Krooninen sairaus

tiivistelmä

syntyminen proteiinikinaasi D (PKD) mahdollisena terapeuttisena kohteena useissa sairauksia kuten syöpää on aiheuttanut etsiä tehokas, selektiivinen, ja solun läpäisevä pienmolekyylisalpaajien. Tässä tutkimuksessa kuvaamme tunnistamisen,

in vitro

luonnehdinta, rakenne-aktiivisuus-analyysi, ja biologinen arviointi uudenlainen PKD estävä rakennustelineet esimerkkinä 1-naftyyli PP1 (1-NA-PP1). 1-NA-PP1 ja IKK-16 tunnistettiin yleiseurooppalainen PKD estäjät pienessä mittakaavassa kohdistettuja estäjä kirjasto määrityksessä. Molemmat seulonta osumia esti PKD isoformit noin 100 nM ja oli ATP-kilpailevat inhibiittorit. Analyysi useiden liittyvien kinaasien osoitti, että 1-NA-PP1 oli hyvin selektiivinen PKD verrattuna IKK-16. SAR analyysi osoitti, että 1-NA-PP1 oli huomattavasti voimakkaampi ja osoitti selvästi substituentti efektiä pyratsolopyrimidiinista ydin. 1-NA-PP1 oli cell-aktiivinen, ja voimakkaasti estetty eturauhassyövän solujen lisääntymisen indusoimalla G2 /M pidätykseen. Se myös voimakkaasti esti migraation ja invaasion eturauhasen syöpäsolujen, jotka osoittavat lupaavia syövänvastainen toimintaa useilla rintamilla. Yliekspressio PKD1 tai PKD3 lähes täysin päinvastainen kasvun pysähtymisen ja tuumorin solujen invaasion aiheuttaman 1-NA-PP1, mikä osoittaa, että sen anti-proliferatiivisia ja anti-invasiivisen toiminnan oli välittyy inhibition PKD. Mielenkiintoista on, että 12-kertainen herkkyyden 1-NA-PP1 voitaisiin saavuttaa tekniikan portinvartija mutaatio aktiiviseen kohtaan PKD1, viittaa siihen, että 1-NA-PP1 voi pariksi analogia-herkkä PKD1

M659G for dissecting PKD-toimintoja ja signalointireittejä erilaisissa biologisissa järjestelmissä.

Citation: Tandon M, Johnson J, Li Z, Xu S, Wipf P, Wang QJ (2013) Uudet pyratsolopyrimidiinista proteiinikinaasi D Voimakkaat syöpälääkkeitä eturauhassyövän solut. PLoS ONE 8 (9): e75601. doi: 10,1371 /journal.pone.0075601

Editor: Makoto Kanzaki, Tohoku University, Japani

vastaanotettu: 30 tammikuu 2013; Hyväksytty: 18 elokuu 2013; Julkaistu 23 syyskuuta 2013

Copyright: © 2013 Tandon et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Institutes of Health (R01CA129127-01, R01CA142580-01, ja P50-GM067082). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tällä coauthor Qiming Jane Wang on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

jälkeen löytö Gleevec, se oli laajalti osoitettu, että hyvin voimakas ja pienimolekyylisiä inhibiittorit kinaasien näytteille merkittävä kliininen teho ja vähentynyt toksisuus [1]. Proteiinikinaasit ovat keskeisiä säätelijöitä signaalitransduktioreaktioteiden ja siksi houkutteleva terapeuttisia kohteita monia sairauksia. Seriini /treoniini proteiinikinaasi D (PKD) perhe muodostaa erillinen ryhmä kalsium /kalmoduliinista riippuvaisten proteiinikinaasien (CaMK) [2], [3]. Kolme tunnettua isoformia PKD (PKD1, PKD2 ja PKD3) tärkeitä rooleja useissa olennainen solun prosesseja, kuten solun lisääntymistä, eloonjääntiä, muuttoliike, säätelyn proteiinia kaupan, ja immuunivastetta [4], [5]. Erityisesti, PKD1 on liitetty monin tavoin kasvaimen kehittymisen, kuten kasvaimen kasvua, metastaasia, ja angiogeneesi [4]. Poikkeava PKD aktiivisuus ja ilme on raportoitu eri kasvainsolulinjoissa ja kasvaimen kudokset haima [5], iho [6], [7] ja eturauhasen [8], [9]. PKD välittää suuria signalointi polkuja, jotka ovat elintärkeitä syövän kehitystä, mukaan lukien VEGF ja MEK /ERK signalointipolkujen [4], joka tukee aktiivisesti PKD in kasvaimeen liittyviä biologisia prosesseja erilaisissa syöpätyypeissä [5], [7], [ ,,,0],9] – [12].

