plakoglobin, klooni H125 ja TCF4, Santa Cruz Biotech, CA). Immunosaostukseen, 1 mg solun uutetta inkuboitiin 30 ui spesifisen proteiinin A /proteiini G helmiä 4 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Helmet otettiin talteen sentrifugoimalla, suspendoitiin uudelleen näytepuskuriin ja alistettiin immunoblot-analyysillä. Ei-immunisoiduista hiiren tai kanin seerumin IgG käytettiin negatiivisena kontrollina määrittää tietyn vaikutuksen immunosaostus.

immunoblot-analyysillä, 30 ug solun erotettiin käyttäen 8% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille. Kalvo hybridisoitiin yhden seuraavista primaaristen vasta-aineiden: klooni 5H10 on DSG3, klooni H1 plakoglobin, klooni M-20 sykliini D1, klooni 9E10 ja c-myc (Santa Cruz Biotech, CA), tai klooni MAB3315 varten MMP- 7 (Millipore, MA). Kalvo sen jälkeen inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (Santa Cruz Biotech, CA). Proteiini kuva kehitettiin käyttäen Renaissance Western Blot kemiluminesenssin Reagent Kit (NEN Life Science Products, MA) ja autoradiografia. Tiheys kunkin proteiinin kaistan määritettiin normalisoinnin jälkeen kohteena on Actin Säätökaista käyttämällä Gel Image System ja Image J ohjelmisto (Scion Corporation, MD).

Solun kasvua, pesäkkeiden muodostumista, ja virtaussytometria analyysi

kasvu ja pesäkkeiden muodostumisen määritykset suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [19], [20] Solut ympättiin tiheydellä 5 x 10

5 100 mm: n annoksia, ja missä määrin solujen kasvu määritettiin päivittäin käyttäen hemosytometriin. Sillä pesäkemuodostusta analyysi, yhteensä 1000-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille ja annettiin kasvaa ilman, että siirrettävä 7 päivää täydellisessä elatusaineissa, joka sisälsi 20% FBS: ää. Määrä solun pesäkkeet laskettiin värjäyksen jälkeen 5% kristalliviolettia 15 minuuttia.

Virtaussytometria-analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [21]. Lyhyesti, kun synkronointi solut G0 /G1-vaiheessa seerumistarvaatio, solut myöhemmin talteen eri ajankohtina (6 tunnin välein OECM1 solujen ja 3 tunnin välein SAS soluja). Solusakat kiinteä etanolilla, läpäiseviksi Triton X-100 ja RNaasi, ja inkuboitiin sitten propidiumjodidilla (PI) tumavärjäystä. Näytteet olivat välittömästi analysoitiin käyttäen FACScan-virtaussytometrillä (Becton Dickinson, San Jose, CA). Jakelu solusyklivaiheista määritettiin käyttäen Cell Quest Pro ja ModiFit ohjelmiston. Kaksi itsenäistä koetta suoritettiin jokaiselle tietokokonaisuus.

Solun maahanmuutto- ja invaasion määritykset

solumigraatioon ja invaasiota määritykset suoritettiin aikaisemmin kuvatulla [19]. Lyhyesti, solujen vaeltamiseen määritykset suoritettiin käyttäen TranswellTM polykarbonaattia kammiot (Becton Dickinson Biosciences). Solut ympättiin 6-kuoppalevyn Transwell-insertit, jotka olivat huokoisen polykarbonaattikalvon (8 um koko) ja inkuboitiin säännöllisesti media. 24 tunnin kuluttua solut, jotka olivat vaeltaneet alapuolelle Transwell-insertit kiinnitettiin glutaraldehydillä, värjättiin kristallivioletilla, ja valokuvataan.

soluinvaasion määritys suoritettiin käyttäen BD BioCoat Matrigel invaasiota kammioiden (Becton Dickinson Biosciences, Bedford, MA) ja Millicell invaasio kammio (Millipore Corporation, Bedford, MA). Kalvoon Millicell ylemmän kammion insertin, jolla on huokoskoko on 8 um, laitettiin 24-kuoppalevylle ja päällystetty Matrigel. Solut siirrostettiin yläkammiot kanssa väliainetta, joka sisälsi 1% FBS: ää. Alakammioissa sisälsi täydellisen elatusaineet (10% FBS) ansaan hyökkääviä soluja. Hyökkäys solujen kykyä määritettiin 24 tunnin välein laskemalla solut alakammioissa jotka olivat läpäisseet läpi Matrigel päällystetyn kalvon.

