Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kemoterapia muodostaa standardin liikennemuotojen hoidon paikallisten pään ja kaulan okasolusyöpää (HNSCC). Kuitenkin monet potilaat eivät pysty vastaamaan ja uusiutumisen jälkeen hoitojen takia hankinnasta chemo-vastus. Siksi on kiireesti kehittää uusia lääkkeitä, jotka voivat kääntää vastustuskykyinen fenotyyppi. Curcumin, ainesosa mausteen kurkuma on osoitettu olevan anti-inflammatorisia, antioksidantti ja antiproliferatiivisia ominaisuuksia useissa kasvaintyypeissä. Kuitenkin käyttö curcumin on rajallinen johtuen sen huonosta bio-imeytymistä. Äskettäin uuden luokan curcumin analogien, joka perustuu diarylidenylpiperidones (DAP), on kehitetty, joissa on piperidoni linkki beeta-dikarbonyyliyhdisteen rakenne ja fluori substituutiot fenyyliryhmiä. Tässä tutkimuksessa arvioimme tehokkuus H-4073, joka on parafluorinated variantti DAP, käyttäen sekä

in vitro

ja

in vivo

pään ja kaulan alueen syöpä malleja. Tuloksemme osoittavat, että H-4073 on tehokas kasvaimen vastainen aine, ja se esti merkitsevästi solujen lisääntymistä kaikilla HNSCC solulinjat testattiin annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi esikäsittely sisplatiinin vastustuskykyisten HNSCC solulinjoissa H-4073 merkittävästi päinvastaiseksi kemiallis-vastus havaittuna solunelinkykyisyysmääritys (MTT), apoptoosimäärityksessä (anneksiini V: n sitoutumisen) ja lohkaistaan ​​kaspaasi-3 (Western blot). H-4073 välittämä sen antituumorivaikutuksia estämällä JAK /STAT3, FAK, Akt: n ja VEGF signaalipolkuja tärkeä rooli solujen lisääntymisen, muuttoliike, selviytymisen ja angiogeneesiä. In SCID hiiren ksenograftimallissa, H-4073 merkittävästi parannettu anti-kasvain ja anti-angiogeneesiä vaikutukset sisplatiinin, johon ei ole lisätty systeemistä toksisuutta. Mielenkiintoista, H-4073 inhiboi kasvaimen angiogeneesiä estämällä VEGF tuotantoa tuumorisoluissa sekä suoraan estämällä endoteelisolujen toiminto. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että H-4073 on tehokas kasvaimen vastainen aine, ja sitä voidaan käyttää voittamaan kemoterapian resistenssin HNSCC.

Citation: Kumar B, Yadav A, Hideg K, Kuppusamy P, Teknos TN, Kumar P (2014) romaani Curcumin Analog (H-4073) Parantaa terapeuttinen teho sisplatiinihoitoon pään ja kaulan syöpä. PLoS ONE 9 (3): e93208. doi: 10,1371 /journal.pone.0093208

Toimittaja: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 marraskuu 2013; Hyväksytty: 28 helmikuu 2014; Julkaistu: 27 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Kumar et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Institutes of Health (NIH /NCI-CA133250, P. Kumar), Joan n Fund Research Grant (BK P. Kumar), Experimental terapeuttiset siemenet apurahan Ohio State University Kattava Cancer Center (s Kumar) Arthur G. James Cancer sairaalan ja Richard J. Solove Research Institute (TT, P. Kumar). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) on yksi yleisimmistä syövän maailmanlaajuisesti yli 600.000 tapausta diagnosoidaan vuosittain [1]. Tupakka käyttö ja alkoholin kulutus on tiedetty olevan vahvin riskitekijöitä tämän taudin kehitystä [2]. Se on kuitenkin nyt tunnustettu, että ihmisen papilloomaviruksen (HPV) voi myös olla merkitystä kehitettäessä osajoukko pään ja kaulan syöpiin [3]. Useimmat HNSCC diagnosoidaan edenneessä vaiheessa ja tulos näillä potilailla on usein heikko [4]. Sisplatiini on yksi yleisesti käytetty kemoterapeuttisten aineiden hoitoon pään ja kaulan alueen syövissä [5]. Sisplatiini on epäorgaaninen platina ainetta, joka voi sitoutua DNA: ta, joka indusoi juosteensisäiseen ja säikeiden- DNA ristisidosten, sekä DNA-proteiini-cross-linkkejä. Nämä rajat linkkejä johtaa apoptoosin ja solujen kasvun inhibition [6]. Kuitenkin monet potilaat kehittävät resistenssin sisplatiinihoitoon johtaa hoidon epäonnistuminen [7]. Näin ollen on olemassa tarve kehittää uusia terapeuttisia strategioita, jotka ovat tehokkaampia ja niillä on vähemmän sivuvaikutuksia kuin tällä hetkellä käytössä hoito-.

