Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kiinteä parafinoidut (FPE) kudokset ovat potentiaalisesti rikas resurssi tutkimuksiin, jotka koskevat Notch1 syövän ja muiden sairauksien, mutta testit luotettavasti havaitsemaan aktivoidaan Notch1 (NICD1) in FPE näytteet on on puuttunut. Täällä tämän kuilun kehittämällä immunohistokemiallinen (IHC) tahra joka havaitsee neoepitope luoma proteolyyttisen tapahtuman, joka aktivoi Notch1. Sen jälkeen validointi käyttäen ksenosiirrettyjä syöpien ja normaaleissa kudoksissa, joissa tiedetään malleja Notch1 aktivointia, me soveltanut tätä kasvaimiin liittyvät väärin säädeltyyn Notch opastinjärjestelmillä mutaatiotutkimukset. Kuten odotettua, usein NICD1 värjäytyminen havaittiin T lymfoblastileukemian /lymfooma, kasvaimen, joka aktivoimalla

Notch1

mutaatiot ovat yleisiä. Kuitenkin, kun IHC käytettiin mittaamaan Notch1 aktivointia muissa ihmisen syövissä, useita odottamattomia löydöksiä syntynyt. Joukossa B kasvaimet, NICD1 värjäytyminen oli paljon yleisempää krooninen lymfaattinen leukemia kuin voidaan ennustaa perustuen taajuuden

Notch1

mutaatioita, kun taas Manttelisolulymfooman ja diffuusi suuri B-solu lymfooma ei havaittu Notch1 aktivointia. NICD1 havaittiin myös 38% perifeerisistä T-solulymfoomien. Kiinnostaa, NICD1 värjäytyminen kroonisen lymfaattisen leukemian solut ja angioimmunoblastic lymfooma oli johdonmukaisesti voimakkaampi imusolmukkeiden kuin ympäröivissä pehmytkudoksiin, syyllistämättä tekijöitä solmukohtien mikroympäristön Notch1 aktivaation näissä sairauksissa. Joukossa karsinoomat, hajanainen vahva NICD1 värjäytyminen havaittiin 3,8% tapauksista kolminkertainen negatiivinen rintasyöpä (3 78 kasvaimet), mutta oli poissa 151 ei-pienisoluisen keuhkosyövän ja 147 munasarjakarsinoomat. Usein värjäys normaalista endoteelin havaittiin myös; sopusoinnussa tämän havainnon, vahva NICD1 värjäytymistä nähtiin myös 77% angiosarcomas. Nämä havainnot täydentävät oivalluksia genomisesta sekvensointi tutkimusten ja viittaavat siihen, että IHC värjäytyminen on arvokas kokeellinen työkalu, joka voi olla hyötyä valittaessa potilaita kliinisiin tutkimuksiin.

Citation: Kluk MJ, Ashworth T, Wang H, Knoechel B, Mason EF, Morgan EA, et ai. (2013) Pinnankorkeuden Notch1 Aktivointi Cancer käyttäminen Immunohistokemia. PLoS ONE 8 (6): e67306. doi: 10,1371 /journal.pone.0067306

Editor: Jose Angel Martinez Climent, Navarran yliopisto, Center for Applied Medical Research, Espanja

vastaanotettu: 01 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 16 toukokuu 2013; Julkaistu: 18 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Kluk et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: tukemana avustuksia NIH ja Leukemia ja lymfooma Society (JCA) ja BWH Patologian osasto Robbins Award (MJK). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut: Co-kirjailija Jon Aster on konsultti Cell signaling Technologies, valmistaja joidenkin vasta-reagenssien kuvattu tässä asiakirjassa. Alexander Stoeck, Sriram Sathayanrayanan, ja Brian Haines ovat työntekijöitä Merckin Oncology. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Notch reseptorit osallistuvat Suojellussa signalointi, joka säätelee monia solun fenotyyppejä, mukaan lukien solujen kohtaloa , soluproliferaatiota, ja solujen eloonjäämistä (katsausta varten katso [1]). Nisäkkäillä on neljä Notch geenejä (

Notch1

–

4

), joista jokaisella on erillinen malleja ilmaisun ja eri knockout fenotyyppejä hiirissä. Canonical signalointi läpi kaikki neljä reseptorien perustuu sarjan ligandista riippuvan proteolyyttisen katkaisut, joista viimeinen on suorittaa moniyksikköisten proteaasilla kutsutaan gamma-sekretaasin, joka pilkkoo Notch reseptorit sisäisillä puolen reseptorin transmembraanidomeeni. Tämä vapauttaa Notch solunsisäinen domeeni, NICD, joka siirtyy tumaan ja muodostaa lyhytikäinen transkription aktivaation monimutkainen.

