Krooninen sairaus

tiivistelmä

Yksilöllinen bakteereja ja siirtymiä koostumuksessa microbiome on liitetty ihmisen sairauksia kuten syöpää. Tutkia muutoksia microbiome liittyy suusyöpä, me profiloitu syöpien ja anatomisesti Hyväksytty kontralateraalista normaalia kudosta samalta potilaalta sekvensoimalla 16S rDNA hypervariaabelialue amplikoneja. Syöpänäytteissä sekä löydön ja myöhemmin vahvistuksen kohortin runsaus

firmicutes

(erityisesti

Streptococcus

) ja

Actinobacteria

(erityisesti

Rothia

) pieneni merkitsevästi suhteessa kontralateraaliseen normaalia näytettä samasta potilaasta. Merkitsevää pienenemistä runsaasti näitä phyla havaittiin ennalta syöpiä, mutta ei verrattaessa näytteitä contralateral sivustoja (kielen ja lattian suussa) terveistä yksilöistä. Painotettu UniFrac pääasiallinen koordinaatit analyysi perustuu 12 taxa erotettu useimmat syövät muista näytteistä kanssa suurin erottaminen solmun positiivisia tapauksia. Nämä tutkimukset alkavat kehittää puitteet hyödyntämällä suullista microbiome seurannan suusyöpää kehitystä, etenemisen ja uusiutumisen.

Citation: Schmidt BL, Kuczynski J, Bhattacharya A, Huey B, Corby PM, Queiroz ELS, et al . Muy-Teck Teh (2014) muutokset runsaus Oral Microbiota Associated Oral Cancer. PLoS ONE 9 (6): e98741. doi: 10,1371 /journal.pone.0098741

vastaanotettu: 21 elokuu 2013; Hyväksytty: 7. 2014; Julkaistu: 02 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Schmidt et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain myöntämällä GS Junior 454 Sequencing aikavälillä Rochelta, National Center for Research Resources, National Center for edistäminen Translational Sciences, ja toimiston johtaja, National Institutes of Health, kautta University of San Francisco ( UCSF) – CTSI lupanumeroon UL1 RR024129, ja yksittäiset tutkija palkintoja National Cancer Institute avustus (R01 CA131286, R21 CA 941186215) ja National Institute of Dental ja kallon ja kasvojen tutkimus (R01 DE019796). Sen sisältö ovat yksin vastuussa kirjoittajien eivätkä välttämättä edusta näkemykset NIH. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: kuitti palkinnon sekvensointi Rochelta, kaupallinen rahoittaja, ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Dr. Justin Kuczynski on työntekijä Toiseksi Genome, Inc. Hänen työsuhteensa ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Vuosittain ~ 22000 amerikkalaiset ovat diagnosoitu suullinen syöpä, joista 90% on levyepiteelisyöpä (SCC). Viiden vuoden eloonjääminen, 40% ei ole parantunut viimeisen 40 vuoden aikana, ja se on yksi pienimmistä luvuista suurten syöpä sivustoja, mikä lisää ihmisiä kuolee suusyövän kuin melanooma, kohdunkaulan tai munasarjasyövän Yhdysvalloissa. Maailmanlaajuisesti on 350,000-400,000 uutta tapausta diagnosoidaan vuosittain. Toisin kuin useimmat muut anatomiset sivustoja, jotka ovat vähentyneet syövän ilmaantuvuus, esiintyvyys suusyövän lisääntyy, erityisesti nuorten ja naisten [1], [2]. Tärkeimmät riskitekijät, tupakan ja alkoholin käyttö, ei voi selittää muutokset esiintyvyys, sillä suusyövästä myös esiintyy yleisesti potilailla, joilla ei ollut alkoholia tai tupakkaa altistus [3]. Äskettäin ihmisen papilloomaviruksen (HPV) on todettu, etiologinen tekijä suun ja nielun syöpä, mutta HPV-infektio ei vaikuttanut merkittävästi suusyövän, koska virus on harvoin löytyy näitä syöpiä (2-4% tapauksista) [4] . Siten Muilta, mahdollisesti ympäristötekijät vielä löytyy.

rooli bakteeri-infektion aiheuttaa tai edistää syövän on tunnettu suhteen yhdistyksen

