Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Wnt5a on ei-kanoninen erittyy glykoproteiinia Wnt perheen näyttelee tärkeä rooli syövän kehittymisessä ja etenemisessä. Aiemmat tutkimukset raportoivat, että Wnt5a ylössäädellään eturauhassyövässä ja ehdotti, että Wnt5a vaikuttaa muuttoliike ja hyökkäys eturauhaskasvainsolun. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida ennusteen arvioinnissa on Wnt5a proteiinin ilmentymisen eturauhassyöpäkudoksen ja sen mahdollisuuksia ennustaa tulos, kun eturauhasen potilailla, joilla on paikallinen eturauhassyöpä.

Menetelmät ja tulokset

immunohistokemiallinen analyysi kudos microarray sisälsi eturauhasnäytteissä 503 potilailla, joilla on paikallinen eturauhassyöpä osoitti merkittävästi korkeampi Wnt5a proteiinin ilmentymistä syövän verrattuna hyvänlaatuinen ydintä samasta potilailla (p 0,0001). Potilaat, joilla on korkea ilmentymisen Wnt5a proteiinin oli merkittävästi parempi tulos kannalta aikaa biokemiallisten toistuminen verrattuna potilaisiin, joilla on alhainen ekspressiotasot (p = 0,001, 95% CI 1,361-3,570, Hazard n suhde 2,204). Yhdistelmä korkean Wnt5a lausekkeen alhainen Ki-67 tai androgeenireseptorin ilmaisu oli jopa parempi tulos verrattuna kaikkiin muihin ryhmiin. Lisäksi olemme havainneet, että Wnt5a ilmentyminen korreloi merkitsevästi VEGF: n ja Ki-67 ja androgeenireseptorin ilmaisua, vaikkakaan ei hyvin merkittävä. In vitro, osoitimme, että yhdistelmä-Wnt5a vähentynyt hyökkäystä 22Rv1 ja DU145 soluja ja että siRNA knockdown endogeenisen Wnt5a proteiinin lisäsi hyökkäys 22Rv1 ja LNCaP.

Johtopäätös

Osoitamme, että säilynyt yli-ilmentyminen Wnt5a proteiinia potilailla, joilla on paikallinen eturauhassyöpä ennustaa suotuisaan lopputulokseen leikkauksen jälkeen. Tämä havainto yhdessä meidän in vitro tiedot, jotka osoittavat kykyä Wnt5a heikentää invasiivisia ominaisuuksia eturauhassyöpäsolujen, ehdottaa kasvain painava vaikutus Wnt5a in paikallinen eturauhassyöpä. Nämä tulokset osoittavat, että Wnt5a voidaan käyttää ennakoivaa merkki ja että se on myös uskottavaa terapeuttinen kohde hoidettaessa paikallinen eturauhassyöpä.

Citation: Syed Khaja AS, Helczynski L, Edsjö A, Ehrnström R, Lindgren A, Ulmert D, et al. (2011) Kohonnut taso Wnt5a proteiinin paikallinen eturauhassyöpä Tissue liittyy parempaan tulokseen. PLoS ONE 6 (10): e26539. doi: 10,1371 /journal.pone.0026539

Editor: Alana L. Welm, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 28 syyskuu 2011; Julkaistu: 24 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Syed Khaja et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat Ruotsin Cancer Foundation (AB ja TA), Ruotsin Research Council (AB ja TA), The Söderberg säätiöt (TA), Malmön yliopistollisen sairaalan Research Foundations (AB ja TA), Gunnar Nilsson Cancer Foundation (AB ja TA ) ja Euroopan unionin kuudes Framework (P-Mark), Grant määrä LSHC-CT-2004-503011. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: patenttihakemus on toimitettu Anders Bjartell ja Tommy Andersson kuten keksijät, jossa ne, jotka perustuvat esillä olevat tulokset, ehdottaa eturauhassyövän potilailla, joiden kasvaimissa, joissa on pieni endogeeninen Wnt5a ilmaisutapoja aine liuottaa Wnt5a signalointi eturauhasen kasvaimia näillä potilailla. Tämä sovellus ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on johtava syöpä vaikuttaa miehiin kaikkien rotujen ja toiseksi yleisin kuolinsyy kehittyneissä maissa [1]. Androgeenit ja androgeenireseptorin (AR) kriittisiä rooleja ei vain normaalia kehitystä, kasvua ja toimintaa eturauhasen mutta myös syövän synnyn ja etenemisen PCa [2]. Aluksi PCa solut ovat yleisesti AR riippuvainen niiden kasvua ja selviytymistä, ja siten vastata androgeenien puute hoitoa (ADT), mutta myöhemmissä vaiheissa PCa solut tulevat androgen-tunteeton, ja kohtalokas kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC) kehittää [3] . Molekyylimekanismeja vastaa siirtymistä CRPC tunnetaan huonosti, mutta parhaiten yhteen muutos liittyy kastraatio kestävä maailmanlaajuinen kasvu geeniekspressioprofiilien Eturauhassyövän ksenograftien lisääntyi AR mRNA [4]. Lisääntynyt ilmentyminen AR pidetään keskeinen piirre CRPC ja on osoitettu, seurauksena joko mutaatiosta tai monistaminen AR tai lisääntynyt ekspressio aiheuttaman vapautuneilla kasvutekijöiden tai erilaisia ​​co-säätävät [5]. Vaikka meillä on pääsy ennustetekijöiden PCA, kuten Gleason laatu, TNM vaiheessa kirurginen marginaali tila ja seerumin PSA-arvot, on kiireellinen tarve määrittää uusien biomarkkereiden, joka voi merkittävästi parantaa, joko yksin tai yhdessä muiden biomarkkereiden meidän kyky ennustaa lopputulosta PCA potilailla. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet mahdollisen suhde AR ja Wnt-β-kateniinin signalointireittien aikana kehittymistä ja etenemistä PCa [6], [7].