PKD on keskeinen signaloinnin osa diasyyliglyserolia (DAG) signalointia verkkoon. Se on ensisijainen kohde DAG ja alavirran efektori proteiinikinaasi C (PKC). On olemassa useita konservoituneita rakenteellisia motiiveja PKD, kuten C1 verkkotunnuksen, joka sitoo DAG ja moduloi PKD lokalisointi, ja PH verkkotunnuksen, joka kohdistaa autoinhibitorinen toiminnon kinaasidomeenisekvenssiin. Koskemattomissa soluissa, PKD suoraan fosforyloituu DAG-reagoiva PKcs kahdesta konservoituneet seriinitähteiksi aktivoinnissa silmukan katalyyttisen domeenin, joka johtaa sen aktivoinnin. PKD usein esiintyy jatkuvaa toimintaa aktivoinnin, joka on pääasiassa ylläpidetään autofosforylaation [5].

Viimeisten vuosien ajan huomattavaa edistystä on tapahtunut kehittämisessä voimakkaita ja spesifisiä pienimolekyylisiä PKD estäjiä. CID755673 ja analogit [13], [14], 2,6-naftyridiini ja bipyridyyli-inhibiittorit ja niiden analogit [15] – [17], 3,5-diarylazoles [18], CRT0066101 [19], ja CRT5 [20] osoittaa, kohdennettua esto PKD

in vitro

ja koskemattomien solujen. Erityisesti CRT0066101 havaittiin voimakkaasti estää kasvun haiman tuumoriksenograftien

in vivo

hiirissä [19]. Huolimatta näistä merkittäviä edistysaskeleita, no PKD-alatyypin erityinen estäjä on saatavilla, ja PKD inhibiittorit ovat vielä edetä klinikalle. Osittain Koska kliinisiä ehdokkaita voidaan katsoa rajoitetun valikoivuus,

in vivo

vakautta ja yleinen toksisuus ongelmia nykyisten tunnettujen estäjiä. Siksi on välttämätöntä jatkaa etsintää romaani PKD estävää chemotypes jotka osoittavat houkutteleva kohde valikoivuus, parantuneet farmakokineettiset profiilit, ja suurempi

in vivo

tehoon.

Olemme aiemmin tunnistettu sekä ATP-kilpailuun ja -noncompetitive PKD estäjiä, jotka ovat erillisiä rakenteeltaan muihin raportoitu estäjien [13], [14], [21] – [23]. Nämä osumat olivat tunnistettiin HTS kampanjan käyttämällä suuria, puolueeton pienmolekyylikirjastojen. Sen jälkeen, lääketieteellisen kemian strategioita käytetään optimoimaan toimintaa, selektiivisyys, ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet johtavan rakenteen, CID755673, jolloin sarja analogeja, jotka osoittivat parannettu kohde-inhibitio

in vitro

ja soluissa, ja parantunut metabolinen profiilit [13], [14], [21] – [24]. Tässä kuvaamme tunnistamisen ja arvioinnin uusi PKD estävä kemotyyppi perustuu 1-naftyyli PP1 (1-NA-PP1), pyratsolopyrimidiiniunilääke joka oli alun perin suunniteltu analogia-mutantti kinaasin lähde [25]. Tämä estäjä tunnistettiin pieni, kohdennettua kirjasto erilaisia ​​estäjät. 1-NA-PP1 oli erinomainen selektiivisyys PKD vähän tai ei lainkaan estävää aktiivisuutta kahdelle liittyvien kinaasien, CaMK tai PKC. Se esti voimakkaasti lisääntymistä, muuttoliike ja invaasion eturauhasen syöpäsoluja. Myöhempi SAR analyysi paljasti merkittäviä rakenteellisia tekijöitä tähän lyijyn yhdiste ja asemoi 1-NA-PH1 uutena ja erillinen PKD estäjä kemotyyppi joilla on potentiaalia tuottaa kehitystä ehdokkaita

in vitro

ja

in vivo

sovelluksia.

tulokset

tunnistaminen romaani PKD estävän tukirakenteet tavoitekonversiosta estäjä kirjasto

Kahdeksankymmentä kemiallisesti monipuolinen estäjät oli valittu Tocris biotieteiden pieni molekyyli kokoelma.

in vitro

PKD1 estävä aktiivisuus Näiden yhdisteiden arviointi perustuu niiden kykyyn inhiboida rekombinanttisen PKD1 proteiini 1 uM on radiometrinen PKD -kinaasimäärityksessä. Prosentuaalinen PKD1 inhibitio laskettiin inhibitioprosentti koko PKD1 kinaasiaktiivisuuden puuttuessa estäjien (DMSO). Kuusitoista yhdisteet tunnistettiin ensisijaisesti osumia (≥50% inhibitio yhteensä PKD1 kinaasiaktiivisuuden) on radiometrinen PKD1 määrityksessä (Taulukko 1). Näistä osumia, 1-NA-PP1, mutantti src estäjä, ja IKK-16, joka on IKB-kinaasi-inhibiittori, vaimentaa 77% ja 67% PKD1 aktiivisuus 1 uM, ja valittiin lisäkarakterisointia perustuu niiden teho ja erillisiä rakenteellisia piirteitä.