Helicobacter pylori

mahalaukun syöpä [5], ja muiden syöpien, mukaan lukien sappirakon, koolon-, keuhko- ja eturauhassyöpää, on liittynyt erityisesti bakteeri-infektioiden [6], [7], [8]. On perusteltua kysyä, siis, jos muutokset koostumuksessa tavanomaisen suuontelon microbiome, joka koostuu yli 600 eri bakteerilajien [9] ja /tai krooninen bakteeri-infektio voi olla promoottorit tai aiheuttaa suun syöpä. Itse muutokset mikrobipopulaatiossa liittyy yleisesti hampaiden sairauksien kuten parodontiitin, mikä on todennäköisesti monimikrobisten sairaus, seuraus tiettyjen patologisten organismien [10], ja krooninen parodontiitti on raportoitu olevan riskitekijä suullinen syöpää edeltävät vaurioita ja syövät [11]. Kohonneita ja koostumuksen muutoksia bakteerien ja sienten mikrobiston suuontelon on raportoitu suun kautta ennalta syöpiä ja syövät [12]. On kuitenkaan ole yksimielisiä raportteja koskien syöpään liittyvät muutokset suun microbiome. Tämä sekaannus on saattanut johtua siitä varhain tutkimukset rajoittuivat analyysi verrattain pienen määrän tunnettujen ja viljeltävien suun bakteerien lajeja [13], [14], ja myöhemmissä tutkimuksissa käyttäen molekyylimenetelmät keskitytään erityisesti phyla [15] tai kloonattu ja sekvensoitu pieni määrä klooneja näytettä kohden [16], [17].

Culture riippumattomia menetelmiä, erityisesti ne, jotka käyttävät seuraavan sukupolven sekvensointi hypervariaabelin alueen 16S ribosomaalisen alayksikön, tarjoavat keinon kattavammin ja tarkasti profiloida microbiome terveyden ja sairauden [18]. Tällaiset tutkimukset suun microbiome [16], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28] paljastaa , toisaalta, että terve suun microbiome on ominaista suhteellisen pieni määrä bakteerin phyla (9-13), yleisimmin raportoituja runsas phyla ollessa

firmicutes

,

proteobacteria

,

Bacteroidetes

,

Actinobacteria

, ja

Fusobacteria

[16], [19], [20], [21], [22], [23], [24 ], [25], [26], [27], [28]. Toisaalta, suurin osa yksilöiden välisiä eroja on katsottu johtuvan monimuotoisuuden lajin tai kannan [24].

Streptococcus

useimmiten havaittu olevan hallitseva suvun terve suun microbiome, ja harvemmin

Prevotella

,

Veillonella

,

Neisseria

, ja

Haemophilus

hallitsevat yksilön suullinen microbiome [19], [24]. Vaihtelu on myös havaittu mikrobien koostumusta Biokalvojen kussakin intraoral elinympäristö (

esim

., Hampaan pintaan, sivusuunnassa ja selkä kielen jne), todennäköisesti heijastaa eri pintaominaisuudet ja mikroympäristöihin [21], [24].

kunnolla selvittämään mahdollisia muutoksia koostumuksessa suun kautta microbiome suun syöpä, vuoksi on tarpeen valvoa eroja suullista alisivustot ja yksilöiden välisiä eroja. Lisäksi korkeat uusiutuminen ja levinneisyys toisen ensisijaisen suusyöpä tukevat ehdotusta, että näiden syöpien kehittää ulos kentän geneettisesti muutettu soluja, käsite ”kentän cancerization” [29]. Tällaisia ​​aloja on raportoitu jatkaa niin paljon kuin on 7 cm kasvaimen ja näkyvän kliinisesti normaaleja [30]. Näistä syistä olemme tutkineet suun liittyvän syövän microbiome ei-invasiivisesti näytteitä syövän vaurion ja anatomisesti sovitettu contralateral alueella normaalin kudoksen kustakin yksilöstä. Olemme altistetaan DNA eristettiin näistä näytteistä 16S ribosomialayksikköä vahvistusta ja sekvensointi. Näillä tutkimuksissa oli alkaa luoda perusta, joka mahdollistaisi hyödyntäminen suullisen microbiome hoitoon ja seurantaan suusyövän aloittamista, etenemistä ja uusiutumisen.

