Krooninen sairaus

tiivistelmä

Genistein on osoitettu tukahduttaa kasvua useiden syöpien mukauttamisella eri reittejä. Kuitenkin vaikutukset genisteiinin sääntelystä onkogeenisten mikroRNA-151 (miR-151) ei ole raportoitu. Tässä tutkimuksessa me tutkimme, genistein voisi muuttaa ekspression onkogeenisten miR-151 ja sen kohde-geenejä, jotka osallistuvat etenemisen ja etäpesäkkeiden eturauhassyövän (PCa). Reaaliaikainen RT-PCR osoitti, että ilmentyminen miR-151 oli korkeampi PC3 ja DU145 soluja verrattuna RWPE-1-soluissa. Hoito PC3 ja DU145 solujen 25pM genisteiini- alassäädetty ilmentymistä miR-151 verrattuna ajoneuvon hallinnan. Esto miR-151 PCA soluissa Genistein esti merkitsevästi solujen vaeltamiseen ja invaasiota.

In silico

analyysi osoitti, että useat geenit (CASZ1, IL1RAPL1, SOX17, N4BP1 ja ARHGDIA) ehdotti, että tuumoria tukahduttavan tehtävät olivat kohdegeenien miR-151. Lusiferaasireporttiterilla analyysit osoittivat, että miR-151 suoraan sitoutuu tiettyyn sivustoja 3’UTR kohdegeenien. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti, että mRNA-ekspressiotasot viiden kohdegeenien PC3 ja DU145 oli merkittävästi muuttunut miR-151 jäljittelee ja estäjä. Kaplan-Meier käyrät ja log-rank testit paljastivat, että korkeat ekspressiotasot miR-151 oli kielteinen vaikutus eloonjäämisaste. Tämä tutkimus viittaa siihen, että genistein välitteinen tukahduttaminen onkogeenisten miRNA voi olla tärkeä ravinnon terapeuttinen strategia hoitoa varten PCa.

Citation: Chiyomaru T, Yamamura S, Zaman MS, Majid S, Deng G, Shahryari V, et al. (2012) Genistein vaimentaa Eturauhassyöpä Kasvua esto onkogeeninen MicroRNA-151. PLoS ONE 7 (8): e43812. doi: 10,1371 /journal.pone.0043812

Editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 26 heinäkuu 2012; Julkaistu: 23 elokuu 2012

Copyright: © Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Center for Research Resources National Institutes of Health kautta lupanumeroita R01CA160079, R01CA138642, T32DK007790 ja VA Merit Review ja VA Program Project. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yksi yleisimmistä pahanlaatuisten kasvainten miehillä ja sijalla toinen keuhkosyövän syöpään liittyvien kuolemien [1]. Sen jälkeen androgeenipuutteen hoito. Eturauhassyövän voi useimmat uusiutua kuin androgeenista riippumaton, etäpesäkkeitä, joka johtaa kuolemaan useita vuosia [2]. Tällä hetkellä ei ole tehokasta hoidot ovat käytettävissä paranna androgeenista riippumaton PCa. Näin uudet ennustetekijöitä markkereita ja tehokkaampien hoitomenetelmien kehittäminen kiireellisesti.

MikroRNA (miRNA) ovat luokan pieniä ei-koodaavan RNA on noin 22 nukleotidin, jotka säätelevät geeniekspression translationaalisen tukahduttamisen ja mRNA pilkkominen [3]. Bioinformatiikan osoittavat, että miRNA säädellä 60%, proteiinia koodaavan geenien [4]. Tällä hetkellä 1527 ihmisen miRNA on rekisteröity miRBase tietokannassa (https://microrna.sanger.ac.uk/). miRNA ovat mukana erilaisissa biologisissa prosesseissa, mukaan lukien metabolia, kehityksen ja erilaistumisen, sekä edistää eri syöpätyyppien [5]. Monet ihmisen syövissä on poikkeava ekspressio miRNA, joka voi toimia joko tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien [6].

