Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aberrant ilmaus kadheriineja ja catenins pelaa keskeinen rooli munasarjasyövän kehittymisen ja etenemisen. Plakoglobin (PG, γ-kateniinin) on paralogi on β-kateniinin dual liima- ja signalointitoiminnoista. Kun taas β-kateniinin on tunnettu onkogeenisen funktion, PG yleensä toimii kasvaimen /etäpesäke vaimennin. Olemme äskettäin osoittivat, että PG vuorovaikutuksessa p53 ja että alan kasvu /etäpesäke estävä toiminto saattaa välittää tämän vuorovaikutuksen. Hyvin vähän tiedetään roolista PG munasarjasyöpä. Täällä, tutkimme

in vitro

kasvaimen /aggressiivisuutta vähentävänä vaikutukset PG munasarjasyövän solulinjoissa mutantti p53 ilme ja eri kadheriinin profiileja. Osoitimme, että N-kadheriinin ilmentävät ja E-kadheriinin ja PG puutteellinen ES-2 solut olivat laajasti vaeltavia ja invasiivisia, kun taas OV-90-solut, jotka ilmentävät E-kadheriinin, PG ja hyvin vähän /ei N-kadheriinin eivät olleet. Eksogeeninen ilmaus PG tai E-kadheriinin tai N-kadheriinin knockdovvn ES-2-solut (ES-2-E-cad, ES-2-PG ja ES-2-SHN-cad) vähensi merkittävästi muuton ja hyökkäystä. Myös PG ilmaisu tai N-kadheriinin Knockdown merkittävästi vähentynyt ES-2-solujen kasvuun. Lisäksi PG vuorovaikutuksessa sekä kadheriineja ja villin tyypin ja mutantti p53 normaalissa munasarja- ja ES-2-PG solulinjoissa, vastaavasti.

Citation: Alaee M, Danesh G, Pasdar M (2016) Plakoglobin Vähentää

in vitro

kasvu, Migration and Invasion munasarjasyöpäsoluja ilmaiseminen N-kadheriinin ja Mutant p53. PLoS ONE 11 (5): e0154323. doi: 10,1371 /journal.pone.0154323

Editor: Zhiqian Zhang, Peking University Cancer Hospital Institute, Kiina

vastaanotettu: 9. joulukuuta, 2015 Hyväksytty: 12 huhtikuu 2016; Julkaistu: 4. toukokuuta 2016

Copyright: © 2016 Alaee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Kanadan Breast Cancer Foundation, Prairies /NWT (MP, toiminta); Alberta Cancer Foundation (MA, jatko apurahan); Naiset Lasten Health Research Institute (GD, Summer stipendi).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat julistaa ole kilpailevia intressejä.

Johdanto

Munasarjasyöpä (OVCA), viidenneksi yleisin syöpä naisilla on johtava syy kaikkien naisten lisääntymis- syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti, ja sen kokonaispaksuus viiden vuoden eloonjäämisaste ~ 45% [1]. Suurimmat muoto OVCA on epiteelin munasarjasyöpä (EOC), jonka osuus ~ 80% kaikista munasarjojen kasvainten [2]. EOCs luokitellaan tyypin I ja tyypin II [3]. Tyypin I kasvaimet ovat geneettisesti stabiileja, hitaasti kasvava, ja on suhteellisen hyvä kliininen tulos. Kuitenkin suurin osa OVCA ovat tyypin II. Yli 90% näistä kasvaimista satama p53 mutaatioita, ovat geneettisesti epävakaita, erittäin aggressiivinen ja on huono kliinistä tulosta [4-6].

TP53

mutaatiot uskotaan olevan varhainen tapahtuma kehittämisen aikana tyypin II kasvaimia ja edistää sekä metastasointiin ja chemoresistance [7-12]. p53 on transkriptiotekijä ja tuumorisuppressoriproteiinia että on olennaisia ​​rooleja säätelyssä solujen lisääntymistä, eloonjääntiä, vanhenemista, apoptoosin ja aineenvaihdunta [13]. Vastauksena stressiä, p53 aktivoi DNA-vaurioita vastaus, solusyklin pysähtymiseen ja solukuolemaa [14,15]. Erilaiset posttranslational muutokset ja proteiini-proteiini vuorovaikutusten säädellä p53 vakautta ja toiminnot [16]. Olemme tunnistaneet plakoglobin (PG, γ-kateniinin) uutena vuorovaikutuksessa kumppani sekä villityypin (WT) ja mutantti p53 (Mp53) [17,18].