Tulokset

tutkia muutoksia suullinen microbiome liittyy suusyövän, me takautuvasti kerättyjen syövän ja anatomisesti sovitettu potilaan kliinisesti normaaleja näytteitä viidestä potilaasta (taulukko 1, Study 1 Discovery Kohortti, taulukko S1). Vahvista ja laajentaa alkuperäistä havaintoja, teimme toisessa tutkimuksessa (tutkimus 2, taulukot S2 – S6, näytteiden kokonaismäärä = 83), jossa me takautuvasti kerättyjen riippumaton sarja leesiottoman ja anatomisesti Hyväksytty kliinisesti normaaleja näytteitä suusyövän (taulukko 2, tutkimus 2 Vahvistus Kohortti, taulukko S2), karsinooma

in situ

(CIS, taulukko S3) ja ennalta syöpäpotilailla (taulukko S4), sekä vasemmalla ja oikealla puolella sivusuunnassa kielen ja lattia suun terveiden normaalien yksilöiden (taulukko S5). Tutkimuksessa 2, me myös riippumattoman analyysin Ensimmäisen viiden syöpäpotilaiden alkaen Study 1 ja kuusi paria samanlaiset näytteet (kolme syöpä ja kolme ennalta syöpäpotilailla, taulukko S6). Jälkimmäinen sisällytettiin arvioida toistettavuus näytteen kerääminen ja käsittely ja eivät sisälly mihinkään analyyseissä (katso lisäkeskusteluja menetelmät).

Tutkimus 1. Discovery kohortissa

pyyhittiin suun syöpä vaurion ja vastaava anatomisesti sovitettu kliinisesti normaalin kudoksen alue Discovery kohortin viisi potilasta (taulukko 1). Käyttäen Roche GS Junior väline suorittaa pyrosekvensointi, saimme, yhdellä ajolla, yhteensä 104380 sekvenssien amplikonien joka kesti V4 hypervariaabeli alue bakteerin 16S pienet ribosomialayksikköä (taulukko S7). Määrä raaka-sekvenssin lukee monipuolinen by 10-kertaisesti yli näytteitä, jotka vaihtelevat 1231 enintään 17682 raaka lukee. Laatu suodatettu sekvenssit etsittiin vastaan ​​Greengenes viitetietokantaa 16S sekvenssit, ryhmittyneistä 97%, ja Operational Taksonominen Units (Otus) jaettiin taksonominen luokittelu sellaisia ​​mothur n Bayes luokitin. Niistä 92987 sekvenssit, jotka kulkivat laatu suodatus, 81308 olivat samankaltaisia ​​tiedossa bakteerit ja useimmat voidaan luokitella sukuun tasolle (65037), joissa on vähemmän luokiteltu lajitasolla (17115). Sequence kattavuus oli vaihteleva poikki näytteitä; määrän lukee näytettä kohti määritetty Otus (lukuun ottamatta suodatettua huonon laadun tai puuttuminen liittyvän sekvenssin Greengenes viitetietokannassa) vaihteli 1,038 enintään 14359, ja käsitti 76-85% raaka-sekvenssit (taulukko S7 ). Kaikkiaan 276 Otus tunnistettiin (per näyte alue, 37-161, (taulukko S8). Alipaine- analyysin perheiden tasolla osoitti melko laaja valikoima α monimuotoisuuden kanssa havaittujen perheiden vaihtelevat ~15-28 (kuva S1a). Kolme potilasnäytettä, normaali ja syövän potilaasta 117 ja normaalissa näytteessä potilaasta 142, tasanteen vähemmän perheisiin kuin muiden näytteiden, mikä osoittaa jonkin verran vähentää monimuotoisuutta näistä näytteistä. Kaikki näytteet tasaantui jossain määrin, mutta ei täysin, edelleen sekvensointi todennäköisesti paljastaa lisää perheitä. Toisaalta, pyrosekvensointi melu ja PCR-virheiden voisi virheellisesti lisätä OTU numerot [31]. samanlainen vaikutus havaittiin klo suvun tasolla (kuvio S1B).

moninaisuuden microbiomes liittyvän anatomisesti Hyväksytty suun syöpä ja normaali näytteet

Otus syöpä ja kliinisesti normaaleja näytteitä Discovery kohortin luokiteltiin 12 phyla (taulukko S7). valtaosa kuului yksi viidestä phyla (99,2%, normaali , 98,0% syövät) kanssa runsaammin phyla ollessa

firmicutes

,

Bacteroidetes

,

proteobacteria

,

Fusobacteria

, ja

Actinobacteria

(taulukko 7, kuvio 1). Vaikka jakelu syövän ja kliinisesti normaali näytteet näistä viisi yhteistä phyla vaihteli henkilöissä (kuvio 1), kaikilla potilailla, havaitsimme merkittävä väheneminen runsaus

firmicutes

ja

Actinobacteria

syövän verrattuna anatomisesti Hyväksytty kontralateraalista kliinisesti normaali potilaan näytteestä, (p = 0,004, FDR oikaistu p = 0,02 ja p = 0,028, FDR oikaistu p = 0,07, vastaavasti). Havaitsimme myös, että osuus