Outcomes tuottama Notch signalointi normaaleissa soluissa vaihtelee dramaattisesti solujen yhteydessä, luultavasti siksi epigeneettiset kuviointi genomien johtaa vaihteli vaikutuksia NICD on transkription tuotoksia. Genotyyppiset tietoja ihmisillä ja koe-tulokset hiirillä, osoittavat, että

Notch1

on myös monipuolinen roolista syövässä, joka toimii joko onkogeenin tai kasvainsuppressorigeenin riippuen solujen yhteydessä. Gain-of-function mutaatioiden

Notch1

ovat yleisiä T lymfoblastileukemian /lymfooman (T-LL) [2,3], ja niitä on myös kuvattu osajoukkoja kroonisen lymfaattisen leukemian (KLL) [4- 6], manttelisolulymfooman (MCL) [7], diffuusi suuri B-solujen lymfooma [8], perifeerinen T-solujen lymfooma (PTCL) [9], rintasyövän [10], ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [ ,,,0],11]. Nämä aktivoivat mutaatiot kuuluvat erilaiset piste, -deleetioita, ja alueelta toiselle siirtäminen, jotka tuottavat ligandista riippumatonta Notch1 proteolyysiä ja aktivointia, sekä mutaatioita, jotka poistavat C-pään PEST degron domain ja siten vakauttaa NICD1. Lisäksi saatujen tietojen syvä sekvensointi syövän genomien on havaittu usein mutaatio geenien koodaavat Notch polku komponenttien korkealaatuisesta munasarjojen serous karsinoomien [12], vaikka toiminnalliset seuraukset näiden mutaatioiden Notch signalointi on epävarmaa. On myös näyttöä siitä, että Notch1 on merkittäviä toiminnallisia rooleja endoteelin ja muiden tukikudosten osat, jotka saattavat myötävaikuttaa pahanlaatuiseen käyttäytymiseen syöpien [13,14]. Kääntäen, keskeytys- toiminto mutaatioiden jaetaan suuren osan

Notch1

lokuksen ovat yleisiä okasolusyöpää ihon [15] sekä pään ja kaulan [16,17] ja esiintyy myös pienemmässä osajoukko levyepiteelikarsinoomien keuhkojen [15,18]. Samoin menetys

Notch1

toiminto verisuonten endoteelin johtaa angiosarcoma kaltaisia ​​planktonin kasvu hiirissä [19,20].

On kiinnostusta terapeuttinen kohdentamiseen Notch1 syövissä, joissa se on onkogeeniset rooli antagonisteilla kuten estävä vasta-aineiden ja gamma-sekretaasin estäjät (GSI) [21]. Ihannetapauksessa tällaiset tutkimukset keskityttäisiin potilaiden hoitoon, joiden kasvaimet merkkejä jatkuvan Notch1 aktivointia. Koska suuri koko

Notch1

rataa, ja moninaiset geneettiset poikkeamia, jotka tuottavat ligandista riippumaton aktivointi Notch1 tai vakauttaa NICD1, geeniseulonnasta onkogeeniselle

Notch1

muutoksia on haastavaa, varsinkin työskenneltäessä arkistonhoidolliset FPE näytteitä. Lisäksi epäillään, että ligandivälitteinen Notch1 aktivointi edistää myös kasvainsolujen kasvua ja selviytymistä, ja tällaiset kasvaimet olisi havaitsisi geeniseulonta.

Ihanteellinen biomerkkitesti havaitsisi NICD1 sisällä kasvainsoluja suoraan, riippumatta taustalla mekanismi Notch1 aktivointia. Tätä varten olemme kehittäneet vankan erityisiä immunohistokemiallinen (IHC) värjäys menetelmä, joka tunnistaa NICD1 in arkistointi näytteissä. Testi perustuu kaupalliseen kanin monoklonaalista vasta-ainetta, on aiemmin käytetty vain Western blot -analyysit, joka on spesifinen neoepitope in NICD1 luotu gamma-sekretaasin-välitteisen proteolyysi Notch1, tapahtuma, joka laukaisee Notch1 signalointia. Sen jälkeen optimointi ja validointitiedoista käyttää syövän ksenograftien pitäen monipuolinen

Notch1

poikkeavuuksien normaaleissa kudoksissa, me seulotaan suuri joukko ihmisen syövissä tuntemattomien

Notch1

mutaatiostatuksesta tila aktivoituu Notch1. Useimmat T-LLS ja CLLs ilmeni merkkejä jatkuvan Notch1 aktivaation, kuten monet reuna-T-solu lymfoomat ja pieni joukko triple-negatiivinen rintasyöpiä. Aktivointi Notch1 havaittiin myös useimmissa angiosarcomas mukaisesti havaintoon, että NICD1 on helposti havaittavissa normaaleissa endoteelisolujen sisällä kasvain strooman. Sitä vastoin vain vähän tai ei lainkaan Notch1 aktivaatio havaittiin Manttelisolulymfooman diffuusi suuri B-solujen lymfooma, ei-pienisoluisen keuhkosyövässä, ja munasarjojen syöpä. Nämä havainnot osoittavat, että Notch1 aktivaatio joukossa B-solujen kasvaimia on sekä voimakkaammin rajoitettu ja yleisempiä KLL kuin olisi ennustaa etukäteen genotyypin tiedot, herättävät kysymyksiä ehdotetusta kasvain tukahduttava rooli Notch1 verisuonten kasvaimet, ja viittaavat siihen, että IHC testaus NICD1 voidaan valita potilaita kliinisten kokeiden Notch reitin estäjiä, erityisesti niitä, joissa potilaalla on kasvaimia, kuten triple-negatiivinen rintasyöpä, jossa Notch1 aktivointi rajoittuu pienessä määrässä kasvaimia.

