Krooninen sairaus

tiivistelmä

Virtsarakon syöpä (BCA) on yleinen maligniteetti maailmanlaajuisesti ja on suuri todennäköisyys uusiutumisen jälkeen alustavan diagnoosin ja hoidon. Tämän seurauksena toistuva valvonta, ja eritoten toistuva cystoscopies, on kriittinen osa jälkeisen diagnoosin potilaan hoitoon. Koska kystoskopian on invasiivinen, kallis ja mahdollinen pelote potilaalle noudattamisen säännöllinen seuranta seulontaan, uusi ei-invasiivisia tekniikoita auttamaan havaitsemiseen toistuva ja /tai ensisijainen virtsarakon syöpä ovat vahvasti tarvita. Tässä tutkimuksessa massaspektrometria perustuu metabolomiikan käytettiin tunnistamaan biokemiallisten allekirjoituksia ihmisen virtsasta, jotka erottavat virtsarakon syöpä ei-syöpä valvontaa. Yli 1000 erillisiä yhdisteitä mitattiin myös 587 nimetty yhdisteet tunnettujen kemiallisten identiteetin. Alkuperäinen biomarkkereiden tunnistus suoritettiin käyttäen 332 aihe vedostulostus takautuvan virtsanäytteiden (kohortti 1), joka sisälsi 66 BCA positiivista näytettä. Joukko 25 ehdokkaan biomarkkereiden valittiin perustuu tilastollista merkittävyyttä, kertainen ero ja metaboliareitti kattavuus. 25 ehdokasta biomarkkerit testattiin riippumaton virtsanäytteen sarja (kohortti 2) käyttämällä satunnaisia ​​metsä analyysiä, palmi- sfingomyeliinin, laktaatti, adenosiini ja sukkinaatti tarjoaa voimakkaimman ennusteita erottamiselle kohortti 2 syöpä ei-syöpä virtsoissa. Kohortti 2 aineenvaihduntatuote profilointi paljasti muita aineenvaihduntatuotteita, kuten arakidonaatista, jotka olivat korkeampia kohortissa 2 syöpää vs. muu syöpä valvontaa, mutta olivat alle määritysrajan rajoja kohortin 1 profilointia. Metaboliitit liittyvät rasva-aineenvaihdunnan saattaa olla erityisen kiinnostavaa biomarkkereita. Tulokset viittaavat siihen, että virtsa aineenvaihduntatuotteet voivat tarjota paljon tarvitaan ei-invasiivisia lisänä diagnostisia jotta kystoskopian havaitsemiseen virtsarakon syövän ja uusiutuva sairaus hallintaan.

Citation: Wittmann BM, Stirdivant SM, Mitchell MW, Wulff JE, McDunn JE Li Z, et al. (2014) Virtsarakon syövän biomarkkereiden Discovery käyttäminen Global Metabolomic Profilointi virtsaa. PLoS ONE 9 (12): e115870. doi: 10,1371 /journal.pone.0115870

Editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 23, 2014; Hyväksytty: 27 marraskuu 2014; Julkaistu: 26 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Wittmann et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Rahoitusta näytteiden keräämistä ja merkintä tukivat avustuksia NIH 1R01-CA151489-01 (Bogdan Czerniak PI), ja NIH /NCRR 5 UL1 RR24982 -02 (YL co-tutkija). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Metabolon hankittu näytteitä per otantaperiaatteella.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: BMW, SMS, MWM, JEM, ZL, BPN, MVM ja RLW ovat työntekijöitä Metabolon Inc .; YL solminut tutkimuksia Abbott Kefeidi ja Tyynenmeren Edge, mutta ei konsulttina tai kaiutin. Nämä kilpailevat edut eivät muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin lehden politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Yhdysvalloissa virtsarakon syöpä on 4