Immunofluoresenssi- ja konfokaalimikroskopialla

immunofluoresenssitutkimukset ja konfokaalimikroskopia analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [22]. Lyhyesti, lasipeitinlevyjä ensin päällystetty poly-L-lysiiniä ja formaldehydiä. Kiinnitetyt solut sen jälkeen permeabilisoitiin Triton-X-100 ja salvattiin naudan sikiön seerumia. Peitinlasit inkuboitiin anti-DSG3 (klooni 5H10), anti-plakoglobin (klooni H-80, Santa Cruz Biotech), anti-β-kateniinin (klooni E5), tai anti-TCF4 (cloneD4) vasta-aine, ja värjättiin fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) – tai rodamiini-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. Peitinlasit asennettiin kanssa kiinnitysväliaineet sisältävien DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Fluoresenssi visualisoidaan konfokaalisella laser mikroskooppi (Leica TCS SP2 MP).

lusiferaasireporttiterilla määrityksen TCF promoottorin aktiivisuuden

määrittämiseksi TCF promoottorin toimintaa, TOPflash (TOP) ja negatiivinen ohjaus vastine FOPflash (FOP) reportteri-plasmidit (Millipore, Corporation, Bedford, MA) käytettiin. TOP plasmidi sisälsi TCF sitoutumiskohtia, kun taas FOP sisälsi mutantti, aktiivinen TCF sitoutumiskohtia. ShDSG3 stabiili soluja tai plakoglobin pudotus solut transfektoitiin ylös tai FOP reportteri plasmidit, sekä tymidiinikinaasin promoottori-Renilla lusiferaasireportteriplasmidin (Promega, Madison, WI) sisäisenä kontrollina. 48 tunnin jälkeen solut kerättiin, ja TOP /FOP aktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual-Luciferase Reporter Assay System yhdessä GloMax 20/20 Luminometer mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Promega). TOPflash tai FOPflash aktiivisuus normalisoitiin vastaan ​​Renilla lusiferaasiaktiivisuuden, ja kertaiseksi TOP verrattuna FOP reportteriplasmidilla (TOP /FOP) on raportoitu.

Hiiri ksenograftimalleissa ja immunohistokemiallinen analyysi Ksenosiirretyn kasvainten

Kaikki eläin menettelyt hyväksynyt IACUC (Institutional animal Care ja käyttö komitea) Chang Gung yliopistossa ja seurasi ohjeita meidän laitoksen tutkimuksen toimikunta hoitoon ja koe-eläinten käytön. Minimaalinen määrä hiiriä käytettiin tutkimukseen ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Menetelmää tuottaa ksenograftien suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [23]. Lyhyesti, yhteensä 6 BALB /C nollahiiriä 5 viikon ikäisiä käytettiin kokeessa. Yhteensä 5 x 10

5 vakaa DSG3 hiljentäminen (shDSG3) soluja tai pysyvän vektori transfektoituja soluja ihon alle ruiskutettiin yläosan takaraajan. Kasvaimen koko tarkkailtiin päivittäin laskemalla äänenvoimakkuutta pituus x leveys x korkeus käyttäen jarrusatulat. Kasvaimen paino mitattiin sen jälkeen, kun hiiret lopetettiin päivänä 38. ksenograftikasvaimissa poistettiin ja alistettiin immunohistokemia (IHC) tai Western blot -analyysi.