Materiaalit ja menetelmät

käyttö Ihmiskudokset

Ihmiskudokset yksilöt hyväksytty käytettäväksi Institutional Review Boards seuraavasti. Kaikki kudokset osallistuvat mukaan lymfoidineoplasmoissa (paitsi yksi) kerättiin ja käytettiin ilman tietoisen suostumuksen nojalla Brigham and Women n sairaala IRB protokolla 2010-P002736. Ei-pienisoluisen keuhkosyövän microarray oli rakennettu kudoksia saatiin potilailta ilman suostumusta Brigham and Women n sairaala IRB protokolla 2006-P001929. Serous munasarjasyöpä microarray oli rakennettu kudoksia saatiin potilailta ilman suostumusta Brigham and Women n sairaala IRB protokolla 2006-P000321. Angiosarcoma microarray oli rakennettu kudoksia saatiin potilailta ilman tietoisen suostumuksen nojalla University of Texas M. D. Anderson Cancer Center IRB protokollaa LAB04-0890. Kussakin näistä tapauksista, tutkimukset myönnettiin luopuminen suostumuksen seuraavilla perusteilla: 1) näytteet kerättiin takautuvasti patologian arkistoista ja johtui tavanomaisesta kirurgisten suoritetaan diagnostisia tarkoituksia varten; 2) potilaan identiteettien anonymisoituja ja täysin delinked alkaen yksilölliset tunnisteet; ja 3) vaaraa ei ollut osallistujille (vain nimettömiksi kudokset käytettiin). Yksi T-lymfoblastisen lymfooman näyte kerätään osana oikeudenkäynti Merck GSI MK-0752 käytettiin kanssa kirjallinen lupa kärsivän potilaan alla Dana Farber /Partners Cancer Center protokolla 2004-P002170. Rintasyöpä mikrosiru, joka sisältää kolmen syöpäkasvain (negatiivisia estrogeenireseptori, progesteroni reseptorin, ja

HER2

vahvistus) oli rakennettu kudoksia saatiin potilailta, jotka kirjallisia suostumus alle Dana Farber Cancer Institute IRB protokollaa 93-085.

käyttö Hiiret Vieraslajisiirteen Studies

REC-1 ja KOPT-K1 solun ihonalainen ksenografti tutkimukset suoritettiin alla Dana Farber Cancer Institute IACUC protokollaa 04-111. HCC1599, HCC1587, ja MB-157 solua ihon alle ksenografti tutkimukset tehtiin alle protokolla hyväksymän IACUC Merkc Oncology. Eläinten työ tehtiin mukaisesti NIH ohjeita. Kaikki -ksenografti omaavilla eläimillä tarkkailtiin päivittäin eläinlääkintähenkilöstön epänormaaleja käyttäytymismalleja /olosuhteet, jotka saattavat vaatia huomiota minimoida kärsimyksen. Eläimet lopetettiin CO

2 tukehtumisen kohti suositusten American Veterinary Medical Association. Kaikkia eläimiä ylläpidettiin CO

2 vähintään 5 minuuttia lopettamisen jälkeen hengitysteiden liikkeet.

Solulinjat

Solulinjat saatiin American Tissue Culture Collection (REC-1, MAVER-1, HCC1599, HCC1587, ja MB-157-solut) tai Leibniz-instituutin DSMZ-saksalaiseen mikro-organismien ja Cell Lines (KOPT-K1).

testien kehittämiseen ja validointitutkimuksia

Nämä tutkimukset tukeutui: 1) solulinjoissa mutaatioita

Notch1

joka tuottaa joko voitto tai tappio Notch1 toiminto, joka kasvatettiin hiirissä ; 2) normaalia ihmisen squamous limakalvoja ja kateenkorva, jossa anatominen jakaumat solujen aktivoidulla Notch1 tunnetaan; ja 3) ensisijaisen ihmisen T-ALL tunnettujen

Notch1

genotyyppi (kuvattu alla). Ksenosiirrettyjä solulinjat ja niihin liittyvien

Notch1

genotyypit on esitetty taulukossa 1. Kaikki ksenosiirrettyjä kasvaimet kiinnitettiin fosfaattipuskuroidussa liuoksessa, joka sisältää 10% formaliinia tai 4% paraformaldehydillä (okasolusyöpää) ja upotettiin parafiiniin, ja haettiin kudoksesta arkistoista yksittäisille laboratorioille, jossa ksenografti tutkimuksia tehtiin osana muita tutkimuksia. Luut olivat kalkki seuraavat formaliinia kiinnittäminen käyttäen RDO Rapid Kalkinpoisto Solution (Sigma, St. Louis, MO).

