Krooninen sairaus

tiivistelmä

interleukiini (IL) -6 on osoitettu olevan merkittävä tekijä kasvun ja etenemisessä munasarjasyöpä. Sytokiini kykenee pro-tuumorigeenisia aktiivisuuden aktivoitumisen kautta useiden signalointipolkujen erityisesti signaalinmuuntajana ja aktivaattori transkription (STAT3) ja ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK) 1/2. Siten kohdistaminen IL-6 on tulossa yhä houkuttelevampi kuin hoitovaihtoehto munasarjasyöpä. Tässä, tutkimme vaikutuksia minosykliinin IL-6 ja sen signalointireittien munasarjasyövän.

In vitro

, minocycline todettiin olevan huomattavasti tukahduttaa sekä konstitutiivista että IL-1β tai 4-hydroxyestradiol (4-OH-E2) stimuloidut IL-6 ilmentymistä ihmisen munasarjasyöpäsoluja; OVCAR-3, SKOV-3 ja CAOV-3. Lisäksi minosykliinille alassäädetty kaksi pääosaa IL-6-reseptorin järjestelmä (IL-6Rα ja gp130) ja esti aktivointi STAT3 ja ERK1 /2 johtavia reittejä tukahduttaminen jatkojalostustuotteen MCL-1. Naisten kantavien nude-hiirten vatsaonteloon OVCAR-3 kasvaimia, akuutti anto (4 ja 24 h) minosykliinin (30 mg /kg) johti poistaminen IL-6. Jopa yksi annos minocycline oli tehokas merkittävästi alentaa plasman ja kasvaimen IL-6 tasoa. Tämän mukaisesti, kasvaimen ilmaus p-STAT3, p-ERK1 /2 ja MCL-1 määrä väheni minocycline saaneilla hiirillä. Arviointi toiminnallisen seuraus minocycline on metastaattinen aktiivisuus paljasti kapasiteettia minosykliinin estää solun muuttoliikettä, invaasio ja tarttuvuus liittyvät alassäätelyyn metalloproteinaasien (MMP) -2 ja 9. Siten tulokset viittaavat mahdollinen rooli minosykliinin tukahduttaa IL-6 ilmaisun ja toimintaa. Nämä vaikutukset saattavat osoittautua tärkeä ominaisuus tulevaa kliinisten kokeiden minosykliinin munasarjasyöpä.

Citation: Ataie-Kachoie P, Morris DL, Pourgholami MH (2013) Minocycline vaimentaa interleukiini-6, reseptoriinsa System ja signalointireitteihin ja heikentää Migration, invaasio ja Adhesion kapasiteetti munasarjasyöpäsoluja: In vitro ja in vivo -tutkimuksissa. PLoS ONE 8 (4): e60817. doi: 10,1371 /journal.pone.0060817

Editor: Chih-Xin Tang, Kiina Medical University, Taiwan

vastaanotettu: 28 marraskuu 2012; Hyväksytty: 03 maaliskuu 2013; Julkaistu: 08 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Ataie-Kachoie et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on erittäin tappava gynekologinen pahanlaatuisen joille yleinen ennuste on edelleen heikko viime vuosikymmeninä [1]. Selittää taustalla molekyylitason mekanismeja mukana kehittämässä tämän tappavan maligniteetin useita teorioita on ehdotettu tähän mennessä [1]. Vakuuttavia tietoja tukevat osallistumista tulehduksellinen strooman microenvironment aiheuttama yli-sytokiinien ja kemokiinien edistämisessä munasarjojen kasvainten synnyssä ja syövän etenemistä [2]. Erityisesti IL-6 tuotettu kasvain ja /tai aktivoida immuunisolujen on oletettu olevan keskeinen toiminnallinen sytokiinia, joka muuttaa kasvainsolut käyttäytymistä monimutkaisten mekanismien välityksellä [3]. IL-6 on ilmaistu primäärisistä ihmisen munasarjan pintaepiteelisolujen ja on havaittu täysin suurempi kasvainkudoksessa [4], plasma ja maligni askites munasarjasyövän potilailla [5]. IL-6 ilmentymisen munasarjakasvain microenvironment voi vaikuttaa isännän immuunipuolustuksen mekanismit sekä kasvainsolujen kasvua, lisääntymistä, erilaistumista ja angiogeneesiä [6]. Se aiheuttaa myös etäpesäkkeiden kautta ylössäätöä syöpäsolujen tarttuvuus ja hyökkäys kapasiteetti [7]. Lisäksi IL-6 vaikuttaa kliinisen taudin tila ja ennuste, jonka resistenssin perinteisiin hoitoihin [8], stimuloiva maligni askites muodostumista [9], ja houkutella oireita, kuten anoreksiaa, muuttunut energia-aineenvaihduntaa, väsymys ja anemia [10]. Viimeaikaiset tiedot näyttöä siitä, että saarto IL-6 voi tarjota lupaava terapeuttinen strategia hallinnan parantamiseksi munasarjasyöpäpotilaalle. Inhibitio IL-6 signalointi on todettu heikentävän kasvaimen kasvua ja apoptoottisten ja metastaattisen tapahtumien munasarjasyöpä potilaille. Se johti myös pitkäaikainen sairaus vakauttaminen, käänteinen chemoresistance ja vahvistetaan isännän immuniteetin potilailla, joilla solunsalpaajaresistentti uusiutuva munasarjasyöpä [3].