(A) Expression profiili miR-151 PCa solulinjoissa (LNCaP, DU145 ja PC3) ja normaalissa eturauhasen epiteelisolut (RWPE-1). Reaaliaikainen PCR osoitti, että ekspressiotasot miR-151 oli säädelty vahvistavasti androgeeni-riippumaton PCa solulinjoissa (DU145 ja PC3). miR-151-ekspressio normalisoitu RNU48. Data esitetään keskiarvoina ± SE. (B) Expression tasot miR-151-hoidon jälkeen genisteiini- (25 uM). miR-151 ilmentyminen havaittiin alennetaan 15-45% vuonna genisteiini käsitellyissä soluissa. *, P 0,05.

miR-151 on kartoitettu kromosomin 8q. Jonka on havaittu olevan usein monistaa useilla syöpiä, kuten virtsarakon, munuaisten, eturauhasen, rinta-, keuhko-, maha- ja peräsuolisyöpä [7] – [13]. Olemme aiemmin osoittaneet, että kromosomaalisen voitto lokuksen 8q24.3, jossa onkogeenisiä LY6K-geeni, voi olla ratkaiseva rooli virtsarakon syövän kehitykseen [7]. Yksi paperi osoitti, että kopiomäärä vahvistus miR-151 geenin 8q24.3 PCA korreloi etäpesäkkeitä [14].

Genistein (4 ’, 5,7-Trihydroxyisoflavone), merkittävä isoflavone ainesosana soija ja soijaa, on osoitettu olevan tehokas syövän vaikutukset PCa [15], [16]. Epidemiologiset todisteet osoittavat, että esiintyvyys ja kuolleisuus Eturauhassyövän ovat huomattavasti alempi Aasiassa kuin Yhdysvalloissa [17]. Keskimääräinen pitoisuus seerumissa genisteiiniä Aasian miehillä oli korkeampi kuin Yhdysvaltain väestöstä [18], ja useat tutkimukset ovat osoittaneet, että isoflavonin saanti oli liittynyt väheneminen PCa riskiä [19] – [22]. Genistein on useita molekyylikohteista lukien reseptorit, entsyymit, ja signalointireitteihin [15]. Genisteiini on myös osoitettu tukahduttaa kasvua useiden syöpäsolulinjojen

in vitro

ja

in vivo

, vähentää ilmentymistä useita onkogeenisten miRNA. Tähän mennessä vaikutukset genisteiini sääntelystä miR-151 ei ole raportoitu. Siksi tässä tutkimuksessa, tutkimme genistein voisi muuttaa ilmaus miR-151 ja sen tavoite geenien etenemisen ja etäpesäkkeiden Eturauhassyövän.

(A) knockdovvn miR-151a-5p merkittävästi estyy solujen vaeltamiseen. Transfektion jälkeen (48 tuntia), haavan muodostettiin kaapimalla ja haava mitattiin 24 tunnin kuluttua. Edustavat kuvat haavan paranemisen määrityksen näkyvät x200 suurennuksella. **, P 0,0001 (B) knockdovvn miR-151a-5p merkittävästi vähentynyt soluinvaasiota. Edustavat kuvat invaasiomääritys näkyvät x200 suurennuksella. **, P 0,0001.

Tulokset

miR-151 on säädelty PCA ja Genistein hoito Laskua miR-151

määrittämiseksi suhteelliset ekspressiotasot Mir-151 PCa soluissa, teimme TaqMan kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysi käyttäen androgeeniriippuvaisissa (LNCaP) ja androgeenista riippumaton (PC3, DU145) solulinjat, ja verrataan näitä normaalia eturauhasen epiteelisolujen (RWPE-1). miR-151 koostuu kahdesta kypsän miRNA; miR-151a-5p ja miR-151a-3p (miRBase). Havaitsimme, että miR-151: n ilmentyminen oli selvästi säädellään ylöspäin androgeenistä riippumaton PCa solulinjoissa verrattuna RWPE-1-soluja (miR-151a-5p, PC3 4,02-kertainen, DU145 1,36-kertainen) (miR-151a-3p; PC3 5.14-kertainen, DU145 2,25-kertainen) (Fig. 1A).