Cell Line

kasvaintyyppi

Notch1 Mutaatio

Vaikutus Notch1 Signaling

Reference

KOPT-K1T-LLL1600P /del (P) * Gain [3] REC-1MCLdel (ECN1) /del (P) * Gainthis paperi /[7] MAVER-1MCLNoneN.A. [7] HCC1599Breast Carcinomadel (ECN1) Gain [10] MB-157Breast Carcinomadel (ECN1) GainUnpublished dataHCC1587Breast CarcinomaNoneN.A. [10] Taulukko 1. Syöpä ksenografteissa ja liittyvä voitto-of-function mutaatioiden Notch1.

* X /Y osoittaa pariksi mutaatiot syntyvät poikkeamat

cis

samalla

Notch1

alleledel (ECN1) osoittaa esillä poisto, joka poistaa koodaava sekvenssi solunulkoista domeenia NOTCH1del (P) osoittaa läsnä lukukehyksen tai lopetuskodonin mutaatioita, jotka poistavat C-terminaalinen Notch1 PEST degron domainT-LL, T lymfoblastileukemian /lymfooma; MCL, Manttelisolulymfooman; N. A., ei sovelleta CSV Lataa CSV

Arkistointi ihmisen syövän näytteitä

Kaikki FPE näytteitä käytettiin hyväksymisen jälkeen institutionaalisten tarkastuslautakunta (katso etiikkaa lausunnot). Ensisijainen T-ALL näytteen tiedetään kantaa aktivoivia mutaatioita

Notch1

kerättiin osana kliinistä tutkimusta gamma-sekretaasin estäjä MK-0754 potilailla, joilla on uusiutunut /vaikeahoitoinen T-ALL [22]. Arkistointi ”hävittää” T-LL, KLL, MCL, angiosarcoma, ja normaali kudosnäytteet valitaan parafinoidut kudosten arkistoon Brigham and Women n sairaala perustuu yksinomaan saatavuudesta kudoksen kiinnitettiin 10% formaliinilla tai B +, puskuroitu fiksatiivi joka sisältää 3,7% formaldehydiä ja sinkkikloridia, joka on laajalti käytetty kudosten mukana jonka lymfoidineoplasmoissa. FPE ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [23], diffuusi suuri B solulymfooma [24], angiosarcoma [25], ja munasarjasyöpä [26] näytteitä tutkittiin värjäämällä aikaisemmin kuvatulla kudossiruina. Uusi kudosta mikrosiru, joka sisältää joukon 78 kolminkertainen negatiivisen rintasyövän koottiin seuraavasti. Archival formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut rintasyöpiä kerättiin ja paras lohkot ja parhaista alueilla ytimenotto tunnistettiin ja valitaan rintaa patologi (DD). Tulokset Immunohistokemiallisen tutkimusten estrogeenin (ER) ja progesteroni reseptorin (PR) ja HER2 ja FISH määrityksen tulokset HER2 poimittiin patologiaraporteista. Seitsemänkymmentäkahdeksan kolminkertainen negatiivinen (ER /PR /HER2 negatiivinen) invasiivisia rintasyöpiä havaittiin riittävän kasvainkudoksen kudosten microarray (TMA) rakentaminen, joka toteutettiin Dana Farber /Harvard Cancer Center Tissue Microarray Core Facility. Kolme 0,6 mm ytimet otettiin merkityt alueet ja laitettiin vastaanottoblokista manuaalisella ryhmittäjällä (Beecher Instruments).

immunohistokemia

Standard 4-mikronin parafiiniin kudos leikkeet värjättiin käyttäen Ventana Benchmark XT alustan (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ.), jossa on laajennettu lämmön epitooppisup- haku (CC1 Buffer). Laseja inkuboitiin 1 h ajan huoneen lämpötilassa anti-NICD1 kanin monoklonaalista vasta-ainetta (klooni D3B8, luettelo # 4147, Cell Signaling Technology, Beverly, MA; lopullinen konsentraatio, 8.5microgram /ml). Signaalit monistettiin sitten (Ventana -monistustarvikesarjaa, # 760-080) ja visualisoitu (Ventana Ultraview Universal DAB havaitseminen pakki, # 760-500) kohden valmistajan ohjeiden. Kaikki värjäystä kulkee mukana kaksi positiivisista kontrollinäytteistä (REC-1 solun ksenografti ja nielurisojen limakalvon). Pisteytys suoritettiin kaksi patologit (MJK, JCA). Värjäys tuloksia myös tarkistettava patologeja kanssa subspecialty asiantuntemusta hematopathology (MJK, JCA, GP, DD, EAM, EFM), keuhkojen patologia (LC), gynekologiset patologia (MH), rintojen patologia (DD), ja pehmytkudoksen patologia (JH , AL), jotka kaikki vaikuttivat myös asia valinta.