IL-6 välittää signaaleja vuorovaikutuksessa reseptorin monimutkainen koostuu ligandin aa sitova glykoproteiini nimeltään IL-6R ja signaalia välittävä komponentti gp130. On olemassa kahden tyyppisiä IL-6R, eli solukalvon IL-6-reseptorin (IL-6Rα), joilla on alhainen affiniteetti, joka muodostaa kompleksin gp130 sitoutumisen jälkeen IL-6 aloittaa solunsisäisen signaalin (klassinen signalointi), ja liukoinen IL-6-reseptorin (sIL-6R), joka sitoutuu IL-6 ja sitten kalvo-reseptorin β-ketju – gp130 johtaa signaalitransduktion (trans-signalointi) [11]. Signaalin transduktion IL-6 liittyy aktivaatio useita onkogeenisten reittejä. Erityisesti STAT3 fosforyloidaan ja aktivoituu vasteena IL-6. Fosforylaation jälkeen, STAT3 muodostaa dimeerin kanssa, joka sitten tumaan säädellä useiden geenien ekspression, joka johtaa induktion sarja tapahtumia, kuten kasvainsolujen kasvua, selviytymistä ja etäpesäkkeiden. Lisäksi STAT3, mitogeeni aktivoitu proteiini-kinaasien (MAPK) cascade aktivoituu myös vasteena IL-6, joka johtaa hyperfosforylaatiota useita proteiineja, mukaan lukien ERK1 /2, joka puolestaan ​​välittää transkriptiotekijöiden kanssa erilaisia ​​vaikutuksia kasvainsoluihin, mukaan lukien induktio selviytymisen, muuttoliikkeen ja hyökkäys valmiuksia [12].

Minocycline (7-dimetyyliamino-6-desoxytertracycline) on hyvin siedetty ja turvallinen antibiootti toisesta sukupolven tetrasykliiniperheen. Vieressä sen laaja-taajuuksien antibiootti aktiivisuus, minosykliini on myös tunnustettu anti inflammatoriset edustaja. Sitä käytetään kliinisesti hoidettaessa sairauksia, joilla on tulehduksellinen tausta, kuten akne [13], ja rakkulainen pemfigoidi [14]. Lisäksi, minosykliini on osoittautunut tehokkaaksi hoidettaessa autoimmuunisairauksia, kuten nivelreumaa [15] ja skleroderma [16]. Voimakas anti-inflammatorinen ja solujen modu toimintaa minosykliinin arvellaan välittyvän estämällä proinflammatoristen sytokiinien, kuten tuumorinekroositekijä α [17], ja IL-1β [18]; ja tukahduttaminen MMP [19]. Erityisen kiinnostavia ovat tietoja, joiden tukahduttaminen IL-6 minocycline monosyyteissä [20] ja keskushermoston asukas tai infiltroituvat solut [21]. Tämä estävä vaikutus on myös raportoitu, että IL-6 aalto havaittiin neuropaattista kipua [22]. Kokeelliset tiedot käyttämällä erilaisia ​​sinoomasolulinjoja ja eläinmalleissa on myös osoittanut, että minosykliinille ja useita muita tetrasykliinit ja niiden kemiallisesti muunnetut johdannaiset voivat estää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden tukahduttamalla matriksin metalloproteinaasien ja suora vaikutus soluproliferaatioon. Antituumorivaikutukset näistä aineista on tähän mennessä osoitettu prekliinisissä malleissa leukemia [23], melanooma [24], munuaisten, eturauhasen [25] ja rintasyövän [26]. Tämän mukaisesti olemme äskettäin ilmoittaneet alustavat tulokset osoittavat, että minocycline estää kasvua ihmisen munasarjasyövän ksenografteja [27], [28] ja myös tukahduttaa munasarjasyövän aiheuttama maligni askites muodostumisen [28]. Tunnustaminen näiden ominaisuuksien ohella suotuisa farmakologinen ja fysikaalis-profiilin minocycline kuten korkea lipofiilisten omaisuus, täydellinen suullinen imeytyminen [29], on pitkä puoliintumisaika, kliinisesti halutut farmakokineettiset ominaisuudet [30] ja hyvä turvallisuusprofiili (keskiarvo siedetty annos suun kautta 400 mg /vrk) [31] johti meidät suunnittelemaan nykyistä tutkimuksen profiloida tämän lääkkeen suhteen sen vaikutuksia IL-6 ja IL-6 signalointireittien munasarjasyövän. Tässä esitämme