IHC suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, kudosnäytteet joka on kiinnitetty formaldehydiliuosta ja upotettiin parafiiniin. Kohdat poistettiin parafiini ksyleenillä, keitettiin sitraattipuskurissa hakea antigeenejä, ja estää vetyperoksidin kanssa. Sitten aluslaseja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla. Seuraavat ensisijaiset vasta-aineita käytettiin: anti-DSG3 (klooni 32-6300, Zymed Laboratories Inc., CA, USA), anti-c-myc: n (klooni 9E10, Santa Cruz Biotech, CA, USA), anti-sykliini D1 (klooni M20, Santa Cruz Biotech, CA, USA), tai anti-MMP-7 (MAB3315, Millipore, Corporation, Bedford, MA). IHC analyysi ja värin kehittäminen suoritettiin käyttäen Dako Kuvitella järjestelmä (Dako, Carpinteria, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vasta-aine laimennusaineita korvattiin ensisijaisen vasta negatiivisina kontrolleina ja sitten vastavärjättiin hematoksyliinillä (HE). Värjäytyminen reaktiot määritettiin mikroskooppinen tutkimus.

Tilastollinen

Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Studentin t-testiä verrata kaksi tietoja eri näytteitä. Kaikki p-arvot olivat kaksipuolisia.

p

arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

DSG3 hiljentäminen häiritsee sen vuorovaikutusta plakoglobin ja indusoi plakoglobin translokaation tumaan

Osoittaakseen matkapuhelinverkon toiminta DSG3 perustimme shDSG3 stabiilisti ilmentävät solut ovat peräisin valinta HNC solulinjojen OECM1 ja SAS transfektion jälkeen shRNA kohdistaminen DSG3. Tehoa DSG3 pudotus on esitetty kuviossa 1A. Vuonna OECM1 soluissa, sekä kloonit (SH1 ja SH2) näytetään merkittävä knockdovvn DSG3 ( 90%), verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla. SAS-solut, SH1 ja SH2 vähentää DSG3 ilmentyminen 60% ja 30%, vastaavasti. Siksi käytimme OECM1-SH1 ja SAS-SH2 klooni soluista koko jatkotutkimuksia.

(A) DSG3 ilmentyminen tukahdutetaan shDSG3 soluihin käyttäen RNAi. OECM1 ja SAS-solut transfektoitiin DSG3-spesifinen shRNA ekspressioplasmidin tai tyhjän vektorin plasmidiin, ja kloonit valittiin käyttämällä G418: aa. Neljä kloonia (OECM1-SH1 ja OECM1-SH2 in OECM1 soluissa ja SAS-SH1 ja SAS-SH2 SAS solua) shDSG3 soluja valittiin ja analysoitiin western blot määrityksiä määrittämään DSG3 proteiinin taso. Kaksi kloonia (OECM1-V OECM1 soluissa ja SAS-V SAS soluissa) vektorin-transfektoidut solut myös valinneet kontrolleina. Aktiini-proteiinin taso määritettiin sisäisenä kontrollina proteiinin ilmentymisen. (B) DSG3 hiljentäminen vähensi vuorovaikutuksen DSG3 kanssa plakoglobin, kuten määritetään immunosaostuksella (IP) ja immunoblot (IB) analyysi. Kahdet soluja tutkittiin, tyhjä vektori-transfektoitujen solujen ja shDSG3-transfektoiduissa soluissa. Kunkin näytteen, proteiinit uutettiin ja immunosaostettiin anti-DSG3 (D3), anti-plakoglobin (Pg), hiiren IgG: tä (IgG) (negatiivisena kontrollina), kuten edellä kunkin kaistan. Jokainen näyte myöhemmin immunoblotattu joko plakoglobin (Pg) – tai DSG3 (D3) spesifisen vasta-, kuten vasemmalla puolella kunkin sarjan näytteitä. (C) DSG3 hiljentäminen indusoi plakoglobinn translokaatiota sytoplasmasta tumaan. Immunofluoresenssi ja konfokaalimikroskopialla käytettiin tutkimaan lokalisointi DSG3 ja plakoglobin sekä tyhjän vektorin transfektoiduissa ja shDSG3-transfektoiduissa soluissa. DSG3 havaittiin käyttämällä DSG3-spesifisen primaarisen vasta-aineen FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta ja on esitetty vihreällä. Plakoglobin havaittiin käyttämällä plakoglobin-spesifisen primaarisen vasta-aineen kanssa, rodamiini-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen, ja se on esitetty punaisella. DAPI värjäys suoritettiin tumavärjäystä ja näkyy sinisenä. Kuvat yhdistettiin tunnistamaan solunosasijaintia DSG3 ja plakoglobin. Mittakaavapalkki osoittaa kokoinen kuin 40 pm. (D) kokonaismäärä ja tumaproteiiniuutetta käytettiin tutkimaan plakoglobin tasolle immunoblottimäärityksessä. Proteiini tiheys mitattiin Image J ohjelmisto. Yhteensä proteiiniuutokset normalisoitu aktiini; tumaproteiiniuutteet normalisoitiin HDAC laskea suhteellisen ilmentymisen tasolla.