Notch1

sekvensointi

DNA valmistettiin makean pakastetut näytteet käyttäen QIAamp DNA Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). Sangerin sekvensoinnin

Notch1

mutaatiostatuksesta kuormittajat tapauksessa T-lymfoblastisen lymfooman tehtiin kuten [3]; sekvensointi jäljet ​​analysoitu Mutaatio Surveyor Software (Softgenetics, State College, PA). Syvä sekvensointi

Notch1

mutaatiostatuksesta kuormittajat suoritettiin seuraavasti. Alukkeet suunniteltiin ja vahvistanut Fluidigm (Fluidigm Corporation, San Francisco, CA) eksonit 25-28 ja 34

Notch1

per suositeltavien suuntaviivojen Roche Titanium sekvensointia (Roche, Mannheim, Saksa). Kaikkiaan 2304 amplikonien edustavat 48 ainutlaatuinen näytteet monistettiin 48 kohderyhmäspesifittömän alukeparia kertyi kussakin sekvensointi aikavälillä. Kukin aluke sisällyttää otokseen erityisiä Fluidigm 454 viivakoodin pohjamaali ja sovitin sekvenssit. Reaktiot sisälsivät 50 ng genomista DNA: ta, eteen ja taakse tagged -monistusalukkeet (1microM), eteen ja taakse viivakoodi alukkeita (400 nM), 1x Access Array Loading Reagent, 1x FastStart High Fidelity Reaction Buffer, 4,5 mM MgCl

2, 5% DMSO , 0,05 U FastStart High Fidelity Enzyme Blend ja PCR-grade nukleotidiseoksella (200microM, Roche). Lämpökäsittelyyn suoritettiin Fluidigm FC1 Cycler per valmistaja ohjeita. Saatu kirjastot otettiin talteen ja kerättiin mikrotiitterilevylle, jossa ne kvantitoitiin käyttäen Qubit® dsDNA BR Assay Kit on Qubit® 2,0-fluorometri (Invitrogen, UK). Kirjastot normalisoituivat ja yhdistettiin ennen puhdistus käyttämällä Agencourt AMPure XP-järjestelmään (Beckman, UK) kohti valmistajan protokollaa. Kirjasto komponentit kloonaamalla monistettiin käyttäen GS Junior emPCR Lib-A Kit (Roche) syöttämällä 1 molekyyli kirjaston DNA kohti kaapata helmi. Pyrosekvensointi suoritettiin käyttäen GS Junior-järjestelmä (Roche /454 Life Sciences).

selektiivisesti havaita kodoni 2514 del (CT) mutaatio

Notch1

, joka on pyrosekvensointi määritys kehitettiin. Lyhyesti,

Notch1

eksonin 34 kohde- sekvenssi monistettiin PCR: llä, joka sisälsi 30 ng genomista DNA: ta, biotinyloidun forward-aluketta (5′-CTCCTCGCCTGTGGACAA) ja reverse-aluketta (5′-GGGACGAGCTGGACCACT) käyttäen seuraavia sykliparametrit: 94 ° C: ssa x 2 minuuttia, minkä jälkeen 94 ° C x 30 sekuntia, 62 ° C x 30 sekuntia, 72 ° C x 30 sekuntia, 45 sykliä, jota seurasi lopullinen pidentäminen 72 ° C: ssa 10 minuutin ajan. PCR-monistettu tuote vangittiin streptavidiinilla Sepharose-helmiin, denaturoitua, siirretään pyrosekvensointi levy, hehkutetaan käänteinen sekvensointialukkeena (5 ’CACTGGTCAGGGGACT 3’), ja sekvensoitiin kohti standardin protokollan (PyroMark Q96 MD, Qiagen, Germantown, MD) . Päätös käyttää kääntää sekvensointialukkeena perustui sattumanvaraisesta läsnäolo ajaa 3 G jäämiä välittömästi 3 ’AG-antisense kodonin 2514 mutaatio, joka toimii lisätä määrityksen herkkyyden noin 3-kertaiseksi. Tämän mukaisesti ennuste, verrokkitutkimuksia käyttäen solulinjaa KOPT-K1, T-LL solu- linjassa heterotsygoottiseen del (CT) kodoni 2514 mutaatio [3], osoitti luotettavasti havaita tämän sekvenssivariantti laimennettuna alas tasolle 2,5% mutatoitunut alleeleja DNA, joka sisältää villityyppisen

Notch1

alleelit.

molekyylikarakterisointi sellaisen geeninsisäiset Notch1 poisto in REC-1-soluissa