Viime aikoina on kiinnitetty huomiota rooliin Wnt proteiinien ja Wnt signalointia PCa. Nimi Wnt tulee ”siivetön liittyvistä MMTV integraatio site” ja alun perin ehdotti Nusse ja työtoverit vuonna 1991 [8]. Wnt proteiinit muodostavat perheen yhdeksäntoista erittyy glykoproteiineja, jotka tärkeä rooli kehityksen aikana ja solukohtalon selityksessä solujen kulkeutumista ja solujen napaisuuden [9], [10]. Wnt-proteiinien voidaan luokitella ainakin kahteen alaperheeseen; kanoninen Wnts jotka edistävät β-kateniinin-välitteisen transkription ja ei-kanoninen Wnts. Wnt signalointi tapahtuu auto- tai parakriiniseen muoti sitoutumisen kautta erittyvien Wnt molekyylien seitsemän transmembraanisen Frizzled reseptoriproteiineille (Fz) puuttuessa tai läsnä koreseptorit kuten LRP 5/6 ja ROR [10]. Useita Wnt signalointia komponentteja on myös osallisena synnyssä ihmisen syövissä; yli-ilmentymisen Wnt-1 havaittiin rintaepiteelisolulinja adenokarsinooman [11] ja useissa PCa solulinjoissa ja PCa kudoksissa. Wnt-1 ilmentymisen korreloi positiivisesti Gleason pisteet, β-kateniinin ja seerumin PSA-arvot [12]. Lisäksi, joka perustuu määritykseen Wnt5a mRNA-tasojen eturauhastuumoreissa on ehdotettu, että epänormaali ilmentyminen ei-kanoninen Wnt5a on mukana PCa [13].

Wnt5a, yksi tutkittu ei- kanoninen Wnts, on olennainen Wnt-proteiinia indusoimisessa ja ohjaamalla Wnt /Planar solun polariteetti (PCP) ja Wnt /Ca

2+ reittejä [14], [15]. Lisäksi Wnt5a ei pelkästään ole osoitettu vastapainoksi Wnt /β-kateniinin reitin lisäksi, tietyissä yhteyksissä, aktivoida tämän reitin [16]. Mahdollisuus Wnt5a aiheuttavan erilaisia ​​alavirran signalointi tapahtumia voidaan ainakin osittain selittää läsnäolo raporttien mukaan epäselvä luonne Wnt5a; joilla on joko tuumorisuppressorina tai kasvaimen mainostaisi riippuen yhteydessä ja kasvaintyyppi [16]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että Wnt5a on vaimentua tiettyjen maligniteettien, mukaan lukien peräsuolen syöpä (proteiinin ekspressio) [17], neuroblastooma (mRNA-tasot) [18], invasiivinen duktaalinen rintasyövissä (proteiinin ekspressio) [19], [20] ja leukemiat (mRNA tasot) [21], mikä osoittaa kasvaimen estävä vaikutus Wnt5a. Mielenkiintoista, muut raportit ovat sen sijaan ehdottaneet onkogeenisessä vaikutus Wnt5a perustuu ensisijaisesti säätelyyn ylöspäin rintasyöpäsoluissa (mRNA) [22], mahasyöpä (proteiinin ilmentymisen) [23], melanooma (proteiiniekspressiota) [24], keuhkosyöpä ja eturauhasen syöpä (mRNA ilmaisu) [13]. Poikkeava geeni ja proteiinin ilmentymistä Wnt5a PCA ja mahdolliset taustalla molekyylitason mekanismit on kuvattu aiemmissa raporteissa [13], [25], [26], [27]. Eräässä tuoreessa tutkimuksessa, joka perustuu Affymetrix tutkimusten normaalin eturauhasen epiteeli- ja syöpäsolulinjoissa, Wang et al osoittivat, että lisääntynyt transkriptio Wnt5a geenin PCa johtui hypometylaatio; mikä viittaa siihen, että epigeneettisellä säätely Wnt5a ilmentyminen voi olla merkitystä PCa etenemistä [28]. Jokainen johtopäätös valmistettu dataa Affymetrix analyysi ilman samanaikaista analyysiä Wnt5a proteiinin ilmentymisen on vaarallista, koska Wnt5a mRNA on pitkä transkriptoimattoman 3′-alue avoinna translaation sääntelyä. Data yllä tätä translaation säätely Wnt5a proteiinin ilmentymisen on aiemmin kuvattu [19], [29].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet kasvanut Wnt5a ja proteiinin tasot PCa verrattuna hyvänlaatuinen kudokseen [25], [26] . Yamamoto et al osoittivat