Genistein hoito merkitsevästi alassäädetty suhteellisen ilmentymistason miR-151 verrattuna ajoneuvon ohjaus (miR-151a-5p; PC3 15% vähennys , DU145 14% vähennys) (miR-151a-3p; PC3 44%: n lasku, DU145 32% vähennys) (Fig. 1 B).

vaikutus miR-151 knockdown soluproliferaatioon, Migration, ja Invasion Eturauhassyövän Solulinjat

tarkastella toiminnallisia rooleja miR-151, suoritimme keskeytys- toiminto tutkimukset käyttäen anti-miR miRNA -estäjä transfektoitiin PC3 ja DU145 soluja. Ekspression miR-151 oli merkittävästi tukahdutettu anti-miR miRNA estäjä transfektantteja (tuloksia ei ole esitetty), ja havaitsimme samanlaisia ​​solujen elävyys kaikissa solulinjoissa, mikä viittaa siihen, että pudotus miR-151 ei vaikuttanut solujen proliferaatiota (tuloksia ei ole esitetty). Haavojen parantumisen määrityksessä osoitti merkitsevän eston soluvaelluksen anti-miR miRNA-151a-5p transfektoidut PCa solulinjoissa verrattuna heidän kollegansa (Fig. 2A). Kuitenkaan mitään merkittävää estoa ei havaittu anti-miR miRNA-151a-3p transfektoidut PCa solulinjoja. Matrigel invaasiomääritys osoittivat, että määrä hyökkääviä solujen väheni huomattavasti anti-miR miRNA-151a-5p transfektanttien verrattuna heidän kollegansa (Fig. 2B). Siksi on todennäköistä, että miR-151a-5p pelaa tärkeässä osassa kasvaimen solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Arvioida samanaikainen vaikutuksia miR-151a-5p ja miR-151a-3p, keskeytys- toiminto tutkimukset käyttäen miRNA estäjä kotransfektoitiin PCa solulinjojen suoritettiin. Ei ollut mitään ylimääräisiä vaikutus solujen elinkelpoisuuden miR-151a-5p ja miR-151a-3p kotransfektiolla (tuloksia ei ole esitetty).

PC-3-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti Pre-miR miRNA esiaste tai Anti-miR miRNA Inhibitor tai negatiivinen kontrolli, jonka jälkeen lyhytaikaisella transfektiolla villityypin 3’UTR toimittaja plasmidit tai mutatoitu 3’UTR plasmidit 24 tuntia. 3’UTR toimittaja aktiivisuus mitattiin lusiferaasianalyysissä ja normalisoidaan aktiivisuus Renillan lusiferaasin. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE. *, P 0,05.

tunnistaminen miR-151a-5p Target Geenit In silico analyysi

tunnistaa mahdolliset kohdegeenien miR-151a-5p, käytimme TargetScan ja microRNA.org tunnistamaan sivustot, joissa nämä miRNA sitovat. Nämä ohjelmat tunnistettu viisi geeniä sisältävä otaksuttu kohdesivustoissa miR-151a-5p niiden 3’UTR (N4BP1: NEDD4 sitova proteiini 1, CASZ1: castor sinkki sormella 1, IL1RAPL1: interleukiini 1-reseptorin proteiini kaltaista 1, SOX17: SRY ( sukupuoli määrittävä alue Y) -laatikon 17 ja ARHGDIA: Rho BKT dissosiaation estäjä (GDI) alfa. Nämä geenit tunnistettiin sekä algoritmien ja bioinformatiikan analyysi osoitti ne voivat olla tuumorisuppressoriproteiinia toiminto useisiin syöpiin [23] – [27].

(A) (B) (C) (D) (E) mRNA-tasot viidellä kohdegeenien miR-151a-5p määritettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysit transfektion jälkeen miR-151a-5p jäljittelee , miR-151a-5p-estäjän ja negatiivisena kontrollina PCa solulinjoissa (PC3 ja DU145). (F) mRNA-tasot viidellä kohdegeenien miR-151a-5p määritettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysit hoidon jälkeen genisteiiniä ( 25 uM) PCA solulinjoissa (DU145). (G) proteiini tasot kohdegeenien miR-151a-5p määritettiin western blot analyysit transfektion jälkeen miR-151a-5p jäljittelee, miR-151a-5p estäjä ja negatiiviset ohjaus PCA solulinjoissa (PC3 ja DU145). Tiedot esitetään keskiarvona ± SE. *, P 0,05.