signaalimuunta- ja aktivaattoreita transkription (STAT) ovat perheen signalointi proteiineja, jotka ovat aktivoida sytokiinit ja kasvutekijät [8]. Tähän mennessä 7 jäsenet STAT perheen on tunnistettu nisäkkäillä. Normaaleissa soluissa, STAT proteiinit saavat ohimenevästi aktivoituvat fosforylaation ja osansa sytokiini ja kasvutekijä-vasteita kuten solujen kasvua, selviytymistä ja tulehdus [9], [10], [11]. Kuitenkin on havaittu lukuisissa tutkimuksissa, että STAT3 on konstitutiivisesti aktiivinen erilaisissa ihmisen kiinteiden kasvainten, mukaan lukien keuhkosyöpä, [12], eturauhassyöpä [13], rintasyöpä [14], ja yli 95% pään ja kaulan alueen syövissä [10]. Säätelyhäiriötä ja konstitutiivisen aktivaation STAT3 stimuloi syöpäsolujen kasvua ja edistää kasvainten kehittymiseen ja etenemisen säätelyä STAT3 kohdegeenien lukien Bcl-2, c-myc, sykliini D1 ja VEGF, joka voi parantaa solujen selviytymistä, proliferaatiota ja edistää angiogeneesiä [15] , [16], [17]. Lisääntynyt STAT3 ilmaisu on yhdistetty huonon ennusteen potilailla mahalaukun, paksusuolen ja peräsuolen syöpiä, kohdunkaulan levyepiteelisyöpä ja gliooma [18], [19], [20]. Lisäksi STAT3-yli-ilmentyminen ja signalointi on havaittu liittyvän sisplatiinin vastus HNSCC [21], [22]. Siksi voimakas ponnistelut ovat keskittyneet kohdistaminen STST3 signalointi käyttäen uusia hoitomenetelmiä, jotka saattavat aiheuttaa apoptoosin ja herkistää kasvainten kemoterapiaa [23].

Äskettäin uuden luokan diarylidenylpiperidone (DAP) yhdisteet on syntetisoitu sisällyttämällä piperidonia rengas beta-diketonin selkäranka rakenne curcumin [24]. Nämä yhdisteet osoittivat merkittävästi korkeampi syövän vastaista aktiivisuutta kuin curcumin käytettäessä munasarjasyövän mallia [25]. Havaittiin myös, että nämä yhdisteet estivät aktivointi STAT3. Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida tehoa yhden diarylidenylpiperidone (DAP) yhdiste, H-4073 joko yksinään tai yhdessä sisplatiinin kanssa, sekä

in vitro

ja

in vivo

. Osoitamme, että H-4073, ainoana lääkkeenä, oli tehokas inhiboimaan kasvainsoluproliferaation ja aiheuttamaan apoptoosin. Lisäksi H-4073 estoa STAT3, fokaalisen adheesion kinaasi (FAK), Akt ja verisuonten endoteelisolujen kasvutekijän (VEGF) signalointipolkujen ja pystyi herkistää kasvainsolut vaikutuksille sisplatiinin, ja estää siten muuttoliikettä ja apoptoosin

in vitro

sekä väheneminen kasvaimen tilavuuden

in vivo

. Tuloksemme tukevat terapeuttiseen käyttöön H-4073 yhdistettynä sisplatiiniin hoidossa pään ja kaulan alueen syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläin työ hyväksymä Ohio State University IACUC eläinten eettisen komitean ja johdetaan niiden ohjeiden (Animal Welfare Assurance Number A3261-01).

Solulinjat ja reagenssit

UM-SCC-74A, UM- SCC-1, UM-SCC-74B, UM-SCC-38 ja UM-SCC-47 saatiin laboratoriossa Dr. Thomas E. Carey Michiganin yliopistossa [26]. CAL27 saatiin ATCC (Manassas, VA). Sisplatiini resistentti solulinja (CAL27-CisR) muodostettiin sen vanhempien CAL27 solulinja (ATCC), kuten aiemmin on kuvattu [27]. Identiteetti kaikissa solulinjoissa varmentanut STR genotyypitys (AmpFlSTR Identifiler PCR -monistustarvikesarjaa, Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Kaikki pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA), 10% naudan sikiön seerumia, 1% penisilliini /streptomysiiniä ja 1% ei-välttämättömiä aminohappoja (Invitrogen). H-4073 syntetisoitiin, kuten aiemmin on kuvattu [24]. Massa Yhdiste tuoreeltaan liuotettiin DMSO

in vitro

työssä. Sillä

in vivo

työhön, H-4073 sekoitettiin rehuksi (50 ppm annos Harlan Tekland). Vasta-aineet pSTAT3 (Tyr705), Pakt (Ser473), pp38 (Thr180 /Tyr182), pERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) ja GAPDH saatiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA) ja pFAK (Tyr397) vasta-aine oli peräisin Abcam ( Cambridge, MA). CD31-vasta-aine oli Dianova (Hampuri, Saksa) ja p21-vasta Calbiochem (EMD Millipore, Billerica, MA).