1-NA-PP1 ja IKK-16 ovat uusia yleiseurooppalaisia ​​PKD estäjät

in vitro

IC

50 1-NA-PP1 ja IKK-16 määritettiin 10 pisteen pitoisuus käyrän avulla radiometrisen PKD kinaasimäritykselle [13]. Rekombinantti ihmisen PKD1, 2, tai 3-proteiineja inkuboitiin seoksessa, joka sisälsi peptidin, substraattia, joka on peräisin PKD substraatti, HDAC-5, ja 10 eri pitoisuuksia kahden yhdisteen. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, 1-NA-PP1 ja IKK 16 esti kaikki kolme isoformeja PKD lähes yhtä suuri teho. 1-NA-PP1 esti PKD1, 2 ja 3 kanssa IC

50 154,6 ± 21,8 nM (n = 3), 133,4 +/- 3,6 nM (n = 3), 109,4 +/- 6,8 nM (n = 3), vastaavasti, kun taas IKK-16 samoin inhiboi PKD-isomuotojen kanssa, IC

50 153,9 +/- 7,7 nM (n = 2) ja PKD1, 115,0 +/- 7,1 nM (n = 2) ja PKD2 , ja 99,7 +/- 3,0 nM (n = 2) varten PKD3. Nämä tulokset osoittavat, että sekä 1-NA-PP1 ja IKK 16 ovat voimakkaita pan-PKD-inhibiittorit.

inhibitio ihmisen rekombinantti PKD1, 2 ja 3 analysoitiin, kun läsnä oli 10 eri konsentraatioita 1-NA-PP1 (A) ja IKK-16 (B) toimesta

in vitro

radiometrinen PKD kinaasianalyysiä. IC

50-arvot laskettiin keskiarvona ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen kanssa kolmen määrityksen kunkin lääkeaineen konsentraatio kussakin kokeessa. Aineisto funktiona lääkepitoisuuden ja edustava kuvaaja on esitetty.

1-NA-PP1 on ATP-kilpaileva estäjä korkea selektiivisyys PKD yli läheisesti kinaasien

saada parempi käsitys toimintatavan 1-NA-PP1 ja IKK-16, tutkimme vaikutuksia kasvavia pitoisuuksia ATP PKD1 esto. Lineweaver-Burk käyrät laadittiin piirtämällä vastavuoroista reaktion nopeudet (1 /v) vasten vastavuoroisesti ATP pitoisuudet (1 /[ATP]) eri yhdistettä pitoisuuksina. Pisteet sovitettiin lineaarisella regressiolla. Kuten on esitetty kuviossa. 2A-B, kaikki rivit lähentyneet Y-akselilla, joka osoittaa, että sekä 1-NA-PP1 ja IKK-16 oli ATP-kilpailevat inhibiittorit.

PKD1 kinaasin aktiivisuus mitattiin funktiona kasvavia konsentraatioita ATP kun läsnä on vaihtelevia pitoisuuksia 1-NA-PP1 (A) ja IKK-16 (B). Lineweaver-Burke tontit tiedot esitetään. Esitetyt tiedot eivät edustavat kolmen erillisen kokeen.

Seuraavaksi määritettiin spesifisyys 1-NA-PP1 ja IKK-16 PKD tutkimalla niiden toimintaa useiden toiminnallisesti tai rakenteellisesti läheisten kinaasien, mukaan lukien PKC-a , PKCδ ja CAMKIIα. Mitään merkittävää inhiboivaa toimintaa PKC-isoformien havaittiin 0,1, 1 ja 10 uM pitoisuuksina 1-NA-PP1, toisin kuin IKK-16, joka oli konsentraatiosta riippuvaisen eston sekä PKC-a ja PKCδ ja 50%: n inhibition 10 uM (Fig. 3A-B). Voimakkaan PKC-inhibiittorin GF109203X testattiin positiivisena kontrollina ja sitä voimakkaasti ja pitoisuudesta riippuvasti esti PKC-a ja PKCδ. PKD kuuluu alaryhmä CaMK perheen ja kinaasien sekä perheiden jakaa korkea sekvenssihomologia. Tämä sai meidät arvioimaan inhibition CAMKIIα näiden yhdisteiden. Kuten kuviossa. 3C, 1-NA-PP1 nähtiin vähän aktiivisuutta CAMKIIα jopa 10 uM, kun taas IKK-16 aiheutti pitoisuudesta riippuva inhibitio entsyymin ja kumosi melkein täysin sen aktiivisuus 10 uM. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että 1-NA-PP1 on erittäin spesifinen inhibiittoria PKD suhteessa muihin läheisesti liittyvien kinaasien, mukaan lukien PKcs ja CAMKs, kun taas IKK-16 on todennäköisesti irrallisia estäjä.

Inhibition PKC-a- (A) tai PKCδ (B) määritettiin 10 nM, 100 nM, 1 uM ja 10 uM. Verrokkeina, PKC estäjä GF109203X esti voimakkaasti PKC-a ja PKCδ toimintaa. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM kahden erillisen kokeen. C. inhibitio CAMKIIα mitattiin radiometrinen CaMK kinaasimääritys. Koe toistettiin kahdesti ja edustava kuvaaja on esitetty. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttäen paritonta t-testiä. ns, ei ole tilastollisesti merkitsevä; *,

p

0,05; **,

p

0,01; ***,

p

0,001.

