Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyövässä, on olemassa tyydyttävää tarve tunnistaa uusia seerumimarkkereiden joko varhaisen diagnoosin, terapeuttinen kerrostuminen tai potilaan seurantaa. Proteomiikan analyysi kasvainsolun secretomes on lupaava lähestymistapa osoittaa proteiineja vapautuu kasvainsoluista

in vitro

. Ektodomeeni irtoaminen läpäisevien proteiinien on aiemmin on osoitettu myötävaikuttavan merkittävästi jakeet kasvainsolun secretomes ja tuottaa arvokkaita seerumin biomarkkereita. Tässä esittelemme liukoinen muoto jättiläinen kadheriinin -rasva1 uutena biomarkkereiden ehdokas. -rasva1 Ilmaisun ja proteolyyttinen käsittely analysoitiin massaspektrometrialla ja Western blottaus käyttämällä haimasyövän solulinjoissa verrattuna ihmisen haiman ductal epiteelisolujen. RNA ilmentyminen syövän kudoksissa arvioitiin

in silico

analyysin julkisesti saatavilla microarray data. Osallistumista ADAM10 (A disintegriini- ja metalloproteinaasi domain sisältävä proteiini 10) -rasva1 ektodomeeni leviämistä analysoitiin kemiallisten esto ja knockdown kokeiluja. Sandwich-ELISA kehitettiin tasojen määrittämiseksi liukoisen -rasva1 seeruminäytteistä. Esillä olevassa raportissa kerrotaan vapauttamista korkeita tasoja ektodomeenia -rasva1 kadheriinin osaksi secretomes ihmisen haimasyövän soluja

in vitro

, prosessi, joka välittää ADAM10. Me vahvistaa täyspitkä ja käsitellään heterodimeerisen muodon -rasva1 ilmentyvät solukalvon ja myös osoittaa p60 C-terminaalinen transmembraaninen jäännös fragmentti, joka vastaa irtoa ektodomeenia. -rasva1 Ja sen sheddase ADAM10 yliekspressoituvat haiman adenokarsinooman ja ektodomeeni verenvuodatusta myös toisteta

in vivo

mikä lisää -rasva1 seerumin joillakin haimasyövän potilaille. Ehdotamme, että liukoinen -rasva1 voi löytää sovelluksen markkerina potilaan seurantaan täydentää hiilihydraattiantigeeniä 19-9 (CA19-9). Lisäksi yksityiskohtainen analyysi monipuolinen jalostettujen proteiini-isoformit ehdokkaan tuumorisuppressorin -rasva1 voi myös edistää ymmärrystämme solubiologian ja kasvaimen käyttäytymisen.

Citation: Wojtalewicz N, Sadeqzadeh E, Valkoinen JV, Tehrani MM, Klein-Scory S, Hahn S, et ai. (2014) liukoinen muoto Giant kadheriinin -rasva1 vapautuu haimasyöpäsoluissa by ADAM10 välittämä ektodomeeni irtoaminen. PLoS ONE 9 (3): e90461. doi: 10,1371 /journal.pone.0090461

Editor: Andreas-Claudius Hoffmann, Länsi-Saksan Cancer Center, Saksa

vastaanotettu: 11 lokakuu 2013; Hyväksytty: 28 tammikuu 2014; Julkaistu: 13 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Wojtalewicz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Bundesministerium für Bildung und Forschung, NGFN Plus -ohjelmaa, 01GS08117 (MS) ja 01GS08118 (IS-W) ja avustusta Hunter Translational Cancer Research Unit (ja RFT). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

haiman adenokarsinooma on yleisin pahanlaatuinen kasvain haiman ja on neljäs sijoittui syy syövän liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti. Pidetään kaikkein aggressiivinen kiinteä kasvain, kuolleisuus Haimasyöpä on korkea 5-vuoden eloonjäämisluvut alle 5% [1], [2]. Tällä hetkellä vain leikkaus tarjoaa mitään mahdollisuuksia parannuskeinoa, mutta resektio on mahdollista vain 15-20%: lla potilaista. Siksi aiemmin havaita haimasyöpä on tärkeää parantaa hoitotuloksia.

Serum biomarkkerit ovat erittäin haluttuja varhaisen diagnoosin, terapeuttinen kerrostuminen ja potilaan seurantaa. Yhteydessä haimasyövän hiilihydraatin antigeeni 19-9 (CA19-9) tunnetaan myös sialyyli Lewis veriryhmäantigeeniä, on tärkein seerumi biomarkkereiden käytetään kliinisesti [3]. Seerumin määritykset CA19-9 on rajoitettu diagnostinen arvo, jota ei voida käyttää seulontakokeessa yksin ([4] ja viitteet), mutta antaa tärkeää tietoa suhteen ennustetta, vastaus kemoterapiaa ja varhaisena indikaattorina jälkeisen uusiutumisen . Sarjamuotoinen määritys CA19-9 tasoja voidaan havaita taudin uusiutumisen kuukautta ennen kliinisiä tai radiologisia todisteita. Lisäksi laskua CA19-9 vastauksena kemoterapia voi toimia surrogaattimarkkerina kliininen vaste [4] (katso katsaus [5] – [7]). Kuitenkin useat sekoittavia muuttujia rajoittaa kliininen hyöty CA19-9.