in vitro

tulokset osoittavat kykyä minosykliinin vähentää sekä konstitutiivista ja stimuloi (joko IL-1 SS tai 4-OH-E2) IL-6 ilmentymistä munasarjasyöpäsoluja. Lisäksi olemme osoittaneet, että minosykliinin estää IL-6-reseptorin järjestelmä (IL-6R: n ja gp130), signalointireittejä (STAT3 ja ERK1 /2) sekä alavirran kohde MCL-1 näissä soluissa. Lisäksi olemme osoittaneet, että minosykliinin häiritsee metastaattisen potentiaalin munasarjasyövän soluja, jotka oli liitetty tukahduttaminen MMP-2 ja MMP-9. Tämän jälkeen meidän

in vivo

-pohjainen tutkimus paljastaa ensimmäistä kertaa vaikutukset minosykliinille vähentää sekä plasman ja kasvainten IL-6 lauseke yhdessä alas-säätely kasvaimen p-STAT3, p-ERK1 /2 ja MCL-1 kokeellisessa mallissa munasarjasyövän hiirillä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläin töitä on tehty mukaan University of New South Wales Animal Care ja eettisen komitean (ACEC) ohjeet. Kaikki toimenpiteet suoritettiin hiirillä oli tiukasti protokollan mukaisesti hyväksymän ACEC (hyväksynnän numero: 9 /23B) ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Kemikaalit ja vasta-

Ellei toisin totesi, kaikki lääkkeet ja kemikaalit, joita käytetään tässä tutkimuksessa saatiin Sigma-Aldrich (Australian tytäryhtiö, Sydney, Australia). Seuraavat ensisijainen vasta-aineita käytetään tässä tutkimuksessa: kanin polyklonaalisia vasta-aineita spesifisiä IL-6Rα, gp130, Tyr

705-p-STAT3, STAT3, Mcl-1, p-p44 /42 MAPK (p-ERK1 /2) , p44 /42 MAPK (ERK1 /2) (Cell Signaling Technology, Sydney, Australia), MMP-2 ja MMP-9 (Santa Cruz, Sydney, Australia) ja hiiren monoklonaalisia anti-β-aktiini (R OVCAR-3, SKOV-3 ja CAOV-3-soluja, jotka on saatu American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Soluja ylläpidettiin RPMI 1640 -elatusaineessa, jossa oli 2 mM L-glutamiinia, 2 g /l natriumbikarbonaattia, 4,5 g /l glukoosia, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaattia (Invitrogen, Sydney, Australia), jota oli täydennetty 10% lämmön avulla inaktivoitua sikiövasikan seerumia (FBS) ja penisilliini-streptomysiiniä (50 U /ml) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO2.

in vivo

Kokeet

nainen nude kateenkorvattomissa Balb C nu /nu -hiirten (6 viikkoa) hankittiin yhtiöstä Biological Resources (lääketieteellinen tiedekunta, University of New South Wales). Hiiret majoitettiin ja ylläpidetään laminaarisen virtauksen kaappien erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa tiloissa hyväksymiä University of New South Wales Animal Care ja eettisen komitean (ACEC). Kaikki toimenpiteet suoritettiin hiirillä oli tiukasti protokollan mukaisesti hyväksymän ACEC (hyväksynnän numero: 9 /23B) ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Lyhyesti, 10 x 10

6 log-vaiheen kasvava OVCAR-3 soluja suspendoitiin 0,5 ml: aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) ruiskutettiin intraperitoneaalisesti (i.p.) ja kullekin hiirelle. Päivänä 28 soluinokulaation jälkeen, hiiret satunnaistettiin yhteen hoitoon tai kontrolliryhmiin. Minocycline liuotettiin steriiliin normaaliin suolaliuokseen (0,6 mg /ml). -Hiiriin ruiskutettiin i.p. yhden annoksen minosykliinin (30 mg /kg). Kontrolliryhmä sai steriiliä normaalia suolaliuosta sijaan. Lopussa hoitojakson (4 tai 24 h), veri kerättiin sydänpunktiolla, eläimet tapettiin käyttämällä Lethabarb R (100 mg /kg) i.p. injektio (VIRBAC, Sydney, Australia) ja kasvaimia välittömästi leikeltiin ja sitä säilytetään -80 ° C: ssa western blot analyysiä.