Plakoglobin on jäsen Armadillo perheen proteiinit ja paralogi on β-kateniinin [19,20]. Toisin, β-kateniinin, joka vain kumppaniaan vyöliitos ja hallussaan tunnettuja onkogeenisen toimintoja, PG on kasvain /etäpesäke soriproteiini ja osallistuu muodostumiseen sekä vyöliitos ja desmosomeja [19,21]. PG voi antaa kasvua /etäpesäke estäviä vaikutuksia kautta vuorovaikutusta kadheriineja ja induktion yhteystiedot kasvun esto [19]. Lisäksi, se voi olla vuorovaikutuksessa useiden solunsisäisten kumppaneiden, kuten transkriptiotekijöiden [17-19,22-27]. Olemme osoittaneet, että PG vuorovaikutuksessa p53 ja sen kasvaimen /aggressiivisuutta vähentävänä toiminta voi ainakin osittain, välittyvän tämä vuorovaikutus [17,18].

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että menetys cadherin- kateniinin monimutkainen ja aktivointi β-kateniinin onkogeenisiä toiminto pelata keskeisiä rooleja paikallisessa hyökkäyksen munasarjojen kasvainsolujen ja myöhemmin etäpesäkkeiden [28-31]. Lisäksi heterotsygoottisuuden menetys PG-geenin (JUP) on raportoitu satunnaisesti OVCAs [32]. Kuitenkin tiedetään hyvin vähän roolista PG OVCAs. Tässä tutkimuksessa olemme arvioineet kasvaimen /aggressiivisuutta vähentävänä toiminnot PG OVCAs jatkuvan normaalin munasarjan solulinja menettää tavallisesti-364 ja OVCA solulinjoissa OV-90 (PG ja E-kadheriinin positiivinen, Mp53 ilmentävät), ES-2 ( PG ja E-kadheriinin negatiivinen, N-kadheriinin positiivisia ja Mp53 ilmentävät), ES-2-PG (ES-2 transfektantit ilmentävät PG), ES-2-E-cad (ES-2 transfektantit ilmentävät E-kadheriinin) ja ES- 2-SHN-cad (ES-2-solut, joissa N-kadheriinin on tippuu alas). Tutkimme PG tasolle, lokalisointi ja vuorovaikutusta E- ja N-kadheriinin ja p53 ja arvioidaan kasvun, muuttavien ja invasiivisia ominaisuuksia eri solulinjoissa. Tulokset osoittivat, että PG vuorovaikutuksessa sekä kadheriineja ja p53. Eksogeeninen ilmentyminen E-kadheriinin tai PG tai knockdovvn N-kadheriinin vähensi muuttoliikettä ja hyökkäys ES-2-soluissa. Lisäksi PG ilmaisun ja N-kadheriinin pudotus, mutta ei E-kadheriinin ilmentymisen vähensi merkittävästi ES-2-solujen kasvuun.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

menettää tavallisesti -364 (jäljempänä menettää tavallisesti) kasvatettiin 1: 1 M199: ssä, ja MCDB M105 media plus 5% FBS: ää ja 1% PSK (penisilliini, streptomysiini, kanamysiini). OV90 soluja ylläpidettiin samassa M199 ja MCDB M105 media plus 15% FBS ja 1% PSK. ES-2-soluja kasvatettiin McCoyn 5a media täydennetty 10% FBS: ää ja 1% PSK. ES-2-E-cad ja ES-2-PG-soluja kasvatettiin ES-2 väliaineessa, joka sisälsi 400 ug /ml (valinta) tai 200 ug /ml (ylläpito) G418. ES-2-shNcad transfektoimiseksi muurahaisia ​​viljeltiin ES-2 media 1 ug /ml (valinta) tai 0,5 ug /ml (ylläpito) puromysiini.

Transfektio

koodaavat plasmidit E-kadheriinin ja PG on kuvattu [33, 34]. Cultures of ES-2 solut 60 mm tai 100 mm: n maljaa transfektoitiin 50-75% konfluenssiin kanssa 10-25μg DNA käyttäen kalsiumfosfaattia. Kaksikymmentä tuntia transfektion jälkeen, solut huuhdeltiin PBS: llä ja annettiin toipua 24 tuntia täydellisessä kasvualustaa. Valitse stabiilit transfektantit, 72 h transfektion jälkeen, väliaineessa, joka sisälsi 400 ug /ml G418: aa (ES-2- PG ja ES-2- E-cad transfektantit) lisättiin soluihin, ja resistentit pesäkkeet valitaan 3-4 viikkoa. Resistentit kloonit ylläpidettiin 200 ug /ml G418 ja seulottiin PG ja E-kadheriinin ilmentymisen immunofluoresenssilla ja immunoblottauksella määrityksissä.