Korkeimmat CA19-9 tasot havaitaan potilailla, joilla on sappiteiden tukos, riippumatta siitä, onko tukkeuma johtuu syövästä tai hyvänlaatuinen syitä [8], [9]. Lisääntynyt CA19-9 tasot liittyy myös haimatulehduksen, maksakirroosi, sappitietulehdus ja useita adenokarsinoomat muuta, esim. peräsuolen syöpä. Tärkeää on, että ilmaus CA19-9 riippuu Lewis positiivinen fenotyyppi, jossa väärien negatiivisten tulosten yhteinen lähinnä noin 7-10% valkoihoisista ja jopa 20% afrikkalaisista on

Lewis

antigeeninegatiivisille jossa CA19- 9 on havaittavissa riippumatta kasvaintaakkaa [10], [11]. Siksi on olemassa tyydyttävää tarve tunnistaa uusia seerumimarkkereiden joko varhaisen diagnoosin, terapeuttinen kerrostuminen tai potilasvalvonnan jotka ovat kasvaneet apuohjelma tai voi täydentää kanssa CA19-9 tai muiden seerumimarkkereiden [8].

Yksi lähestymistapa biomarkkereiden löytö, että me ja muut ovat käyttäneet, on kuulusteluun täydellisen ohjelmistoon proteiinien vapautuu syöpäsolujen

in vitro

– syöpäsolun secretome [12] – [15]. Proteomiikan analyysit secretomes ovat löytäneet tuhansia proteiinien ja hieman yllättäen, joukossa merkittävä murto-transmembraaninen (TM) proteiineja. Tämä johtuu ensinnäkin vapauttamaan Mikrovesikkelien joka kuljettaa ehjänä TM proteiineja. Toiseksi, TM-proteiineja voidaan käsitellä liukoisessa muodossa, jonka proteolyyttinen prosessointi [16] – [18]. Olemme aikaisemmin havainneet, että molemmat microvesicular julkaisu [19] ja proteolyyttisen TM proteiinien tapahtuu paitsi

in vitro

, mutta myös

in vivo

. Erityisesti päätimme nousu seerumin liukoisen kadheriinit eli liukoisen E-kadheriinin [20] ja liukoisen LI-kadheriinin (julkaisematon data) potilailla, joilla peräsuolen syöpä.

Tässä raportissa olemme analysoineet secretome haimasyövän soluja

in vitro

ja kuvaavat tunnistamisen liukoinen muoto -rasva1 kadheriinin kuin erittäin runsas ainesosana tätä fraktiota. -rasva1 Kuuluu pieneen alaryhmän neljä selkärankaisten geenien (-rasva1, Fat2, Fat3 ja Fat4). Fat kadheriinin koodaavat erittäin suuria proteiineja ~500-600 kDa kanssa säilyttämisen rakenteen selkärangattomia nisäkkäisiin. Jokainen jäsen käsittää jopa 34 kadheriinin toistoja, yksi tai kaksi lamininG n kaltaista motiivia ja useita epidermaalinen kasvutekijä (EGF) kaltaista motiivia niiden solunulkoisen alueen, single-pass TM domeeni ja laaja sytoplasminen domeeni [21] – [ ,,,0],23]. Proteolyyttinen prosessointi Fat proteiineja esiintyy alussa eritysreitille ja tuottaa ei-kovalenttisesti sitoutunut heterodimeerin solukalvoon on kuvattu aikaisemmin. Se kutsutaan ”klassinen” käsittelyä ja näyttää konservoituneet Drosophila [24] ja ihmisen [22], [25].

-rasva1 ei ole aikaisemmin tutkittu haimasyöpä. Tässä esittelemme ensimmäistä kuvaus liukoisen isoformin -rasva1 vapautuu haimasyöpäsoluissa

in vitro

. Huomasimme, että A disintegriini- ja metalloproteinaasi domain sisältävä proteiini 10 (ADAM10) on suurelta osin vastuussa julkaisun ektodomeeni fragmentti.