Lisätietoja oivalluksia spesifisyydestä 1-NA-PP1 voitaisiin saada arvioimalla kinome scan tiedot 1-naftyylimetyyli PP1 ( 1-NM-PP1), jossa 1-NM-PP1 yhdessä 178 tunnettujen estäjät, profiloitiin vastaan ​​paneelin 300 rekombinanttia ihmisen proteiini kinaasien yhdellä pitoisuudella [26]. Kuten 1-NA-PP1, 1-NM-PP1 on myös C3-derivatisoitu PP1 analoginen, joka poikkeaa 1-NA-PP1 vain yksi metyyliryhmä yhdistää pyratsoli ja naftyylirenkaat. Tuloksemme osoittivat, että 1-NM-PP1 esti PKD1 kanssa IC

50 138,7 ± 33,2 nM (n = 3) (Fig. 3d), joka oli vastaava kuin 1-NA-PP1 (154,6 nM). Niiden estovaikutuksista useimpien villityypin ja mutatoidun Src-kinaasit ovat myös verrattavissa [27], mikä osoittaa, että nämä kaksi estäjät eivät ainoastaan ​​rakenteeltaan samanlaisia, mutta myös biologista aktiivisuutta. Spesifisyys tiedot 1-NM-PP1 poimittiin at cut-off 50% jäljellä kinaasiaktiivisuuden käyttäen Kinase Inhibitor Resource (KIR) online-työkalu (https://kir.fccc.edu/) kuvatulla (taulukko S1) [26]. Tiedot vahvistivat inhibitio PKD isoformin tämän yhdistettä. Vaikka lisätavoitteita 1-NM-PP1 tunnistettiin, tämä estäjä osoitti suhteellisen korkea Gini pisteet 0,67 (selektiivisyys pisteet kinaasien ja estäjät), mikä osoittaa korkeampi selektiivisyys. Samaan aikaan, ei ole PKC-isoformit inhiboi merkittävästi tätä inhibiittoria ( 90% jäljellä kinaasiaktiivisuuden kaikille PKC-isoformien). Tämän perusteella ja edellä tuloksia, päätämme keskittyä pelkästään 1-NA-PP1 meidän myöhemmissä tutkimuksissa.

synteesi ja SAR-analyysi 1-NA-PP1 analogit

Tavoitteena meidän synteettisiä tutkimuksissa oli muuttaa substituentit 1-NA-PP1 pyratsolo [3,4

d

] pyrimidiini ytimen rakenne ja määrittää biologinen vaste näiden muutosten, sekä mahdollisesti tunnistaa lisää PKD alatyypin valikoiva analogit. Me pidetään 4 eri muunnelmia, kuten on esitetty kuviossa. 4, ja valmistettu yhteensä 18 johdannaiset, mukaan lukien uudelleensyntetisoidulle vanhempi, 1-NA-PP1.

. 4-Zone mallia 1-NA-PP1 analoginen synteesi. B. synteesi 1

H

-pyratsolo [3,4

d

] pyrimidiinien 1.

Only kaksi variaatiota tutkittiin vyöhykkeellä 1,

t

butyyli ja metyyli (taulukko 2). At 1 uM, 1-NA-PP1 esti PKD1 aktiivisuutta 80%, kun taas sen R

1 = metyyli analoginen 1f vain johti 32%: n vähennys toimintaa. Kaikki muut analogien metyylisubstituentti vyöhykkeellä 1 ja erilaiset vaihdot vyöhykkeillä 2-4 menestynyt vielä pahempi ja osoittivat 10% estovaikutuksista 1 uM pitoisuuksina. Vaatimus vieviä ryhmiä R

1 pyratsolopyrimidiinista on aiemmin tunnustettu ja näyttää olevan yleinen ominaisuus kinaasien esto tämän telineen [11]. Kuitenkin, vaikka säilyttäen

t

butyyliryhmä vyöhykkeellä 1, muunnelmia, kuten käyttöönotto metyyliryhmä vyöhykkeellä 3 (1a), ja vaihdot on naftyyli substituentin muiden aryylirenkaisiin (1b-e ) ablatoitu PKD1 toimintaa. Vastaavasti meidän rajallinen SAR korostettu 1-NA-PP1 koska tehokkain yhdisteen kanssa hyvin vähän toleranssia rakenteellisia muutoksia substituenttien pyratsolopyrimidiinista ydin. Vaikka elektrofiilisiä johdannaiset kloorin ryhmän alueella 4 ja mahdollisuudet peruuttamaton entsyymin alkylointi (1j, 1k, 1m, 1p, 1 r) eivät osoittaneet voimakkuuden kasvua. Samanmuotoi- jyrkkä väheneminen v-Src-tyrosiinikinaasin estoaktiivisuus pyratsolopyrimidiinista johdannaisten on havaittu aiemmin ja on todennäköisesti liity tiettyyn vetysidosten kuvio alueilla 2 ja 3 ATP sitova tasku, jota ei pitäisi levoton [25]. Niinpä jatkoimme tutkimus estäjän profiilia pyratsolopyrimidiineihin on PKD kaikkein voimakas agentti, 1-NA-PP1.