th yleisin syöpä tyyppi miehillä ja 11

th yleisin syöpä tyyppi naisilla [1]. Yhdysvalloissa vuonna 2012, arvioitiin 73000 uutta tapausta diagnosoidaan ja 15000 ihmistä kuolisi tautiin [1]. Potilaat, joilla on virtsarakon syöpä useimmiten läsnä hematuria [2]. Diagnoosi virtsarakon syövän, niillä potilailla, hematuria, tarkoittaa ensisijaisesti cystoscopy yhdessä kuvantaminen, sytologia ja biopsia [3]. Cystoscopy ja sytologia ovat nykyiset standardit alustavan diagnoosin ja uusiutumisen, mutta rajoituksia on olemassa. Kystoskopia saattaa epäonnistua havainnollistamaan tiettyjä alueita rakossa ja voi myös epäonnistua havaita kaikki syövät, erityisesti joissakin tapauksissa carcinoma in situ [4]. Sytologia on suuri spesifisyys ja selektiivisyys korkealaatuista kasvaimet mutta ei toimita ennustaa vahvasti for huono laatu kasvaimia [5]. Hoitovaihtoehtoja perustuvat lavastus ja onko lihaskudosta hyökkäystä. Valtaosa virtsarakon syöpiä (75%) ovat urothelial karsinoomat luokitellaan ei-lihas- invasiivisia virtsarakon syöpien (NMIBC). Vuonna NMIBC, noin 70%: lla potilaista esiintyy vaiheessa pTa, 20% pT1 ja 10% kanssa karsinooma in situ (CIS) [6]. Toistumisen korko NMIBC jälkeen kasvaimen resektion on korkea, arvioiden vaihtelee 35-80% [6], [7]. Riskin vuoksi kasvaimen uusiutumisen tai etenemisen, laadittuja ohjeita suositeltavaa NMIBC potilaita seurataan jälkeen alustavan diagnoosin ja hoidon [8], [9]. Säännöllinen aikataulu kystoskopian suositellaan valvontaa taajuudella 3-6 kuukauden välein 3 vuotta ja vuosittain siellä jälkeen [10], [11]. Tämän seurauksena virtsarakon syöpä voidaan nähdä krooninen sairaus, jossa elinikäinen seurantaa tarvitaan. Pitkäaikainen seuranta tukeutuen kystoskopialla on paitsi invasiivisia, on potentiaalia haittavaikutusten ja voi aiheuttaa huomattavia pitkävaikutteiset menot [12], [13]. Lisäksi potilas vastenmielisyys kystoskopian voi vähentää potilaan hoitomyöntyvyyttä säännöllistä valvontaa suosituksia [14]. On vahva kliininen tarve ei-invasiivisia, edullinen vaihtoehto kystoskopian jotka auttavat havaitsemisessa primäärisyövästä, seurata uusiutumisen ja auttaa kerrostuvat potilaille riskin toistumisen ja etenemistä. Viimeaikaiset edistysaskeleet metabolomiikan on avannut mahdollisuuden käyttää virtsan aineenvaihduntatuotteiden biomarkkereina syövän [15] – [18]. Useat tutkimukset verranneet aineenvaihduntatuote eroja rakkokasvaimista suhteessa hyvänlaatuisia kudokseen ja ovat tunnistaneet ehdokas syöpä biomarkkereita [19] – [23]. Yhdessä tutkimuksessa tarkasteltiin myös eroja virtsaan metaboliittien välillä potilailla, joilla on virtsarakon syöpä verrattuna syövän vapaa tarkastuksia [19]. Aikaisemmat tutkimukset olivat usein rajoitettu havaittujen nimetty aineenvaihduntatuotteiden ja kattavamman metaboliitin profiloinnin voi tuottaa uutta ehdokasta biomarkkereita ja ennakoivan algoritmeja. Raportoimme tässä metabolomic profilointi virtsaa kaksi ikäluokat virtsarakon syövän potilaiden ja niiden ei-syöpä valvontaa. Tiedot viittaavat siihen useita ehdokas virtsarakon syöpä biomarkkereita, jotka voivat tarjota ennusteen arvioinnissa tunnistamaan syövän positiivisen virtsoissa.

Materiaalit ja menetelmät

Potilasvalinta

Retrospective (kohortti 1) ja mahdollisille ( kohortti 2) virtsanäyte sarjat saatiin IRB-hyväksytty virtsa arkistoon (IRB # CR00008160 /STU032011-187) yliopiston Texas Southwestern Medical Center (UTSW). Kaikki koehenkilöt olivat suostunut kirjallisen suostumuksensa. Kohortti 1 virtsarakon syövän positiivinen virtsoissa olivat koehenkilöillä, joilla oli joko primaarinen tai toistuva syöpä. Mitätöidään virtsanäytteet otettiin ennen kystoskopian varten aiheista kohortin 1 virtsarakon syöpä positiivisia, sekä syövän historia ja hematuria valvontaa. Cystoscopies tehtiin osana jatkuvaa tarkkailua tai syövän havaitsemiseen ja tuloksia käytetään diagnosoida nykyiset syövän tilan läsnä- tai poissaolevaksi. Kohortti 2 virtsanäytteitä saatiin henkilöillä, joilla oli hematuria tai henkilöillä, joilla on ollut sairauden meneillään seurannan. Virtsarakon syöpää positiivinen virtsoissa in kohortissa 2 saatiin henkilöillä, joilla oli joko primaarinen tai uusiutuva sairaus. Metadata koskevat ikä, sukupuoli, rotu, ja syövän vaiheessa ja arvosana oli saatavilla sekä ikäryhmät.