In silico

analyysin julkisesti saatavilla ilmaisun array data osoitti yliekspressio -rasva1 sekä ADAM10 haiman adenokarsinooman. Lopuksi olemme kehittäneet ELISA-määrityksessä, joka kykenee mittaamaan ektodomeenia -rasva1 ja osoittavat, että kohonneet liukoisen -rasva1 voidaan havaita seerumissa potilaiden osuus, joilla haiman adenokarsinooma verrattuna terveisiin kontrolleihin.

materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

otettiin kudosnäytteet potilailta Department of Internal Medicine, Knappschaftskrankenhaus, Ruhr-Universität Bochum, Saksa, kun tietoon perustuvan suostumuksen saatiin. Tutkimuksen hyväksyi paikallinen eettinen tarkastelu hallituksen Ruhr-Universität Bochum ja suoritettiin ilmoituksen mukaan Helsingin. Katso taulukko S5 varten potilastiedot.

kirjallinen suostumus kaikilta potilailta ja kudosten luovuttajia dokumentoitiin mukaan paikallisten eettisten ohjeiden mukaisesti. Kolmen syöpä otosten potilaista, joilla PancCa vaiheissa UICC IIB. Normaalia kudosta Kontrollit olivat samasta potilaiden vieressä tervettä kudosta.

seeruminäytteet saatiin potilailta, Department of Internal Medicine, Knappschaftskrankenhaus, Ruhr-Universität Bochum, Saksa, kun tietoon perustuvan suostumuksen saatiin. Tutkimuksen hyväksyi paikallinen eettinen tarkastelu hallituksen Ruhr-Universität Bochum ja suoritettiin ilmoituksen mukaan Helsingin. Katso taulukko S4 potilastiedot.

Kirjallinen suostumus kaikkien potilaiden ja verenluovuttajien dokumentoitiin mukaan paikallisten eettisten ohjeiden mukaisesti. 30 syöpä otosten potilaista, joilla PancCa vaiheissa UICC I (1), UICC II (9), UICC III (2) ja UICC IV (18). Ryhmä 26 potilasta negatiivisin diagnostisia tuloksia syövän käytettiin (kliininen) valvontaa.

Soluviljely

Ihmisen haiman adenokarsinooman solulinjan Paca44 [26] oli ystävällisesti M. Löhr (Heidelberg, Saksa), BxPc3, MiaPaca2 ja Panc1 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) ja A818-4 soluja meidän lab (WS). Soluja ylläpidettiin täydennetyssä Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), kuten aiemmin on kuvattu [19]. Ihmisen haimatiehyen epiteelin (HDPE) solut ystävällisesti toimittanut M.S. Tsao (Toronto) ja viljeltiin määritelty Keratinosyyttien-SFM (KFSM, Life Technology), kuten aiemmin on kuvattu [19].

valmistaminen proteiinin näytteiden

Secretome valmistamiseksi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [20] . Lyhyesti soluja viljeltiin vakio keskipitkällä kunnes ne saavuttivat yhtymäkohta 60-70%. Sen jälkeen ne pestiin kolme kertaa DMEM: llä ja inkuboitiin seerumivapaassa alustassa täydentää joko 16 h MS-analyysiä varten tai vielä kaksi päivää western blot -analyysillä. Supernatantit kerättiin ja kadota kelluvien solujen ja jätteiden steriilisuodatuksella. Voit estää proteolyyttistä hajottamista, proteinaasi-inhibiittorit lisättiin. Secretome proteiinit konsentroitiin ultrasuodatuksella.

soluviljelmä lysaatti valmistamiseksi solut hajotettiin NP-40-puskurilla (25 mMTrisHCl, pH 7,4, 0,5% NP-40, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 45 min 4 ° C), jossa on CHAPS-lyysipuskuria (100 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM MgCI

2, 10% glyseroli, 1% CHAPS 90 min, 4 ° C) tai NDE-lyysipuskurilla (10 mM Tris /HCl: ää, pH 7,2, 66 mM EDTA, 0,4% SDS, 1% NP-40, 1 h, 4 ° C), joka sisältää proteaasi-inhibiittori cocktail (Roche, Basel, Sveitsi) ja 1 mM PMSF: ää. Supernatantti kerättiin sentrifugoinnin jälkeen (14,000 rpm, 10 min 4 ° C: ssa). Proteiinipitoisuus määritettiin standardin Bradfordin proteiinimääritys (BioRad, Hercules, CA, USA).

Frozen kudoksen poisto

Pieni pala jäädytettyjä kasvain tai normaalia kudosta katkaistiin ja jauhettu samalla jäähdytettiin nestemäisellä typellä. Jauhe oli peitetty NDE- puskurilla ja proteiini uutettiin edellä kuvatulla tavalla.