Immunosytokemia Värjäys

Solut ympättiin steriloitu lasipeitelevyihin. Sitten niitä käsiteltiin minocycline 24 tuntia, pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 100 ui per dia, jäähdytettiin 95% etanolia, 5% jääetikkaa 10 minuutin ajan. Kiinteä jälkeen solut pestiin ja niitä inkuboitiin 0,3% Tween 20: ssa 20 minuutin ajan, pestiin PBS: llä, blokattiin 1% BSA: ta, inkuboitiin primaaristen vasta-aineiden 1% BSA seurasi Alexafluor-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita, 1% BSA: ta. Solutumat värjättiin propidiumjodidilla (PI) (1:2000 laimennos) 1 minuutin ajan, ennen kuin peitelasit asetettiin lasilevyille käyttäen glyserolia, ja analysoitiin proteiinin ilmentymisen käyttäen Olympus IX71 pyyhkäisymikroskoopilla 60 x öljyssä linssi.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) IL-6

in vitro

, solut ympättiin 6-kuoppalevyille 10% FBS: ssa 24 tuntia loppuun kiinnityksen . Sitten ne joko stimuloitiin IL-1β (10 ng /ml) tai 4-OH-E2 (50 ug /ml) tai ei-stimuloitujen tai ilman esikäsittelyä minosykliinillä. IL-6 tuotettu elatusaine mittaamaan IL-6: lle spesifisellä ELISAlla mukainen pakkaus valmistajan ohjeiden (Biolegend Inc., San Diego, CA). Liitteenä solut laskettiin normalisoida IL-6 pitoisuudet vastaan ​​solujen määrän. Kvantitatiivinen määritys IL-6 pitoisuus plasmassa

in vivo

tutkimuksessa suoritettiin myös käyttäen samaa ELISA-pakkausta.

Western Blot analyysi

vaikutuksen tutkimiseksi minosykliinille solu- ilmentymisen gp130, IL-6Rα, p-STAT3, STAT3, Mcl-1, p-ERK, ERK, MMP-2 ja MMP-9, western blot -analyysi suoritettiin standardimenetelmän mukaisesti. Lyhyesti, solut pestiin jääkylmällä PBS: llä ja uutettiin 30 minuutin ajan puskurissa, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 140 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM NaN3, 1% Triton X-100, 1% NP -40, 1 mM EGTA, 10% fosfataasinestäjällä ja proteaasiestäjäseostabletit. Lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla 13000 x

g

30 min ja proteiinin konsentraatiot määritettiin käyttämällä Bio-punainen proteiinimäärityksellä. Yhtä suuret määrät kokosolu-uutteet erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (Millipore Corporation, MA, USA). Sitten membraanit tutkittiin spesifisten vasta-aineiden. Immuuni-kompleksit detektoitiin käyttämällä piparjuuren peroksidaasiin konjugoitu joko anti-hiiri- tai anti-kani seuraa kemiluminesenssidetektiolla (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA, USA). Osoittaakseen yhtäläinen proteiini lastaus, blotit stripattiin ja uudelleenseulottiin tietyn tunnistavaa vasta-ainetta β-aktiini.

TranswellTM Migration ja invaasiomääritys

Solun maahanmuutto- ja invaasion määritettiin käyttämällä 24-kuoppaista Transwell järjestelmä polykarbonaattia kalvoja 8 mm huokoskoko (Life Technologies, Vic, Australia). Lyhyesti, 1 x 10

3-soluja siirrostettiin 0,1% BSA RPMI sisältävät vaihtelevia pitoisuuden minocycline ylemmässä kammiossa (normaali kammion migraatiokokeessa ja Matrigel päällystetty kammiossa invaasiomääritys). Alempi kammio täytettiin samalla alustalla, joka sisälsi 1% FBS: ää. Kun oli inkuboitu 18 tuntia 37 ° C: ssa, solut ylemmässä kammiossa poistettiin varovasti pumpulipuikolla ja soluja, jotka olivat kulkeneet kääntää kasvot kalvon kiinnitettiin metanolissa, värjättiin Giemsa ratkaisu. Kullekin rinnakkaisnäytettä (n = 3), muuttoliike tai invaasion solujen kvantifioitiin laskemalla värjättyjen solujen (solua viidellä) alla käännettyä mikroskooppia.