Luciferase Reporter Analyysit käyttäminen sisältävien vektoreiden 3’UTR toutumiskohtiin Oletettujen kohdegeenien

CASZ1, IL1RAPL1 ja ARHGDIA kullakin yksi ennustettu sidoskohdan asennuspalveli- 151-5p niiden 3’UTRs taas N4BP1 ja SOX17 kullakin kaksi ennustetun sitoutumiskohtia (Fig. 3). Olemme kloonattiin otaksuttu miR-151a-5p 3’UTRs tavoitteet osaksi lusiferaasireportteri- määritys vektori. Lusiferaasireportterigeenin määritys osoitti, että miR-151a-5p laski suhteellisen lusiferaasiaktiivisuudet CASZ1, IL1RAPL1 ja ARHGDIA (Fig. 4A, 4B ja 4E). Lusiferaasireporttiterilla määritys osoitti myös, että tukahduttaminen miR-151a-5p kasvoi suhteellisen lusiferaasi 3’UTR toimintaa. Mutaatio oletetun miR-151a-5p sitoutumiskohtien näissä 3’UTRs vähensi vaste miR-151a-5p. Nämä tulokset osoittavat, että miR-151a-5p sitoutuu suoraan 3’UTRs on CASZ1, IL1RAPL1 ja ARHGDIA. Lusiferaasireporttiterilla määritys osoitti myös, että miR-151a-5p laski suhteellinen lusiferaasiaktiivisuudet ja knockdovvn miR-151a-5p kasvoi suhteellisen lusiferaasiaktiivisuudet sekä villityypin SOX17 3’UTRs (Position 472-478 ja kannan 769-776) (Fig. 4C ja 4D). N4BP1 3’UTR Position 3383-3389 ei osoittanut lusiferaasivaikutusta muutosta joko miR-151a-5p jäljittelee tai miR-151a-5p estäjä. Muut kohdepaikan (kanta 4077-4083) osoittivat, että miR-151a-5p merkittävästi vähentynyt suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus ja tukahduttaminen miR-151a-5p huomattavasti lusiferaasin aktiivisuuden villityypin 3’UTR. Siten nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-151a-5p sitoutuu suoraan yhdessä paikassa (kanta 4077-4083) on 3’UTR N4BP1 mRNA.

(A) miR-151 ilmentymisen kliinisissä näytteissä (BPH, n = 17; PCA n = 30). **, P 0,0001 (B) Kaplan-Meier selviytymisen käyrä yleistä selviytymistä miR-151a-5p lauseke (P = 0,0944).

asetukseen Target Gene Expression PCA Cell Lines by miR -151a-5p

Quantitative reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti, että mRNA-ekspressiotasot viiden kohdegeenien PC3 ja DU145 oli merkittävästi tukahdutettu MIR-151a-5p transfektanttien kontrolleihin verrattuna (Fig. 5A -E). Lisäksi mRNA: n ekspressio viidestä kohdegeenien PC3 ja DU145 olivat selvästi säädellään ylöspäin MIR-151a-5p estäjä transfektantit kontrolleihin verrattuna. Olemme myös arvioineet vaikutuksia genisteiinin mRNA- ilmentyminen miR-151a-5p tavoitteita. Nämä kohdegeenien olivat lähes ajan säädellä genisteiiniä hoitoa DU145 solulinjoissa (kuvio. 5F). Proteiini ekspressiotasot SOX17 ja ARHGDIA merkittävästi vähentynyt miR-151a-5p transfektantit kontrolleihin verrattuna ja säädellään ylöspäin MIR-151a-5p estäjä transfektanttien (Fig. 5G).