N-kadheriinin Knockdown

Ihmisen N-kadheriinin lentiviraalinen shRNA plasmidi [35 ] käytettiin transfektoimaan Phoenix-AMPHO soluihin käyttäen kalsiumfosfaatti. Lentivirusvektorikonstruktit hiukkaset kerätään 48 ja 72 tuntia transfektion yhdistettiin ja suodatettiin käyttäen 0,45 um matala-proteiinia sitovan suodattimen. Lentivirus- partikkeleita käytettiin transdusoimaan ES-2-soluja, kun läsnä oli 8μg /ml polyberene (Santa Cruz, Kanada). Puromysiiniresistenttiä stabiilit solulinjat, jotka ekspressoivat N-kadheriinin shRNAs (ES-2-SHN-cad) eristettiin, ja N-kadheriinin tasot arvioitiin immunoblot ja immunofluoresenssilla.

immunoblot-analyysi

Confluent 100 mm viljelymaljoille huuhdottiin kylmällä PBS: llä ja solubalized SDS-näytepuskurissa (10 mM Tris-HCI, pH 6,8, 2% (w /v) SDS: ää, 50 mM ditiotreitolia, 2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 1 mM NaF, 1 mM Na

3Vo

4). Yhtä suuret määrät koko solun proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Biorad, Kanada). Membraanit inkuboitiin tietyn ensisijaisen vasta-aineiden yön yli 4 °

C, minkä jälkeen sopiva sekundaarisia vasta-aineita huoneenlämpötilassa (taulukko 1). Kalvot skannattiin käyttäen Odyssey CLX infrapuna Imaging System.

Immunofluoresenssikoe

Konfluentteja soluviljelmät perustettiin lasipeitinlevyille ja huuhdellaan kylmällä PBS: llä, joka sisälsi 1 mM kutakin NaF, Na

3Vo

4 ja CaCl

2. Solut kiinnitettiin 3,7% formaldehydillä 20 minuutin ajan ja uutettiin CSK-puskuriin (50 mM NaCl, 300 mM sakkaroosi, 10 mM PIPES, pH 6,8, 3 mM MgCI

2, 0,5% Triton X-100, 1,2 mM PMSF: ää, ja 1 mg /ml DNaasia ja RNaasia; [17]) 10 minuutin ajan. Peitelaseja blokattiin 4,0% vuohen seerumia ja 50 mM NH

4CL

4 PBS: ssä, joka sisälsi 0,2% BSA: ta 1 tunnin ajan. Peitinlasit inkuboitiin sitten erityisissä primaaristen vasta-aineiden 1 tunnin ajan, jonka jälkeen sekundaarisia vasta-aineita 30 minuutin ajan pitoisuuksilla esitetään taulukossa 1. Tumat vastavärjättiin DAPI (1: 2000). Peitinlasit kiinnitettiin Elvanol, joka sisälsi 0,2% (w /v) parafenyleeni diamiini (PPD) ja tarkastella käyttämällä 63x objektiivin linssistä Zeiss -konfokaalimikroskoopilla.

immunosaostus

Viljelmiä kasvatettiin konfluenssiin 100 mm astiat ja huuhdeltiin kylmällä PBS: llä, joka sisälsi 1 mM NaF, Na

3Vo

4 ja CaCl

2. Solut uutettiin 1 ml: aan lyysipuskuria (50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksikolaattia, 0,7gg /ml pepstatiinia, 1 mM Na-

3Vo

4, 1 mM NaF, ja proteaasiestäjäseostabletit) 20 minuuttia keinuvivun 4 ° C: ssa. Solut kaavittiin ja sentrifugoitiin 48000xg 10 minuutin ajan. Supernatantit käsitellä immunosaostuksella p53 ja PG-aineita (taulukko 1) ja 40 ui proteiini G agaroosi (Thermo Fisher Scientific, Kanada) helmiä yön yli rokkari-pyörittäjä 4 ° C: ssa. Sitten näytteitä sentrifugoitiin 14000xg 2 min, helmet poistettiin ja supernatantit prosessoitiin toisen immunoprecipation 3 tuntia. Helmet kaksi immunosaostukset yhdistettiin ja pestiin kolme kertaa lyysipuskurilla. Immuunikompleksien liuotettiin 60 ui SDS-näytepuskuria, erotettiin SDS-PAGE ja käsitellään immunoblot edellä kuvatulla tavalla.

Kasvu, muuttoliike ja invaasiomääritys

In vitro kasvun määrityksessä, 3×10

4 solut ES-2, ES-2-E-cad, ES-2-PG: n ja ES-2-SHN-cad-soluja maljattiin 24-kuoppalevylle. 1, 3, 5 ja 7 päivää sen jälkeen, kun pinnoitus, viljelmiä käsiteltiin trypsiinillä ja solut laskettiin. Aina piste edustaa keskiarvoa kolmen erillisen kokeen.

solujen vaeltamiseen määrityksissä, 2 x 10

5 Solut suspendoitiin uudelleen 0,5 ml: aan seerumitonta median ja kullattu ylemmässä kammiossa transwell inserttien (3 um huokosten, 6.5mm halkaisija, BD Biosciences, CA, USA). Normaali media sisälsi 10% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon ja viljelmiä inkuboitiin 16 tuntia 37 ° C: ssa. Insertit siirrettiin sitten uusia ruokalajeja ja huuhdeltiin PBS poistamiseksi un sitoutumattomia soluja. Insertit kiinnitettiin 3,7% formaldehydillä (PBS: ssä), 2 minuuttia, läpäiseviksi 100% metanolissa 20 minuutin ajan ja värjättiin Giemsa-värjäys 15 minuuttia huoneen lämpötilassa. Seuraavat värjäys, kalvot tarkasteltiin käännettyä mikroskooppia käyttäen 20x objektiivilinssin ja valokuvattiin.