Koska DSG3 on osa Desmosomi ja vuorovaikutuksessa muiden desmosomiproteiinien, kuten plakoglobin, säilyttää solu-solu-adheesion. Me tutkimme, signalointireitiksi DSG3 oli välittyvät sen vuorovaikutusta loppupään molekyylin plakoglobin. Kuten kuviossa 1B, DSG3 hiljentäminen ei ollut merkittävää vaikutusta ilmentymistason plakoglobin. Kun proteiini näytteitä tyhjän vektorin-transfektoidut solut immunosaostettiin DSG3-spesifistä vasta-ainetta ja immunoblotattiin kanssa plakoglobin-spesifistä vasta-ainetta, nämä kaksi molekyyliä vuorovaikutuksessa toistensa kanssa. Vuonna shDSG3 soluissa, DSG3 osoitti paljon heikompi yhdessä plakoglobin kuin tyhjän vektorin-transfektoiduissa soluissa. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös päinvastaisessa kokeessa. Kun proteiini näytteet immunosaostettiin plakoglobin-spesifistä vasta-ainetta ja immunoblotattiin kanssa DSG3-spesifistä vasta-ainetta, vaikka vuorovaikutukset havaittiin näiden kahden molekyylien tyhjän vektorin-transfektoiduissa ja shDSG3 solujen shDSG3 solut osoittivat paljon heikompi -alueella. Nämä tulokset osoittivat, että DSG3 pudotus häiritsee vuorovaikutus DSG3 ja plakoglobin.

Häiriöt vuorovaikutusta DSG3 ja plakoglobin sh-D3-solujen osoitettiin edelleen käyttäen immunofluoresenssilla. Kuten on esitetty sulautuneen tumavärjäystä ja Fluoresenssikuvat kuviossa 1C, DSG3 ja plakoglobin co-paikallistaa solukalvon kontrollisoluissa. Vuonna sh-D3-solut, tämä yhteistyö lokalisointi ei havaittu. Sen sijaan, knockdovvn DSG3 helpottaa plakoglobin translokaatiota solukalvon ja Desmosomi liittymien tumaan. Lisäksi kokonaisproteiinin ja tumaproteiiniuutteet tutkittiin plakoglobin jakautuminen immunoblottimäärityksessä. Kuviossa 1D, plakoglobin taso koholla tumaproteiiniuutetta sh-D3 soluja kuin vektorisäätö soluja, mutta määrä plakoglobin yhteensä proteiinifraktio löytänyt mitään merkittävää eroa sh-D3 ja vektorisäädön soluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, DSG3 Knockdown häiritsee sen vuorovaikutusta plakoglobin ja indusoi plakoglobin translokaation tumaan