1-NA-PP1 on solu-aktiivinen ja aiheuttaa kohde esto eturauhasen syöpäsolut

tässä tutkimuksessa tutkimme onko 1-NA-PP1 oli solun läpäisevä ja joka pystyy tavoite esto kokonaisissa soluissa. Vaikutus 1-NA-PP1 12-myristaatti 13-asetaattia (PMA) aiheuttama endogeeniset PKD1 aktivointi LNCaP eturauhassyövän solut tutkittiin kuten aiemmin on kuvattu [9], [23], [28]. PMA aktivoi PKD kautta PKC-riippuvaisen trans-fosforylaatioon Ser744 /748 (S

744/748) aktivoinnissa silmukka seuraa autofosforyloinnin PKD1 on Ser916 (S

916) C-päässä [29], [30]. PKD1 aktiivisuus korreloi hyvin taso fosfo-S

916 (p S

916) [30]. Siksi käytetään p-S

916 seuraamaan PKD toimintaa ja p-S

744/748 of PKD1 onko yhdiste häirinnyt PKC aiheuttama trans-fosforylaatiota mahdollisesti estämällä PKC. Kuten on esitetty kuviossa. 5, hoito LNCaP 10 nM PMA 20 min aiheuttama molemmat p-S

916-PKD1 ja p-S

744/748-PKD1 signaaleja. Esikäsittely konsentraation kasvaessa 1-NA-PP1 pitoisuus riippuvasti esti autofosforylaatioon at p-Ser

916-PKD1 kanssa IC

50 22,5 ± 1,5 uM (n = 2). Sen sijaan, PKC-riippuvaisen trans-fosforylaation Ser

744/748 ei vaikuttanut 1-NA-PP1. Siten 1-NA-PP1 nimenomaan kumottu PKD1 aktiivisuutta tukkimatta PKC-välitteisen trans-fosforylaatioon.

. LNCaP-soluja esikäsiteltiin eri annoksilla estäjiä 45 min, mitä seurasi PMA-stimulointi 10 nM: ssa 20 min. Solulysaatit altistettiin immunoblottauksella p-S

916-PKD1 ja p-S

744/748-PKD1. Tubuliinia blotattiin kuten latauskontrollina. Koe toistettiin kolme kertaa ja edustava blotit on esitetty. B. määrittäminen IC

50. Western-blotit kvantitoitiin käyttäen densitometrisesti analyysiä. Tiedot piirrettiin ja IC

50 arvot johdettiin pitoisuus-vastekäyrät käyttäen GraphPad. Yksi kolmesta pitoisuus-vaste-käyrät on esitetty.

1-NA-PP1 voimakkaasti estää eturauhassyövän soluproliferaatiota indusoivan G2 /M pidätys

PKD on tullut lupaava terapeuttinen tavoite syöpään. Tässä vaikutukset kohdennetun eston PKD 1-NA-PP1 eturauhasen syöpäsolujen lisääntymistä, eloonjääntiä, ja solusyklin etenemisen tutkittiin. Solujen proliferaatio määritettiin käsittelemällä soluja 30 uM aineen, ja sitten solujen lukumäärä laskettiin kuuden peräkkäisen päivän ajan, kun läsnä ja inhibiittorin puuttuessa. Kasvu ja sytotoksisia vaikutuksia 1-NA-PP1 arvioitiin solujen määrä laskee ja MTT-määritys. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, 1-NA-PP1 30 uM aiheuttanut voimakkaita kasvun pysähtymisen PC3 eturauhassyöpäsolujen alkaen päivänä 2 ja pysyi sen kokeen loppuun (päivä 6). 1-NA-PP1 myös pitoisuus riippuvasti solukuolema, jossa IC

50 23,3 ± 5,7 pM (n = 3) (Fig. 6B). Tarjota näkemystä vaikutusta 1-NA-PP1 soluproliferaatioon, tutkimme seurausta 1-NA-PP1 hoito solusyklin levitysmuotoja virtaussytometria. Solusyklin analyysi suoritettiin käsittelyn jälkeen PC3-soluja, 30 uM 1-NA-PP1: ssa 72 tuntia. Kuten on esitetty kuviossa. 6C, 1-NA-PP1 lisäsi merkittävästi solujen osuus on G2 /M-vaiheen solusyklin, joka vastaa siirtymistä 5,8% soluista G2 /M ohjaus 28,6% 1-NA-PP1-käsiteltyjen soluja, ja siten ymmärtää, että kasvun estäminen aiheuttamat 1-NA-PP1 johtuu sen kyky aiheuttaa G2 /M pidätykseen.