5 ’ nopea cDNA-päiden monistamisen (RACE) suoritettiin RNA valmistettiin REC-1-soluja ja ohjaus DND-41-T-ALL-solut, kuten on kuvattu [27]. Genominen DNA eristettiin REC-1-soluissa käyttämällä QIAamp genomista DNA: eristäminen (Qiagen, Valencia, CA). Exon1 sense (5′-CCTGCTCTGCCTGGCGCTG) ja eksonin 28 (5’-CCACGAAGAACAGAAGCACA) antisense-alukkeita käytettiin monistamaan geeninsisäinen Notch1 poistamista 100 ng genomista DNA: ta käyttäen Expand Long Template PCR -järjestelmää (Roche, Branford, CT). PCR-monistuksen olosuhteet olivat 94 ° C: ssa x 2 minuuttia, jota seurasi 94 ° C x 15 sekuntia, 60 ° C x 30 sekuntia ja 68 ° C x 45 sekuntia, 30 sykliä, jota seurasi 68 ° C laajennus 7 minuuttia. Saatu PCR-tuote puhdistettiin, kloonattiin pCR2.1-TOPO-plasmidia (Invitrogen, Carlsbad, CA), ja Sanger sekvensoitiin.

Western blot -analyysi

Koko solu pesuainetta lysaatit solulinjoja valmistettiin, kuten on kuvattu [27] värjättiin NICD1 (luettelo # 4147), yhteensä Notch1 (luettelo # 4380), tai aktiinin (luettelo # 4970) käyttämällä vasta-aineita on saatu Cell Signaling Technologies (Beverly, MA).

Vieraslajisiirteen Studies

REC-1-soluissa ja MAVER-1-solut ympättiin ihonalaisesti 6 viikon ikäisiä SCID /beige hiiriä (Charles River Laboratory, Wilmington, MA) (1×10

7 solua per hiiri) 30% Matrigel tyvikalvon matriisi (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Kasvaimen tilavuus määritettiin mittaharppimittauksilla. Kun kasvaimet saavuttivat tilavuuden 100-200 mm

3, hiiriä käsiteltiin gamma-sekretaasin estäjä diaminobentsidiiniä (DBZ) on 10microM /kg vatsaonteloon tai vehikkeliä (DMSO) ja 3 päivää. Kudokset kerättiin 2 h kuluttua viimeisestä lääkkeen annosta. KOPT-K1-soluissa transdusoitu lentiviruksesta joka ilmaisee tulikärpäsen lusiferaasi injektoitiin häntälaskimoon osaksi NOD /SCID /gamma-ketju (NSG) hiiret kasvatettu klo Lurie Family Imaging Center (Dana Farber Cancer Institute). Hiiriä seurattiin kehittämiseen leukemia bioluminesenssin ja sitten käsiteltiin DBZ tai DMSO: ta, kuten edellä. HCC1587 ja HCC1599 ihmisen rintasyöpäsolulinjaa -ksenografteja kehitettiin CB17 hiirissä, kuten on kuvattu [10], kun taas MB157-solulinjasta ksenografteja kehitettiin Swiss nu /nu (nude) hiiriä, kaikki Merck Oncology. Eläinkokeet suoritettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health.

Tulokset

Luodaan immunohistokemiallinen Stain aktivoiduille Notch1

Vaikka kanoninen Notch signalointi vetoaa tumaansiirtymiseen sen solunsisäisen domeenin (NICD), havaitseminen ydinaseiden NICD

in situ

ihmisen kudoksissa on ollut vaikeaa. Polyklonaalisia vasta-aineita, jotka havaitsevat neoepitope luotu aminopäässä on NICD1 pilkkomalla Notch1 on konservoituneiden päällä sen transmembraanidomeeni on käytetty laajalti tunnistamaan NICD1 solulysaateissa, mutta eivät ole tuottaneet luotettavia IHC testejä. Viimeaikainen kehitys kanin monoklonaalista vasta-ainetta vastaan ​​NICD1 neoepitope kannusti meitä uudelleen mahdollisuutta käyttää IHC havaita NICD1 on FPE kudoksissa. Voit rajoittaa run-to-run värjäystä vaihtelua ja mahdollistaa mahdollisten kliinisten käännös, arvioimme värjäys kahdella laajalti käytetty automatisoitu immunovärjäystä alustoja, Ventana Discovery XT ja Leica Bond. Molemmat toteuttaa samalla, mutta olemme huomanneet, että värjäämällä tulkitaan tiettyjä (per alla) ilmestyi vahvempi Ventana alustalle (tuloksia ei esitetty), jota käytettiin kaikissa tutkimuksissa raportoitu tässä.