in vitro

että knockdovvn Wnt5a vähensi invasiivisia ominaisuuksia DU145, ja yli-ilmentyminen Wnt5a stimuloi invaasion PC3-solujen [25]. Sen sijaan Wang Q ja työtoverit osoittivat, että yhdistelmä-DNA-Wnt5a ei aiheuttanut lisääntynyttä liikkuvuutta samassa PC3-soluja [26]. Lisäksi se on osoittanut immunohistokemiallinen (IHC) että Wnt5a ilmaisu korreloi Gleason pisteet ≥8 24 potilasta kohortin 98 PCa potilaista, jotka oli tehty eturauhasen. Tämä voi osoittaa, että Wnt5a edistää aggressiivisuus, koska potilailla, joilla on alhainen Wnt5a tasoilla oli parempi uusiutumisen elinaika verrattuna potilaisiin, joilla on korkea Wnt5a tasolla [25].

ristiriitaisia ​​tietoja roolista Wnt5a PCA etenemistä ja harva tietoa Wnt5a ilmaisun suhteessa kliiniseen tulokseen, kehotti meitä tutkimaan proteiinin ilmentymistä Wnt5a suuressa väestöpohjainen kohortti ja tehtävä ennustaa lopputulosta leikkauksen jälkeen paikallinen ja pääasiassa huonolaatuisen (91%) PCa. Tämä tutkimus täydennettiin

in vitro

kokeita tutkia mahdollisia syitä kyky Wnt5a toimimaan ennakoivaa biomarkkereiden tämän potilasryhmän luokkaan. Tässä tutkimuksessa olemme vahvistaneet Wnt5a proteiini tasot yläreguloituja PCa verrattuna hyvänlaatuinen kudokseen, mutta huomasimme, että lisääntynyt Wnt5a proteiinin ilmentyminen oli positiivinen vaikutus tulokseen PCA potilailla, kuten potilailla, joilla on korkea Wnt5a proteiinia tasot olivat parempia tuloksia verrattuna potilaisiin alhainen Wnt5a tasot jälkeen eturauhasen. Hyvässä sopimuksessa, Huomasimme myös, että tämä kyky Wnt5a vaikuttaa positiivisesti tulokseen PCA potilailla saattaa johtua sen kyvystä estää hyökkäystä Eturauhassyövän soluja ilman aluksi vaikuttamatta niiden leviäminen

in vitro

. Lisäämällä Foxy5 (a Wnt5a matkimalla peptidi) laski myös invaasio, mutta ei näiden solujen.

Tulokset

immunohistokemiallinen arviointi Wnt5a, AR, Ki-67: n ja VEGF

kudos mikrosiru (TMA) rakentaa päällekkäisiä ytimet sekä hyvän- että pahanlaatuisia kudoksia 503 potilasta (potilaan ominaisuuksien taulukko 1), joka oli tehty eturauhasen, oli immunovärjättiin Wnt5a, AR, Ki-67 ja VEGF (Fig. 1a- F). Wnt5a-proteiinin ekspressiota havaittiin sytoplasmisen osaston epiteelisolujen ja satunnaisesti stroomasolujen sekä syöpä ja hyvänlaatuinen kudosnäytteet. Syöpä kudokset useimmista potilaista (82%) osoitti homogeenisen voimakas soluliman immunovärjäystä, kun taas suurin osa hyvänlaatuinen kudosten (65%) osoitti heikkoa immunoreaktiotuotteet tukevat että ylös-säätely Wnt5a proteiinia esiintyy syöpäkudoksessa. Tulokset manuaalinen pisteytys sytoplasmista värjäytymisvoimakkuuksia pahanlaatuisia ja hyvänlaatuisia epiteelisoluja kuvassa. 1G-I. Ero Wnt5a värjäytymisvoimakkuuksia syöpä ja hyvänlaatuinen näytteiden todettiin olevan merkittäviä (p 0,0001), kun pariksi Wilcoxonin summa suoritettiin. Lähes 80% potilaista löysimme vahvan Wnt5a värjäytymisen intensiteetti (mielivaltainen yksikkö 2 tai 3) syövän ytimiä, kun taas vain 35% potilaista näkyy voimakas värjäytyminen hyvänlaatuista kudosnäytteistä. Lisätietoja pisteytys tietojen Wnt5a, AR, Ki-67 ja VEGF värjätään ytimiä on esitetty taulukossa 2.