A1-NA-PP1 estetty PC3-solujen lisääntymisen. PC3-solut maljattiin kolmena rinnakkaisena 24-kuoppaisilla levyillä. Solujen annettiin kiinnittyä yön yli. Solujen lasku 1. päivänä tehtiin, ja sitten joko ajoneuvon (DMSO) tai 1-NA-PP1 10 uM lisättiin. Solut laskettiin päivittäin yhteensä 5 päivää. Tuore media ja estäjää lisättiin 2 päivän välein. Välineet kolminkertaisten määritysten oli ajan funktiona. Koe toistettiin kahdesti ja tulokset yhdestä edustavasta kokeesta on esitetty. B. 1-NA-PP1 aiheuttamaa solukuolemaa PC3-soluissa. PC3-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille (3000 solua /kuoppa) ja inkuboitiin sitten väliaineessa, joka sisälsi 0,3-100 uM estäjät 72 tuntia. MTT-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 4 tuntia. Optinen tiheys luettiin 570 nm: ssä sen määrittämiseksi, solujen elinkelpoisuuden. IC

50 määritettiin keskiarvo kahden itsenäisen kokeen kullekin yhdisteelle. C. 1-NA-PP1 aiheutti G2 /M vaiheessa solusyklin pysähtymiseen. PC3-soluja käsiteltiin joko vehikkelillä (DMSO), tai 10 uM 1-NA-PP1: ssa 48 tuntia. Solusyklin jakautuminen määritettiin virtaussytometrialla jälkeen propidiumjodidileimauksella kiinnitettyjä soluja. Tilastollinen merkittävyys määritettiin parittomia t-testiä ja osoitetaan. **,

p

0,01; ***,

p

0,001.

1-NA-PP1-indued kasvun pysähtymisen välittyy suunnattu eston PKD

onnistumisen varmistamiseksi kohdennetun hoidon, on tärkeää osoittaa kohdespesifisyyttä biologisella tasolla. Edellisessä tiedot osoittivat, että biologiset vaikutukset aiheuttama PKD-inhibiittorit phenocopied aiheuttamat pudotus PKD isoformit, mikä osoittaa, että vaikutukset estäjien välittyy suunnattu inhibition PKD [9], [23]. Tässä tutkimuksessa, otimme suorempi lähestymistapa onko kohdennettu esto PKD osuus biologisten vaikutusten 1-NA-PP1. Erityisesti, keskittyen anti-proliferatiivista vaikutusta 1-NA-PP1, pyrimme määrittämään, onko yliekspressio PKD1 ja PKD3 käyttäen adenovirukset voivat pelastaa antiproliferatiivisia vaikutuksia 1-NA-PP1. Kuten on esitetty kuviossa. 7A-B, PC3-solut infektoitiin nolla adenovirus (Adv-null) ja adenovirus kuljettavat PKD1 ja PKD3 geenit (Adv-PKD1 ja ADV-PKD3) 50 ja 100 MOI. Tartunnan solut altistettiin 1-NA-PP1 hoitoa 10 ja 30 uM. Infektio Adv-PKD1 ja Adv-PKD3 päinvastaiseksi antiproliferatiivisia vaikutuksia 1-NA-PP1. Korkeammat ekspressiotasot PKD1 tai PKD3, sitä suurempi pelastus vaikutuksia, ja 100 MOI lähes kokonaan käänteinen 1-NA-PP1-indusoidun soluproliferaation inhibointi havaittiin Adv-PKD1. Nämä tiedot osoittavat, että anti-proliferatiiviset vaikutukset 1-NA-PP1 oli välittyy inhibition PKD. Se viittaa myös siihen, että toiminnot PKD isoformien todennäköisesti tarpeeton, koska sekä PKD1 ja PKD3 voi pelastaa vaikutuksia 1-NA-PP1.

yli-ilmentyminen PKD1 ja PKD3 eturauhassyöpäsoluissa pelastettiin anti-proliferatiiviset vaikutukset 1-NA-PP1. PC3 (0,5 miljoonaa) solua ympättiin 60 mm lautasen ja tartunnan seuraavana päivänä 50 ja 100 MOI adenovirukset kuljettaa PKD1 (Adv-PKD1) (A) ja (Adv-PKD3) PKD3 (B). Tyhjät adenovirus (Adv-null) käytettiin kontrollina. 24 tunnin kuluttua, 3000 solua /kuoppa maljattiin 96-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin kanssa ja ilman 10 ja 30 uM 1-NA-PP1: ssa 72 tuntia. MTT-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 4 tuntia. Optinen tiheys luettiin 570 nm: ssä sen määrittämiseksi, solujen elinkelpoisuuden. Yli-ilmentyminen PKD1 ja PKD3 vahvistettiin Western blotting-analyysi (kuvat alla kaavioita). Tilastollinen merkitys välillä DMSO ja estäjähoidon kunkin adenoviruksen välillä sekä ohjaus ja PKD adenoviruksia kullakin inhibiittoriväkevyyden määritettiin parittomia t-testin GraphPad Prism V. ns, ei tilastollisesti merkitsevä; *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001