Metabolomic Profilointi

massaspektrometri alustoja, näytteenottoa ja valmistelu, laitteen asetukset ja ehdot, sekä tiedot käsittelyn on aiemmin kuvattu yksityiskohtaisesti [24]. Lyhyesti, pääkomponentit prosessia voidaan tiivistää seuraavasti. Osmolaalisuus kunkin virtsanäyte määritettiin ennen käsittelyä. Cocktail elpyminen standardien lisättiin virtsanäytteistä, ja 100 ui alikvootit poimittiin 500 ui metanolia. Saatu uute jaettiin kolmeen jakeet kohdistamattomia metabolisen profiloinnin ja satunnaistettiin analysoitavaksi. Kukin näyte kuivattiin vakuumissa orgaanisen liuottimen poistamiseksi. Näytteet karakterisoitiin käyttämällä kolmea riippumatonta alustat: ultrahigh suorituskyvyn nestekromatografia /tandem-massaspektrometrialla (UHPLC-MS /MS), että negatiivisten ionien tilassa, UHPLC-MS /MS: positiivinen ioni-tilassa ja kaasukromatografia-massaspektrometrialla (GC-MS ) jälkeen sialylaatio-. Toistettavuus louhinta protokollan arvioitiin elpymistä xenobiotic yhdisteiden Piikitin jokaisessa virtsanäytteen ennen uuttamista. Kohortti 1 virtsoissa analysoitiin käyttämällä alustaa, joka koostuu Waters ACQUITY UHPLC (Waters Corporation, Milford, MA, USA) ja Thermo-Finnigan LTQ massaspektrometrillä (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA. USA), kun taas kohortti 2 oli analysoitiin käyttämällä alustaa, joka koostuu Waters ACQUITY UHPLC ja ThermoFisher Scientific Orbitrap Elite korkearesoluutioisia /tarkka-massa massaspektrometriä (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA. USA). Yhdisteet tunnistettiin vertaamalla kirjaston merkintöjä puhdistetun standardien tai uusiutuva tuntematon yhteisöjä. Tunnistaminen tunnettujen kemiallisten yksiköiden perustui verrattuna metabolomic kirjaston merkintöjä puhdistettua standardeihin perustuva kromatografiaominaisuuksiin ja massaspektrit. Tätä kirjoitettaessa, yli 4000 kaupallisesti saatavilla puhdistettua standardiyhdisteillä oli hankittu ja rekisteröity osaksi lims jaettavaksi sekä LC ja GC alustoja määrittämiseen niiden analyyttiset ominaisuudet. Muita yksiköitä (nimetön yhdisteet) tunnistettiin nojalla niiden luonteeltaan toistuvia (sekä kromatografisilla ja massaspektriarvot). Nämä yhdisteet ovat mahdollisuudet tunnistaa tulevaan hankintaan vastaava puhdistettu standardin tai klassisilla rakenneanalyysiin.

Tilastollinen

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin R versio 2.14.2 [25] . Wilcoxonin testi määrittämiseen käytettiin tilastollisen merkitsevyyden metaboliitin keskimääräinen eroja vertailuryhmissä. Kaikissa analyyseissä, puuttuvat arvot (jos on) olivat laskennallisia kanssa havaitun minimi kyseisen yhdisteen (laskennalliset arvot kuluttua lisättiin block-normalisointi). Tilastolliset analyysit suoritettiin luonnollinen log-muunnetun datan vaikutuksen vähentämiseksi mahdollisista harha tiedoissa. Lisäksi tiedot on normalisoitu näyte osmolaliteetti kompensoimaan eroja virtsan pitoisuuden. Random metsä on valvottu luokittelu tekniikka perustuu kokonaisuus päätöspuilla [26] ja suoritettiin R version 2.14.2. Hierarkkinen klusterointi virtsarakon syövän ja ohjaus virtsaa runsaasti profiileja suoritettiin ArrayStudio versiossa 5.0 täydellisin sidos ja Pearsons n korrelaatiota samankaltaisuudesta metrinen (OmicSoft, Raleigh, NC). Laskelmat AUC ja ROC käyrät tehtiin käyttämällä proc paketin R [27]. Multi-biokemiallinen algoritmia, käytetään tuottamaan AUC ja ROC käyrät, koulutettiin ja testattava tiedot, jotka uudelleenskaalataan jotta mediaanit sekä kohortti-1 ja kohortti-2 negatiivit olivat yhtä kuin 1. muuttaminen asteikolla sallii algoritmi geenitutkimuksesta sopivassa mittakaavassa sovitetun johdetusta kerroin opetusjoukolla.