A B) Paneelit osoittavat edustaja Wnt5a immunovärjäyksin hyvänlaatuisia ja syövän kudoksen alueita samasta potilaasta C D) Paneelit osoittavat edustaja ydin- AR immunovärjäyksin hyvänlaatuisia ja syövän kudoksen alueet E F) Paneelit ääriviivat VEGF immunovärjääminen hyvänlaatuinen ja syöpä kudoksen alueita samasta potilaasta. Kaikki teriä paneelit kuvaavat suurennus (40 x) kuvaa alueen nuolella on suurempi kuva nähdään 15-kertainen suurennus. G, H I) Paneelit hahmottaa graafisen esimerkkejä Wnt5a, AR ja VEGF-proteiinin ilmaisuja hyvänlaatuinen ja syöpä näytteet PCA potilailla. Rimaa kussakin paneelissa linjaa 100 pm.

Androgeenireseptorin värjäytyminen oli pääasiassa ydinvoiman odotetusti ja yleensä voimakkaampi syövän verrattuna hyvänlaatuinen kudosnäytteiden kuten taulukosta 2. seitsemänkymmentä prosenttia kasvaimen ytimet voimakkaasti värjättiin verrattuna 53% hyvänlaatuisen sydämiä.

Nuclear Ki-67 ilmentyminen käytettiin leviämisen markkeri (kuvio S1A, B, C, D). Siellä oli merkittäviä eroja Ki-67 värjäys syövän ja hyvänlaatuinen ydintä, koska 14%: n hyvänlaatuinen ytimien olivat negatiivisia Ki-67, kun taas vain 5% syövistä ytimien olivat Ki-67 negatiivinen. Mitä positiivisia Ki-67 tumavärjäystä, lähes 9% syövän ytimien oli värjäys pisteet yli 2, kun vastaava luku hyvänlaatuinen ytimien oli vain 2,5% (taulukko 2).

VEGF ilmaisua, kuten surrogaattimarkkerina angiogeneesiä, havaittiin sytoplasmassa sekä pahanlaatuisten ja hyvänlaatuisten epiteelisolujen syöpä alueet osoittavat korkeampi värjäytymistä kuin hyvänlaatuinen. Yli 73% syövän ytimien osoitti vahvaa VEGF immunovärjäystä, kun taas vain 51% hyvänlaatuinen ytimien osoitti vahvaa immunoreaktiotuotteet (taulukko 2).

Ero AR, Ki-67 ja VEGF värjäytymisvoimakkuuksia syöpää vastaan hyvänlaatuinen ytimet oli tilastollisesti merkitsevä (p 0,0001), kun Wilcoxonin summa testi suoritettiin (taulukko 2).

Korrelaatio Wnt5a kudoksen ilmaisutapoja AR, Ki-67 ja VEGF

Tässä kohortti Wnt5a ilme oli positiivista ja tilastollisesti merkittävää korrelaatiota VEGF ilme (Spearmanin rho (ρ) = 0,396, p 0,0001), heikko mutta silti tilastollisesti merkitsevä korrelaatiota AR ilme (ρ = 0,159, p = 0,007) ja Ki-67 lauseke (ρ = 0,233, p 0,0001) (taulukko 3). Useimmat potilaat (220/365, 60%), joilla on vahva Wnt5a immunovärjäys syöpäkudoksiin oli myös voimakas AR värjäytymistä (taulukko 4). Samanlainen suuntaus havaittiin, kun Wnt5a ja VEGF verrattiin; 65% (219/339) syöpä ytimien osoitti vahvaa värjäytymistä sekä Wnt5a ja VEGF. Emme löytäneet eroja Wnt5a immunovärjäyty- intensiteetti kun vertasimme potilasryhmiä eri Gleason tulokset. Potilailla, joilla patologinen Gleason pisteet jopa 3 + 4 ( ”huono laatu”), 81% oli kohonnut Wnt5a proteiinin ilmentymisen verrattuna 86%: lla potilaista, joilla on korkeampi Gleason (tuloksia ei ole esitetty). Samoin ei korrelaatiota ei havaittu Wnt5a värjäytymistä ja patologinen T vaiheessa, kliininen T vaiheessa kirurginen marginaali tila tai rakkularauhanen invaasio (tuloksia ei ole esitetty).

Wnt5a proteiinin ilmentymisen ja ennustaminen kliinisen tulos

Seuraavaksi arvioimme jos Wnt5a proteiinin ilmentymistä syövän kudoksissa analysoitiin jälkeen eturauhasen lokalisoitu PCa voisi ennustaa kliininen tulos mitattuna aikaa biokemiallisten uusiutuminen (BCR), käyttäen PSA 0,2 ng /ml verta näytteitä vahvistava arvo korvikemarkkerina. Wnt5a proteiinin ilmentyminen, kuten on esitetty IHC oli merkittävästi suurempi syövän alueilla verrattuna hyvänlaatuinen alueilla (Fig. 1, taulukko 2). Mielenkiintoista, kun Kaplan-Meierin käyrä piirrettiin välillä Wnt5a proteiinin ilmentymisen ja BCR vapaa-aikaa, jonka tulos on myönteinen (p = 0,001) oli ilmeinen potilailla, joilla on korkea Wnt5a proteiinin ilmentymisen verrattuna potilaisiin, joilla on alhainen Wnt5a proteiinin ilmentymisen (Fig. 2A). Kuten odotettua, pieni ilmaus AR (kuva S2C) ja Ki-67 (kuvio S2B) liittyi myönteisen tuloksen taas VEFG ilmaisua ei merkittävästi liittynyt BCR vapaa-aikaa (kuva S2D).