Soluadheesiokoe

määritys oli suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu vähäisin muutoksin [32]. Lyhyesti, SKOV-3-soluja kasvatettiin 70% konfluenssiin, seerumin köyhdytettyä, ja sitten käsiteltiin vaihtelevilla pitoisuuksilla minosykliinistä (0-100 uM) 18 tunnin ajan. Solut poistettiin käyttäen ei-entsymaattista irtoaminen liuos, pestiin kahdesti, uudelleensuspendoitiin RPMI ilman seerumia, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia minosykliinin (0-100 uM), ja maljattiin tiheydellä 1 x 10

4 solua /kuoppa 96-kuoppaisille levyille päällystetyn kollageeni IV. 30 min inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, väliaine poistettiin, ja levyt pestiin kahdesti PBS: ssä. Sitten solut kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla liuos, varovasti pestiin 3 kertaa PBS: llä, ja kristallivioletti-liuottaa käyttämällä etikkahappo /metanoli /vettä (10:30:60), ja absorbanssi luettiin 595 nm: ssä.

tilastollinen analyysi

Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin kanssa Graph Pad Prism-ohjelmiston versio 5.0 (CA, USA). Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. Opiskelija

t

-testi käytettiin vertaamaan kahden riippumattoman ryhmää tarkoittaa. Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) käytettiin määrittämään tilastollisia eroja enemmän kuin kaksi ryhmää, ja kaksisuuntainen toistettujen mittausten ANOVA käytettiin arvioimaan ajan ja hoidon vuorovaikutuksen vaikutukset riippuva muuttuja IL-6; merkittävä vuorovaikutus tulkitsi myöhemmin yksinkertainen vaikutusten analyysi Bonferroni korjaus. Tilastollinen merkitsevyys perustettiin

p

0,05 tasolla.

Tulokset

Minocycline Vähentää ilmentämällä IL-6 munasarjasyöpäsoluja

vaikutuksen tutkimiseksi minosykliinin IL-6 ilmentymistä munasarjasyöpäsoluja, immunofluoresoiva värjäys suoritettiin 24 tunnin kuluttua hoidon OVCAR-3 (alhainen IL-6 ekspressiota), SKOV-3 (keskipitkän IL-6 ilmentyminen), ja CAOV -3 (korkea IL-6 lauseke) solulinjat minosykliinillä (100 uM). Tulokset osoittivat, että minosykliini vähensi IL-6 kaikissa kolmessa munasarjasyövän solulinjoissa (Fig. 1). Määrällisesti Tätä ELISA-määritystä käytettiin määrittämään IL-6-tasot soluviljelyalustoissa uimisen OVCAR-3, SKOV-3 ja CAOV-3-soluja käsiteltiin minosykliini (100 uM) ja 1, 2, 4, 6 ja 24 h. Kuten on esitetty kuviossa. 2, sillä OVCAR-3-solujen IL-6 ei ollut havaittavissa alustassa. Kuitenkin minocycline hoito johti ajasta riippuva väheneminen IL-6 ilmentymistä sekä SKOV-3 ja CAOV-3-soluissa, jotka oli merkitsevä 6 h alennusprosentin vertailuryhmään nähden: 55 ± 5% SKOV-3 (p 0,001 ), ja 25 ± 4,5% CAOV-3 (p 0,05); ja 24 h alennusprosentin vertailuryhmään nähden: 60 ± 7% SKOV-3 (p 0,001) ja 35 ± 3,5% CAOV-3 (p 0,001).

edustaja konfokaali kuvia IL 6 (vihreä) in OVCAR-3, SKOV-3 ja CAOV-3-solujen kontrolloiduissa olosuhteissa ja altistetaan minosykliinin (100 uM) 24 tuntia. Solut värjättiin myös propidiumjodidilla (punainen). Kuvat saatiin 60-kertainen suurennus. Asteikko pylväät edustavat 20 um.

Minocycline (100 uM) väheni IL-6 ekspressiota SKOV-3 ja CAOV-3 solujen ajasta riippuva kuvio analysoituna ELISA: lla. Esitetyt arvot ovat keskiarvoja ± SD tietojen kolmen erillisen kokeen (*

p

0,05 ja ***

p

0,001

vs.

Kontrolliryhmä) .