1-NA-PP1 estää voimakkaasti eturauhaskasvainsolun muuttoliikettä ja invaasiota

PKD on osoitettu olevan tärkeä rooli säätelyssä soluliikkuvuus , tarttuvuus ja hyökkäys [4]. Tässä tutkimuksessa vaikutuksia 1-NA-PP1 kasvainsolujen muuttoliikettä ja invaasiota arvioitiin kaksi riippumatonta määrityksissä, haavan paranemista määritys (solujen vaeltamiseen) ja Matrigel invaasiomääritys (soluinvaasiota). Kuten kuviossa. 8A, 1-NA-PP1 30 uM voimakkaasti estetty PC3 solujen vaeltamiseen. Kaksikymmentäkaksi tunnin kuluttua haavoittaen, 88,6% haavoittuneista alueen 1-NA-PP1 saaneista yksikerroksista pysyi auki, että valvonnan oli kokonaan suljettu. Samoin 1-NA-PP1 myös merkittävästi estänyt kasvainsolun invaasiota. Solujen käsittely 30 uM 1-NA-PP1 20 tuntia johti 60%: n inhibition soluinvaasiota verrattuna kontrolli (Fig. 8B). Yhdessä 1-NA-PP1 on voimakas estäjä eturauhassyövän solumigraation ja invaasiota.

A1-NA- PP1 estetty eturauhassyövän solujen vaeltamiseen. PC3-soluja kasvatettiin konfluenteiksi 6-kuoppaisilla levyillä. Yksikerroksinen haavoittui ja kuvattiin heti (0 h). Sitten soluja käsiteltiin kasvua väliaineessa, joka sisältää ajoneuvon (DMSO) tai 30 uM 1-NA-PP1: ssa 22 tuntia ja haavan mitattiin. Prosenttiosuus haavan paranemista laskettiin prosenttia parantunut haava-alue verrattuna alkuperäisen haavan. B. 1-NA-PP1 esti eturauhasen syöpäsoluinvaasiota. DU145 soluja inkuboitiin 30 uM 1-NA-PP1 in matrigeeliin inserttejä. 20 tunnin kuluttua noninvasive solut poistettiin ja invasiivisia solut kiinnitettiin 100% metanolia, värjättiin 0,4% hematoksyliinillä ratkaisu, ja valokuvataan. Solujen lukumäärä, jotka tunkeutuivat Matrigel matriisin määritettiin solujen määrä 6 alojen suhteessa solujen lukumäärä, jotka kulkeutuivat tarkastusalueen läpi insertin. Prosenttiosuus invaasio laskettiin prosenttia solujen hyökkäsi läpi matrigeelin lisää vs. koko solut vaelsivat läpi ohjaus inserttejä. C. yli-ilmennetään PKD1 ja PKD3 päinvastaiseksi estovaikutukset 1-NA-PP1 on kasvainsolun invaasiota. DU145 solut infektoitiin null, PKD1, ja PKD3 adenovirukset (Adv-null, Adv-PKD1, ja ADV-PKD3) 100 MOI. 24 tunnin kuluttua solut maljattiin uudelleen ohjaus ja Matrigel lisää, ja Matrigel invaasiomääritys suoritettiin kuten edellä on kuvattu. Yli-ilmentyminen PKD1 ja PKD3 vahvistettiin Western blotting-analyysi (kuvat alla kaavioita). Kaikki edellä mainitut kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa ja datan edustavasta kokeesta esitetään.

Voit selvittää, PKD välittää vaikutukset 1-NA-PP1 muuttoliikettä ja invaasio, pelastus kokeita tutkia, jos yli-ilmentynyt PKD1 ja PKD3 voisi heikentää estäviä vaikutuksia 1-NA-PP1. PC3-solut infektoitiin nolla adenovirus (Adv-null) ja adenovirus kuljettavat PKD1 ja PKD3 geenit (Adv-PKD1 ja ADV-PKD3). Invasiivista ominaisuus infektoituneissa soluissa mitattiin Matrigel invaasiomääritys. Kuten on esitetty kuviossa. 8C, yliekspressio PKD1 tai PKD3 täysin päinvastainen esto 1-NA-PP1 solujen invaasiota, vaikka niillä ei ole inhiboivia vaikutuksia soluihin invaasio kun ilmaistaan ​​yksin. Nämä tiedot merkitsevät sitä, että kohdennetun esto PKD välittää anti-invasiivisen vaikutukset 1-NA-PP1. Sen sijaan, koska yli-ilmentyminen PKD1 ja PKD3 esti migraation PC3-soluja, emme voineet mitata merkittäviä muutoksia solujen vaeltamiseen in läsnä ollessa tai poissa ollessa 1-NA-PP1 käyttäen haavan paranemista määritystä (tuloksia ei ole esitetty). Vaihtoehtoisesti tutkimme migraatio DU145 soluihin käyttämällä siirtymisen kammioiden. Tuloksemme osoittivat, että yli-ilmentyminen PKD1 tai PKD3 esti solujen vaeltamiseen ja ei vaikuttanut estävää vaikutusta 1-NA-PP1 solujen maahanmuuttoa (Fig. S1).