Up säännelty ilmentäminen miR-151-5p PCA näytteet

arvioitiin ekspressiotasot miR-151-5p PCA (n = 30) ja hyvänlaatuinen eturauhasen syöpä (BPH) (n = 17) kudoksiin. Ilmentymistasojen miR-151-5p olivat merkitsevästi korkeammat PCa verrattuna BPH kudosten (P = 0,0001; kuvio. 6A). Sen määrittämiseksi, tasot miR-151a-5p kasvainkudoksissa korreloi selviytymisen PCA potilaiden, myös mitattuna miR-151a-5p ekspressiotasot ihmisen kasvainten näytteissä (kuvio. 6B). Tulokset osoittavat, että potilailla, joilla on korkea miR-151a-5p ilme oli pienempi eloonjäämisaste kuin ne, joilla on alhainen 151 a-5p ilmaisua, vaikka nämä tulokset eivät saavuttaneet tilastollista merkitystä (P = 0,0944). Myös merkittävää korrelaatiota toisen kliinis-patologisten tekijöiden (kasvain vaihe ja Gleason Score) (tuloksia ei ole esitetty).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että miR -151 ilmentyy erittäin androgeeni-riippumaton PCa solulinjoissa ja että solun liikkuvuus ja invasiivisuus pienennetään miR-151a-5p pudotus solulinjoissa (PC3 ja DU145). miR-151 koostuu kahdesta kypsän miRNA; miR-151a-5p ja miR-151a-3p. Kaksi kypsä miRNA leikataan samasta varsi-silmukka esiaste-miR-151a. Näin miR-151a-5p ja miR-151a-3p on erilaiset sekvenssit ja siksi kohdistaa eri mRNA: t. Haavan paranemista määritys ja invaasiomääritys osoittivat, että knockdovvn miR-151a-5p, mutta ei miR-151a-3p, laski merkittävästi PCa solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-151a-5p toimii onkogeenin lisäämällä solujen vaeltamiseen ja invaasion PCA. Sen sijaan ei ollut merkittävää vaikutusta soluproliferaation miR-151a-5p estäjä transfektoitujen PCa soluja, mikä viittaa siihen, että miR-151a-5p ei osallistu proliferaatioaktiivisuuden. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että säätely ylöspäin miR-151a-5p ilmentyminen kasvaimissa liittyy alentaa selviytymisen Eturauhassyövän potilaiden mutta nämä tulokset eivät olleet merkittävästi erilaiset joko tämän parametrin tai muu klinikalla-patologisia piirteitä. Koska meidän kohortti ei ollut suuri (n = 30) ja sisälsi vain viisi näytettä edennyt syöpä (yli pT3) ja kolme näytettä, joiden Gleason Pisteet 8 tai enemmän, tutkimuksia suurempi määrä näytteitä tasapainoisen patologinen tausta on tehdä tarkempaa tilastollista arviointia.

Computational bioinformatiikka ja 3 ’lusiferaasireportterista määritykset osoittavat, että miR-151a-5p on useita mahdollisia kohdegeenien (CASZ1, IL1RAPL1, SOX17, N4BP1 ja ARHGDIA). CASZ1, joka on neuronaalisen erilaistumisen geenin, on osoitettu olevan kasvaimia estävä aktiivisuus. Kliinisissä primaarikasvain sumples, ekspressiota CASZ1 on merkittävästi vähentynyt aggressiivinen neuroblastooma verrattuna suotuisa kasvaimia [28]. Palauttaminen CASZ1 ilmaisun estää kasvaimen maahanmuutto

in vitro

ja tukahdutti tuumorigeenisyystesti

in vivo

[23]. IL1RAPL1-geeni sijaitsee alueella X-kromosomissa ja koodaaman proteiinin tämän geenin on jäsen interleukiini 1 -reseptorin perheen ja on samanlainen kuin interleukiini 1 lisäproteiineja [29]. IL1RAPL1 on raportoitu vaimentua monissa aivojen kasvainsolulinjoissa ja ksenografteissa verrattuna normaaleissa kudoksissa [24] viittaa siihen, että se voi toimia tuumorisuppressorina [30]. SOX17 geeni koodaa jäsen SOX perheen transkriptiotekijöiden säätelyyn osallistuvan alkion kehityksen ja määrittämisessä solun kohtalon [31]. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR osoitti, että SOX17 ilmentyminen oli alempi mahasyövän kudoksissa kuin normaaleissa kudoksissa [32]. SOX17 ilmoitettiin olevan ehdokkaana tuumorisuppressorigeeniä joka estää kanoninen WNT /β-kateniinin signalointireitin kolorektaalisyövässä ja maksasyövän [25], [33]. N4BP1 on tunnistettu substraattina mono ubiquitylation E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla Nedd4 [34]. On osoitettu, että N4BP1 vuorovaikutuksessa ja säätelee negatiivisesti ITCH E3 aktiivisuus on suunnattu sen substraatteja, mukaan lukien c-Jun ja p53 liittyvät-tuumorisuppressorin proteiinien (p73 ja p63) [35]. ARHGDIA on solun sääntelyn proteiini, joka sitoo ja säätelee negatiivisesti useimmat Rho GTPaasit lukien RhoA, Rac1, ja Cdc42 [36]. Menetys ARHGDIA parantaa etäpesäke ja kestävyys tamoksifeenin rintasyövässä [37] ja menetys ARHGDIA ilmaisun edistää kehittymistä ja etenemistä PCa [27]. Vuonna thisb tutkimuksessa osoitimme, että mRNA ekspressiotasot näistä viidestä tuumorisuppressorigeenin kohdegeenien PC3 ja DU145 oli merkittävästi muuttunut kokeilun miR-151a-5p matkii ja miR-151a-5p estäjä, mikä osoittaa, että miR-151-5p suoraan tavoitteet nämä geenit.