ADAM ja MMP inhibition

ADAM10 spesifinen estäjä GI254023X [27], [28] ja laaja kirjo-inhibiittori batimastaatista (Tocris Bioscience, Bristol, UK) molemmat liuotetaan DMSO varastoliuok- ennen laimennusta ja käyttöä. Soluja viljeltiin, kunnes ne saavuttivat yhtymäkohdassa noin 60-70%. Ne pestiin ja sen jälkeen inkuboitiin 10 uM Batimastaatin tai 5 uM GI254023X seerumittomassa alustassa kaksi päivää.

siRNA-pudotus tutkimukset

siRNA kokeissa soluja kasvatettiin konfluenssiin noin 30% ja inkuboitiin antibiootti-väliaineessa yhden päivän. Sen jälkeen ne inkuboitiin 30 uM joko ON-TARGETplus siRNA tai Dharmacon ON-TARGETplus nontargeting siRNA kontrollina käyttäen Dharmafect (Fermentas, ST. Leon Rot, Saksa) kahden päivän ajan, jota seuraa inkubointi seerumittomassa väliaineessa vielä kaksi päivää ja toisen inkubaation seerumivapaassa väliaineessa vielä kaksi päivää.

vasta-aineet ja Western blotting

ei-kaupallinen anti–rasva1 hiiren monoklonaalinen ja kanin polyklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​N-terminaalinen tai C- pääaluetta -rasva1 on kuvattu aikaisemmin [25]. Polyklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​ekstrasellulaarisen domeenin -rasva1 (HPA001869 ja HPA023882) ja monoklonaalisia vasta-aineita β-tubuliinia (T4026) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). ADAM10 vasta-aineet hankittiin Calbiochem (Darmstadt, Saksa) (kani, 735-749) ja Millipore (Darmstadt, Saksa) (kani AB19026). E-kadheriinin-vasta-aine hankittiin Invitrogen (Darmstadt, Saksa) (hiiri, 13-1700).

Western blot -analyysiä varten, 8 ug kokonais-proteiinin secretomes, 50-75 ug solulysaateista ja kudoksen tai 12 ug seerumin proteiinit erotettiin käyttämällä 3-8% Tris-asetaatti-gradienttigeelejä (Life Technologies, Darmstadt, Saksa), kuten aiemmin on kuvattu [25], jossa joitakin muutoksia. Lyhyesti, proteiinit siirrettiin nitroselluloosa- tai PVDF-kalvoille käyttäen puolikuiva blottaus ja kalvoja blokattiin 1 tunnin ajan 5% rasvatonta maitojauhetta PBS: ssä. Inkuboinnin jälkeen, jossa on esitetty ensisijaisen vasta-aineita, havaitsemisen immunoreaktiivisia bändejä suoritettiin käyttäen sopivia sekundäärisiä vasta-aineita yhdessä infrapuna fluoroforeilla (Alexa-Fluor 680 (Life Technologies, Darmstadt, Saksa) tai DyLight 800 (Thermo Scientific, Schwerte, Saksa)) tai HRP ( BioRad laboratoriot, München, Saksa). Signaalit havaittiin käyttämällä Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) tai Fuji LAS-4000 kuvantamisjärjestelmä (GE Healthcare, Braunschweig, Saksa).

Sähkösumutusionisaatio-tandem-massaspektrometrialla (ESI -MS /MS) analyysi

yksityiskohtainen kuvaus nähdä materiaaleja ja menetelmiä S1. Lyhyesti secretome ja seeruminäytteet erotettiin PAGE-geelit värjättiin Krypton (Pierce, Rockford, USA), ja kunkin proteiinin kaista leikattiin 29 viipaleiksi ja pilkottiin trypsiinillä. Tryptic peptidiseokset erotettiin käyttäen nanoAcquity UPLC järjestelmä (Waters GmbH, Eschborn, Saksa), kuten aiemmin on kuvattu [19]. Nano UPLC järjestelmä kytkettiin verkossa kohteena on LTQ Orbitrap XL massaspektrometriin (Thermo Scientific, Bremen, Saksa). Massaspektrometri toimii herkällä tilassa. Themgf-tiedostoja syntyy Xcalibur ohjelmisto (Thermo Scientific, Bremen, Saksa) käytettiin tietokantahakuihin kanssa MASCOT hakukoneen (Matrix Science, London, UK, versio 2.2) vastaan ​​MSIPI tietokantaan. Kukin viipale analysoitiin erikseen ja MS /MS-tiedot eivät yhdistettiin ennen Proteiinitietokantahaku säilyttää tietoja molekyylipaino jokaisen proteiinin, peptidin tulitikut ja tunnistaminen pisteet. Tällä tavoin proteiini luetteloita ihmisen haimasyövän solu secretomes (A818-4, BxPC3, MiaPaca2, Paca44, Panc1 ja HDPE (ihmisen haimatiehyen epiteelin)) perustettiin.