Kaikki syöpätapausta erotettiin 2 ryhmään perustuu värjäytymisen voimakkuudet Wnt5a, Ki-67, AR ja VEGF. Alhainen ryhmien mukana kasvainten pistein 0 tai 1 ja korkeat ryhmien mukana kasvainten pistein 2 tai 3.) Paneeli näyttää eloonjäämiskäyrien piirretty välillä korkea tai matala Wnt5a proteiinin ilmentymiseen ja BCR vapaa-aikaa. B) Paneeli näyttää eloonjäämiskäyrien piirretty välillä korkea tai matala Wnt5a sekä korkean ja matalan Ki-67-proteiinin ilmaisuja. Näin ollen kasvaimia jakaa seuraaviin 4 ryhmään; Wnt5a alhainen Ki-67 matala, Wnt5a alhainen Ki-67 korkea, Wnt5a suur- ja Ki-67 matala ja Wnt5a suur- ja Ki-67 korkea. C Paneeli näyttää eloonjäämiskäyrien piirretty välillä korkea tai matala Wnt5a sekä korkean ja matalan AR proteiinin ilmaisuja. Näin ollen kasvaimia jakaa seuraaviin 4 ryhmään; Wnt5a alhainen AR alhainen, Wnt5a alhainen AR korkea, Wnt5a suur- ja AR alhainen ja Wnt5a suur- ja AR korkea. D) Paneeli näyttää eloonjäämiskäyrien piirretty välillä korkea tai matala Wnt5a sekä korkea ja matala VEGF-proteiinin ilmaisuja. Näin ollen kasvaimia jakaa seuraaviin 4 ryhmään; Wnt5a alhainen VEGF alhainen, Wnt5a alhainen VEGF korkea, Wnt5a suur- ja VEGF alhainen ja Wnt5a suur- ja VEGF korkea. Kaikki paneelit korkea proteiinin ilmentymistä on osoitettu ↑ taas ↓ osoittaa heikkoa ilmentymistä. Jokainen askel käyrät edustavat uusiutumisen PCA. Annetut p-arvot alareunassa oikealla puolella paneelien osoittaa huomattavia eroja tuloksen välillä suotuisin ryhmän ja vähiten suotuisa ryhmä (katso taulukko 4 tarkempia tietoja).

Lisäksi, tutkimme jos Wnt5a proteiinin ilmentyminen voi myös ennustaa tuloksen, kun se yhdistetään johonkin muun kudoksen biomarkkerit. Paras ennustemallin saatiin, kun Wnt5a -proteiiniekspressio yhdistetään joko AR tai Ki-67 ilmentyminen (Fig. 2B, C), kuten potilailla, joilla on korkea Wnt5a ja alhainen AR tai matala Ki-67 ilmentyminen osoittivat parempaa uusiutumisen elinaika (p 0,0001), kun taas potilailla, joilla on alhainen Wnt5a ilme ja korkea AR tai korkean Ki-67 ilmentyminen oli huonoin tulos leikkauksen jälkeen. Potilaat, joilla on korkea Wnt5a ja matala VEGF ilme oli parempi tulos verrattuna muihin ryhmiin (p = 0,003) tai kunkin merkin yksinään. Kuitenkin yhdistelmä korkeaa Wnt5a ja matala VEGF oli huonompi kun Wnt5a analysoitiin yhdessä AR tai Ki-67 osoittaa, että VEGF ei ole yhtä vahva kuin AR tai Ki-67 ennustaa tuloksista yhdessä Wnt5a tässä yhteydessä ( kuva 2D). Cox regressional analyysiä käytettiin monimuuttuja-analyyseissä ja paljasti, että Wnt5a ilmaisua, Gleason pisteet ja patologinen T vaiheessa olivat riippumattomia vaikuttavia tekijöitä uusiutumisen elinaika PCA (taulukko 4).