Genisteiini on osoitettu tukahduttaa kasvua useiden syöpäsolulinjojen

in vitro

ja

in vivo

, vähentää ilmentymistä onkogeenisten miRNA, kuten miR -21 [38], miR-27a [39], miR-221 ja miR-222 [40]. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että genistein hoito merkitsevästi alassäädetty suhteellisen ilmentymistason onkogeenisten miR-151. Äskettäin ryhmämme osoitti, että genistein esti ilmaus miR-21 munuaisen syöpäsoluissa ja kasvaimissa jälkeen muodostettu ruiskuttamalla genisteiini- käsitelty munuaisten syöpäsoluja nude-hiirissä yhdessä tuumorin muodostumisen [38]. miR-27a on raportoitu olevan onkogeenisen miRNA eri syöpäsoluissa, ja sen ilmentyminen ja kohdegeenin (ZBTB10) tasot olivat riippuvaisia ​​annoksesta genisteiinin [39]. Olemme aiemmin osoittaneet, että genistein ilmen- tymisen lisääntymisen tuumorisuppressorigeenin Arhi mukaan vähen- tämisessä miR-221 ja miR-222 PCa [40]. Genisteiini myös on raportoitu tukahduttaa kasvua useiden syöpien lisäämällä ilmaus tuumorisuppressorien, miR-146a [41] ja miR-1296 [42]. Hoito haimasyövän soluja isoflavone yhdisteet (myös 70,54% genisteiiniä), lisääntynyt miR-146a ilme, aiheuttaen downregulation EGFR, MTA-2, IRAK-1, ja NF-KB, johti esto soluinvaasiota [41]. Olemme myös raportoitu, että genistein lisääntynyt miR-1296 ilmentyminen (3-5-kertaisesti) PCA-soluissa ja merkittävästi vaimentua ilmaus MCM2 joka on kohteena miR-1296 [42].

Tässä tutkimuksessa olemme ovat osoittaneet, että miR-151 suoraan suunnattu useita kasvainten synnyssä ja mukana etenemisen ja etäpesäkkeiden Eturauhassyövän. Lisäksi tämä on ensimmäinen raportti osoittaa, että genisteiiniksi downregulates miR-151 ilmaisu viittaa siihen, että genistein voi toimia tärkeänä ruokavalion terapeuttinen aine hoitoa varten PCa.

Materiaalit ja menetelmät

Clinical eturauhasnäytteissä

Kaikki kudosta objektilasit uudelleen muussa hallituksen sertifioitu patologi tunnistamiseksi eturauhassyövän pesäkkeitä sekä viereisen normaalin rauhasepiteeliin. Kaikki syöpäpotilailla oli kohonneita prostataspesifisen antigeenin (PSA) ja oli tehty eturauhasen vuodesta 1999 vuoteen 2004. Potilaiden ominaisuudet on esitetty taulukossa 1. Ei-syöpäkudokset saatiin BPH potilasta, joille oli tehty prostatektomia tai höyläysleikkaus. Tietoinen suostumus saatiin kaikilta potilailta.