ELISA-määritystä vastaan ​​erittyy -rasva1

96-kuoppaisille levyille (valkoinen MaxiSorp tasapohjaisille 96-kuoppalevyille (Nunc, Roskilde, Tanska) päällystettiin ensin yli yön 4 ° C: ssa 100 ul: lla anti-Fat mAb NTD-7 (nostatettu kadheriinin verkkotunnuksia 11/12 ; [25]), 50 ug /ml karbonaattipuskurissa (pH 9,6). välillä kaikki inkuboinnin vaiheet, levyt pestiin kolme kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi 0,1% Tween (v /v) (PBS-T). sitten maljat blokattiin 5% rasvatonta maitoa PBS-T (2 h, RT), ennen soveltamista merkitty näytteitä ja inkuboitiin vielä (2 h, RT). Siepattu -rasva1 antigeeni havaittiin 0,05 ug /ml biotinyloitua anti–rasva1 NTD-14 mAb (16 h, 4 ° C) (peptidiä vastaan ​​nousseen in kadheriinin toista 12 -rasva1 [25] laimennettuna 2% rasvatonta maitoa PBST: llä. Kompleksit havaittiin käyttäen 5 ug /ml neutravidiini-HRP: tä (Pierce, Darmstadt, Saksa) 2 h huoneenlämmössä ennen ravistellen inkubointi 50 ul substraattia (SuperSignal ELISA FemtoMaximum herkkyys).

tulokset

jättiläinen kadheriinin -rasva1 on tärkeä osa secretome haiman syöpäsoluja

osana biomarkkereiden löytö ohjelma olemme luetteloitu ohjelmistoon proteiinien vapautuu viiden ihmisen haimasyövän solulinjoissa käyttämällä massaspektrometriaa (A818-4, BxPC3, MiaPaca2, Paca44 ja Panc1) ja verrattiin tätä sen secretome of kuolemattomaksi ihmisen haimatiehyen epiteelin (HDPE) soluja. Secretomes valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [12], [13], [19] ja erotettiin 1D-gradienttigeeliä. Kukin geelikaistan leikattiin 29 viipaleiksi. Tryptinen ruoansulatusta ja massaspektrometrialla suoritettiin erikseen jokaiselle Geeliviipale ja tietokanta hakua johti tunnistamiseen yli 1000 proteiineja kohden secretome ja yli 3000 proteiineja yhteensä (julkaisemattomia tuloksia).

On huomattava, lukuisia peptidejä kartoitus jättiläinen protocadherin Fat-1 löydettiin kaikissa kuudessa secretomes kuluessa geelileikkeistä kaksi ja kolme, jotka vastaavat proteiineja 400 kDa yhdenmukainen ennustetun massan -rasva1 of ~500 kDa (vertaa taulukko 1). Todellakin, määrältään peptidien tunnistettu, mikä on suhteellinen mitta proteiinin runsauden, -rasva1 oli joukossa runsain proteiineja syöpäsolun secretomes edustavat enintään 0,9% kaikista peptidien ja yleisin johdannainen tahansa TM-proteiinin. Jakelu -rasva1 peptidien joukossa solulinjat ja peptidit, jotka ovat peräisin muista Fat proteiinit (Fat2 ja Fat4) on esitetty taulukossa 1.

seuraava profiloitu mRNA: n ilmentymisen kaikkien neljän Fat perheen kadheriineja on haimasyöpä solulinja paneeliin mikrosiruanalyysi (taulukko S1) ja sen jälkeen toissijaisen vahvistus käyttämällä kvantitatiivista PCR: ää (kuvio S1). -rasva1 Ilmentyi korkealla tasolla kaikissa kuudessa solulinjoissa, Fat2 ja Fat4 kohtuullisella tasolla vain kaksi kuudesta solulinjoissa. Sitä vastoin vain taustatasoja saatiin Fat3 tässä analyysissä.

määritetylle tasolle mRNA enimmäkseen vastasi kanssa proteomic data kuitenkin verrataan syöpäsolujen HDPE soluihin oli joitakin eroavaisuuksia. Erityisesti HDPE soluilla korkea -rasva1 mRNA: n ilmentymisen, mutta toisaalta antoi vähiten -rasva1 peptidien secretome. Samoin, peptidi numerot Fat2 ja Fat4 että HDPE secretome ovat pienemmät tai jopa poissa, vastaavasti, verrattuna syöpäsolulinjoissa, että myös ilmaista vertailukelpoisia Fat2 ja Fat4 mRNA: t (BxPC3 ja Panc1, vastaavasti), mikä viittaa, että syöpäsolut vapauttavat enemmän rasvan proteiinien kuin normaalit solut.

itsenäisesti vahvistaa nämä havainnot suoritimme Western blot -analyysi haiman solujen secretomes ja verrataan näitä vastaaviin solulysaateista. Tunnistus vasta-aineiden kanssa aminopäästä on -rasva1 proteiinin paljasti pääasiassa yhden kaistan hieman yli 460 kDa, että secretomes vastaavien solulysaatteja syöpäsolujen näyttää samankaltaisen vyöhykkeen liikkuvuus (kuva 1). Sen sijaan, HDPE-solut osoittivat vähän reaktiivisuuden -rasva1 että secretome ja päänauhassa havaittu lysaateissa esiintyi suurempi viittaa voi olla translaation jälkeisen eroja. Koska bändi intensiteetit secretomes korreloi peptidin määrä määritettiin määrään kunkin solulinjan (taulukko 1), yhdessä nämä tiedot tarjoavat hyviä todisteita, että -rasva1 on erittäin runsas vuonna secretomes haimasyövän solulinjoissa mutta vähemmän totuttuun cellular kollegansa.