Matrigel invaasio määrityksiä, soluja nälkiinnytettiin seerumittomassa elatusaineessa 24 tunnin ajan ennen määritystä. Kutakin solulinjaa, 5 x 10

4 solua 0,2 ml seerumittomassa alustassa levytettiin ylimmässä osastossa Matrigel päällystetyn invaasio kammiota (8 um huokosia PETE kalvo, BD Biosciences). Fibroblasti elatusaine (0,8 ml) lisättiin pohjalle kammioihin ja levyjä inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa. 16 tunnin kuluttua membraanit otettiin talteen ja käsitellään kuten on kuvattu migraatiokokeessa. Asennettu kalvot tarkasteltiin 20x tavoitteen linssin käännettyä mikroskooppia ja valokuvataan.

Siirretty /hyökkäsi solut laskettiin 5 random aloilla kunkin kalvon avulla ImageJ Cell Counter-ohjelma. Numerot kunkin solulinjan laskettiin keskiarvo ja normalisoitu kuin normaalin solulinjan tai vanhempien transfektoimattomia soluja ja histogrammit rakennettu. Histogrammit edustavat keskiarvoa vähintään 3 riippumatonta määritykset kustakin solulinjasta.

Tilastollinen analyysi

Arvot esitetään keskiarvoina ± SD. Tilastolliset erot ryhmien välillä arvioitiin Studentin t-testillä.

P

-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Proteiinin ilmentymistä epiteelin ja mesenkymaalisten markkereita ja p53 erilaisissa OVCA solulinjoissa

Protein ilmentyminen E-kadheriinin, N-kadheriinin, plakoglobin, sytokeratiineja, vimentiinistä ja p53 menettää tavallisesti, ES-2 ja OV-90-solut havaittiin käyttäen immunoblot-analyysi (kuvio 1). Menettää tavallisesti soluilla oli hyvin vähän, jos lainkaan, E-kadheriinin ja ilmaistu N-kadheriinin ja PG. Nämä solut ilmaisivat myös sytokeratiineja, vimentiinistä ja p53. Nämä havainnot olivat yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen osoittaa, että normaali OSE soluilla sekä epiteeli- ja mesenkymaalisten markkereita [36]. Sen sijaan OV-90-solut, jotka ilmentävät Mp53 [37] ei ollut havaittavaa N-kadheriinin, alhainen vimentiinista ja korkeita epiteelin markkereita kuten E-kadheriinin, PG ja sytokeratiineja. ES-2-solut, jotka myös ilmaista Mp53 [38, 39], näytetään entistä mesenkymaaliset fenotyyppi, puuttui E-kadheriinin ja PG ja ilmaisi N-kadheriinin, vimentiinistä ja hyvin alhainen sytokeratiineja.

kokosoluliuotteista mistä menettää tavallisesti-364, ES-2 ja OV-90-soluja käsitellään immunoblot-analyysillä käyttäen N-kadheriinin, E-kadheriinin, plakoglobin, vimentiinistä, sytokeratiineja ja p53-vasta-aineita. Equal kuormitukset vahvistettiin käsittelemällä saman lysaatit kanssa aktiini vasta-aineilla.

Tasot ja lokalisaation E-kadheriinin, N-kadheriinin ja plakoglobin normaalissa ja syövän munasarjan solulinjat

Subsellulaariset jakelu ja mahdollisia kolokalisaation E- /N-kadheriinin PG tutkittiin kaksois- immunofluoresenssivärjäyksen (kuvio 2). Vuonna menettää tavallisesti soluja, sopusoinnussa immunoblot tuloksiin, E-kadheriinin tasot olivat havaittavissa taas N-kadheriinin ja PG ilmaistiin korkealla tasolla ja olivat yhdessä jaettu kalvon (kuvio 2, menettää tavallisesti). In OV-90-solut, korkea E-kadheriinin ja PG oli läsnä ja oli colocalized klo kalvon. Havaitsimme lisäksi tuskin jaetaan pieniä laikkuja N-kadheriinin positiivisten solujen OV-90 kulttuureissa. Näissä laastaria, N-kadheriinin oli colocalized PG (kuvio 2, OV-90). ES-2-soluissa, ei ollut havaittavissa E-kadheriinin tai PG, kun ne ilmensivät runsaita tasoja N-kadheriinin, joka on jaettu koko sytoplasmassa (kuvio 2, ES-2). Yhdenmukainen puuttuminen PG ja liiman liittymissä, ES-2-solut osoittivat merkitsevästi vähemmän solu-solu-kontakti ja niiden morfologia oli selvästi erilainen kuin menettää tavallisesti ja OV-90-soluissa.