Cell Culture

Ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjoissa, LNCaP, PC-3 ja DU145 ja ei-pahanlaatuisen epiteelin eturauhasen solulinja, RWPE-1, olivat hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Eturauhassyövän solulinjaa viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), kosteutetussa atmosfäärissä 5% CO2 ja 95% ilmaa 37 ° C: ssa. RWPE-1-solulinjaa viljeltiin keratinosyyttien kasvualustassa, johon oli lisätty 5 ng /ml ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää ja 0,05 mg /ml naudan aivolisäkeuutetta (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Subkonfluentit solut (60% -70% konfluentteja) käsiteltiin genisteiiniä (25 umol /l, Sigma, St Louis, MO, USA) liuotettiin dimetyylisulfoksidiin ja soluja käsiteltiin vehikkelillä (dimetyylisulfoksidi) toimi kontrollina. Cell-väliainetta ja genisteiiniä vaihdettiin joka päivä ja kasvatettiin 4 päivää.

RNA uuttaminen

RNA uutettiin FFPE ihmisen näytteistä käyttäen miRNeasy formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (Qiagen, Valencia, CA, USA) jälkeen mikrodissektion. Sulattaa DNA, Qiagen RNase-Free DNaasia kit käytettiin. Kokonais-RNA uutetaan myös eturauhasen syöpäsolulinjoissa ja ei-pahanlaatuisten epiteelin eturauhasen solulinja käyttämällä miRNeasy mini -kittiä (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

uutettiin kokonais-RNA käänteiskopioitiin yksijuosteiseksi cDNA käyttäen iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ja TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysi suoritettiin Applied Biosystems Prism7500 Fast Sequence Detection System käyttäen TaqMan Universal PCR Master Mix mukaan valmistajan protokollan (Applied Biosystems). Tasot RNA ilmaisun määritettiin käyttämällä 7500 Fast System SDS ohjelmistoversio 1.3.1 (Applied Biosystems). Kvantitatiivinen PCR parametrit pyöräily olivat seuraavat: 95 ° C 20 sekunnin ajan, 40 sykliä PCR-95 ° C: ssa 3 sekunnin ajan, ja 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Kaikki reaktiot tehtiin 10 ul: n reaktiotilavuudessa kolmena kappaleena. Aineisto analysoitiin delta-delta Ct laskentatapana kertamuutosta. TaqMan-koettimet ja alukkeet CASZ1 (määritys ID: Hs00214901_m1), IL1RAPL1 (määritys ID: Hs00990788_m1), SOX17 (määritys ID: Hs00751752_s1), N4BP1 (määritys ID: Hs00206373_m1), ARHGDIA (määritys ID: Hs00366348), GAPDH (määritys ID: Hs02758991_g1), miR-151a-5p (määritys ID: 002642), miR-151a-3p (määritys ID: 002254), RNU48 (määritys ID: 001006) saatiin Applied Biosystems. GAPDH ja RNU48 käytettiin sisäisen valvonnan.

Western blot -analyysi

72 tuntia transfektion jälkeen solut lyysattiin RIPA-puskurilla (Pierce, Brebieres, Ranska), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (Sigma). Proteiini kvantifiointi suoritettiin käyttämällä BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce). Proteiini lysaattia (30 ug) erotettiin 4%: sta 20% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Vasta-aine SOX17 hankittiin Millipore (Bedford, MA, USA). Vasta-aineet ARHGDIA ja GAPDH ostettiin GeneTex (Irvine, CA, USA). Membraani pestiin ja inkuboitiin sitten sekundääriset vasta-aineet on konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Erityiset kompleksit tehtiin näkyviksi kanssa echochemiluminescence (ECL) havaitsemisjärjestelmä (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), ja ekspressiotaso näiden geenien arvioitiin käyttämällä ImageJ ohjelmistoa (ver. 1,43; https://rsbweb.nih.gov/ij /index.html).

transfektio

Pre-miR miRNA lähtöaineiden ja negatiivinen kontrolli (Applied Biosystems) käytettiin voitto-of-function kokeita, kun taas Anti-miR miRNA Inhibitor ja negatiivinen-kontrolli (Applied Biosystems) käytettiin menettämisestä toiminnon kokeita. PC3 ja DU145-soluja transfektoitiin ohimenevästi käyttäen Lipofectamine 2000 transfektioreagenssia (Invitrogen), mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti. Mock transfektioista kanssa transfektioreagenssi, käytettiin verrokkeina.