Kehittää luotettava värjäys menetelmä NICD1, olemme käyttäneet ohjaus FPE kudosten hiiristä ksenosiirrettyjä ihmisen kasvainsolulinjoja, joissa onkogeeninen

Notch1

mutaatioita, jotka johtavat ligandista riippumattomaan sukupolven NICD1 (taulukko 1). Kasvaimet tutkittu gain-of-function

Notch1

mutaatioita sisältyi T-LL solulinja, KOPT-K1, joka on aktivoiva piste substituution Notch1 negatiivinen säätelyalueen kohdistettu

cis

kanssa kodonin 2514 del (CT) mutaatio, joka johtaa deleetio C-terminaalista Notch1 PEST degron verkkotunnuksen [3]; manttelisolulymfoomatutkimuksessa solulinjaa REC-1, joka kantaa

Notch1

alleeli, aiemmin tuntemattomia aktivoiva poistetaan poistamalla suurimman osan koodaussekvenssi Notch1 ektodomeenia linjassa

cis

kanssa nonsense-mutaatio kodonissa 2428 (kuvattu alla), joka myös johtaa poistetaan C-terminaalisen PEST degron domeeni; ja kaksi rintasyövän solulinjoissa, HCC1599 ja MB-157, joka vastaa

Notch1

alleelien kanssa, deleetioita, että suurimman osan poistamiseksi Notch1 ektodomeenia koodaavat sekvenssit ([10], ja tietoja ei ole esitetty). Formaliini FPE osa kaikkien neljän ksenograftien suuntaan aktivoimalla

Notch1

mutaatioita osoitti vahvaa diffuusi ydinreaktiivisuus, kun värjätään NICD1-spesifistä vasta-ainetta (kuvio 1A-D). Erityisesti, NICD1 värjäytymistä KOPT-K1 ja REC-1-ksenografteissa oli merkittävästi vähentää käsittelemällä eläimiä GSI DBZ (kuvio 1 E, F), joka estää sukupolven NICD1 ([3]). Lisäksi, ei ole NICD1 värjäytymistä nähtiin osissa MCL solulinjan MAVER-1 (kuvio 1G), joka on villityypin

Notch1

alleelien ja on vailla NICD1 [7], tai rintasyöpäsolu- line HCC1587 (kuvio 1 H), joka on villityypin

Notch1

alleelien ja sen sijaan on aktivoiva poisto liittyy

NOTCH2

[10].

Leikkeitä värjättiin NICD1 käyttämällä IHC menetelmä, joka tuottaa ruskean tumaväriä ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. A) KOPT-K1-T-ALL-soluja. B) REC-1 Manttelisolulymfooman soluja. C) HCC1599 rintasyöpäsoluihin. D) MB-157 rinnan karsinoomasoluja. E, F) KOPT-K1 ja REC-1 solujen värjäytymisen vastaavasti kudoksissa korjattu käsiteltyjen eläinten GSI DBZ. G) MAVER-1 Manttelisolulymfooman soluja. H) HCC1587 rintasyöpäsoluissa. Genotyypit näistä solulinjoista on esitetty taulukossa 1.

edelleen arvioida menetelmän herkkyyttä ja vakautta NICD1 neoepitope in arkistointia kudoksissa, teimme IHC varten NICD1 osuuksilla, jotka on valmistettu T LL näyte saatiin vuonna 2004 potilaasta kirjoilla tutkimuksessa Merck GSI MK-0754 [22]. Sangerin sekvensoinnin DNA eristettiin tästä näytteestä paljasti heterotsygoottinen pistemutaatio, joka johtaa L1574P substituutio, sekä kaksi muuta subclonal pistemutaatioita linjassa

cis

kanssa L1574P substituutio, jotka luovat L1600P ja F1592S substituutioita (kuvio 2A ). Kaikki nämä mutaatiot laskee eksonissa 26

Notch1

ja vastaavat aiemmin tunnettu voitto-of-function mutaatioita Notch1 negatiivinen säätelyalue [28], osa Notch1 ektodomeenia että on oltava ehjä pitää reseptorin off-tilaan ilman ligandin [29]. Tandem mutaatiot linjassa

cis

että Notch1 ektodomeenia on raportoitu aiemmin [3] ja todennäköisesti osoitus jatkui valinta kasvoi Notch1 signalointia aikana T-ALL etenemistä. IHC värjäys tämä T-ALL tuotettu vahva hajanainen ydin- positiivisuus, mikä viittaa siihen, että NICD1 epitooppi havaitsema kani monoklonaalinen vasta-aine on stabiili ajaksi vuoden rutiininomaisesti tallennetut FPE näytteistä (kuvio 2B).