DSG3 pudotus kasvaa vuorovaikutusta plakoglobin kanssa transkriptiotekijä TCF

Plakoglobin on lähin selkärankaisten sukulainen β kateniinin, joka on alavirran efektorimolekyylin kanonisessa Wnt-signalointireitin aktivaatio, vaikka niillä on erilaiset transaktivaatiota potentiaalit [25] – [28]. Wnt signalointi aloittaa cascade tapahtumista, jonka avulla β-kateniinin paeta proteasomin välittämän hajoamisen, mikä tavallisesti varmistaa, ettei ole vain pieni pohjapinta taso β-kateniinin sytoplasmassa. β-kateniinin pystyy sitten tumaan, jossa se kompleksoituu T-solun tekijän /lymfaattisen tehostajana sitova tekijä (TCF /LEF) perheen transkriptiotekijöiden ja aktivoi kohdegeenien transkription [25], [28]. Siksi tutkimme, plakoglobin tumaansiirtymiseen laukaisi knockdovvn DSG3 vaikuttaa vuorovaikutuksen plakoglobin ja transkriptiotekijä TCF. Immuunisakkautusta ja immunoblot-menetelmiä käytettiin tutkimaan sekä OECM1 (kuvio 2A) ja SAS-soluja (kuvio 2B). Kuten on esitetty, DSG3 hiljentäminen lisäsi sitoutumista TCF4 kanssa plakoglobin mutta se ei ollut merkittävää vaikutusta vuorovaikutus β-kateniinin. Immunofluoresenssimääritykset paljasti myös johdonmukaisia ​​tuloksia. Kontrolliin verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu vektorilla, pudotus DSG3 lisääntynyt määrä plakoglobin tumassa, joka oli osoitettu näkyvä kolokalisaation kanssa transkriptiotekijä TCF4 (kuvio 2C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että pudotus on DSG3 indusoidun plakoglobin kulkeutuessa tumaan, mikä on johtanut yhä sitoutuminen transkriptiotekijä TCF.

(A, B) knockdovvn DSG3 kasvoi plakoglobin sitoutumisen TCF4 transkriptiotekijä, määritettynä immunosaostuksella (IP) ja immunoblot (IB) analyysi määritettynä OECM1 (A) ja SAS (B) soluista. Solu-uutteet vektorin tai shDSG3 stabiileja transfektoituja soluja immunosaostettiin anti-TCF4, kanin IgG: tä (IgG) (negatiivisena kontrollina) ja sen jälkeen immunoblotattu plakoglobin tai β-kateniinin vasta-aine. (C) Immunofluoresenssi ja konfokaalimikroskopialla käytettiin tutkimaan vuorovaikutus plakpglobin ja TCF4. Vektori tai shDGS3 stabiileja transfektoituja soluja yhdessä värjättiin joko plakoglobin ja TCF4 vasta-aineita. Pesun jälkeen objektilasit inkuboitiin rhodamine- tai FITC- konjugoidun toisen vasta-aineen. DAPI värjäys suoritettiin tumavärjäystä. Mittakaavapalkki osoittaa kokoinen kuin 40 pm.

DSG3 hiljentäminen tukahduttaa TCF /LEF transkriptionaalisen aktiivisuuden ja loppupään kohdegeeneissä c-myc, sykliini D1, ja MMP-7

tutki tarkemmin sitä plakoglobin tumaansiirtymiseen laukaisi DSG3 hiljentäminen myös indusoi vaikutuksia TCF /LEF transkriptionaalisen aktiivisuuden. Koska asema plakoglobin on Wnt reitti ei ole määritelty hyvin, siksi yksilöity toiminta plakoglobin on TCF /LEF transkriptionaalista aktiivisuutta. TOPflash /FOPflash lusiferaasireportteri- määritystä käytettiin [28]. Kuten kuviossa 3A on esitetty, knockdovvn plakoglobin ilmentymisen lisääntynyt TCF /LEF transkriptionaalista aktiivisuutta yli 2-kertainen sekä OECM1 ja SAS soluissa, sen jälkeen 1 päivä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että toisin kuin P-kateniini, plakoglobin toimii negatiivisena säätelijänä Wnt signaloinnin ja TCF /LEF transkription kautta.