menettää tavallisesti-364, ES-2 ja OV-90 soluja kasvatettiin peitinlaseilla ja käsiteltyjen kaksinkertainen immunofluoresenssivärjäyksen. E-kadheriinin (E-cad, punainen) tai N-kadheriinin (N-cad, punainen) ja plakoglobin (PG, vihreä) vasta-aineita käytettiin pitoisuuksina ilmoitettu taulukossa 1. Tumat värjättiin DAPI (sininen). Bar, 25 pm.

puuttuminen E-kadheriinin ja PG ilmaisun ja läsnäolo N-kadheriinin edistää muuttavien ja invasiivisia ominaisuuksia ES-2-solut

Aiemmin olemme osoittaneet, että ilmaus PG PG puutosta karsinoomasoluja että puuttuu E-kadheriinin ja express N-kadheriinin vähenee niiden

in vitro

kasvu, muuttoliike ja invaasio [33, 34]. Sen tutkimiseksi, PG oli samanlaisia ​​vaikutuksia OVCA soluissa, ensin tutkinut muuttoliikettä ja hyökkäys ominaisuuksia menettää tavallisesti, OV-90 ja ES-2-soluissa. Sitten me eksogeenisesti ilmaistuna E-kadheriinin tai PG tai kaatanut N-kadheriinin näissä soluissa ja arvioitiin muutoksia niiden kasvua, muuttoliikkeen ja hyökkäystä. Kuten kuviossa 3A, OV-90-solut osoittivat merkitsevästi pienempi maahanmuutto- ja invaasio suhteessa menettää tavallisesti soluihin (8,4% ja 0,4%, tässä järjestyksessä). Sen sijaan ES-2-solut olivat merkittävästi enemmän vaeltavia ja invasiivisia verrata menettää tavallisesti soluihin (138% ja 196,4%, tässä järjestyksessä).

(A) Migration (vasen) ja invaasiota (oikea) ja menettää tavallisesti-364, OV -90, ES-2-soluissa. Viljelmät käsiteltiin in vitro maahanmuuton ja invaasion määrityksiä kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. Määrä siirtynyt /tunkeutuneet solujen normalisoitiin samat kuin menettää tavallisesti-364 soluja. (B) Expression of E-kadheriinin, N-kadheriinin ja plakoglobin ES-2 transfektantit ilmentävät E-kadheriinin (ES-2-E-cad) tai plakoglobin (ES-2-PG) tai N-kadheriinin shRNAs (ES-2 -shN-cad). Vakaa transfektantit käsitellä immunoblottauksella käyttämällä E-kadheriinin, plakoglobin ja N-kadheriinin vasta-aineita. Vahvista yhtä suuri kuormitukset, sama solulysaatit käsitellä aktiini vasta-aineita. (C) Subsellulaariset jakelua ja rinnakkaispaikantumisen E-kadheriinin, N-kadheriinin ja plakoglobin ES-2- E-cad, ES-2-PG ja ES-2-SHN-cad transfektantit. Vakaa transfektantit perustettiin coverslip ja käsiteltyjen kaksinkertainen immunofluoresenssilla E-kadheriinin (E-cad, punainen) tai N-kadheriinin (N-cad, punainen) ja plakoglobin (PG, vihreä) vasta-aineet. Tumat värjättiin DAPI (sininen). Bar, 25 pm.

eksogeeninen ekspressio E-kadheriinin ja PG ja vakaa pudotus N-kadheriinin ES-2 transfektantit varmistettiin käyttämällä immunoblot (kuvio 3B) ja immunofluoresenssilla analyysit (kuvio 3C). ES-2-E-cad-soluissa (kuvio 3B ja 3C, ES-2-Ecad), E-kadheriinin ilmennettiin ja pääasiassa paikallistaa kalvon, vaikka se havaittiin myös sytoplasmassa transfektanttien. Mielenkiintoista, PG ilmentyminen ES-2-PG-soluissa (kuvio 3B ja 3C, ES2-PG) johti säätelyä endogeenisen E-kadheriinin. Näissä soluissa eksogeenisesti ilmaistaan ​​PG colocalized sekä N-kadheriinin ja E-kadheriinin (kuvio 3B ja 3C, ES2-PG). N-kadheriinin pudotus vähensivät endogeenisen N-kadheriinin ( 90%). Värjäys näiden viljelmien N-kadheriinin vasta havaittiin satunnaisia ​​soluja, jotka oli tuskin värjättiin (kuvio 3B ja 3C, ES2-SHN-cad).