A) Identification aktivoivien mutaatioiden joihin eksonin 26

Notch1

. 24 yksittäiset kloonattujen PCR-tuotteiden, 13 antoi villityypin sekvenssit, 9 osoitti mutaatio tuottaa L P substituution jäämien 1574, 1 osoitti L1574P mutaatio

cis

kanssa mutaatio tuottaa F S substituution jäännös 1592, ja 1 osoitti L1574P mutaatio

cis

kanssa variantti tuottaa L P substituution jäämien 1600. B) IHC värjäystä NICD1 samassa kasvain, joka on formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut koepala välikarsinan massa. On murskata artefakti, mutta vahva tumavärjäystä nähdään ehjä soluissa.

totesi myös osissa Ksenosiirretyn kasvainten hiiren endoteelisolujen ja hajallaan stroomasolujen osoittivat ydinreaktiivisuus kanssa NICD1 vasta-aineella (näkyy parhaiten kuvassa 1G ja H). Nämä havainnot ovat sopusoinnussa osoittavilla rooleja Notch1 verisuonten endoteelin [30] ja reuna-T-solujen [31], ja ehdotti, että meidän IHC menetelmä voi havaita fysiologisia tasoja NICD1. Arvioida tämän olemme värjättiin normaali osa ihmisen squamous limakalvon, ihon ja kateenkorva (kuvio 3). Ennen työ on osoittanut, että Notch1 on ohimenevästi aktivoituu suprabasilar soluissa levyepiteeleissä [32], jossa se edistää solukierron exit ja erilaistuminen [33], toimintaa, joka voi edistää Notch1 kasvain tukahduttava rooleja okasolusyöpää ihon ja pään ja kaulan. Kuten odotettua, NICD1 värjäytymistä levyepiteelien rajoittui suprabasilar soluja (kuvio 3A, B). Tymosyyteissä, Notch1 aktivointi kohoaa enintään CD4 /CD8 double-negatiiviset solut parhaillaan beta-valinta [34], jotka sijaitsevat kateenkorvan aivokuori juuri syvälle kateenkorvan kapselin [35]. Aikaisemmissa työtä, olemme huomanneet, että solut tällä alueella kateenkorva on korkein taso immunoreaktiivisuus tunnistavien vasta-aineiden kokonaismäärä Notch1, ottamatta huomioon sen aktivoinnin tila [36]. Kuten ennustettiin raportoitu rakenteessa Notch1 aktivoinnin tymosyyttien NICD1 värjäytymistä ihmisen kateenkorvan oli merkittävintä aivokuoren tymosyyteissä makaa välittömästi alapuolella kapseli (kuvio 3C, D). Nämä tulokset osoittavat, että meidän IHC menetelmä on riittävän herkkä havaitsemaan fysiologisia tasoja aktivoitua Notch1 ainakin joissakin normaaleissa kudoksissa. Tutkimaan edelleen Notch1 aktivoitumisen normaaleissa imukudoksen, värjäytyminen nielurisojen tehtiin myös. Havaitsimme, että itukeskusten sisältävät reaktiivisia B-solut, joilta puuttuu immunoreaktiivisuuden, kun taas ympäröivän vaipan alueet osoitti heikkoa värjäytymistä NICD1 (tuloksia ei ole esitetty).

A) nielusta squamous limakalvo. B) Skin. C, D) Thymus.

Detection of Notch1 Aktivointi arkisto Cancer näytteet

Building seuraavilla validointitutkimukset, seuraavan kerran käytetään IHC seulomaan useita FPE ihmisen syövissä todisteita Notch1 aktivoinnin, keskittyen kasvaintyypeille jossa

Notch1

voitto-of-function mutaatioita on kuvattu. Tutkimme myös angiosarcoma, perustuu havaintoon, että normaalit endoteelisolujen usein värjätty positiivisesti NICD1 ja ennen tutkimusten mukaan

Notch1

on tuumoria tukahduttavan funktion hiiren verisuonen endoteelin [19,20]; siten, olimme uteliaita näkemään jos Notch1 aktivointi saattaa kadota ihmisen angiosarcomas. Käytimme NICD1 värjäytyminen normaalien endoteelisolujen sisäisenä kontrollina arvioida säilyttäminen immunoreaktiivisuuden kudoksissa tutkittiin. Vuonna kartoitustutkimusten totesimme, että arkistointia näytteet kiinnitettiin Zenker ratkaisu, joka on elohopea fiksatiivi käytetään meidän laitoksen poistetaan kalkki luuytimen biopsiat, invertoitu NICD1 immuunivaste endoteelin. Menetys immunoreaktiivisuus ei aiheutunut kalkkisuuden

sinänsä

, koska luuytimen mukana by ksenosiirrettyjä KOPT-K1-soluissa, jotka oli vahvistettu formaliiniin ja sitten nopeasti kalkittomat vahvalla hapolla säilytti immunoreaktiivisuus (kuvio 1A). Rajoituksen vuoksi, me rajoittuu tutkimuksemme kasvaimiin, joissa pehmytkudokset joille FPE näytteet olivat saatavilla. Jotkut imusolmukkeiden mukana CLL näytteet kiinnitettiin B +, kiinnitysnesteeseen joka sisältää formaldehydiä ja sinkkikloridia. Näytteet kiinnitettiin B + säilytetty NICD1 värjäys normaaleissa endoteelisoluissa ja näin otettiin mukaan analyysiin.