tulokset

Aihe populaatiot

Virtsan metabolinen profilointi tehtiin kaksi aiheesta ikäryhmät. Kohortti 1 hyödynnettiin valmistelevan /biomarkkereiden tunnistus asetettu tunnistamaan biokemikaalien joiden tasot olivat erilaisia ​​virtsoista virtsarakon syövän virtsoissa suhteessa tasoa hallita virtsoissa. Kohortti 2 käytettiin toisena löytö asettaa ja testata ennustearvo ehdokas biomarkkereiden valitaan kohortti 1 perustietoja, mutta koska kohortti 2 näytettä analysoitiin herkempi massasp alustan, aineenvaihduntatuotteet, jotka vasta mitattiin kohortissa 2 näytteet olivat myös kiinnostava. Kohortti 1 oli retrospektiivinen virtsanäyte asetettu kerätty University of Texas Southwestern, kun taas kohortti 2 kerättiin prospektiivisesti samaan organisaatioon. Yhteenveto potilaan demografiset kahden kohorttien on esitetty taulukossa 1. kohortti 1 käsitti 66 virtsoissa mistä aiheista diagnosoitu BCA ja 266 ei-BCA valvontaa. Virtsoissa in kohortti 1 kerättiin aiheista joko ensisijaisena tai uusiutuva sairaus. Joitakin eroja yleinen sukupuolen ja rodun koostumuksia oli läsnä kohortissa 1. Non-BCA valvonnan kohortissa 1 voidaan jakaa kolmeen populaatiot: 1) henkilöillä, joilla oli hematuria; 2) henkilöillä, joilla on ollut BCA, mutta ei nykyinen sairaus ja 3) normaali henkilöillä, joilla ei aiemmin ole ollut BCA. Kohortti 2 koostui 29 virtsoissa mistä aiheista diagnosoitu BCA ja 79 ei-BCA valvontaa. Kuten kohortti 1, oli joitakin eroja sukupuolten ja rotuun tasapaino BCA ja ei-BCA valvontaa. Kohortti 2 virtsassa saatiin potilailla, joilla on joko primaarinen tai uusiutuva sairaus suhteessa identtinen kohortin 1 (59% toistuvien: 41% ensisijainen). Huomaa myös oli kohortti ero prosenttia korkealaatuista vs. huono laatu BCA kasvaimet, jossa kohortti 1, jolla on paljon suurempi prosenttiosuus korkealuokkaisesta BCA (79%) kuin kohortti 2 (59%).

Metabolomic profilointia ja analysointia

virtsanäytteet uutettiin ja metabolinen profilointi suoritettiin käyttäen positiivinen (+) ja negatiivinen (-) LC-MS /MS ja GC-MS, jotta saadaan laaja kattavuus biokemikaalit esittää. MS piikkiä tunnistettiin käyttämällä Metabolon patentoiman piikin integrointi /tunnistus ohjelmisto, vertaamalla MS huippu tietoja kuin kirjaston puhdistettua standardien tai uusiutuva tuntematon yhteisöjä. Sen jälkeen lankeavan vähintään havaittujen arvojen, log transformaatio ja normalisointi menettelyt, tilastollinen analyysi tehtiin tunnistamiseksi tilastollisesti merkittäviä eroja metaboliittitasoihin välillä vertailuryhmissä. Profilointi kohortti 1 mitattiin 499 nimetty ja 624 nimeämätön biokemikaalien taas profilointi kohortin 2 mitattuna 587 nimeltään ja 541 nimeämätön biokemikaalien. Luettelot kaikista nimetty aineenvaihduntatuotteiden mitattiin kaksi ikäluokat esitetään S1 S2 Taulukot. Lisääntymisen nimetty yhdisteitä mitataan kohortissa 2, suhteessa kohortti 1, osittain heijastaa suurempaa herkkyyttä tarkka massa MS väline käytetään kohortti 2 ja laajennus biokemiallisten kirjaston välinen aika profilointi kohortteja 1 ja 2 . Wilcoxonin kaksi Testinäyteliuosten käytettiin tunnistamaan tilastollisesti merkitseviä eroja metaboliittitasoihin in kohortissa 1 BCA virtsoissa suhteessa kontrolliin virtsoissa. Tilastollinen analyysi suoritettiin vertaamalla BCA virtsoissa kaikille kontrolliryhmiin yhdistettynä; tai verrataan BCA kullekin valvonnan alaryhmien. Useita tilastollisesti merkittäviä eroja mainittu yhdiste vaihtelivat 178-233 useissa eri vertailuissa (taulukko 2). Kaiken määrä tilastollisesti merkitsevä biokemikaalien ei vaihdellut merkittävästi, kun verrataan BCA positiivista näytettä eri kontrolliryhmiin. Analyysi kohortti 2 BCA virtsoissa kontrolleja käyttäen Wilcoxonin testi, jonka tunnuksena 75 nimetty biokemikaalien näyttämällä tilastollisesti merkitseviä eroja 70 biokemikaalien koholla ja 5 biokemikaalien pienempi BCA virtsoissa suhteessa kontrolliin virtsoissa (taulukko 2). Pienempi määrä tilastollisesti merkittäviä eroja kohortti 2 suhteessa kohortti 1 voi heijastaa osittain alempi näyte numerot kohortissa 2. suurempi prosenttiosuus korkeampi vaiheen kasvaimista kohortti 1 suhteessa kohortti 2 voi olla myös vaikutti määrä tilastollisesti merkittäviä eroja havaittu.

tunnistaminen ehdokas biomarkkereiden

strategia käytettiin käyttää kohortti 1 tunnistaa ehdokas biomarkkereita ja sijoittua mielenkiintoisin kohortti 1 biomarkkereita BCA ennustettavuuden avulla kohortin 2 näytettä asetettu. Työnkulun kaavio käytettyä strategiaa biomarkkereiden testaus ja vahvistus näkyy kuvassa. 1. Hierarkkinen ryhmittely suoritettiin kohortin 1 tietojoukko käyttäen kaikki näytteet (332) ja kaikki nimetty biokemikaalien ilman eksogeenista lääkkeet (yhteensä = 442). Tulokset hierarkkinen klusterointi on esitetty kuvassa. 2, joilla on jonkinasteinen BCA näytteen klustereiden havaittu. Klusterijärjestelyssä Tulokset viittaavat siihen, että aineenvaihduntatuotteen erot syövän ja ei-syöpä ryhmät ovat olemassa ja että nämä erot ovat kyky erottaa virtsanäytteistä.