otto solun sisään

määrittämiseksi ottoa H-4073 by HNSCC solut

in vitro

, UM-SCC-74A-soluja kasvatettiin 10-cm: n maljoihin ja käsiteltiin with10 uM H-4073 tai 100 uM curcumin. 1 tunnin inkuboinnin jälkeen solut trypsinoitiin, laskettiin ja pestiin PBS: llä. Solupelletti annettiin kuivua, uudelleen metanoliin ja sonikoitiin 15 minuutin ajan. Sonikaatti sentrifugoitiin 10000 rpm: llä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti laimennettiin yhtä suurella tilavuudella metanolia ja mitattiin UV /Vis spektrofotometri (λ = 328 nm, ε = 25000 M

-1 cm

-1).

proliferaatiomääritystä

solujen herkkyys sisplatiinin ja H-4073 mitattiin käyttäen MTT-kolorimetristä soluproliferaatiota kit (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa) [27]. Lyhyesti, 5000 solua /kuoppa maljattiin 96-kuoppaiselle levylle. Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla H-4073, sisplatiini, tai molempien yhdistelmä. 72 tunnin jälkeen, 10 ul /kuoppa MTT-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin vielä 4 tuntia 37 ° C: ssa. Formatsaanikitei- muodostuneet kiteet kuoppiin tehtiin liukoisiksi lisäämällä liukoiseksi liuokseen ja inkuboimalla levyjä 37 ° C: ssa yön yli. Levyt luettiin 590 nm: ssä SpectraMax 190 -levynlukijaa (Molecular Devices Inc., Sunnyvale CA). Prosentuaalinen solujen kasvun esto kussakin testiryhmässä laskettiin säätämällä käsittelemättömän kontrolliryhmän 100%. Data analysoitiin käyttämällä GraphPad Prism-ohjelmiston (GraphPad Sofware, Inc., San Diego, CA), ja annos-vaste-käyriä käytetään laskettaessa pitoisuus H-4073 tai sisplatiinia johtaa 50% soluproliferaation inhibointi (IC50) käyttäen neljän parametrinen logistinen malli. Kaikki kokeet toistettiin vähintään 3 kertaa.

lääkeyhdistelmä tutkimuksia, synergistisen vaikutuksen arvioitiin yhdistelmän indeksi (CI), menetelmän mukaisesti ja Chou ja Talalay, joissa synergia on määritelty CI 1, kun antagonismi on CI 1 ja lisäävä vaikutus pidetään CI = 1 [28]. Cl-arvot laskettiin käyttäen CompuSyn ohjelmistoa (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ).

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

Kasvaimen solut maljattiin 6 cm: n maljoihin ja sisplatiinia, H-4073 tai molempien yhdistelmää. 48 tunnin kuluttua hoidon, 4 x 10

3 eläviä soluja kustakin ryhmästä maljattiin 6 cm: n maljoihin ja viljellään vielä 10 päivää. Pesäkkeet kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin kristallivioletilla. Mikrovalokuvista otettiin ja pesäkkeiden lukumäärä laskettiin Alpha Innotech kuvankäsittelyohjelma (San Leandro, CA).

apoptoosimäärityksessä

Solut maljattiin 6 cm astiat ja käsiteltiin 24 tunnin ajan. Soluviljelmäsupernatantissa ja solut kerättiin 48 tunnin kuluttua hoidon. Solut värjättiin anneksiini V 488 (Life Technologies, Grand Island, NY) ja propidiumjodidilla (Sigma, St. Louis, MO), ja analysoitiin virtaussytometrialla. [27]

immunoblottauksella

solulysaatit ajettiin Novex bis-Tris geeli (Invitrogen) pelkistävissä olosuhteissa, blotattiin PVDF-kalvoille (GE Healthcare Life Sciences /Amersham, Piscataway, NJ), testattiin primaarisilla vasta-aineilla, huuhdellaan sitten ja inkuboitiin lampaan anti-hiiri tai aasi anti-kani konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (GE Healthcare). Kalvot tehtiin näkyviksi käyttämällä ECL Plus Kit (GE Healthcare).

migraatiokokeessa

Vaikutus solujen vaeltamiseen käsiteltäessä mitattiin käyttämällä xCELLigence RTCA DP Instrument (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa) [29]. Lyhyesti, soluja kasvatettiin seerumittomassa väliaineessa 24 tunnin ajan. Alaosaan CIM-levyn 16 täytettiin 160 ui täydellistä alustaa. Pohja ja yläosa kammiot katkesi yhdessä. Seerumia pantiin alkuun kammioon ja inkuboitiin 1 tunnin ajan CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Solut trypsinoitiin, pelletoitiin ja suspendoitiin uudelleen niin, että 80000-soluja lisättiin kuhunkin kuoppaan alkuun kammion seerumivapaassa väliaineessa, joka sisälsi sisplatiinia, H-4073 tai molempia. CIM-Plate 16 oli sijoitettu RTCA DP-aseman ja muuttoliike seurattiin 24 tunnin ajan.