Fusobacteria

lisääntyi kaikilla potilailla, mutta muutos runsaasti ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,074, kuva 2). Toteamme kuitenkin, että tarkkailla yhtäpitävät runsaasti kolmessa phyla tässä pienessä kohortin on erittäin merkittävä. Unohtaminen vuorovaikutukset joukossa suhteellinen runsaus eri phyla, binomimallia testi tuotosten p = 0,0022, kun todennäköisyys (alle nollahypoteesi) on kolmella tai useammalla phyla jossa (kaikki viisi potilasta jakaa lisäystä) tai (kaikki viisi osake vähennystä).

suhteellinen jakauma phyla (prosenttia sekvenssit) on esitetty kunkin potilaan näytteestä, joilla on kliinisesti normaali näytteet näytetään yhdessä päälle ja syöpänäytteissä pohjalle.

(a – e ) Suhteellinen runsaus kunkin viiden runsaammin phyla syövissä verrattuna kliinisesti normaaleja näytteitä kustakin viidestä potilaasta. Huomaa, että tiedot esitetään eri mittakaavoissa, mikä runsaasti pääjaksot. Suuruudet muutosten runsaus ovat selvästi suurempia kuin tilastollinen laskenta melu, kuten on osoitettu virhepalkin arvioiden jotka perustuvat neliöjuuri todellisesta määrästä lukee. (F) muutos suhteellinen runsaus näkyy ero runsaasti phyla liittyy syöpiin verrattuna anatomisesti Hyväksytty contralateral kliinisesti normaaleja näytteitä. Syövät, pienenee suhteellinen runsaus

firmicutes

ja

Actinobacteria

havaittiin kaikilla potilailla, kun taas suhteellinen runsaus

Fusobacteria

kohosi syövät kaikista potilaista.

tutkimus 2. Vahvistus kohortti

vahvista näiden ensimmäisten havaintojen teimme Study 2. Kuten ennenkin, me pyyhittiin molemmat vaurio (syöpä tai pre-syöpä) ja kontralateraalista anatomisesti kliinisesti normaaleja Hyväksytty sivusto. Me pyyhittiin vasemmalle ja oikealle puolelle sivusuunnassa kielen ja lattian suun terveiden yksilöiden. Käyttäen Illumina MiSeq väline, sekvensoimme amplikonien ulottuen 16S rDNA V4 hypervariaabelialue. Saimme 4486196 raaka järjestyksessä lukee vaihteluväli 31109 ja 125847 lukee per näytteen ilman kaksi näytettä, jotka epäonnistuivat sekvensointi (taulukot S9 – S 13). Me osoitettu taksonominen luokittelu on Otus kuin ennen. Sekvenssien, jotka kulkivat laatu suodatus, 4444432 olivat samankaltaisia ​​tiedossa bakteerit ja useimmat voidaan luokitella sukuun tasolle (4148785) vähemmillä luokiteltu lajitasolla (1650037). Me tunnistaa yhteensä 2107 Otus (per näyte alue, 90-482, taulukot S9 – S 13). Alipaine- analyysi osoitti melko laaja valikoima α monimuotoisuuden lähes kaikkien näytteiden tasanteen jossain määrin (kuva S2). Kuten edellä, sekvensointi melu ja PCR virheet voivat lisätä OTU numeroita [32].

moninaisuuden microbiomes liittyy anatomisesti Hyväksytty näytteitä suusyövän, pre-syöpä ja terve normaali yksilöiden Tutkimus 2

Me ensin katsoi kerätty yhdeksän 10 Discovery Cohort näytteitä, jotka olivat onnistuneesti profiloitu tutkimus 2 (taulukko S9) korreloivat voimakkaasti alkuperäiset tiedot on saatu 454 pyrosekvensointi (kuva S3). Sitten katsotaan Vahvistus Kohortissa vain näytteitä syöpäpotilaista ei sisälly Discovery kohortin

so

., Me ulkopuolelle yhdeksän Discovery kohortti näytteet (taulukko 2, Taulukko S9). Olemme jälleen havaittu, että suurin osa Otus (61-100%) kuului yksi viidestä runsaammin phyla (

firmicutes

,

Bacteroidetes

,

proteobacteria

,

Fusobacteria

, ja

Actinobacteria

) (kuva 3a, taulukko S14). Sitten kysytään oli merkittäviä vähennyksiä runsaasti

firmicutes

ja

Actinobacteria

syövän verrattuna anatomisesti Hyväksytty kontralateraalista kliinisesti normaaleja potilaan näytteestä. Kuten olimme havaittu Discovery kohortin (tutkimus 1), oli merkittävä väheneminen runsaasti näiden kahden phyla syövissä verrattuna anatomisesti Hyväksytty kontralateraalista kliinisesti normaalin potilaan näytettä (p = 0,042 ja p = 0,004, tässä järjestyksessä), vahvistaa alkuperäistä havainnot (kuvio 3b, kuva S4).