Lyhenteet: HX, BCA negatiivinen mutta historia BCA; Hema, BCA negatiivinen esittämiseen hematuria.

Aihe BCA diagnoosi (post virtsa kokoelma) on osoitettu alemmassa baarissa. Klusterointi suoritettiin käyttäen täydellinen sidos ja Pearsons n korrelaatio kuin samankaltaisuutta metristä.

Valinta biomarkkereiden ehdokkaiden kohortti 1 datajoukon

Wilcoxonin testi levitettiin kohortti 1 profilointitiedot verrataan virtsoissa mistä aiheista nykyisen BCA on virtsoissa kolmesta erillistä kontrolliryhmää: 1) henkilöillä, joilla oli hematuria; 2) henkilöillä, joilla on ollut BCA mutta ei nykyinen sairaus tai 3) normaali henkilöillä, joilla ei aiemmin ole ollut BCA. Lisäksi Wilcoxonin testi levitettiin vertaamalla BCA virtsoissa kontrolliryhmään, joka koostuu kaikkien ei-BCA virtsoissa yhdistettynä. Lämpökarttana ja tilastotiedot kaikkien mitattu aineenvaihduntatuotteiden varten 4 eri vertailuissa sisältyy S1 taulukossa. Yhdistetty, 290 tilastollisesti merkitseviä eroja nimetty metaboliittitasoihin tunnistettiin välillä 3 erillistä BCA /vertailuryhmässä analyysit, 135 aineenvaihduntatuotteiden näyttämällä tilastollisesti merkitseviä eroja kaikissa kolmessa BCA negatiiviseen kontrolli vertailuja (hematuria, historia, normaali S1 taulukko). Vähentää kokonaismäärää metaboliitin eroja alas helpommin hallittavissa joukko ”paras biomarkkereiden ehdokkaita”, useita suodatus perusteita sovellettiin. Suodattimet olivat: 1) metaboliittien BCA kontrolloida tasolle, joka oli tilastollisesti merkitsevä vähintään 3 4 BCA valvoa ryhmään vertailuja; 2) metaboliitin erot näytetään alimman p-arvo (kaikki p≤0.05); 3) suurin kertaiseksi eroja BCA ja valvontaa; 4) mitattuna 50% Virtsanäyteanalyysit; 5) syöpä fenotyyppi yhdistys; 6) kattavuus Useiden metaboliatiet; 7) nimettiin yhdisteet vain; 8) sulkeminen eksogeenisten yhdisteiden (esim vierasaineiden, huumeet). Kun näitä valintakriteerit olemme nimenneet paneeli 25 ehdokkaan biomarkkereita tarkempaa analysointia varten. Joukko 25 ehdokkaan biomarkkereita näkyy heatmap kuvion. 3 yhdessä tilastollisen suorituskyky jokaiseen 3 mahdollista BCA ohjata ryhmään vertailuja. Myös kuviossa. 3 on virtsarakon syöpä osajoukon analyysi vertaamalla ainoastaan ​​ei-lihas- invasiivisia virtsarakon syöpien historiaan kontrolliryhmään. Verrattaessa kaikkia BCA näytteiden kunkin kontrolliryhmien, kaikki biokemikaalien lukuun ottamatta haaraketjuaminohapot (BCAA) leusiini, isoleusiini ja valiini näytetään p≤0.05 tilastollista merkittävyyttä kaikkien 3 kontrolliryhmässä vertailuja. 3-hydroksibutyraatti ja glukonaatti olivat erittäin koholla BCA virtsoissa, kun taas anserine ja 3-hydroksifenyyliasetaattia ja pyridoxate oli eniten vähennetty BCA vs. kontrolli virtsoissa. Valtaosa biomarkkereiden ehdokkaiden tilastollisesti merkitsevästi, kun kaikki BCA näytteitä verrattiin historiaan ohjaimet näytetään myös tilastollisesti merkitseviä eroja, kun vain NMBIC näytteitä verrattiin historiaan valvontaa. Erilaistumista NMBIC syöpien on tärkeää, koska ne ovat yleisempiä potilailla alle aktiivista seurantaa. 25 ehdokasta biomarkkereiden valitaan kohortti 1 tietoja käytettiin hierarkkinen klusterointi analyysi kohortin 1 näytteitä. Klusterointi BCA ja kontrollinäytteiden havaittiin, mikä osoittaa, että ero tasot 25 biokemikaalien tarjoavat jonkinasteista virtsanäytteen ositusta perustuu diagnoosiin (Fig. 4).