Western blot-analyysi -rasva1 vastaavissa secretome (S; 8 ug ladattu) ja lysaatti (L; 50 mikrog ladattu) jakeet neljästä haiman solulinjoista ja HDPE. Blotti koetettiin kanssa antiseeru- solunulkoisen domeenin -rasva1 (ECD1).

-rasva1 haiman syövän secretome koostuu irtoa solunulkoisen domeenin

näennäinen molekyylimassa-alue ( Mr) on -rasva1 kaistan haimasyövän secretomes on alueella ennustetun Mr on täyspitkän ydin -rasva1 polypeptidin 505 kDa (kuvio 1). Vaikka nimellisesti tämä viittaa siihen, että eritetyn -rasva1 voi olla ehjä, kohdistus tunnistettu peptidien -rasva1 aminohapposekvenssi paljasti, että kaikki peptidit yksinomaan peräisin solunulkoisten (ECD, aminohapot 1-4180) ja kaikkein C-terminaalinen aminohappo tunnistetaan peptidissä kartoitus AA 3997 (kuva 2 ja tiedostojen S1).

Massaspektrometrinen analyysit tehtiin kaikki kuusi secretomes ja -rasva1 erityisiä peptidejä havaittiin alkaneet lähellä aminopään alas ja myös EGF-domeeniin ( katso tiedosto S1 lisätietoja). Kuvassa on rinnastuksia -rasva1 spesifisten peptidien kolme esimerkinomaista tuloksia, joilla on korkea sekvenssin kattavuus aminohappo-osiosta 3500 alas C-päähän on AA4588 (mukaan HPRD).

Lisäksi olemassaolo laajempaa bändi HDPE solulysaatissa ehdotti, että posttranslational muutokset voivat myötävaikuttaa koko yhteensä proteiinin isomuotojen niin usein havaitaan TM proteiineja myös monia kadheriineja. Todellakin, deglykosylaatio kokeet vahvistivat, että noin ylimääräinen 70 kDa proteiinin kokonaismassasta johtuvat glykosylaation solujen muotoja ja liukoisen muodon -rasva1 (kuva S2). Mitä tulee signaaleja solulysaateista, erittäin korkea herra bändi esiintyy HDPE soluissa viittaa näiden pääasiallisesti ilmentävät täyspitkän glykosyloitu proteiini. Hieman pienempi kaistalla läsnä syöpäsolujen lysaatit voi edustaa N-terminaalista osaa äskettäin kuvattu -rasva1 heterodimeeri, joka koostuu N-pään gp 490 (P420) ja p85-C-päätteen kalvon läpäisevä fragmentti. Tämä ei-kovalenttisesti sitoutunut heterodimeeri tuotetaan endoproteolyyttisen S1-lohkaisu trans-Golgi-verkon [25] ennen solukalvon. Selventää luonnetta -rasva1 läsnä secretome ja vahvistaa identiteettiä bändejä havaittu solulysaateissa Sitouduimme Western blot analyysit verkkotunnuksen spesifisten vasta-aineiden [25].

Kuva 3 verrataan edustava secretome murto rinnalla solu lysaatit viljellyistä haiman soluja. Blotti tutkittiin vasta-aineiden kanssa solunsisäisen domeenin -rasva1 että helposti havaitsee yhden kaistan 500 kDa solulysaateissa selkeästi toisin kuin secretome, jossa ei ole signaaleja olivat selviä. Seuraavaksi sama blot inkuboitiin vasta-aineiden kanssa solunulkoisen -rasva1 domeeni, jossa haiman solulysaateista antoi kaksi lähekkäin bändejä solulysaateista: ylempi vyöhyke on identtinen tunnistetun solunsisäisten vasta-aineita. Puute reaktiivisuus alemman kaistan solunsisäisen domeenin vasta-aineita, tunnistaa tämän dubletti kaistoja kuin täyspitkä ja heterodimeerisiä muotoja -rasva1, vastaavasti (kuva 3). Lisäksi odotetusti MS-tulokset, solunulkoisen alueen vasta-aineet antoivat vahvoja signaaleja secretome näytteessä. Yhdessä tulokset sekä biokemiallisia ja massaspektrometrisiä (MS) analyysit osoittavat, että -rasva1 läsnä secretome kokonaan puuttuu C-terminaalisten tähteiden kanssa. Koska molemmat tunnettuja muotoja solujen -rasva1 ovat TM proteiineja, pakottavia johtopäätös näistä tiedoista on, että -rasva1 havaittavissa secretome edustaa ekstrasellulaarisen erittymisen kautta proteolyyttistä hajoamista sen solunulkoinen domeeni alavirtaan lamG domain. Western blottauksella solulysaattien emme löytäneet todisteita läsnäolo C-pään jäännöksen fragmentti odotetaan kertyvän ektodomeeni irtoaminen, eikä teimme havaita p85 C-terminaalista fragmenttia heterodimeeri.