In vivo tutkimukset

antituumoriteholla tutkimuksissa nude kateenkorvattomia hiirillä tuumoriksenografteja käytettiin . Kaikki eläinkokeet suoritettiin suuntaviivojen mukaisesti The Ohio State University komitea käytön ja hoidon Animals. Tuumorisoluja (1 x 10

6) sekoitettiin 100 ui Matrigel, ja injektoidaan subkutaanisesti kyljen alueella hiirillä [30]. 8 päivän jälkeen, hiiret ositettu eri ryhmiin (n = 5), niin, että kasvaimen keskimääräinen tilavuus kussakin ryhmässä oli verrattavissa. Eläimet käsiteltiin H-4073 sekoittamalla se rehuun (50 ppm annos, Harlan Teklad), alkaen päivänä 8. Eläimiä hoidettiin sisplatiinilla (5 mg /kg) päivinä 8, 11, 14, 17, 21, 24, ja 28 kautta vatsaonteloon injektioita. Kasvaimen tilavuus mittaukset [määrä (mm

3) = L x W

2/2 (pituus L, mm; leveys W, mm)] alkoi päivänä 6 ja jatkoi kahdesti viikossa, kunnes tutkimuksen loppuun. 30 päivän jälkeen primaarikasvainten poistettiin varovasti, valokuvataan, ja analysoitiin pSTAT3, Tunel-positiivisten solujen ja kasvaimen angiogeneesiä.

immunohistokemia

ksenografti kasvainten kudokset fiksoitiin 4% paraformaldehydi yön yli ja parafiiniin. Kudosleikkeet deparffinized, esikäsitelty antigeenin haku puskurilla (EDTA, pH 8,0; pSTAT3) (sitraatti, pH 6,0; CD31) [27]. Endogeeninen peroksidaasi ja ei-spesifinen sitoutuminen blokeerattiin ja leikkeitä inkuboitiin pSTAT3 (Tyr 705) tai CD31. Primaarisen vasta-aineen sitoutuminen havaittiin käyttämällä biotinyloitua vuohen anti-kani-IgG: tä (Vector Laboratories, Burlingame, CA) tai biotinyloidulla vuohen anti-rotta-IgG: tä (BD Biosciences, San Jose, CA). Levyjä inkuboitiin sitten avidiini-biotiini-kompleksin (Vector Laboratories). Reaktio sivustot visualisoitiin käyttämällä 3,3′-diaminobentsidiiniä (DAB; Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivattu ja peitettiin Per- mountilla.

ApopTag Peroksidaasisysteemit In situ Apoptosis Detection Kit (EMD Millipore, Billerica, MA) käytettiin havaitsemaan apoptoottisten solujen terminaalin deoksinukleotidyylitransferaasin dUTP nick end merkinnät ( TUNEL) värjäytymistä ksenograftissa kasvainleikkeissä mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, leikkeet parafiini, vedettömät ja inkuboitiin proteinaasi K: lla 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja pestiin sitten. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus pysäytettiin ja pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin työtä pitoisuus terminaalinen deoksinukleotidyylitransferaasi (TdT) 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Sitten leikkeet pestiin ja niitä inkuboitiin anti-digoksigeniini-konjugaattia (peroksidaasi) huoneenlämpötilassa. Signaali visualisoitiin DAB kromogeenilla.

Tilastollinen analyysi

Tiedot Kaikissa kokeissa ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM vähintään 3 riippumattoman kokeen. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin kaksisuuntaisen varianssianalyysin tai Studentin t-testiä (soveltuvin osin) ja p-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä. IC

50-arvot H-4073 ja sisplatiinia kasvainsoluproliferaation inhibitio laskettiin käyttäen GraphPad Prism-ohjelmiston (GraphPad Sofware, Inc., San Diego, CA), ja yhdistelmä-indeksi (CI) laskettiin käyttäen CompuSyn ohjelmistoa (ComboSyn, Inc ., Paramus, NJ).