(A) ja (B) vaikutukset TCF /LEF transkriptionaalista aktiivisuutta sen jälkeen, kun Plakoglobin tai DSG3 knockdown. Vakaa plakoglobin hiljentämisen (sh-Pg) tai DSG3 hiljentäminen (sh-D3) solut transfektoitiin TOPflash tai FOPflash lusiferaasireportteriplasmidi ja Renilla plasmidi. 24 tunnin kuluttua, lusiferaasin aktiivisuus määritettiin käyttäen Steady-Glo Luciferase Reagent. Tulikärpäsen lusiferaasi-aktiivisuus normalisoitiin vastaan ​​Renilla lusiferaasiaktiivisuus ja kertainen kasvu TOPflash aktiivisuuden verrattuna FOPflash aktiivisuus raportoitu. (C) ja (D) Ilmauksia TCF /LEF alavirran kohdegeenejä c-myc, ja sykliini D1 määritettiin pysyvästi transfektoitujen solujen erityisten shRNAs tavoite plakoglobin (sh-Pg) tai DSG3 (sh-D3-solut), verrattuna vektori transfektoitiin stabiilisti soluissa. Kunkin näytteen, proteiinit uutettiin ja analysoitiin Western blot -määritykset ilmentymistasojen c-myc, sykliini D1, ja MMP-7.

mahdollista vaikutusta DSG3 hiljentäminen on TCF /LEF transkriptionaalinen aktiivisuus tutkittiin. Kuten on esitetty kuviossa 3B, knockdovvn DSG3 tukahdutetaan TCF /LEF transkriptionaalisen aktiivisuuden tasolle 53% kontrolli solujen OECM1 soluissa ja 59% SAS-soluissa sen jälkeen, kun 1 päivä. Yhdessä aikaisempien tutkimusten nämä tulokset osoittivat, että DSG3 Knockdown häirinnyt sen vuorovaikutusta plakoglobin (kuvio 1 B), joka aiheuttaa plakoglobin ydinohjelman tuonti (kuvio 1 C), mikä helpottaa sen vuorovaikutuksesta TCF (kuva 2), ja johtavat parantamiseksi sen ehkäisevästä vaikutus TCF /LEF transkriptioaktiviteettia (kuva 3B).

tutkimiseksi edelleen miten DSG3 säätelee plakoglobin-TCF /LEF signalointireitin johtavat muutoksiin solun homeostaasin, tutkimme useita TCF loppupään kohdemolekyylejä, kuten c-myc sykliini D1, ja matriksin metalloproteinaasi 7 (MMP-7) [29] – [31], joilla kaikilla on tärkeitä toimintoja, solujen kasvua ja invaasiota. Määritettynä western blot-analyysi, plakoglobin hiljentäminen lisäsi huomattavasti ilmaisuja c-myc, sykliini D1, ja MMP-7 OECM1 ja SAS solulinjoissa (kuvio 3C), kun taas DSG3 hiljentäminen tukahdutti ilmaisuja näiden proteiinien molemmissa solulinjoissa (Kuva 3D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että DSG3 hiljentäminen suppressoi TCF /LEF transkriptionaalisen aktiivisuuden, mikä edelleen estää ilmaisuja alavirran molekyylien c-myc, sykliini D1, ja MMP-7.

DSG3 hiljentäminen estää solujen kasvua ja edistää solujen sykli pysähtyminen G0 /G1 vaihe