Wnt5a proteiinin ilmentymisen ja sen vaikutukset hyökkäyksen ja leviämisen Eturauhassyövän solulinjojen

Tuloksemme osoittavat, että potilailla, joilla on korkea Wnt5a proteiinin ilmentyminen on suotuisamman kehityksen verrattuna potilaisiin, joilla on alhainen Wnt5a proteiinin ilmentymisen. Jotta voitaisiin paremmin ymmärtää tämän löytää Wnt5a proteiinin ilmentymistä yhdessä SV40 ikuisti normaalin ihmisen eturauhasen epiteelisolujen linja (PNT2) ja neljä erilaista PCa soluista tutkittiin. PNT2 solut oli alhainen endogeenistä Wnt5a proteiinin taas oli huomattavaa Wnt5a ilmentymistä PCA solulinjoissa LNCaP ja 22Rv1 (Fig. 3A). Nämä tiedot ovat hyvässä sopusoinnussa meidän havainnot Wnt5a proteiinin ilmentymisen nykyisin analysoidaan kohortti Eturauhassyövän ja tuoreessa tutkimuksessa suoritettiin myös normaalissa eturauhasessa epiteelin ja PCa solulinjat [26]. Kuitenkin analyysit kaksi aggressiivisempi PCa solulinjoja (PC3 ja DU145) paljasti hyvin alhainen ilmentyminen Wnt5a proteiinin, joka on verrattavissa normaaliin PNT2 eturauhasen epiteelisolujen linja (Fig. 3A). Mielenkiintoista on, että Wnt5a proteiinin tasot sovitettu AR proteiinin ilmaisuja näissä solulinjoissa (Fig. 3A).

A) Paneeli esittää endogeenisen Wnt5a ja AR ilmaisun neljässä osoitettu PCa solulinjoissa (LNCaP, 22Rv1 , DU145 ja PC3-solut) ja yhdessä ikuisti ihmisen eturauhasen epiteelisolujen linja (PNT2 solut). Wnt5a proteiinin rintama tunnistettiin ajamalla rWnt5a rinnakkain samassa geelissä. Täplät uudelleenseulottiin varten β-aktiini kuin latauskontrollina. Esitetyt blots edustavat 4 erillisen kokeen. B) Paneeli esitetään suhteellinen hyökkäyksen LNCaP, 22Rv1, DU145 ja PC3 solulinjoissa kuluttua 24 h puuttuessa tai läsnä rWnt5a (0,4 ug /ml) määrityksessä on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Tulokset on esitetty keskiarvoina ± SEM 5 erillisestä kokeesta. Erot invaasion välillä soluissa, joita käsiteltiin vehikkelillä tai rWnt5a arvioitiin tilastollisen merkitsevyyden (p = 0,0001 22Rv1 ja p 0,0001 DU145). C) Paneeli esitetään leviämisen LNCaP, 22Rv1, DU145 ja PC3 solulinjoja 24 h kuluttua puuttuessa tai läsnä rWnt5a (0,4 ug /ml). Tulokset on esitetty keskiarvoina ± SEM 5 erillisestä kokeesta. Ei ollut merkittäviä eroja leviämisen välillä ohjaus ja rWnt5a käsiteltyjä soluja. D) Paneeli edustaa suhteellista hyökkäyksen 22Rv1 ja DU145-soluissa 24 tunnin kuluttua ilman tai läsnä Foxy5 (100 uM) käyttäen samaa määritystä kuin paneelissa B erot invaasion välillä soluissa, joita käsiteltiin vehikkelillä tai Foxy5 oli arvioitiin tilastollista merkittävyyttä (p = 0,01 22Rv1 ja p = 0,0003 varten DU145). E) Paneeli kuvaa vaikutuksia siRNA knockdovvn Wnt5a LNCaP ja 22Rv1. Täplät uudelleenseulottiin varten α-tubuliinin kuin latauskontrollina. Esitetyt blots edustavat 4 erillisen kokeen. F) Paneeli esitetään suhteellinen hyökkäyksen LNCaP ja 22Rv1 solujen käsittelyn jälkeen Wnt5a si-RNA (Wnt5a Knockdown) tai salattu siRNA (kontrolli), samassa määrityksessä on käytetty aikaisemmin paneelissa B. Tulokset on esitetty keskiarvoina ± SEM 5 erillistä koetta. Ero hyökkäyksen välinen salattu ja si-Wnt5a pudotti solut olivat tilastollisesti merkitseviä sekä solulinjoissa (p 0,0001).

Käytimme neljä syöpäsolun riviä (LNCaP, 22Rv1, PC3 ja DU145 ) meidän myöhempää hyökkäystä kokeita. Lisäksi yhdistelmä-DNA-Wnt5a (rWnt5a) pieneni invasiivisen käyttäytymisen sekä 22Rv1 ja DU145 syöpäsolujen (Fig. 3B). Kumpikaan LNCaP tai PC3 soluja ei vastannut rWnt5a kanssa muutos niiden invasiivisia käyttäytymistä. Tuloksena kanssa PC3-solujen on sopusoinnussa äskettäin julkaistun raportin Wang et al [26], jossa PC3-soluissa ei vastannut lisäystä rWnt5a on muuttoliikkeen haavan naarmu määrityksessä. LNCaP-solujen tiedetään olevan hyvin alhainen hyökkäyksen aktiivisuutta, ja tämä voi selittää, miksi nämä solut eivät reagoi, kun rWnt5a lisättiin. Kuitenkin, kun Wnt5a ilmentyminen LNCaP pudotettiin käyttäen si-RNA: iden (Fig. 3E), oli merkittävä kasvu invasiivisia käyttäytymistä LNCaP (Fig. 3F). Lisäksi Wnt5a pudotus jonka si-RNA 22Rv1 syöpäsoluja myös lisännyt hyökkäystä näiden solujen (Kuva. 3E-F ja kuvio S4).