Cell Proliferation, Migration, ja Invasion Analyysit

Solulisääntyminen mitattiin käyttämällä CellTiter 96 vesikerros Solution Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega, Madison, WI, USA) suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solujen proliferaatio määritettiin absorbanssilla mittauksia 490 nm: ssä käyttämällä SpectraMAX 190 (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA). Solumigraation aktiivisuus arvioitiin haavan paranemista määrityksessä. Solut maljattiin kuusikuoppaisille ruokia, ja yksisolukerroksista kaavittiin käyttämällä P-20 mikropipetin kärki. Leveys alkuperäinen ero (0 h) ja jäljelle jäänyt aukko 24 tuntia haavoittamisen jälkeen laskettiin mikrovalokuvia. Solu invaasiomääritys suoritettiin käyttämällä muunnettua Boyden Chambers koostuu transwell-esipäällystetty matrigeeliä kalvosuodattimella insertit kahdeksan mikronin huokoset 24-kuoppaisille kudosviljelylevyille (BD Biosciences, Bedford, MA, USA). Minimum essential joka sisälsi 10% FBS: ää alemmassa kammiossa toimi kemoattraktanttia, kuten aiemmin on kuvattu [43]. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

ennustaminen MicroRNA tavoitteet

ennustettu kohde-geenejä ja niiden miRNA sitoutumiskohta siementen alueet määritettiin käyttäen TargetScan (release 5.2, http: //www.targetscan. org /) ja microRNA.org (elokuu 2010 release, https://www.microrna.org/microrna/home.do). Sekvenssit ennustetun kypsän miRNA varmistettiin miRBase (release 18,0, https://microrna.sanger.ac.uk/).

plasmidin muodostaminen ja Dual-lusiferaasireportteri Analyysit

3 ’UTR lusiferaasireportterigeenin määritys, PmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector käytettiin (Promega). Oligonukleotidisekvenssit (villityypin), jota käytetään on esitetty taulukossa S1. Meillä on myös rakennettu mutatoitujen oligonukleotidien kunkin villityypin oligonukleotidien (taulukko S1). Kokonaistilavuudessa 25 ui, 1 ui kutakin 100 uM eteenpäin ja taaksepäin oligonukleotidi, 2,5 ui 10 X hybridisointipuskuriliuosta (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl ja 10 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappo), ja 20,5 ui vettä oli inkuboitiin 95 ° C: ssa 3 minuutin ajan ja asetettiin sitten 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Oligonukleotidit ligatoitiin Pmel-Xbal pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector. 3 ’UTR lusiferaasianalyysissä, eturauhassyövän solut ko-transfektoitiin Pre-miR miRNA esiaste tai Anti-miR miRNA Inhibitor ja pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target ekspressiovektorit käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ja X-tremeGENE HP DNA transfektio Reagent ( Roche Diagnoosi, Basel, Sveitsi, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Lusiferaasireportterigeenin määritys tehtiin käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) 24 tuntia transfektion jälkeen.

Tilastollinen analyysi

suhde kahden muuttujan ja numeeriset arvot on saatu reaaliaikaisella RT -PCR analysoitiin käyttämällä epäparametrisia U-testi tai pariksi t-testiä. Välisiä suhteita kolme muuttujaa ja numeeriset arvot analysoitiin käyttäen Bonferronin korjattu Mann-Whitneyn U-testi. Association of miR-151 ilmaisutapoja eloonjäämiseen arvioitiin Kaplan-Meier menetelmällä, ja tuloksena käyrät verrattiin käyttäen log rank testi. Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen Expert StatView (versio 4, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Vertailussa joukossa kolme muuttujaa, joka ei säädetty tilastollinen merkitsevyystaso P 0,05 vastaa Bonferronin suhteutettu taso P 0,0167.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Primer oligonukleotidisekvenssit (villityyppinen ja mutatoitu).

doi: 10,1371 /journal.pone.0043812.s001

(DOC) B

Kiitokset

Kiitämme tohtori Roger Erickson hänen tuen ja avun valmistelun käsikirjoituksen .