Minocycline Blocks IL-6 Surge munasarjasyöpäsoluja stimuloidaan IL-1β tai 4-OH-E2

IL-1β indusoi IL-6 ihmisen soluihin [33]. On osoitettu, että sekä normaalissa että pahanlaatuisten munasarjan epiteelin solut yhdessä aktivoidun immuunisolujen stroomassa tuottaa IL-1β. Lisäksi konstitutiivinen tuotanto IL-1β, jonka munasarjakarsinoomasolut stimuloi sytokiinien, kuten IL-6 [34]. Simuloida mitä tapahtuu munasarjakasvainten, käytimme IL-1β (10 ng /ml), joilla IL-6 ilmentymistä munasarjasyöpäsoluja ja jälkeen tutkittiin minosykliinille voi estää nousun IL-6 ilme. Käyttämällä tavanomaista ELISA kit, IL-6 pitoisuudet tiedotusvälineissä OVCAR-3, SKOV-3 ja CAOV-3 mitattiin eri ajankohtina stimulaation jälkeen IL-1β. Havaittiin, että IL-6-pitoisuus kasvoi ajan riippuvalla tavalla, kun läsnä oli IL-1β median uimisen kaikki kolme solulinjoissa. Suurin kasvu havaittiin 6 h prosentuaalinen kasvu suhteessa valvontaan 335 ± 15% OVCAR-3 (p 0,001), 110 ± 6% SKOV-3 ja 90 ± 5% CAOV-3 (p 0,01); ja 24 h prosenttiosuuden korotus suhteessa valvontaan 940 ± 13% OVCAR-3, 185 ± 7,8% SKOV-3 ja 100 ± 5,4% CAOV-3 (p 0,001) (Kuva. 3A). Esikäsittely IL-1β-stimuloitujen solujen minosykliinillä (100 uM) johti merkitsevän eston IL-6 aalto 6 h (prosentuaalinen lasku suhteessa IL-1β stimuloitujen ryhmä: 40 ± 7,3% ja OVCAR-3, 50 ± 4,5 % for SKOV-3 ja 35 ± 6,2% CAOV-3, p 0,05); ja 24 h (inhibitioprosentti verrattuna IL-1β stimuloitujen ryhmä: 50 ± 3,8% ja OVCAR-3, 50 ± 2,5%: SKOV-3 ja 30 ± 5% CAOV-3, p 0,001). Edelleen vahvistavat IL-6-tuotannon moduloiva vaikutus minosykliinin, vaikutus lääkkeen tutkittiin 4-OH-E2-käsiteltyjen munasarjasyöpäsoluja. On hyvin dokumentoitu, että steroidihormonien, erityisesti estrogeenit voivat moduloida sytokiinituotannossa induktion kautta IL-1β-geenin transkription tasolla [35]. 4-OH-E2 on katekoli metaboliitti 17β-estradioli, joka on biologisesti aktiivinen munasarjojen estrogeenin. Vuonna munasarjasyöpäsoluja, 4-OH-E2 on voimakas mitogeeninen ainetta [36], joka indusoi muita kasvutekijöitä ja karsinogeeninen reittejä [37]. Tässä, OVCAR-3, SKOV-3 ja CAOV-3-soluja käsiteltiin 4-OH-E2 (50 ug /ml) ja IL-6 konsentraatio mitattiin soluviljelyalustoissa kuluttua 6 ja 24 tuntia. Sillä OVCAR-3-solujen IL-6 ei ollut havaittavissa alustassa jopa 24 tunnin kuluessa 4-OH-E2 hoitoa. Kuitenkin 4-OH-E2-hoito johti merkittävään kasvuun IL-6 pitoisuudet sekä SKOV-3 ja CAOV-3-solujen mediaa 6 h (5 ja 12-kertainen lisäys SKOV-3 ja CAOV-3, vastaavasti) ( p 0,001); ja 24 h (6 ja 3-kertainen lisäys SKOV-3 ja CAOV-3, vastaavasti) (p 0,01) (Fig. 3B). Kuten on esitetty kuviossa. 3B, minosykliini esikäsittely 4-OH-E2-stimuloiduissa soluissa johti konsentraatiosta riippuvaisen eston IL-6 ekspressiota. Pitoisuudella 100 uM minosykliinin esti täydellisesti IL-6 aalto indusoi 4-OH-E2 sekä SKOV-3 ja CAOV-3-solulinjojen.

(A) OVCAR-3, SKOV-3 ja CAOV -3-soluja esikäsiteltiin minosykliini (100 uM) ja sen jälkeen stimulaation IL-1β (10 ng /ml) eri ajankohtina. Tasot IL-6 viljelyalustassa kvantitoitiin sandwich-ELISA: lla. Kukin Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (*

p

0,05, **

p

0,01 ja ***

p

0,001

vs.

Kontrolliryhmään,

# p 0,05 ja

###

p

0,01

vs.

IL-1β-stimuloidun ryhmä). (B) OVCAR-3, SKOV-3 ja CAOV-3-soluja esikäsiteltiin 1 tunnin ajan vaihtelevilla minosykliinin (0-100 uM) ja sen jälkeen stimulaation 4-OH-E2 (50 ug /ml) ja 6 ja 24 h. Media kerättiin ja IL-6-taso analysoitiin ELISA: lla. Esitetyt arvot ovat keskiarvoja ± SD tietojen kolmen erillisen kokeen (*

p

0,05, **

p

0,01 ja ***

p

0,05 ja **

p

0,01

vs.

säätökennoja,

#

p

0,05 ja

##

p

0,01

vs.