Solulysaatit (75 ug kutakin), ja edustava secretome (8 ug) blotattiin yhdessä proteiinimarkkeri (M). Sama blot koetettiin ensin, ja antiseerumin n sytoplasmista aluetta vastaan ​​(CTD) ja -rasva1 ja sen jälkeen, jonka antiseerumin n solunulkoista domeenia vastaan ​​(ECD 2). Beta-Tubulin lopulta käytettiin latauskontrollina solun lysaatti. Solunulkoisen domeenin spesifisiä vasta-aineita, vasta, havaitsemiseksi käsiteltyjen solujen muodossa ja vapautetaan -rasva1 on secretome.

Näin ollen, seuraavan kerran suoritetaan immunosaostusanalyysille domain monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t) käyttäen kolmea edustavaa adenokarsinoomasolulinja linjat. Käyttämällä biotinylaatio merkitä solun pinnan proteiinien, tämä analyysi osoittaa, että läsnä on ensisijaisesti kaksi korkeaa jäsen bändejä saostetaan N- ja C-terminaaliset erityisiä mAb useimmissa solulinjoissa tutkittiin. Myöhemmät Western blotting, jossa on solunulkoinen domeeni, spesifinen vasta-aine tunnistaa suurempi kaistan vain, kun taas solunsisäisen domeenin spesifisen vasta-aineen merkkien sekä suuria solujen muotoja (kuvio 4). Tämä antaa lisää todisteita kahden prosessorin, jossa sekä koko pituudeltaan ja heterodimeerisiä muotoja -rasva1 esiintyy solun pinnalla haiman adenokarsinooma solujen, kuten aiemmin on kuvattu melanoomasoluja. Erityisesti, solunsisäisen C-terminaalisen domeenin spesifisen vasta-aineen osoitti myös, kun läsnä on p85 kaistan ilmaisee heterodimeerin (kuva 4). Useimmat silmiinpistävän -60 kDa: n vyöhyke vastaa odotetun ektodomeenia irtoaminen katkaisukohta havaittiin BxPC3 solulysaatista ja vähemmässä määrin PaCa44 soluissa. P60 bändi vain saostettiin C-päätelaitteeseen liittyviä mAb: t osoittaa se edustaa tuotetta ei enää yhdessä solunulkoisen domeenin. Tämä on myös yhdenmukaista aikaisempien havaintojen melanoomasoluissa [25].

Solut (Panc1, BxPC3 ja A818-4) leimattiin biotiinilla, hajotettiin ja saostetaan -rasva1 monoklonaalisia vasta-aineita (NTD7 ja CTD7); proteiini A /G-helmiä käytettiin kontrollina. Ensimmäisen inkuboinnin blot neutravidiini-HRP merkitty bändejä, joilla on suuri molekyylipaino, joka vastaa tunnettua korkean Mr muotoja -rasva1 ja oletettavasti ristireagoivia proteiinia ≈200 kDa. Myöhemmät Western blotting solunulkoisen domeenin kanssa spesifistä antiseerumia jälleen havaitsee kaksi korkea Mr muotoja -rasva1. Lopuksi, Western blotting solunsisäisen domeenin kanssa spesifistä antiseerumia tunnistaa täyspitkä proteiinin ja p85 C-terminaalista jäänne fragmentti on peräisin klassisesta käsittelystä molemmissa -rasva1 saostuu, vahvistaa yhdistys N-terminaalin ja C-terminaalin osaa. Lisäksi p60 on yksinomaan havaitaan sakka käyttäen solunsisäistä domeenia vasta-aine, jolla on vahvat signaalit BcPC3 ja viikolla signaaleja A818-4 lysaateissa. Immunosaostus (IP) analyysi -rasva1 jälkeen solun pinnalla merkintöjä Panc1, BxPC3 ja A818-4 soluja biotiiniin. IP käyttämällä domeenispesifisiä mAb: itä vastaan ​​-rasva1 yhdessä ohjaus (proteiini A /G-helmiä inkuboitiin lysaatteja) ensin tutkittiin NeutrAvidin koristella proteiineja solun pinnalla, jonka jälkeen polyklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​ECD CTD, kuten on esitetty. Bändit leimataan gp575, gp490 ja p85 kohti A) p60 ilmaiseva vielä proteolyyttinen tuote.