Voit selvittää, onko lasku hyökkäyksen 22Rv1 ja DU145 solulinjoja lisäämällä rWnt5a johtui vähenee leviämisen näistä solulinjoista, tutkimme proliferaationopeus PCA solulinjoissa. Lisääminen rWnt5a ei ollut merkittävää vaikutusta proliferaatioon näissä solulinjoissa 24 tunnin aikana käytetty invaasiomääritys (Fig. 3C).

Koska rWnt5a vähensi hyökkäyksen 22Rv1 ja DU145 soluja, invaasiomääritys oli suoritettiin myös näissä solulinjoissa käyttäen Foxy5 joka on heksapeptidi johdettu aminohapposekvenssi Wnt5a proteiinin ja aiemmin osoitettu estävän motiliteettia rintasyöpäsolujen kuten rWnt5a [30]. Foxy5 todellakin tukahdutettu invasiivisia ominaisuuksia näiden kahden PCa solulinjoista (kuvio. 3D), ja tämä väheneminen invaasio ei aiheuttanut vähentynyt proliferaatio Foxy5 ei vaikuttanut leviämisen asemaan näissä solulinjoissa (BrdU määritys, tuloksia ei ole esitetty).

keskustelu

Tietääksemme tämä toistaiseksi vain yksi tutkimus, jossa on rajoitettu määrä potilaita on osoittanut roolin Wnt5a proteiinin ennustaa kliinistä tulosta PCa [25]. Tämä kehotti meitä suorittamaan tutkimuksen Wnt5a proteiinin ilmentymistä suuremmassa kohortin hyvin määritelty PCa potilailla, joilla on paikallista ja pääasiassa matala-asteinen sairaus ja suhteuttaa tuloksia ilmaisun muiden tunnettujen kudosten biomarkkereita ja mikä tärkeintä kanssa BCR. Tässä tutkimuksessa mukana peräkkäinen 503 PCa potilaista, jotka oli tehty eturauhasen aikana 1988-2003 at Skåne University Hospital, Malmö, Ruotsi, joiden keskimääräinen seuranta-aika 41,6 kuukautta (alue +1,51-+205,90). Potilaalla kohortti on suuri, väestö perustuu, ja potilaat ovat hyvin ominaista (taulukko 1). Vuonna TMA liukuu hyvän- ja pahanlaatuisten kudosten samasta potilaasta ovat läsnä kaksoiskappaleet. Perustuen Gleason laadut potilaan materiaali karakterisoitiin edelleen osaksi huonolaatuisen syöpiä (Gleason pisteet enintään 3 + 4) ja korkea-asteen syöpiä (Gleason 4 + 3 tai korkeampi). Lähes 89%: lla potilaista luokiteltiin heikompilaatuisen syöpiä, joka on odotettavissa ryhmässä potilaita paikallisluonteisia PCa sopii eturauhasen. Kontrollina meidän kliinisestä materiaalista, me todeta, että oli tilastollisesti merkitsevää eroa kliinisten tulosten välillä potilailla, joilla on matala-asteinen ja korkea-asteen syövän käyttäen Kaplan-Meier analyysit BCR-elinaika (kuvio S2A). Edelleen valvonta kliinisestä materiaalista paljasti myös, että sama pätee silloin, kun proliferaatiota tutkittiin Ki-67 ilme, validoitu kudos biomarkkereiden PCA [31]. Potilaat, joilla on korkea Ki-67 ilmentyminen oli vähentänyt uusiutumisen eloonjäämisaika verrattuna potilaisiin, joilla on alhainen määrä Ki-67 ilmentäviä tuumorisoluja (kuvio S2B).