Red täyttää solut osoittavat aineenvaihduntatuotteet korkeammat keskimääräiset pitoisuudet BCA virtsoissa kuin ei-BCA valvontaa ap≤0.05 merkitys. Vihreät solut osoittavat alempia tasoja BCA vertailuryhmään nähden virtsoissa klo p≤0.05 merkitys. Tilastollinen q-arvoja ja profilointi tuloksia kaikille muille nimetyille yhdisteitä mitataan kohortin 1 näytteet esitetään majatalo S1 taulukossa.

Aihe BCA diagnoosi (post virtsa kokoelma) on osoitettu alemmassa baarissa. Klusterointi suoritettiin käyttäen täydellinen sidos ja Pearsons n korrelaatio kuin samankaltaisuutta metristä.

kohortti 1 ehdokas biomarkkerit parhaiten erottavat kohortin 2 näytettä

satunnainen metsä analyysi suoritettiin käyttäen 25 kohortti 1 biomarkkereiden ehdokkaita osittaa kohortti 2 näytettä set osaksi oikeisiin syöpä ja ei-syöpä ryhmiä. Random metsä on kokonaisuus perustuva menetelmä luokitteluun puiden ja out-of-bag error esitetään arvio siitä, miten hyvin voimme odottaa ennustaa tulevaa näytettä. Satunnaisen metsän analyysi antaa ”merkitystä” listalla tilaaminen biokemikaalien. Suhteellinen merkitys kunkin 25 metaboliittien on esitetty kuviossa. 5, palmi- sfingomyeliinin näyttämällä suurin erottelukyky (korkeampi keskiarvo pienentää tarkkuutta arvo). Top 6 syrjivä hajoamistuotetta satunnainen metsässä analyysi muodosti 3 aineenvaihduntatuotteita, jotka olivat korkeammat BCA virtsoissa ja 3, jotka olivat pienemmät BCA näytteissä. Vertailu pitoisuudet näille 6 aineenvaihduntatuotteiden kaikissa syövän virtsoissa verrattuna kaikkiin ei-syöpä valvonnan kaksi ikäluokat näkyy kuvassa. 6. Erot suhteellinen taso kullekin 6 aineenvaihduntatuotteiden oli tilastollisesti merkitsevä (p≤0.05) molemmissa ikäluokat, lukuun ottamatta sukkinaatin joka saavutti p-arvo 0,053 kohortissa 2 vertailun. Lisäksi NMIBC osajoukko BCA näytteiden verrattuna kaikkiin vertailunäytteet sekä 4 6 metaboliittien edelleen saavuttaa tilastollista merkitsevyyttä, klo p≤0.05 tasolla, fosfokoliini ja sukkinaatin on poikkeus (Fig. 6). Phosphocholine ja sukkinaatti oli tilastollisesti merkitsevä p≤0.1 tasolla.

Metaboliitteja ovat listalla-tilaama niiden keskiarvo pienenee tarkkuus pisteet. Suurempi keskimääräinen lasku tarkkuus arvo osoittaa suurempaa ennustearvo. 6 boxed datapisteet esittävät tehokkaimmissa aineenvaihduntatuotteiden koottu kuvioon. 6.

Vertailut ovat kaikille BCA positiiviset virtsoissa versus yhdistää BCA negatiiviset kontrollit. Tummanpunainen ja tummanvihreä solut edustavat kertaiseksi erojen kanssa p≤0.05. Vaaleanvihreä solu sinisellä tekstillä edustaa p≤0.1. BLQ: Alle määritysrajan; NA: Ei sovellettavissa.

lisäbiomarkkeria ehdokkaita havaittu kohortissa 2 virtsanäytteistä

metabolinen profilointi kohortin 2 virtsanäytteiden suoritettiin käyttäen herkempiä accurate- massaa MS-alustalla, joka pystyy mittaamaan virtsan aineenvaihduntatuotteiden läsnä pienempinä pitoisuuksina. Lämpökarttana sisältää kaikki nimetty aineenvaihduntatuotteet mitataan kohortti 2 näytettä esitetään S2 taulukossa. Arakidonaatista, spermidiini, spermiini ja sytosiini, ei mitattu kohortissa 1 virtsoissa, mutta kohosivat kohortissa 2 BCA virtsoissa at p≤0.05 (Fig. 6). Arakidonaatista myös koholla NMIBC kasvaimen virtsoissa tilastollisesti merkitsevä tasolla, kun NMIBC näytteet olivat eriytyneet ja analysoitiin erillään MIBC kasvain virtsoissa (Fig. 6). Spermiiniä, spermidiinia ja sytosiini kohosivat NMIBC virtsoissa samoin, mutta ei tilastollisesti merkittäviä. Nämä neljä aineenvaihduntatuotteiden voidaan katsoa olevan ehdokas biomarkkereita, mutta vahvistusta vaatisi riippumatonta kohortin joka oli myös profiloitu on tarkka-massa väline.