Arvio migraation ja invaasion ES-2 transfektantit osoittivat merkittävää vähenemistä sekä muuttoliike ja hyökkäys ES-2-Ecad ja ES-2-PG solujen suhteessa vanhempien ES-2-solut (kuvio 4A, 4B ja 4D). E-kadheriinin ilmentymisen ES-2-solut vähensi muuttoliikettä ja invaasiota näiden solujen 39% ja 42%, vastaavasti. PG ilmentyminen ES-2-solujen vähentynyt muuttoliikkeen ja hyökkäystä 58% ja 44%, vastaavasti. Vaikutus N-kadheriinin Knockdown maahanmuutosta oli samanlainen kuin PG ilmentymää eli vähennys 65%, kun taas hyökkäyksen ES-2-SHN-cad-soluissa oli merkittävästi pienempi kuin ES-2-E-cad ja ES -2-PG soluja (68% vähennys) (kuvio 4A, 4B ja 4D).

menettää tavallisesti-364, OV-90, ES-2 ja ES-2 transfektanttien (ES-2-E-cad, ES-2-PG, ES-2-SHN-cad) käsiteltiin muuttoliikkeen (A) ja invaasiota (B) määritykset kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. Määrä siirtynyt /tunkeutuneet solujen normalisoitiin samat kuin menettää tavallisesti-364 soluja. (C) Rinnakkaiset viljelmät ES-2-solut ja ES-2 transfektanttien (E-cad, PG ja SHN-cad) maljattiin yksittäisen solun (3×10

4) tiheys. Viljelmiä laskettiin päivinä 1, 3, 5 ja 7. Kukin ajankohta on keskiarvo kolmesta itsenäisestä kokeesta. (D) Yhteenveto muutoksista kasvun, siirtolaisuuden ja hyökkäys ES-2 transfektantit. Transfektantit arvot normalisoitiin ES-2-soluissa.

p

arvot, * 0,05, ** 0,001.

Vertasimme myös kasvua ES-2-solujen kuin ES-2-E-cad, ES-2-PG ja ES-2-SHN-cad transfektanttien (kuvio 4C ja 4D). Päivänä 7, ES-2-E-cad-solut osoittivat samanlaisia ​​kasvuvauhdin ES-2-solut, kun ES-2-PG ja ES-2-SHN-cad-solut osoittivat merkitsevästi alhaisempi kasvu ES-2-solut (21% ja 25 % lasku vastaavasti, (kuvio 4C ja 4D). vaikka ES-2-SHN-cad-solut osoittivat laski kasvua koko 7 päivää, ES-2-PG viljelmät osoittivat väheni solujen määrä päivän 5 jälkeen, mikä johtuu todennäköisesti induktion kontakti-inhibition yhteydessä kulttuuri konfluenttisuuden (kuvio 4C).

Yhteenvetona nämä tulokset viittaavat siihen, että ilmentyminen E-kadheriinin tai PG tai knockdovvn N-kadheriinin vähentää tehokkaasti muuttoliike ja hyökkäys ES-2-soluissa. kuitenkin vain PG ilmentymistä tai N-kadheriinin pudotus vähensi näiden solujen kasvua.

vuorovaikutus plakoglobin ja p53 normaalissa ja munasarjasyöpäsolulinjoihin

Olemme osoittaneet, että PG vuorovaikutuksessa sekä WT ja Mp53 erilaisissa sinoomasolulinjoja ja ne molemmat liittyvät promoottorit useiden p53 kohdegeenien [17, 18, 40]. PG: n vuorovaikutusta Mp53 ilmentävien karsinoomasoluja vähensivät kasvuun, muuttoliike ja invaasion näiden solujen. Tätä varten me tutki PG liittyy p53 OVCA soluissa. Yhteensä solu ote menettää tavallisesti, ES-2 ja ES-2-PG soluja käsiteltiin vastavuoroisesti coimmunoprecipitation (co-IP) ja immunoblottauksen PG ja p53-vasta-aineita (taulukko 1). Vuonna menettää tavallisesti soluissa PG vasta yhteissaostetusta p53 ja PG (kuvio 5). Vastavuoroinen yhteistyö IP käyttäen p53-vasta-aineita yhteissaostetusta PG, edelleen validointi vuorovaikutusta PG ja p53 näissä soluissa. ES-2-solut ilmentävät eksogeenisiä PG ja endogeenisen Mp53, PG vasta kerasaostettu p53 ja PG. Vuonna vastavuoroinen yhteistyössä IP ES-2-PG solujen p53 vasta kaatoi sekä PG ja p53 (kuvio 5). Sen sijaan ES-2-solut, joilla ei ole PG ilmentymistä, p53-vasta-aineita saostetaan p53 vain (kuvio 5). Ohjaus immunosaostukset p53 ja PG esi vasta-aineet eivät tunnista myöskään proteiinia kokosoluliuotteista (kuvio 5B).

Samanlaiset määrät koko solu-uutteiden (TCE) peräisin menettää tavallisesti-364, ES-2 ja ES-2 -PG soluja käsiteltiin vastavuoroista ja juokseva immunosaostuksella (IP) ja immunoblottaus (IB) käyttäen p53 ja plakoglobin aineita (A) tai esi-vasta-aineita (B), kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Samat lysaatit prosessoitiin aktiini vasta vahvistamaan yhtäläiset kuormitukset. PG, plakoglobin; Pi, pre-immuuni.