(a) Näkyy on suhteellinen jakauma phyla (prosenttia sekvenssit). Syöpien, me mukana vain potilaita, joille sekä syövän ja kontralateraalista kliinisesti normaali näytteet olivat saatavilla. (B) Muutos suhteellinen runsaus phyla esitetty ero runsaasti phyla liittyvien syöpien tai ennalta syöpiä verrattuna anatomisesti Hyväksytty contralateral kliinisesti normaaleja näytteitä. Terveellistä normaali näytteitä, vertasimme vasemmalle ja oikealle puolelle sivusuunnassa kielen tai lattialle suuhun.

Tutkimuksessa 2, myös havaittu, että suurin osa Otus näytteissä pre-syöpäpotilasta ja terve normaalit (kuva 3a) kuului yksi viidestä phyla

firmicutes

,

Bacteroidetes

,

proteobacteria

,

Fusobacteria

, ja

Actinobacteria

(pre-syöpiä = 99-100%, terve normaali = 87-100%). Me taas kysytään merkittävästi vähentää runsaasti

firmicutes

ja

Actinobacteria

voi olla läsnä, kun verrataan ennalta syöpiä ja anatomisesti Hyväksytty kontralateraalista kliinisesti normaaleja potilaan näytteitä. Teimme huomaavat runsaasti

firmicutes

ja

Actinobacteria

aleni (p = 0,048 ja p = 0,037, tässä järjestyksessä), mikä viittaa siihen, että muutokset runsaasti näiden kahden phyla voi tapahtua aikaisin (Kuva 3b ). Sitä vastoin emme löytäneet merkittäviä eroja runsaasti näiden kahden phyla tai viidestä runsaammin phyla verrattaessa vasemmalle ja oikealle puolelle sivusuunnassa kielen ja lattian suussa terveiden normaalien yksilöiden (kuva 3b).

tutkia muutoksia runsaasti at suvun tasonsa viiden runsaammin phyla, me pidetään potilas Hyväksytty näytteet Vahvistus Colson ja myös neljä viidestä Discovery Cohort tapaukset onnistuneesti analysoitiin tutkimus 2 (14 syöpiä 13 potilaat, taulukko S9). Me normalisoitui määrä Otus miljoona laskee, (taulukko S15) ja kunkin Mollusca, päätimme muutokset runsaasti sukuihin joka edusti 10% Otus yli 20% näytteistä (kuvio S5 ja S6). Merkittävä väheneminen runsaasti havaittiin

Streptococcus

(p = 0,003) ja

Rothia

(p = 0,021) syövissä verrattuna anatomisesti Hyväksytty kliinisesti normaali näytteet (taulukko S16). Sen sijaan havaitsimme, lisääntynyt runsaasti

Fusobacterium

(p = 0,044) verrattuna täsmäsi kliinisesti normaaleja näytteitä syöpäpotilailla. Pre-syöpiä, havaitsimme vähensi runsaasti

Streptococcus

(p = 0,042) (taulukko S16). Emme ei havaittu huomattavia eroja runsaasti näitä yleisempiä sukujen verrattaessa runsautta otetuissa näytteissä vasemmalle ja oikealle puolelle sivusuunnassa kielen ja lattian suussa terveiden yksilöiden (taulukko S16).

totesi myös, että vaikka emme löytäneet yhtäpitävät runsaasti

Bacteroidetes

verrattaessa sisällä yksilöiden (kuva 3b), näytteet syövän ja pre-syöpäpotilailla (sekä leesiosta ja anatomisesti Hyväksytty kontralateraalista kliinisesti normaalia kudosta) liitettiin lisääntyneeseen runsaasti

Bacteroidetes

verrattuna näytteisiin terveistä normaaleista yksilöistä (kuvio 3a).