tulokset

H-4073 on voimakas estäjä HNSCC leviämisen

kasvua estäviä vaikutuksia sisplatiinin paneelin HNSCC solulinjoja arvioidaan käyttämällä MTT-määritystä. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, sisplatiinihoitoon esti kasvun HNSCC solulinjojen annoksesta riippuvaisella tavalla. Valitsimme kaksi solulinjaa (CAL27-CisR ja UM-SCC-74A), jotka olivat eniten resistenttejä sisplatiinin lisäkokeita varten. UM-SCC-74A on levyepiteelikarsinooma solulinja, joka on johdettu kielen tyveen kasvain. Tämä solulinja valittiin jäljittelemään luonnon tai luontainen sisplatiinia vastus. CAL27-CisR valittiin kasvattamalla vanhempien kielen levyepiteelikarsinooma solulinja (CAL27) lisäämään sisplatiinin pidemmän ajanjakson ajan [27]. Tämä solulinja jäljittelemään hankittu sisplatiinin kestävä fenotyypin. Curcumin on ollut laajoja tutkittu sen STAT3-estäviä ominaisuuksia ja kasvaimen aktiivisuus [31]. Kuitenkin, koska sen huono hyötyosuus ja nopea aineenvaihdunta, curcumin ei ole siirtynyt klinikalla. Siksi olemme kehittäneet synteettisen analogi curcumin, H-4073 (Fig. 1 B). Tutkimuksessamme H-4073 (10 uM) osoittivat 5-kertainen solujen sisäänottoa pään ja kaulan alueen syöpä solulinja (UM-SCC-74A) verrattuna kurkumiini (100 uM, Fig. 1 C). H-4073 oli erittäin tehokas inhiboimaan solujen lisääntymisen kaikkien HNSCC solulinjoja testattiin, riippumatta niiden p53 asemasta tai ihmisen papilloomaviruksen tila (HPV, kuvio 1 D). Meidän mekanistinen tutkimuksessa havaitsimme huomattavan estymisen STAT3, FAK ja Akt fosfory- H-4073 hoidon pitoisuudesta riippuvalla tavalla (Kuva. 1 E). Lisäksi, H-4073 hoito indusoi myös aktivointi p38 MAPK, stressi aktivoitu kinaasi, jonka tiedetään välittävän solukuolemaa.

V:

HNSCC solulinjoja käsiteltiin eri pitoisuuksilla sisplatiini (CDDP) ja proliferaatiota arvioitiin MTT: llä.

B:

kemialliset rakenteet kurkuma ja H-4073.

C:

UM-SCC-74A-soluja viljeltiin 10-cm viljelyastioihin ja käsiteltiin kurkuma tai H-4073: ssa 1 tunti. Soluunottoa kurkumiinin ja H-4073 mitattiin UV /Vis-spektrofotometrissä.

D:

HNSCC solulinjoja käsiteltiin eri pitoisuuksia H-4073, ja soluproliferaatiota arvioitiin MTT-määrityksellä.

E:

UM-SCC-74A-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla H-4073: ssa 2 tuntia. STAT3, FAK, Akt ja p38 fosforylaation tutkittiin Western blottauksella ja yhtäläinen proteiini lastaus varmistettiin strippaamalla pyyhkii ja reprobing kanssa GAPDH vasta-aineella.

H-4073 synergistisesti tehosti antituumoritehoon sisplatiinin vuonna HNSCC soluissa

seuraava tutkittiin jos H-4073 hoito voisi kääntää sisplatiini vastus pään ja kaulan alueen syövän solut ja parantaa sen antituumoriteholla synergistinen tavalla. Valitsimme kaksi sisplatiini-resistenttejä solulinjoja, UM-SCC-74A (luonnostaan ​​sisplatiini kestävä) ja CAL27-cis-R (tuotettu laboratoriossamme) kaikille tutkimuksiin. Antiproliferatiivista vaikutusta H-4073 ja sisplatiini (CDDP) yhdistelmähoidon avulla mitattiin laskemalla yhdistelmä indeksi (CI) mukaan Chou-Talalay menetelmä [28] käyttämällä kiinteää annosta suhde. Sekä H-4073 ja CDDP lisättiin kasvainsoluviljelmiä 0,25 ×, 0,5 ×, 1 ×, 1,5 × ja 2 × niiden IC

50 annosta. Solujen lisääntymisen sekä solulinjoissa laskivat tuntuvasti seuraavista yhdistelmistä hoitoa useita pariksi pitoisuudet verrattuna hoitoon joko yhden aineita yksinään (Fig. 2). Yhdistelmä-indeksi (CI) eri tehokkaat annokset (ED) laskettiin käyttäen CompuSyn ohjelmistoa. CI-arvot UM-SCC-74A solujen ED50, ED75 ja ED90 oli 0,550, 0,537 ja 0,244 vastaavasti. CI-arvot CAL27-CisR solut olivat 0,628, 0,606 ja 0,507 at ED50, ED75 ja ED90, vastaavasti. Nämä tulokset viittaavat siihen, että H-4073 ja sisplatiinin yhdistelmähoito oli erittäin tehokas inhiboimaan kasvainsolujen proliferaatiota in synergistinen tavalla sekä sisplatiini resistenttejä solulinjoja.