Multi-aineen algoritmin suorituskykyä käyttämällä erilaisia ​​6 biomarkkereita

Koska testi esimerkin mahdollisista biomarkkereiden suorituskyvyn usean analyytin algoritmi, palmitoyyli sfmgomyeliini, laktaatti, glukonaatti, adenosiini, 2-methylbutyrylglycine ja guandinoacetate valittiin algoritmin koulutuksen menetelmiin kohortti-1 tietokokonaisuutta. Nämä ehdokas biomarkkerit valittiin perustuu niiden kertaiseksi eroista ja p-arvot sekä kohortti-1 ja kohortti-2. Algoritmi johdettu koulutusta kohortti-1 tietokokonaisuutta testattiin kohortti-2 tietokokonaisuutta. AUC ja ROC käyrät sekä koulutusta ja Koepakettia analyysi näkyvät kuvassa. 7. Vertailukelpoinen AUC saatiin molemmille ikäluokat, jossa AUC = 0.81 for kohortti-1 ja 0,78 kohortin-2. Spesifisyys arvot pysyivät korkealla, jopa herkkyys sulku noin 0,5, molemmissa ikäluokat. Suorituskyky havaittu tällä algoritmi ei päätellä tulevia ennustearvoa, koska biomarkkereita käytetty algoritmi esivalitut perustuen niiden kasvaimen erilaistumiseen kyky molemmissa ikäryhmät. Tämä esimerkki osoittaa, että on mahdollista saada sellainen algoritmi, joka erottelee kasvaimen valvonnan virtsassa sekä näiden erityisten kohortteja.

algoritmia käyttäen ehdokas biomarkkerit palmi- sfingomyeliini, laktaatti, glukonaatti, adenosiini, 2-methylbutyrylglycine ja guanidinoacetate oli koulutettu käyttäen kohortti-1 datajoukko ja sitten testataan kohortti-2 tietokokonaisuutta. ROC käyrät AUC näytetään harjoitussarjassa (A.) ja Koepakettia (B.).

Keskustelu

Virtsarakon syöpä on merkittävä syy sairastavuus ja kuolleisuus korkea toistumisen määrä ja tarve usein seurannan valvonta. Tällä hetkellä seuranta uusiutumisen edellyttää kystoskopian puoliksi rutiininomaisesti, tyypillisesti kunnes laaja taudista vapaan ajan käynyt ilmi. Entistä facile, vähemmän invasiivisia diagnostisia menetelmiä olisi edullinen potilaan hoitoon ja saattaa lisätä seuranta valvonta noudattamista. Mittaaminen virtsan aineenvaihduntatuotteiden voi tarjota kumppani diagnostinen menetelmä, joka voisi helpottaa virtsarakon syövän uusiutumiseen ja ehkä myös osaltaan päädiagnoosina.

Viimeaikaiset metabolomic tutkimukset ovat osoittautuneet arvokkaiksi tunnistamisessa syöpä biomarkkereita ja saamaan oivalluksia rooliin metabolisen uudelleenohjelmointi käynnistymiseen ja etenemiseen syöpäsairauksia. Metabolinen kyseeseen kasvainsoluissa on yleinen ilmiö, ja on nyt tunnustettu syntymässä tunnusmerkki syövän [28]. Muutokset metaboliittitasoihin johtuvat kasvaimen metabolisen uudelleenohjelmointi voi tarjota ainutlaatuisia mahdollisuuksia biomarkkereiden löytö. Esimerkiksi 2-hydroxyglutarate lisääntyy glioomis-, multippelin myelooman ja paksusuolen syöpä [29] ja kohonnut sarkosiini liittyy eturauhasen ja peräsuolen syöpä [30], [31]. Metaboliitit, jotka liittyvät kasvainsolujen metabolisen uudelleenohjelmointi tai ehkä kasvaimeen strooman vuorovaikutukset voisivat olla mahdollisia näyttää muutoksen tasoa ei ainoastaan ​​kasvain itse kudoksesta, mutta myös matriisit, kuten veressä tai virtsassa, jotka tukevat ottoa tai erittymiseen biokemikaalien liitetty kasvaimen kasvuun tai invaasio. Useissa tutkimuksissa on raportoitu hyödyllisyydestä metaboliitin biomarkkereiden diagnosoida, kerrostuvat ja seurata syöpäpotilaiden [31] – [34].