Prevotella

lajeja, erityisesti, erosivat ja mukana esimerkiksi Otus vastaa

P. intermedia

,

P. melaninogenica

,

P. nanceiensis

,

P. Oris

,

P. tannerae

ja luokittelemattomat lajit (kuva S5, taulukko S15). Kohonneita

P. melaninogenica

on raportoitu aikaisemmin mahdollisena syljen biomarkkereiden suusyövän [33] ja

P. intermedia

on periodontal taudinaiheuttaja [34]. Lisätutkimuksia tarvitaan ymmärtää osuudet yleisen (

Bacteroidetes

) ja leesio koskevat muutokset (

Actinobacteria

,

firmicutes

) on microbiome suusyövän ja pre -cancer potilaista.

Otus erottavien syövän anatomisesti täsmäsi contralateral normaalin potilaan näytteitä

Vastatakseen tarpeeseen biomarkkerit ennustaa käyttäytymistä suusyöpä joka voitaisiin määrittää ei-invasiivisia testejä, kysyimme onko syöpä otokset voitaisiin erottaa bakteeri- koostumus. Ottaen huomioon syövän /normaali pariksi näytteitä tunnistimme 11 Otus alkaen pääjaksot

Actinobacteria

(

Actinomyceksen

ja

Rothia

, 2 Otus kustakin suku) ja

firmicutes

(

Streptococcus

, 7 Otus), jotka olivat merkittävästi vähentyneet syöpien ja yksi OTU päässä phylum

Fusobacteria

(

Fusobacterium

), joka korotettiin syövissä verrattuna anatomisesti Hyväksytty contralateral normaalia potilaan näytteitä (taulukko S17). Painotettu UniFrac pääasiallinen koordinaatit analyysi (PCoA), joka perustuu tämä joukko Otus erotettu useimmat syövät normaalista ja ennalta syövän näytteiden viisi seitsemästä imusolmuke positiivinen tapauksissa muodostavat tiukan klusteri oikeassa alakulmassa juonta (kuva 4). Etäpesäke kohdunkaulan (niska) imusolmukkeiden on määräävä tekijä suusyövästä elossaololuku [35]. Nykyinen ole luotettavia menetelmiä, joilla arvioidaan etäpesäkkeiden riski tulosten potilailla on rutiininomaisesti tehdään muita leikkaus poistaa imusolmukkeet, vaikka suurin osa eivät hyödy menettelystä. Tiukka klusterointi näytteiden solmusta positiivisten potilaiden kuviossa 4 viittaa siihen, että muutokset koostumuksessa suusyövän microbiome voi myös olla lupaava kasvaimeen liittyvä biomarkkeri etäpesäkkeiden riski.

PCoA perustuu painotettu UniFrac välimatka näytteiden annetaan runsaasti 12 Otus. Axis 1 (PCoA1): 54% vaihtelua selitti. Axis 2 (PCoA2): 24% vaihtelua selitti. N0 ja N + osoittavat imusolmukestatuksesta syöpäpotilaan, N0 = imusolmukenegatiivisista, N + = imusolmukkeisiin. Syöpä ohjaus ja ennalta syövän ohjaus ovat contralateral kliinisesti normaaleja potilaan näytteitä. Muut tunnisteet näytettä terveistä normaaleista yksilöistä.

Koko micrbiome – β monimuotoisuus

tutkimiseksi näytteen ja näytteen erilaisuus, me alinäytteenotetaan data satunnaisesti valitsemalla 31109 sekvenssit kustakin yhteisöä säädä vaihtelu sekvensointi syvyys (taulukko S18). Kun otetaan huomioon kolme näytettä ryhmään (Syövät, Healthy Normals, ja Pre-syövät), havaitsimme merkittävää microbiome eroja potilaiden identiteetti perustuu sekä painotettuun UniFrac (runsaus) ja Painottamaton UniFrac (läsnäolo /poissaolo) mittarit (taulukko S19, kuviot S7 ja S8). Mikään muu vertailuja, kuten vasen vs. oikea, sekvenssien määrä tai vaurion (syöpä tai ennalta syöpä) vs. kontrolli normaali sivustoja paljastanut merkittäviä eroja. Nämä havainnot ovat sopusoinnussa muiden tutkimuksia, jotka ovat korostaneet yksilöiden välisiä eroja suullisen microbiome [24]. Lisäksi ne tukevat tutkimuksen suunnittelu, joka mittaa muutoksia microbiome sisällä yksilöiden,

eli

. Käyttämällä kullekin potilaalle oman valvonnan.