A ja C:

UM-SCC -74A

(

) B tai CAL27-CisR

(

C

) B-soluja käsitelty H-4073 tai sisplatiini (CDDP) yksin tai yhdessä 0,25, 0,5, 1, 1,5 ja 2 kertaa niiden IC

50 annosta ja proliferaatiota arvioitiin MTT: llä. Tulokset analysoitiin mukaan Chou-Talalayn menetelmän ja yhdistelmä-indeksi (CI) arvot laskettiin CompuSyn ohjelmisto.

B ja D:

Bar kaavioita esittäen soluproliferaatioon tulokset UM-SCC-74A

(

B

) B ja CAL27-CisR

(

D

) B IC

50 annosta H-4073 ja sisplatiini (CDDP). *, On merkittävä ero (p 0,05) verrattuna ei hoitoryhmässä ja **, on merkittävä ero (p 0,05) kuin kerta-hoitoryhmissä.

vieressä tutkineet vaikutus H-4073 yksinään tai yhdistelmänä sisplatiinin kanssa kasvainsolujen pesäkkeiden muodostumista. Kuten havaitaan soluproleferaatiomäärityksessä, yhdistelmä hoito H-4073 ja sisplatiinia niiden IC

50 annosta esti kasvainsolujen pesäkkeenmuodostusta synergistinen tavalla (93% vuonna UM-SCC-74A ja 92% vuonna CAL27-CisR solut) (Fig. 3A-C).

CAL27-CisR

(

A-B

) B tai UM-SCC-74a

(

C

) B-soluja käsiteltiin H-4073 tai sisplatiini (CDDP) yksinään tai yhdessä 48 tuntia. Neljätuhatta elävää solua kustakin ryhmästä viljeltiin vielä 10 päivää 6 cm: n maljoilla. Kukin määritys kuvattiin ja pesäkkeiden lukumäärä analysoitiin. *, On merkittävä ero (p 0,05) verrattuna ei hoitoryhmässä ja **, on merkittävä ero (p 0,05) kuin kerta-hoitoryhmissä.

H-4073 inhiboi solujen vaeltamiseen ja parannettu tuumorisolujen apoptoosin

vieressä tutkittiin, mikä vaikutus H-4073 ja sisplatiinin yhdistelmähoito kasvaimen soluliikkuvuus naarmuja määrityksessä. H-4073 ja sisplatiinin hoito yksinään osoitti 48% ja 44% inhibitio UM-SCC-74A solun liikkuvuus ja 46% ja 42% inhibitio CAL27-CisR solun liikkuvuus, vastaavasti (Fig. 4A-B). H-4073 yhdistettynä sisplatiinin verrokkeja suurempi esto UM-SCC-74A ja CAL27-CisR soluliikkuvuus (85% ja 82%), tässä järjestyksessä. Ensi koesarjassa tutkimme jos H-4073 välittämän anti-kasvain vaikutukset välittyvät apoptoosin. Todellakin, H-4073 yhdistelmänä sisplatiinin osoitti merkittävästi korkeammat kasvaimen apoptoosia (anneksiini V-värjäys, Fig. 4C) verrattuna käsittelemättömiin soluihin tai H-4073 ja sisplatiini-käsiteltyjä soluja yksinään. Lisäksi yhdistelmähoito estivät merkittävästi STAT3 aktivointi ja selvästi nostivat aktivoitua kaspaasi 3 ja p21 (Fig. 4D).

A-B:

Kasvain solun liikkuvuus tutkittiin tyhjästä määritys . Kukin määritys kuvattiin ja etäisyydet vaeltavat solun reunat olivat määrällisesti ja prosentteina migraatiota laskettiin. *, On merkittävä ero (p 0,05) verrattuna ei hoitoryhmässä ja **, on merkittävä ero (p 0,05) kuin kerta-hoitoryhmissä.

C-D:

UM-SCC-74A soluja käsiteltiin H-4073 tai sisplatiini (CDDP) yksin tai yhdessä. 24 tunnin kuluttua solut joko värjättiin anneksiini V ja analysoitiin virtaussytometrialla tai Western blotattiin varten pSTAT3, p21 tai pilkotaan kaspaasi 3. Yhtäläiset Proteiinilisäyksen varmistettiin strippaamalla pyyhkii ja reprobing kanssa GAPDH vasta-aineella.