vuodattamalla -rasva1 kadheriinin liittyy ADAM10

Metalloproteaasit usein säädellä ektodomeenin vuodattamalla TM reseptorien kanssa kalvo-ankkuroitu ADAM perhe metalloproteaasit usein mukana. mRNA profilointi haiman solulinjojen paljasti rajoitetun ekspressiokuviota ADAM perheenjäsenten (taulukko S2). ADAM10 erityisesti on sheddase on pitkälti vastuussa ektodomeenin vuodattamiseen E-kadheriinin ja LI-kadheriinin peräsuolen syöpäsoluissa (julkaisematon data) ja neljä viidestä syöpäsolun riviä näkyy korkeampia ADAM10 tasolla kuin HDPE-soluissa. Proteiinitasolla, ADAM10 erityisiä peptidejä ei ole havaittu secretome luetteloissa mutta rikastettu eksosomeiksi MS, eli 9 ottelut HDPE eksosomeiksi ja 62 otteluita Panc1 eksosomeiksi; ei ole muita ADAM havaittiin näissä luetteloissa (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä nämä tiedot antavat perusteet tutkia roolia ADAM10 vuonna -rasva1 ektodomeeni irtoaminen.

arvioimiseksi osallistumista metalloproteinaasien ja erityisesti ADAM10 in -rasva1 ektodomeeni irtoaminen, ihmisen haimasyövän soluja käsiteltiin laaja kirjo proteaasinestäjä Batimastaatin ja ADAM10 erityinen estäjä GI245023X [28], [29]. Western blottaus -rasva1 vuonna secretomes vuonna Paca44 ja Panc1 solulinjat osoittivat Batimastaatin hoito vähensivät ektodomeenia vuodattamalla -rasva1 alle valvonnan tason. GI254023X estäjä oli samanlainen vaikutus pitoisuuksien vähentämistä ektodomeenia irtoa -rasva1 molemmissa solulinjoissa (kuvio 5A). Määrällinen arvio vaikutuksista näiden aineiden kolmessa peräkkäisessä kokeet osoittivat, että Batimastaatin estivät merkittävästi -rasva1 irtoaminen Panc1 ja Paca44 soluja (kuvio 5B) mikä vahvistaa asemaa metalloproteinaasien tässä prosessissa. Vaikutukset GI254023X olivat samanlaisia ​​viittaa siihen, että ADAM10 osallistuu -rasva1 irtoaminen näissä soluissa. Kuitenkin jotkut raportit ovat esittäneet, että GI254023X käytetyillä pitoisuuksilla voi myös olla jonkin verran vaikutusta matriksimetalloproteaaseja (MMP: t), esim. [27], ja lisäksi kokeita, joissa RNAi vastaan ​​ADAM10.

Lukuun A) esittää tyypillisen western blot. PaCa44 ja Panc1 soluja inkuboitiin seerumittomassa alustassa kaksi päivää lisäämällä joko laaja kirjo metalloproteaasin estäjä Batimastaatin (B, 10 uM), tai ADAM10-spesifisen inhibiittorin GI245023X (GI, 5 uM) tai liuotinta kontrollina ( C, DMSO). Secretomes, 8 ug proteiinia per näyte, analysoitiin Western blot -analyysillä käyttäen -rasva1 ECD2 polyklonaalinen vasta-aine. Blotting vastaan ​​transferriinin käytettiin latauskontrollina. (B) -rasva1 merkinannoista kolmesta itsenäisestä kokeet määrällisesti ja normalisoitu kanssa transferriinin signaaleja. Pylväiden esittävät keskiarvoja +/- SEM kolmen kokeen.

hoito Paca44 ja Panc1 haimasyövän soluja ADAM10 erityisiä siRNA dupleksit johti 90% knockdovvn ADAM10 proteiinin tasot stabiilina 96 h (kuvio 6). Tarkastelu secretome osoitti samanaikainen lasku liukoisen -rasva1 tuottamia Panc1 ja Paca44 solut (kuva 7). Vaikka ADAM10 pitoisuus väheni alle 10% kontrollitasoista maksimaalisen väheneminen -rasva1 erityksen havaittiin oli noin 50% valvontaa. Samanlaisia ​​vähennykset eritystä E-kadheriinin, joka on tunnettu kohde ADAM10, havaittiin rinnakkaiskokeissa ryhdytty kemiallisten estäjien tai ADAM10 siRNA-dupleksit (kuva S3 A ​​ja B). Yhdessä tämä viittaa siihen, että ADAM10 on merkittävä efektori -rasva1 irtoaminen, mutta ei ainoa mukana.