Gatekeeper mutantti PKD1 on 12 kertaa enemmän herkkä inhibition 1-NA-PP1 in ehjien solujen

1-NA-PP1 on yksi C3-modifioitu analogit Src-perheen kinaasin estäjä PP1. Se kehitettiin ja käytettävä erittäin selektiivinen estäjä kanssa yhden numeron nanomolaarista IC

50s analogista herkkien (as) kinaaseja, jotka on suunniteltu kuljettamaan yhden aminohapposubstituution portinvartijan jäännös kinaasi aktiivisessa [25] , [27]. Kuitenkin mikromolaarinen 1-NA-PP1 ei estä tai vain heikosti estää villityypin kinaasien, mikä mahdollistaa inhibiittorin /as-kinaasin parin, jota käytetään lei- toimintoja ja viestinvälitystekniikoita kinaasien. Tämä kemikaali geneettistä lähestymistapaa on sovellettu onnistuneesti eri proteiinikinaasien [27], [31] – [36]. Niinpä arveltu, että teho ja selektiivisyys 1-NA-PP1 varten PKD voitaisiin tehostaa entisestään ottamalla käyttöön portinvartijana Aminohappomutaatiot. Kohdistus aktiivisen sekvenssin PKD isoformien johti tunnistamiseen portinvartija aminohapon, metioniinin 659 (M659), on PKD1 (Fig. 9A). Olemme myöhemmin syntyy kaksi tilaa luoda analogi-herkkä PKD1 mutantit a Flag-leimatun PKD1 (Flag-PKD1), nimittäin Flag-PKD1

M659G ja Flag-PKD1

M659A. Sen jälkeen kun yli-ilmentyminen in ehjien solujen (Fig. 9B), inhiboiva aktiivisuus 1-NA-PP1 arvioitiin esikäsittely inhibiittorin kanssa, jota seuraa PMA stimulointi, ja sen jälkeen immunoblottauksella PS

916-PKD1 kuin ennen (kuvio. 5). PKD1 ja tubuliinin blotattiin verrokkeina. Kuten on esitetty kuviossa. 9C, Flag-PKD1

M659G osoittivat merkittävästi lisääntynyt herkkyys 1-NA-PP1 verrattuna villityypin ohjaus. Perusteella densitometrian analyysiin, IC

50 villityypin Flag-PKD1 oli 26,50 ± 2,23 uM, kun taas IC

50 analogista herkkä Flag-PKD1

M659G oli 2,13 ± 0,61 uM, heijastaa 12-kertainen herkkyyden 1-NA-PP1. Sitä vastoin ei ollut merkittävää eroa inhibitio Flag-PKD1

M659A 1-NA-PP1 verrattuna villityypin Flag-PKD1 (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että M659A mutaatio ei pystynyt herkistää PKD1 inhibitioon 1-NA-PP1. Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että estävää aktiivisuutta 1-NA-PP1 varten PKD1 voitaisiin edelleen parantaa ottamalla käyttöön portinvartija mutaatio, mikä tarkoittaa, että 1-NA-PP1 voitaisiin pariksi analogia-herkkä PKD1

M659G määrittää PKD-toimintoja ja signaalireaktioteissä ehjien solujen.

A.Alignment ensisijaisen jaksot, jotka sisältävät portinvartija aminohappo PKD. Nuoli osoittaa konsensus portinvartija aminohappo ”Metioniini” (M) varjoisaan suorakulmio. B. ilmentyminen villin tyypin ja mutantti PKDs. HEK293-solut transfektoitiin villityypin ja kaksi portinvartija mutantteja Flag-PKD1 (Flag-PKD1

M659G ja Flag-PKD1

M659A). Kaksi päivää transfektion jälkeen solut lyysattiin ja suoritettiin Western-blottaus ja PKD1 ja tubuliinin (kuormituksen valvonta). C. 1-NA-PP1 pitoisuus riippuvalla esti PMA-indusoidun aktivoitumisen Flag-PKD1 ja Flag-PKD1

M659G. HEK293-solut, jotka on transfektoitu Flag-PKD1 ja Flag-PKD1

M659G pidettiin seerumin puutteessa 24 tunnin ajan ja esi-käsiteltiin 1-NA-PP1 on lisätä pitoisuudet seerumissa-väliaineessa 45 min, jota seurasi stimulaatio PMA 10 nM: ssa 20 min. Solut kerättiin ja alistettiin immunoblottauksella p-S

916-PKD1, PKD1, ja tubuliinia. Koe toistettiin kolme kertaa ja edustavat kuvat yhdestä kokeesta esitetään.

Keskustelu

PKDs tärkeitä rooleja monissa perustavaa laatua biologisia prosesseja ja edustavat uutta kehitteillä terapeuttinen kohde monissa patologisissa tiloissa ja sairaudet. Kuitenkin tarkka biologisen toiminnan PKD ei ole hyvin määritelty.