IL-1β käsitellyt solut).

Influence of Minocycline on STAT3 ja ERK1 /2: n fosforylaatio ja Mcl-1 Expression IL-1β stimuloidun ja ei-stimuloiduissa munasarjasyöpäsoluja

tutkia minosykliinille estää STST3 fosforylaatio munasarjasyöpä, SKOV-3-solut ilmentävät pysyvästi aktivoitu STST3 hoidettiin minosykliinille tai ilman IL-1β stimulaatio, eri ajankohtina. Havaittiin, että minocycline hoito johti alas-säätely pohjapinta p-STAT3 in ajasta riippuva tavalla suurin estävä vaikutus tapahtuvat 6 h (2,5-kertainen pieneneminen verrattuna kontrolliin, p 0,01). IL-1β stimulaation sääteli fosforylaation STAT3 aikariippuvainen kanssa korotuksen enimmäismäärä 6 h (2,5-kertainen kasvu kontrolliin verrattuna). Esikäsittely IL-1β stimuloiduista minosykliinillä esti STAT3 fosforylaatiomallissa optimaalinen vaikutus 6 h (5-kertainen pieneneminen verrattuna IL-1β stimuloimaa ryhmä, p 0,001). Kuitenkin tämä vaikutus oli palautuva ja tasot p-STAT3 palasivat hallitsemaan tasolle 24 tunnin jälkeen hoidon. Mitään merkittäviä muutoksia ei havaittu yhteensä STAT3 tasolla (Kuva. 5A).

SKOV-3-soluja käsiteltiin minocycline (100 uM) kanssa tai ilman IL-1β (10 ng /ml) edistetään eri ajankohtina . Ilmentymistasojen (A) p-STAT3, STAT3; (B) Mcl-1 tai (C) p-ERK1 /2, ERK1 /2 arvioitiin Western blot -analyysillä. Densitometri-analyysi ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD voimakkuus optisen tiheyden, joka saadaan kolmen erillisen kokeen (*

p

0,05, **

p

0,01 ja ***

p

0,001

vs.

säätökennoja,

#

p

0,05,

##

p

0,01

vs.

IL-1β käsitellyt solut).

MCL-1 on apoptoosia estävä proteiini alavirtaan IL-6 /STAT-3-reitin. Meillä on siis arvioitiin vaikutusta minosykliinille on Mcl-1 in SKOV-3-soluissa sekä tavanomaisissa ja IL-1β-stimuloiduissa olosuhteissa. Stimuloimattomissa SKOV-3-soluissa, minocycline hoito johti alas-säätely Mcl-1 proteiinia alkaen 2 h (1,5-kertainen pieneneminen verrattuna kontrolliin, p 0,05) kanssa maksimaalisen eston 6 h (3-kertainen pieneneminen verrattuna ohjaus, p 0,01). Mutta lopulta proteiinin palasivat normaaliin valvonnan arvoa 24 h. Hoito IL-1β-stimuloiduissa soluissa johti myös ajasta riippuva estovaikutus Mcl-1-proteiini, jossa maksimaalisen eston voitiin havaita 24 h (6-kertainen pieneneminen verrattuna IL-1β-stimuloitu, p 0,01) ( kuva 5B).

yrittää selvittää, onko minosykliinin estää MAPK-reitin vaikutuksia minosykliinin fosforylaation ERK1 /2 normaaleissa ja IL-1β indusoiman SKOV-3-soluja tutkittiin. Kuten on esitetty kuviossa. 5C, ei havaittu merkittäviä muutoksia p-ERK1 /2-proteiinin tasot ei-stimuloitujen solujen jälkeen minosykliinille hoidon. IL-1β stimulaation lisääntynyt phorphorylation ERK1 /2 ajoissa. Hoito minosykliinillä ennen IL-1β stimulaation dramaattisesti tukahdutti fosforylaatiota ERK1 /2 2 h (8-kertainen pieneneminen verrattuna IL-1β stimuloimaa ryhmä, p 0,01). Kuitenkin p-ERK1 /2-proteiinin palasivat normaaliin säätöarvot 24 h. Minocycline käsittely ei muuttanut ilmaisee yleisesti ERK1 /2-proteiinin.