Keskustelu

Nykyisessä tutkimuksessa ensimmäistä kertaa, tutkimme

in vitro

kasvaimen /aggressiivisuutta vähentävänä vaikutukset PG in EOC solulinjoissa Mp53 ilme ja eri kadheriinin profiileja. Osoitimme, että ES-2-solut, jotka ilmentävät N-kadheriinin ja ovat puutteellisia E-kadheriinin ja PG olivat laajasti vaeltavia ja invasiivisia. Sen sijaan OV-90-solut, jotka ilmentävät sekä E-kadheriinin ja PG ja hyvin vähän N-kadheriinin eivät olleet muuttavien tai invasiivisia. Eksogeeninen ilmaus PG tai E-kadheriinin tai knockdovvn N-kadheriinin ES-2-solut vähensi merkittävästi muuton ja hyökkäystä. Tuloksemme osoittivat, että PG colocalized sekä E-kadheriinin ja N-kadheriinin in kiinnitysalueisiin. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen Havaitsimme vähentää merkittävästi ES-2-PG ja ES-2-SHN-cad kasvu suhteessa ES-2 ja ES-2-E-cad soluissa. Lisäksi PG vuorovaikutuksessa WT p53 menettää tavallisesti solujen ja Mp53 ES-2-PG transfektantit.

kadheriinin siirtymistä E- ja N-kadheriinin on kriittinen vaihe epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) -välitteisen maligniteetit [41, 42]. EMT johtaa solu-solu risteykseen purkaminen, menetys solun polariteetin ja vahvistuksen muuttavien ja invasiivisia ominaisuuksia [30, 43, 44]. Vaikka E-kadheriinin on epiteelin markkerin ja tunnetun tuumorisuppressori, N-kadheriinin on mesenkymaalisten merkki ja sen ekspressio liittyy useamman muuttavan ja invasiivisen fenotyypin [44, 45]. Normaali munasarjojen pinnan epiteelisolujen (OSE) solut ilmentävät yhdistelmä epiteeli- ja mesenkymaalisten markkereita. Nämä solut eivät ole E-kadheriinin mutta ilmaista N-kadheriinin, catenins, vimentiinistä ja sytokeratiineja [36, 46-50]. Suostumuksella näistä raporteista, menettää tavallisesti solut ilmensivät N-kadheriinin ja vimentiinista sekä catenins kuten PG, ja sytokeratiineja. Tarkka rooli E- /N-kadheriinin kytkin aloittamista ja etenemistä munasarjakarsinoomat ei ole kovin selvä, koska molemmat kadheriineja voidaan ilmaista munasarjakasvaimia eri alkuperää ja eri vaiheissa [51, 52]. Vaikka muutamat tutkimukset viittaavat siihen, että E-kadheriinin on yliaktiivista OVCA effusions [52, 53], valtaosa viittaavat siihen, että menetys tai alhaisempia E-kadheriinin edistää siirtymistä hyvälaatuisesta rajatapaus munasarjojen vaurioita, huonosti eriytetty munasarjakasvainten ja paikallisen invaasion ja metastaasin [28, 47, 54-58]. Yhdenmukainen tuumorisuppressori toimintaa E-kadheriinin, downregulation /puute E-kadheriinin ilmentymisen johtuen korkeista sen transkriptiorepresso- Snail, Twist ja ZEB-2 on liittynyt muuttolintujen ja invasiivisia ominaisuuksia ES-2 ja muut OVCA soluihin [59-71]. Lisäksi E-kadheriinin tukahduttaa kasvua ja etäpesäkkeiden kautta estämällä reseptori tyrosiinikinaasin signalointi ja PI3K /Akt reittejä [72, 73]. Suostumuksella Näissä tutkimuksissa osoitimme, että ES-2-E-cad soluissa oli huomattavasti pienempi muuttoliikettä ja invaasiota (39% ja 42%, tässä järjestyksessä) verrattuna ES-2-soluissa.

Vaikka N-kadheriinin on ilmentyy normaaleissa OSE, sen ilmentyminen liittyy yleensä lisääntynyt maahanmuutto ja hyökkäys OVCA [74-76]. N-kadheriinin tasojen on osoitettu olevan koholla jotka ilmentävät Snail ja ZEB-1, samoin kuin potilailla, joilla on korkeampi FIGO kasvaimen ja etäpesäkkeiden [51, 64, 77]. Eksogeeninen ekspressio MUC4 in SKOV3- soluissa johti downregulation E-kadheriinin, ylössäätely N-kadheriinin ja lisääntynyt liikkuvuus. N-kadheriinin knockdovvn näissä soluissa vähensi MUC4 aiheuttama motiliteetti, samanaikainen aktiivisuus on alentunut ERK1 /2, AKT ja MMP-9 [78]. Tukeminen näissä tutkimuksissa, selektiivinen anti-N-kadheriinin vasta-aineella (Exherin, ADH-1) on äskettäin osoitettu olevan tehokas vakauttava taudin etenemistä kahdessa OVCA potilailla pienessä faasin I kliinisessä tutkimuksessa, jossa arvioitiin potilailla, joilla oli erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia [79 ]. Täällä, osoitimme, että suhteessa ES-2-solut, migraation ja invaasion ES-2-SHN-cad transfektanttipoolit alennetaan 65% ja 68%, vastaavasti. Lisäksi kaatamalla N-kadheriinin oli paljon tehokkaampi vähentämään muuttoliikkeen ja invaasion kuin ilmentävät E-kadheriinin ES-2-soluissa. Vastaavasti, kun taas E-kadheriinin ilmentyminen oli hyvin vähän vaikutusta (5%) alenevassa kasvu, PG ilmentymistä tai N-kadheriinin pudotus vähensi merkittävästi ES-2-solujen kasvua (20%, 25%, vastaavasti).