Tämä tutkimus profiloitu 430 virtsanäytteiden kaksi ikäluokat aiheita, joilla tiedetään positiivinen tai negatiivinen BCA diagnoosit ja sellaisena edustaa kattavin seulonta virtsarakon syövän virtsametaboliitista biomarkkereiden tasalla. Aikaisemmat tutkimukset ovat mitattu rajallinen määrä metaboliitteja virtsassa (tyypillisesti vähemmän kuin 25). Ei-kohdennettu UPLC /massaspektrometrialla perustuu teknologiayhteisö Tässä tutkimuksessa käytetyt helpottaa tunnistamista ja suhteellinen kvantitointi 500 kemiallisia yhdisteitä, virtsanäytteistä, suuresti laajentaa useita mahdollisia biomarkkereiden ehdokkaita yli aiemmin kuvattu. 25 aineenvaihduntatuotteiden valittiin kohortin 1 arviointia varten riippumattoman kohortissa 2 tietokokonaisuutta. 25 biokemikaalien tunnistaa ehdokas biomarkkerit kattaa laajan aineenvaihdunnan reittejä. Vaikka 25 ehdokasta biomarkkereiden setti sisälsi sekä lisätä ja vähentää aineenvaihduntatuotteiden – valittu parhaiten tutkia usean analyytin ennakoiva algoritmit – hypoteeseja lisäämään virtsan aineenvaihduntatuotteiden BCA helpommin syntyy kuin hypoteeseja laski metaboliittitasoihin. Lisääntynyt aineenvaihduntatuotteiden voisi johtua kasvain metaboliitit erittyvät virtsaan tai jakautuminen tai muuttuminen ei-pahanlaatuisten luukudoksen hyökkäyksen kasvain epiteelin läpi seinän. Tulehdusreaktioita johtuvat läsnäolo kasvain saattaisi myös johtaa kohonneeseen aineenvaihduntatuotteiden. Lasku aineenvaihduntatuotteita saattaa johtua pienempää Metaboliittien erittymisen kasvaimen soluihin suhteessa normaaliin epiteelin tai saantitiet aineenvaihduntatuotteiden virtsaan kasvaimeen tai viereiseen kudokseen. Muutokset systeeminen metabolia aiheuttamat tekijät vapautuu rakkokasvaimista tai uusittu viereisten kudosten ja myöhemmät erittyminen virtsaan, saattaa myös aiheuttaa muutoksia virtsassa metaboliittitasoihin, sekä nousut ja laskut. 25 aineenvaihduntatuotteiden valittiin biomarkkerina ehdokkaita kohortti 1 datajoukon useita ehtoja. Satunnaisen metsän analyysi testaus 25 aineenvaihduntatuotteet vasten kohortti 2 datajoukon havainnollistaa, että osajoukko 25 erottuivat paremmin esiintyjiä. Palmitoyl sfmgomyeliini, laktaatti, adenosiini ja sukkinaatti oli korkeimmat ennustearvo, muiden aineenvaihduntatuotteiden näyttämällä erilaisia ​​pienentää arvoja. Yksi mahdollinen selitys heikentyneet monien kohortin 1 ehdokas biomarkkerit voisi olla, että kohortin 1 virtsarakon syöpä positiivista virtsanäytteet johdettu suurempi prosentuaalinen osuus, joiden korkea vaihe /korkealaatuista kasvaimia kuin läsnä koehenkilöllä kohortin 2. on myös mahdollista, että monet kohortin 1 ehdokas biomarkkerit olivat vääriä positiivisia johtuvat ainutlaatuiset piirteet kyseisen näytteen väestöstä.

25 kohortti 1 ehdokas biomarkkerit ovat monipuolisia metaboliareitit – osittain siksi koulutusjakson monimuotoisuus oli suodattimen valitsemiseksi joukon 25 välillä 200 aineenvaihduntatuotteiden tilastollisesti merkitseviä eroja verrattaessa kohortti 1 BCA positiivinen virtsoissa yhdistetyistä ryhmästä kaikkien negatiivisten kontrollien. Useita reittejä edustaa ehdokas aineenvaihduntatuotteet olivat erityisen kiinnostavia. Merkittävä metabolinen tunnusmerkki syöpä on todettu usein siirtyminen oksidatiivisen fosforylaation enemmän riippuvuutta sokeriaineenvaihduntaan kautta Glykolyysivaiheen, jopa aerobisissa olosuhteissa (Warburg aineenvaihdunta) [35]. Vaikka monet eri mekanismit uskotaan osaltaan tämä kytkin aineenvaihdunta, tulokset ovat lisääntynyt otto ja kulutus glukoosin, lisääntynyt laktaatin ja eritys, kohonnut sitraatti tuotanto ja lisääntynyt pentoosifosfaattireitistä (PPP) aktiivisuus. Upregulating näistä reiteistä antaa energiaa, rasvahappojen, nukleotidibiosynteesiin, ja NADPH sukupolvi [36], [37]. Laktaattitasot lisääntyivät merkitsevästi virtsaan näytteet virtsarakon syövän potilaiden kohortit 1 ja 2, ja se voi olla osoitus lisääntynyt Glykolyysivaiheen vuonna BCA soluissa. Lisäksi laktaatti, β-hydroxypyruvate, jota ei ole aiemmin liitetty kasvaimen aineenvaihduntaa, oli merkittävästi koholla virtsassa ensisijainen virtsarakon syöpä aiheita. β-hydroxypyruvate voidaan liittää glykolyysin vaikka sen muodostumisen kautta seriini-pyruvaattitransaminaasi reaktion tai sen johdettu siitä glykolyysijärjestelmän välituote 3-fosfo- [38].

kolme metaboliittia, jotka liittyvät rasva-aineenvaihdunnan, palmitoyyli sfingomyeliiniä, fosfokoliini ja arakidonaatista (kohortti 2 vain) on muuttunut merkittävästi virtsassa BCA aiheista. Tämä oli hieman yllättävä, koska;