Minocycline Estää translokaatio STAT3 tumaan

jälkeen fosforylaatiota sytoplasmassa, STAT3 siirtyy tumaan tehdä sen transkription aktiivisuutta. Täällä, käytimme immunofluoresenssivärjäyksessä konfokaalimikroskopia vasta-aineilla, jotka sitoutuvat spesifisesti p-STAT3 (Tyr 705) tai koko STST3 Vahvista minosykliinille estää fosforylaatiota ja ydinvoiman translokaation STAT3. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, minosykliinille (100 uM) käsittely tukahdutettu fosforylaatio STST3 in Skov-3-solut, jotka on mukaisesti western blot -analyysin tuloksia. Lisäksi tumaansiirtymiseen ja STAT3 estyi altistuneiden solujen minosykliinin (100 uM) (Fig. 6B).

konfokaali immunosytokemialla (A) p-STAT3 ja (B) STAT3 (vihreä) in SKOV-3 soluja käsiteltiin 100 uM minocycline verrattuna kontrolli soluihin. Ytimet vastavärjätään propidiumjodidilla (punainen). Kuvat saatiin 60-kertainen suurennus. Asteikko palkit edustavat 10 pm.

Minocycline vaimentaa munasarjasyöpäsolu Metastaattinen Mahdollinen joka liittyy Vähentynyt MMP-2 ja MMP-9 Expression

IL-6 vaikuttaa munasarjasyöpä etäpesäkkeiden kautta monimutkainen monivaiheinen prosessi tarttumista, muuttoliike ja hyökkäys syöpäsolujen [7]. Me seuraavaksi suoritetaan Boyden kammioita solujen migraatiokokeessa ja Matrigel invaasiomääritys onko minosykliinille indusoi IL-6 tukahduttaminen johtaa eston SKOV-3-soluissa metastaattinen aktiivisuus. Hoidon minosykliinille (18 h) vaimensi merkittävästi siirtyminen (Fig. 7A) ja invaasion (Fig. 7B) kyky SKOV-3-soluja annoksesta riippuvaisella tavalla. Lisäksi minosykliinille esti kapasiteettia SKOV-3 solujen kiinni kuoppiin päällystetty ihmisen kollageenin tyyppi IV annosvasteisesti (Fig. 7D).

Vaikutukset minocycline SKOV-3 (A) solujen vaeltamiseen ja (B) invaasio mitattiin Transwell määrityksessä. Minocycline käytettiin eri pitoisuuksina (0-100 uM) 18 tunnin ajan. (C) Expression of MMP-2 ja MMP-9 arvioitiin Western blot -analyysillä sen jälkeen, kun 18 h hoito SKOV-3-soluja vaihtelevalla pitoisuus minosykliinin. (D) Soluadheesio seuraavat 18 tuntia altistuksen vaihtelevia pitoisuuksia minocycline kuvatun Materiaalit ja menetelmät (*

p

0,05, **

p

0,01 ja ***

p

0,001

vs.

kontrolli).

Expression of MMP, erityisesti MMP-2 ja MMP-9, voi edistää solujen vaeltamiseen ja hyökkäystä valikoiva proteolyysin soluväliainekomponentteja [38]. Tutkimaan vaikutusta minosykliinin on MMP aktiivisuuden munasarjasyöpäsoluja, olemme analysoineet MMP-2 ja MMP-9: SKOV-3-soluja käsittelyn jälkeen vaihtelevilla minosykliinin 18 tuntia. Kuten on esitetty kuviossa. 7C, minosykliini laski sekä MMP-2 ja MMP-9 ilmentymisen annosvasteisesti. Nämä tiedot viittaavat siihen, että esto metastaattisen potentiaalin munasarjojen syöpäsolujen minosykliini liittyy pienentynyt MMP-2 ja MMP-9 ilmaisun.

Minocycline Estää IL-6 kokeellisessa mallissa munasarjasyövän Hiiret

kyky minosykliinin estää IL-6 ja sen reittejä munasarjasyöpäsoluja

in vitro

oli hyvä osoitus siitä, että sillä on potentiaalia vaikuttaa IL-6 tasoa

in vivo

. Täällä, havaitsimme, että yhden annoksen minocycline hoito johti huomattavasti vähentää plasman (Fig. 8A) ja kasvaimen (Fig. 8B) IL-6 tasoa jälkeen sekä 4 ja 24 tuntia. Lisäksi kasvainten ilmauksia p-STAT3 ja MCL-1 merkittävästi estyy 4 ja 24 tuntia hoidon näytteitä. Estyminen ERK1 /2 aktivaatio havaittiin 4 h kasvaimen näytteitä, jotka sopusoinnussa

in vitro

tuloksiin, näyttää talteen 24 h (Fig. 8B).

( A) IL-6-tasot määritettiin ELISA: lla plasmassa hiirten, jotka kantoivat ip