H-4073 paransi merkittävästi terapeuttista tehoa sisplatiinin sisplatiinin kestävä pään ja kaulan alueen syövät

in vitro

tiedot osoittivat, että H-4073 merkittävästi käänteinen sisplatiinin vastus pään ja kaulan syöpäsolut . Olemme edelleen validoitu meidän

in vitro

tuloksia käyttäen atyymisissä paljaan hiiren ksenograftimallissa. Ensimmäisessä koesarjassa, käytimme luonnostaan ​​vastustuskykyisiä pään ja kaulan alueen syöpä solulinja (UM-SCC-74A). H-4073 (50 ppm) ja sisplatiinia (5 mg /kg) hoito yksinään osoitti 33% ja 39% kasvaimen kasvun inhibitio päivänä 30, vastaavasti (Fig. 5A-B). H-4073 yhdistelmänä sisplatiinin osoitti merkittävästi korkeammat kasvaimen kasvun estämistä verrattuna käsittelemättömän ryhmän (84%) tai ainoana lääkkeenä yksinään (Fig. 5A-B). Lisäksi yhdistelmähoito oli hyvin siedetty, ja se ei aiheuta mitään eläimen myrkyllisyydestä tai aiheuttaa merkittävää painonlaskua.

eläimillä UM-SCC-74A, CAL27 ja CAL27-CisR hoidettiin H -4073 (50 ppm) tai sisplatiinin (CDDP, 5 mg /kg) yksinään tai yhdistelmänä.

V:

edustaja fotomikrograafeja UM-SCC-74A kasvaimia käsittelemättömästä, sisplatiini (CDDP), H-4073, tai CDDP ja H-4073 hoidetuissa ryhmissä.

B:

Kasvaimen kasvukäyrät UM-SCC-74A kasvaimet sisplatiinia (CDDP), H-4073, tai CDDP ja H-4073.

C:

Kasvaimen kasvukäyrät CAL27 ja CAL27-CisR kasvaimet sisplatiinia (CDDP), H-4073, tai CDDP ja H-4073. *, On merkittävä ero (p 0,05) verrattuna ei hoitoryhmässä ja **, on merkittävä ero (p 0,05) kuin kerta-hoitoryhmissä.

toinen joukko kokeiden, käytimme sisplatiinin kestävä solulinja (CAL27-CisR, IC

50 28 mikromol /l) ja sen vanhempien sisplatiini-herkän solulinjan (CAL27, IC

50 3 umol /l). Kuten olemme aikaisemmin osoittaneet, [27], sisplatiinihoitoon (5 mg /kg) eläinten, joissa CAL27-CisR kasvaimia ei vaikuttanut merkittävästi kasvaimen kasvua (9%) päivänä 30, kun taas sisplatiinihoitoon sen emosoluista (CAL27) huomattavasti vähentynyt kasvaimen kasvua (45%). H-4073 kohtelun CAL27-CisR soluissa oli merkitsevästi tehokkaampi vähentämään kasvaintaakkaa (32%). H-4073 ja sisplatiiniyhdistelmähoidon hoito oli tehokkainta tuumorin kasvun CAL27-CisR kasvaimia (77%, kuvio. 5C).

H-4073 ja sisplatiiniyhdistelmähoidon hoito esti merkitsevästi STST3 fosforylaatio

in vivo

ja parannettu tuumorisolujen apoptoosin

meidän

in vitro

tutkimuksessa olemme huomanneet, että H-4073 on voimakas estäjä STAT3 fosforylaation. Me seuraavaksi tutkitaan, jos H-4073 hoito esti SAT3 fosforylaatio

in vivo

. UM-SCC-74A kasvaimia hiiren ksenograftimallissa värjättiin pSTAT3 vasta-aineella. H-4073 ja sisplatiinihoitoon estivät merkittävästi STAT3 fosforylaatiota (43% ja 30%, vastaavasti). H-4073 ja sisplatiinin yhdistelmän hoito oli tehokkainta inhiboimaan STAT3 fosforylaatio (94%) (Fig. 6A-B). Samoin, H-4073 ja sisplatiinin yhdistelmän hoito oli tehokkainta apoptoosin kasvainsoluissa (Fig. 6C-D).

A-D:

Parafiini-upotettu UM-SCC-74A kasvainnäytteestä värjättiin pSTAT3 (Y705) ja apoptoottisten solujen (Apop Tag kit).

V:

edustaja fotomikrograafeja kasvainnäytteestä värjättiin pSTAT3 käsittelemättömästä, sisplatiini (CDDP) tai H-4073 yksinään tai yhdistelmänä ryhmiä.

B:

pSTAT3 positiiviset solut kvantitoitiin 5 HPF (400 X) kunkin kasvaimen näytteitä ja positiivisten solujen prosenttiosuuden lasketaan.