Keskustelu

tutkimus suun pahanlaatuisuuteen liittyvän microbiome muutoksia, teimme Discovery näytön (tutkimus 1), jossa me ei-invasiivisesti näytteitä syöpien ja kontralateraalisen kliinisesti normaalin kudoksen näytteitä kunkin yksittäisen. Vertailu kokoonpano mikrobien yhteisöjä potilaita tunnistettiin muutoksia runsaasti

Actinobacteria

ja

firmicutes

. Olemme vahvistaneet nämä havainnot toisessa Vahvistus Cohort (tutkimus 2) ja edelleen havaittu merkittäviä muutoksia runsaus

Actinobacteria

suvun

Rothia

ja

firmicutes

suvun

Streptococcus

kun otetaan huomioon kaikki syövät tutkimus 2 (taulukko S16). Vaikka emme nähneet merkittävää muutosta runsaasti Mollusca

Fusobacteria

joko Discovery tai vahvistus Kohorteissa, löysimme merkittävä kasvu runsaasti

Fusobacteria

sukuun,

Fusobacterium

harkittaessa kaikille syöpäpotilaille tutkimuksessa 2. Toteamme, että vaikka ikäluokat tutkittujen potilaiden täällä ovat pieniä ja heterogeeninen, meidän toteamukset runsaasti phyla ovat samanlaiset kuin julkaistuissa tutkimuksissa, jossa keskityttiin kattavan analyysin suullista microbiome. Lisäksi käyttää erilaisia ​​sekvensointiteknologioihin mitata runsaasti 16S rDNA amplikonien tutkimuksissa 1 ja 2 tukee luotettavuutta havaintomme. Tästä huolimatta edelleen suurempi tutkimusten avulla olisi voitava määritellä paremmin suusyövän liittyvät muutokset runsaasti näiden phyla ja suvut. Lisäksi havaitsimme muutoksia runsaasti

firmicutes

(

Streptococcus

) yhdessä suun kautta ennalta syöpiä, mikä viittaa siihen, että suullinen vaurio liittyvät muutokset koostumuksessa mikrobien voi tapahtua varhain suun syövän kehittymisen ja /tai airut syövän etenemistä.

Tupakointi on riskitekijä suun sairauksien, kuten syövän ja parodontiitti. Tutkimukset ovat osoittaneet, että tupakointi vaikuttaa koostumuksen bakteeri-yhteisöjä suuontelon, mukaan lukien esimerkiksi, syljen microbiome terveiden tupakoitsijoiden ja tupakoimattomien [36] ja subgingivaaliseen microbiomes potilailla, joilla on parodontiitin [37], samoin kuten hammaskiven muodostusta biokalvojen [38]. Tutkimuksessamme löysimme mitään todisteita yleisiä eroja microbiomes joka voisi johtua tupakointia, mutta vain kolme tupakoijilla ja neljä tupakoimattomien meidän syöpäpotilaan kohortteja Esimerkiksi, emme voi tehdä mitään päätelmiä tässä vaiheessa. Toisaalta, koska käytimme kullekin potilaalle hänen /hänen oma ohjaus, emme odottaa tupakointi liittyy eroja runsaasti mikrobiston syöpään liittyvän, koska tupakointi vaikuttaa sekä ohjaus päällä ja syöpä. Toisaalta, tupakoitsijoilla, solut kliinisesti normaaleja sivustoja ja syövät minun reagoivat eri tupakoinnin aiheuttamiin muutoksiin biofilmin muodostumiseen, esimerkiksi nostamalla mahdollisuus, että vaikka syöpä liittyy muutoksiin runsaasti mikrobiston tupakoitsijoilla ja tupakoimattomilla näyttävät samanlaisilta, muodostumista ja toiminnalliset seuraukset muuttunut microbiomes voivat poiketa näissä potilasryhmissä. Vastaavia näkökohtia voidaan soveltaa heikentyneiden henkilöiden.

bakteerien esiintyminen suusyöpä ja /tai sitä, että bakteeri yhteisöt liittyvät suusyövän on raportoitu aikaisemmin joko kulttuuri riippuvainen [13], [14] tai molekyylin menetelmiä [15], [16], [17], mutta mitään johdonmukaista havaintoja on raportoitu eri puolilla näissä tutkimuksissa. On kuitenkin vaikea vertailla vaikkapa vain kahteen tuoreeseen tutkimukseen raportointi runsaasti bakteereja [16], [17] ja tässä tutkimuksessa, koska ne eroavat toisistaan ​​(a) näyte tyyppi (moppi, tässä tutkimuksessa vs. kudosnäyte [16] [17]), (b) suuontelon päällä, (c) lähde potilaan vastaaviin normaaleihin vertailunäytteet (anatomisesti sovitettu contralateral kliinisesti normaalin, tässä tutkimuksessa, ylempi aerodigestive suolikanavan limakalvojen [16], viereisen normaalin [17]), (d ) monistettu alue 16S ribosomaalisen geenin (V4, tässä tutkimuksessa, V4-V5 [16], tai V1-V4 [17]), (e) menetelmää (Sanger [16], [17] vs. pyrosekvensointi tai MiSeq, tässä tutkimuksessa ), ja (f) useita klooneja tai sekvenssin lukee osoitettu Otus näytettä kohden (keskimäärin 8000 ja 55000 lukee per näyte, Study 1 ja 2, vastaavasti, verrattuna ~90 tai ~250 klooneja näytettä kohti [16], [17] ). Esimerkiksi Pushalkar ja työtovereiden [16] raportoi 10 potilaalla todettiin, että 75 ja 80% klooneista (normaali ja syöpä, vastaavasti) oli osoitettu phylum