koska DSG3 on osoitettava molekyyli muunnin säännellä ilmauksia c-myc, sykliini D1 ja MMP7, tutkimme, onko tämä molekyyli toimi solujen kasvun säätelyssä. Kuten on esitetty kuviossa 4A, DSG3 hiljentäminen tukahdutetaan solujen kasvua OECM1 solujen 64% päivänä 3 ja esti solun kasvua SAS-solujen 76%: iin päivänä 3. Tätä ilmiötä tukee lisäksi käyttämällä pesäkkeiden muodostumisen määritykset, jotka osoittivat 90% kasvun estäminen in OECM1-shD3 soluja ja 80%: n kasvu estoja SAS-shD3 soluissa. Tutkia vaikutuksen DSG3 solusyklin sääntelyn, virtaussytometria-analyysi suoritettiin. Kuten kuviossa 4B, knockdovvn DSG3 johti soluissa, jotka pidätettiin G0 /G1 vaiheessa, kuten on esitetty viivästyminen tekemällä S-vaiheeseen. OECM1 solut alkoivat tekemällä S-vaiheeseen 12 tuntia (45,0%), kun taas OECM1-shD3 solut eivät käynnisty solmimalla S-vaiheeseen vasta noin 18 tuntia (49,3%). Samoin SAS solut alkavat aloittavat S-vaiheeseen 3 tuntia (48,9%), kun taas SAS-shDSG3 soluista ei tehty S-vaiheeseen asti noin 6 tuntia (40,27%). Nämä tulokset viittaavat siihen, DSG3 pudotus esti solun kasvua pidättämällä solut G0 /G1 vaiheeseen viivästyy enter S-vaiheeseen.

(A) Solujen kasvu hidastui shDSG3 soluissa. Yhteensä 10

5 solua tyhjällä vektorilla transfektoidut tai shDSG3-transfektoitujen (sh-D3) soluja ympättiin 10 mm: n levy ja viljeltiin 3 päivää. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena (***, p 0,001) (ylempi paneeli). Pesäkkeenmuodostus pelkistettiin shDSG3 soluissa. Kaikkiaan joko 1000 tyhjällä vektorilla transfektoidut solut tai shDSG3-transfektoitujen (sh-D3) solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle ja inkuboidaan 7 päivää, jotta pesäkkeiden muodostumista. Cell pesäkkeet visualisoitiin ja laskettiin seuraava värjäys 5% kristalliviolettia. (***, P 0,001) (alempi paneeli). (B) Solusykli pidätettiin G0 /G1 vaiheeseen shDSG3 soluissa. ShDSG3 (sh-D3) soluja (5 x 10

5 solua kohti 10 cm malja) on synkronoitu G0 /G1 vaihe viljelemällä niitä seerumivapaassa tiedotusvälineet 24 tunnin ajan. Soluviljelyaine vaihdettiin sitten loppuun median, jotta solut syöttää soluun aikana. Solut kerätään joka 6 tai 3 tuntia, ja niiden solusykliä tila määritettiin käyttäen virtaussytometria. (C) solumigraation kyky väheni shDSG3 soluissa, kuten määritetään käyttämällä Transwell migraatiokokeessa. Joko tyhjää vektoria-transfektoidaan tai shDSG3-transfektoitujen (sh-D3) soluja ympättiin tiheydellä 10

5 solua kuoppaa kohti 6-kuoppalevyn Transwell-insertit, jotka olivat huokoisen polykarbonaattikalvon (8 um koko) ja inkuboidaan säännöllisesti tiedotusvälineissä. 24 tunnin kuluttua solut, jotka olivat vaeltaneet alapuolelle Transwell-insertit värjättiin kristallivioletilla. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. (***, P 0,001). (D) Solujen invaasiota kyky väheni shDSG3 soluissa, määritettynä käyttäen Matrigel invaasiomääritys. Joko tyhjää vektoria-transfektoidaan tai shDSG3-transfektoitujen (sh-D3) soluja ympättiin tiheydellä 10

5 solua kuoppaa kohti 24-kuoppalevyllä Matrigel-päällystetty Millicell hyökkäyksen kammiot ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Numerot läpi vaeltaneiden solujen Matrigel alempaan kammioon määritettiin jokaisen 12 ja 24 tuntia. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena (***, p 0,001).

DSG3 hiljentäminen estää solujen vaeltamiseen ja invaasiota

Koska DSG3 toimii solu-vuorovaikutuksiin, me tutki DSG3 knockdown vaikuttaa solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Solujen liike- tulokset Transwell määritys on esitetty kuviossa 4C. Muuttoa kaksi sh-D3 solulinjojen väheni dramaattisesti 24 tunnin jälkeen verrattuna kontrolliin solulinjoja. Solun invaasio tulokset Matrigel määritys on esitetty kuviossa 4D.