Toisin kuin kadheriinit, tiedetään hyvin vähän roolista PG OVCA. PG on osoitettu olevan kasvun /etäpesäke estävä toiminto, sekä

in vitro

ja

in vivo

[19]. Tämä toiminto PG voidaan välittää vakauttaa /sekvestrausaineita N-kadheriinin ja induktio kontakti-inhibition kasvua ja /tai vuorovaikutuksessa eri solun proteiinien kanssa, mukaan lukien transkriptiotekijöitä [17-19, 27,34,40,80-82]. Täällä, eksogeeninen ilmaus PG vähensi muuttoliikettä ja hyökkäys ES-2-solut (58% ja 44% vastaavasti). Vaikutus PG on estävä vaikutus oli merkittävästi suurempi kuin E-kadheriinin. Koska PG ilme on välttämätöntä muodostumista molempien vyöliitos ja desmosomeja [19,33], tämä saattaa viitata siihen, että PG vähensi muuttoliikettä kautta yhdessä N-kadheriinin ja muodostumisen liittymien sekä vuorovaikutusta transkriptiotekijöiden ja geenin ilmentymisen säätelyyn. Vuorovaikutus PG useiden transkriptiotekijöiden, kuten TCF /LEF, CBP, SOX4 ja p53, on raportoitu aiemmin [17, 22-26, 81]. Olemme osoittaneet, että PG vuorovaikutuksessa Mp53 useissa sinoomasolulinjoja ja ne molemmat liittyvät promoottorit useiden p53 kohdegeenien lukien tuumorisuppressoreilla

SFN

(14-3-3s) ja

NME1

ja onkogeenisel- genomin järjestäjä

SATB1

. Lisäksi nämä yhteydet olivat samanaikaisia, joilla on alentunut kasvua, muuttoliike ja invaasio [17,18]. PG säädellään myös ilmaus HAI-1 ja vähentää muuttoliikettä p53 riippuvainen tavalla NSCLC soluissa [27]. Täällä, osoitimme, että PG vuorovaikutuksessa WT p53 menettää tavallisesti soluissa ja Mp53 ES-2-PG-soluissa. p53 säätelee ilmentymistä EMT markkereita, kuten Twist, etana ja Slug [82-86]. Olemme havainneet alhainen E-kadheriinin ES-2-PG solujen upon PG ilme. Onko tämä E-kadheriinin ilmentymisen johtuu downregulation E-kadheriinin transkriptiorepresso- kautta PG-p53 vuorovaikutus tai stabilointi E-kadheriinin proteiini kautta sen vuorovaikutusta PG optio lisätutkimuksia.

Yhteenvetona tämä on ensimmäinen osoitus roolin PG OVCA soluissa. Tuloksemme osoittivat, että eksogeeninen ekspressio PG tai pudotus N-kadheriinin olivat tehokkaampia kuin ilmentyminen E-kadheriinin kasvun estämisessä, muuttavien ja invasiivisia ominaisuudet ES-2-soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että PG ilmaisu erottautuvat kasvain /etäpesäke toimintojen edistämiseen N-kadheriinin. Induktio E-kadheriinin ilmentymisen ES-2 soluja, jotka ilmentävät eksogeenisiä PG, jotka vuorovaikutuksessa endogeenisen Mp53, nostaa esiin mahdollisuuden, että PG voidaan myös osallisena säätelyssä p53 kohdegeenien maahanmuuttopolitiikasta ja hyökkäystä. Yhdessä tulokset osoittavat, että PG voi toimia kasvaimen /etäpesäke vaimentimen OVCA, kuten on esitetty muita syöpiä. Suurempi seuraus tutkimuksemme on potentiaalia PG terapeuttisena kohteena enemmistön OVCAs kanssa Mp53 ja N-kadheriiniekspressiota.

Kiitokset

Kiitämme Kanadan Munasarjojen Tissue Bank on BC Cancer Agency tarjota menettää tavallisesti-364 soluja. Työmme tukee Kanadan Breast Cancer Foundation Prairies /NWT luku (MP) ja jonka Alberta Syöpäsäätiön Graduate Scholarship (MA). GD tukivat kesän stipendi päässä naisten ja lasten Health Research Institute (WCHRI).