firmicutes

. Tämä osuus ei ole ainoastaan ​​suurempi kuin 40-0% raportoitu muissa tutkimuksissa suuontelon terveiden tai syöpäpotilaita, mutta koska vain ~90 sekvensoitiin näytettä kohden, on liian vähän klooneja luotettavasti määrittää suhteellinen runsaus muiden phyla vertailuja. Phylum taso analyysi vain 16 kielen, lattia suun ja suuontelon syöpien raportoineet Bebek ja työtovereiden [17] kävi kuitenkin ilmi, syöpään liittyvän lisäys runsaasti Mollusca

Fusobacteria

, sopusoinnussa havaintojemme mutta laski runsaasti

Streptococcus

ei voinut nähdä, koska harvat kloonit määritetty tähän sukuun.

Emme voi erottaa, onko havaitut muutokset mikrobipopulaatiossa kuvastavat sitä, että tietyt bakteerit ovat sopii kiinni ja kasvaa syövän mikroympäristössä tai ovatko ne syöpä edistävät. Edelleen on epäselvää, miten punnita mahdollisia maksuja muutoksista runsaasti sukuihin kuten

Streptococcus

verrattuna vähemmän runsas

Actinobacteria

sukuihin. Mahdolliset roolit bakteerien ja sienien syövän edistämiseen kuuluu sukupolven syöpää aiheuttavia aineita, kuten nitrosamiinia tai muita pro-syöpää aiheuttavia kemikaaleja, krooninen tulehdus ja suoria vaikutuksia signalointi epiteelisoluissa johtavat parempaan leviämisen tai poistaminen apoptoosin [6], [7] , [12], [39]. Vain pieni suun mikrobien voi tarttua kova ja pehmeä suullista kudosten ja kokoonpano monimutkainen suullinen biofilmiä tapahtuu myöhemmin tarttumista toissijainen siirtomaavallat.

Streptococcus

on varhainen colonizer ja

Fusobacterium

(

esim

.,

F. Nucleatum

) on taipumusta yhteistyössä aggregaation monien sukujen, muodostaa silta aikaisin ja myöhään colonizers suun biofilmin [40]. Siten toisaalta havaitut lasku esiintyvyys

Streptococcus

ja runsastuminen

Fusobacterium

sukuihin ennalta syöpiä voisi heijastaa muuttuneita pintaominaisuuksien syöpäsoluja ja strooman, joka ehkä enää tue tarttumista

streptokokki

. Toisaalta, voimme hypoteesina, että muutoksia runsaasti näiden kahden sukujen voi johtaa parannettu proinflammatoristen ympäristössä, koska

Streptococcus

lajeja on raportoitu vaimentamaan

Fusobacterium nucleatum

aiheuttama pro -inflammatory vasteita suun epiteelisolujen [41], [42]. Toteamme myös, että

Fusobacterium nucleatum

kasvanut biofilmin pystyy tunkeutumaan organotyyppisten viljelmiä [43], ja toisaalta, että organismi on viime aikoina raportoitu paksusuolen syövissä [44], [45], lisäksi tukee mahdollisen roolin suusyöpää.

suuontelon tarjoaa suhteellisen ainutlaatuisen mahdollisuuden seuloa vaarassa henkilöitä (suun kautta) syöpä, koska vauriot voidaan nähdä, ja koska me raportoimme täällä, muutos microbiome of syöpä ja ennalta syövän vaurioita verrattuna anatomisesti sovitettu kliinisesti normaalin kudoksen samasta yksilöstä voidaan havaita ei-invasiivisesti talteen vanupuikolla näytteitä. Sylki on muu invasiivisesti kerätty suullinen näyte koostuu pääosin bakteerisoluista, mutta myös irtoa epiteelisolujen ja immuunijärjestelmän soluja.