C:

edustaja fotomikrograafeja kasvainnäytteestä värjättiin apoptoottisia soluja käsittelemättömästä, sisplatiini (CDDP) tai H-4073 yksinään tai yhdistelmänä ryhmiä.

D:

TUNEL-positiiviset solut kvantitoitiin 5 HPF (400 X) kunkin kasvaimen näytteitä ja positiivisten solujen prosenttiosuuden lasketaan. *, On merkittävä ero (p 0,05) verrattuna ei hoitoryhmässä ja **, on merkittävä ero (p 0,05) kuin kerta-hoitoryhmissä.

H-4073 inhiboi kasvaimen angiogeneesin vähen- tämisessä VEGF: n eritys kasvainsolujen

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että STAT3 on keskeinen säätelijä angiogeneesin [16], [32]. Me seuraavaksi tutkitaan, jos H-4073 ja sisplatiinin yhdistelmähoito vaikutti kasvaimen angiogeneesiä. H-4073 ja sisplatiinin hoito yksinään osoitti 24% ja 31% tuumorin angiogeneesin UM-SCC-74A (Fig. 7A-B), kun taas H-4073 ja sisplatiinin yhdistelmän hoito osoitti 62% tuumorin angiogeneesiä. Me seuraavaksi tutkitaan, jos H-4073 inhiboi kasvaimen angiogeneesiä estämällä VEGF tuotantoa syöpäsoluja. UM-SCC-74A-soluja käsiteltiin H-4073: n ja VEGF tasot viljelmäsupernatanteissa mitattiin ELISA: lla. Hoitamaton UM-SCC-74A solut tuottivat suuria määriä VEGF (1121 pg /ml /10

6 solua, kuvio. 7C). H-4073 ja sisplatiinihoitoon yksinään osoitti 36% ja 55% VEGF tasoilla. H-4073 ja sisplatiiniyhdistelmähoidon hoito esti merkitsevästi VEGF tuotanto (83%). Seuraavassa koesarjassa tutkimme jos H-4073 voi suoraan vaikuttaa angiogeeninen toiminta endoteelisolujen VEGF signalointi. Meidän Tämän tutkimuksen tulokset osoittavat, että H-4073 merkittävästi estää VEGF-välitteistä ERK1 /2 ja Akt-fosforylaation (kuvio. 7D). Estämisen lisäksi pro-eloonjäämisen molekyylejä (ERK1 /2 ja Akt) H-4073 aktivoi myös p38 MAPK (pro-apoptoottinen molekyyli) annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 7D).

V:

edustaja fotomikrograafeja kasvaimen verisuonten värjäystä käsittelemättömän, sisplatiini (CDDP) tai H-4073 yksinään tai yhdistelmänä ryhmiä UM-SCC-74A kasvaimia.

B:

mikroverisuonitiheys kasvain näytteissä laskettiin laskemalla 5 random kentät (200 x) ja ilmaistaan ​​suonitiheys ± SE.

C:

UM-SCC-74A-soluja käsiteltiin sisplatiinin tai H-4073 yksin tai yhdistelmänä. 72 tunnin jälkeen, supernatantit kerättiin ja niistä määritettiin VEGF-määrät. *, On merkittävä ero (p 0,05) verrattuna ei hoitoryhmässä ja **, on merkittävä ero (p 0,05) kuin kerta-hoitoryhmissä.

D:

endoteelisoluja käsiteltiin VEGF: n läsnä ollessa tai ilman eri pitoisuuksia H-4073: ssa 30 minuuttia. ERK1 /2, Akt ja p38 fosforylaation tutkittiin Western blottauksella ja yhtäläinen proteiini lastaus varmistettiin strippaamalla pyyhkii ja reprobing kanssa GAPDH vasta-aineella.

Keskustelu

Potilaat, joilla on pään ja kaulan syöpä käsittää heterogeeninen ryhmä ja jopa etenemisen hoitovaihtoehtoja, yleinen eloonjäämisaste potilailla, joilla on edennyt sairaus ei ole muuttunut huomattavasti viime vuosikymmeninä [33]. Leikkaus seuraa adjuvantti sädehoitoa on pitkään käytetty potilaiden hoidosta HNSCC [34]. Viime aikoina, platina-pohjaiset hoidot ovat integroitu hoitovaihtoehdot [35]. Kuitenkin monet potilaat kehittävät resistenssin sisplatiinia, joka on yksi laajimmin käytetty platina ainetta, mikä johtaa hoidon epäonnistumiseen [21], [36]. Siksi on kiireesti tarpeen kehittää uusia terapeuttisia aineita, jotka on kohdistettu nimenomaan pro-eloonjäämisreittejä. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että STAT3 konstitutiivisesti aktivoitu tuumorisoluissa ja on yli-ilmentynyt sisplatiini-resistenttejä solulinjoja [21], [37].