Tässä TMA tutkimuksessa käytimme hyvin tunnettu -talo spesifistä vasta-ainetta Wnt5a, kuten aikaisemmin on kuvattu rintasyöpätutkimuksissa [20]. Täällä me myös suorittaa kilpailuun rWnt5a vahvistaa vasta- aineen on eturauhasen kudosnäytteiden (kuva S3). Värjäytymisintensiteettiä laski vasta-ainetta yksin, kun vasta-aineen ja rWnt5a käytettiin ja jo moolisuhteessa 01:10 löysimme selvä vähentäminen immunovärjäyksen. Lisäksi toteutimme immunosolukemialliset (Täydentävät materiaalit ja menetelmät S1) Wnt5a eturauhassyövässä solulinjoissa (LNCaP, 22Rv1 ja DU145) esikäsittelyn jälkeen joko salattu tai Wnt5a si-RNA: ta (kuvio S4A, B, C, D, E) . Ensin havaitsimme sytosolin värjäys Wnt5a samankaltainen kuin eturauhasen syöpä kudoksen ja toiseksi intensiteetti Wnt5a Immunovärjäyksen väheni merkittävästi Wnt5a si-RNA käsitellyt solut verrattuna hoidettiin salatun si-RNA. Hoito Wnt5a siRNA vähentynyt aste Wnt5a Immunovärjäyksen tasolle samanlainen kuin Länsi blotit (Fig. 3E). Analyysi meidän TMA osoittavat selvästi, että Wnt5a proteiinin ekspressio lisääntyi lokalisoitu PCa verrattuna hyvänlaatuinen kudosta samoista potilaista, vaikutus, joka osoitti voimakasta tilastollista merkitsevyyttä (p 0,0001, Fig. 1 A, B G, taulukko 2 ). Nämä tulokset ovat hyvässä kanssa viimeaikaisten havaintojen saatu pienempi kohortin [25]. Kliiniset johtopäätös, että Wnt5a proteiinin ilmentyminen lisääntyy lokalisoitu PCa kudoksessa verrattuna normaaliin /hyvänlaatuinen kudos tukee myös analyysimme ihmisen erilaisten eturauhasen solulinjoissa. Olemme selvästi havaita, että PNT2 solulinja, SV40- kuolemattomaksi solulinja on johdettu normaalista ihmisen eturauhasen epiteelin ilmaista hyvin alhainen endogeenisen Wnt5a proteiinia, kun taas ilmaus Wnt5a proteiini oli korkea PCA solulinjoissa LNCaP ja 22Rv1. Aggressiivisempia solulinjat, PC3 ja DU145, oli hyvin alhainen Wnt5a proteiinin ilmentymisen. Tämä on sopusoinnussa epäedullisempia tulos havaittiin Wnt5 alhainen kasvaimia. Kuitenkin TMA materiaali, Wnt5a ei vaimentua high-grade (Gleason 4 + 3) PCa tapausta. Jos nämä näennäisesti ristiriitaisia ​​tulokset osoittavat grade-etuyhteydettömille funktio Wnt5a tai heijastaa vain yksilölliset ominaisuudet kaksi kasvaimia, joista solulinjat on johdettu on vaikea sanoa. Vaihtoehtona selitystä, määrä korkealaatuisia PCa olevassa kohortissa (n = 41) saattaa olla liian pieni havaita grade liittyvä Wnt5a alassäätöä.

Huomasimme myös lisääntynyt ilmentymä AR, Ki-67: n ja VEGF-proteiinien paikallisen PCa kudoksessa verrattuna hyvänlaatuiseen kudokseen (Fig. 1 C-F, H-I, taulukko 2). Jotta saadaan ensimmäinen käsitys mahdolliset mekanismit kuinka Wnt5a toimii PCA teimme tilastollisia analyysejä potentiaalisten korrelaatioita Wnt5a proteiinin ilmentymisen ja että AR, Ki-67 ja VEGF, kaikki kolme tunnettua voimistuvan progressiivisessa PCa. Wnt5a korreloi merkitsevästi VEGF, merkkiaine angiogeneesiä, mikä osoittaa, että Wnt5a saattavat liittyä kasvaimen kasvua (taulukko 3). Tässä suhteessa meidän tiedot on hieman erilainen kuin raportoitiin analyyseistä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, jossa Wnt5a ei korreloinut VEGF ilmentymistä syöpäkudoksessa, mutta VEGF ympäröivän strooman kudokseen [32]. Lisäksi Wnt5a ilmaisu PCA kudoksessa tutkimuksessamme heikosti mutta merkittävästi liittyy AR ilme (taulukko 3). Proteiinin ilmentyminen analyysi western blot osoitti, että Wnt5a tasoilla ja AR ilmentymistä yhdessä kuolemattomaksi eturauhasen epiteelisolujen linja ja 4 eri PCa solulinjoja sovitettu toistensa kanssa, mikä osoittaa mahdollista korrelaatiota Wnt5a ja AR PCa (Fig. 3A). Vaikka nämä tiedot, se on viime aikoina osoitettu, että Wnt5a inhiboi AR-transkriptionaalista aktiivisuutta 22Rv1 soluihin, kun nämä solut transfektoitiin Wnt5a plasmidi [33]. Lopuksi, Wnt5a proteiinin ekspressio heikosti mutta merkittävästi yhteydessä Ki-67 ilmentyminen (taulukko 3). Tämä tulos on mukaista raportti Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, jossa kasvaimeen Wnt5a ilmaisu korreloi merkitsevästi Ki-67 leviämisen indeksi [32], mutta toisin kuin tutkimus maksasyövän jossa Wnt5a on kasvain estävästi ja menetys Wnt5a on vahva korrelaatio korkean Ki-67 leviämisen indeksi [34]. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että rooli Wnt5a signaloinnin säätelyssä kasvainsoluproliferaation on epävarmaa.

Tässä tutkimuksessa emme löytäneet korrelaatiota Wnt5a proteiinin ilmentymisen ja Gleason pisteet, vaikka tämä voi paras käytettävissä ennustetekijöiden indikaattori tulos PCA [35]. Kuitenkin Gleason pisteytys on rajoituksensa johtuen interobserver vaihtelevuuden patologien ja siten tarvitaan täydentäviä markkereita. B