Krooninen sairaus

tiivistelmä

epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) on tärkeä prosessi kasvainten kehittymiseen. Huolimatta aiemmissa tutkimuksissa, on epäselvää, miten p120-kateniinin (p120ctn) isoformeja 1A ja 3A vaikuttavat EMT syöpäsoluja. Täällä tutkimme ilmentymä p120ctn, E-kadheriinin ja vimentiinista 78 ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) näytteet immunohistokemiallisesti ja totesi, että p120ctn kalvo ilmentyminen korreloi positiivisesti E-kadheriinin ilmentymisen (

P

0,001) ja korreloi negatiivisesti vimentiinista ilme ja imusolmuke etäpesäke (

P

0,05). Samaan aikaan p120ctn sytoplasminen ilmentyminen korreloi negatiivisesti E-kadheriinin ilmentymisen (

P

0,001) ja korreloi positiivisesti vimentiinista ilme ja imusolmuke etäpesäke (

P

0,05). Solut, jotka ilmentävät korkeita (H460 ja SPC) ja matala (H1299 ja LK2) tasot p120ctn oli näytön tutkia sen vaikutuksia EMT. E-kadheriinin rajoitettiin solukalvon H460 ja H1299 soluja, kun taas se oli ilmaistu sytoplasmassa SPC ja LK2 soluja. Ablaatio Endogeenisen p120ctn isoformin 1A soluissa, jotka ilmentävät korkeita proteiinin alensivat E-kadheriinin ilmentymisen, lisäsi N-kadheriinin, vimentiinistä ja etana ilmaisun ja tehostettu invasiivisuus H460-soluissa. Samaan aikaan täysin päinvastainen tuloksia havaittiin SPC soluissa. Lisäksi transfektio in H1299 soluissa, jotka ilmentävät matalan p120ctn tasoja kanssa p120ctn isoformin 1A plasmidi lisännyt E-kadheriinin ilmentymisen, väheni N-kadheriinin, vimentiinistä ja etana ilmaisun ja heikentänyt invasiivisuus, kun taas LK2 solut osoittivat täysin päinvastaisiin tuloksiin. Molemmat solulinjat ilmentävät matalan p120ctn tasoilla ja transfektoitu p120ctn isoformin 3A plasmidin näytti olevan lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen, väheni N-kadheriinin, vimentiinistä ja etana ilmaisun ja heikensi invasiivisuus. Lopuksi soluissa kalvolla E-kadheriinin, molemmat p120ctn isoformit 1A ja 3A esti EMT ja laski solu invasiivisuus. Vuonna solujen soluliman E-kadheriinin, p120ctn isoformi 1A edistänyt EMT ja lisääntynyt solujen invasiivisuus, kun taas p120ctn isoformi 3A esti EMT ja laski solu invasiivisuus.

Citation: Zhang Y, Zhao Y, Jiang G, Zhang X, Zhao H, Wu J, et al. (2014) vaikutus p120-kateniinin isoformien 1A ja 3A on epiteelikasvaimet mesenkymaalitransitioon keuhkosyöpään solut, jotka ilmentävät E-kadheriinin eri Subsellulaariset sijainnit. PLoS ONE 9 (2): e88064. doi: 10,1371 /journal.pone.0088064

Editor: Frédéric André, Aix-Marseille University, Ranska

vastaanotettu: 21 marraskuu 2013; Hyväksytty: 06 tammikuu 2014; Julkaistu 4 helmikuuta 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (avustukset 81071905 ja 81272606 E.-HW, myöntää 81101780 on YZ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) on nopea ja usein palautuva muutos solun fenotyypin ja on erityisen tärkeä rooli kasvainten kehittymiseen. Tässä prosessissa EMT, epiteelisolujen tehdään fenotyyppinen kytkimen muodostamiseksi mesenkymaaliset solut, jotka ovat samanlaisia ​​ulkonäöltään fibroblasteissa [1], [2]. Tällaiset fenotyyppiset muutokset aiheuttavat epiteelisolujen menettävät ominaisuus solu- soluadheesiota rakenteet, muuttavat niiden napaisuus, mukauttaa organisoinnista solun tukirangan järjestelmien siirtyä ilmentyminen keratin- ja vimentiinista-tyyppinen väli- filamentit, sekä tulla eristyksissä, liikkuva ja kestävät anoikis [3], [4]. Tyypillisesti solut meneillään EMT määrä aleni E-kadheriinin ilmentymisen [5], [6] ja vähentynyt ilmentyminen mesenkymaalisten biomarkkereiden kuten N-kadheriinin, vimentiinistä, etana, etana ja kierre [7], [8].

Aikaisemmat tutkimukset suhdetta p120-kateniinin (p120ctn) ja EMT on rajoittunut siirtyminen lyhyen ja pitkän p120ctn isoformit aikana EMT aiheuttama ilmaus SIP1 /ZEB2 [9], twist [10] tai Zeppo1 [11 ]. Kuitenkin mekanismi, jolla p120-kateniinin isoformeja 1A ja 3A vaikuttaa EMT kasvainsolujen edelleen tuntematon. P120ctn proteiini on neljä isoformia (1-4) johtuvat neljästä transkription aloituspaikat, ja jokainen isoformi on täysi keskeinen Armadillo toista toimialueen joka voi olla vuorovaikutuksessa jukstamembraanidomeenissa E-kadheriinin voidakseen osallistua muodostumiseen tartuntaa monimutkaisten solukalvon [12]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että solunosasijaintia ja toiminta p120ctn voidaan vaikuttaa lokalisoinnin E-kadheriinin. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että p120ctn voi olla vastakkaiset rooleja riippuen siitä, onko se sijaitsee kalvon tai solujen sytoplasmassa [13], [14]. Toiset ovat myös havainneet, että p120ctn isoformeja 1A ja 3A on erilaiset sääntelyyn toimintoja kasvainsoluproliferaation, invaasiota ja etäpesäkkeiden [15], [16],. Nämä tutkimukset osoittavat, että jos p120ctn vaikuttaa EMT, se on todennäköisesti erilaiset p120ctn isoformeja 1A ja 3A.

Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että p120ctn voi edistää tai estää kasvaimen kasvua ja invasiivisuus riippuen siitä, onko E -cadherin ilmaistaan ​​vai ei [18], [19]. Yu ja työtovereiden totesi myös erilaisia ​​vaikutuksia p120ctn isomuotojen 1A ja 3A päälle leviämisen ja invaasion kasvainsoluissa näytteille eri lokalisoinneissa E-kadheriinin [20]. Siten onko p120ctn isoformit 1A ja 3A myös pelata erilaisia ​​rooleja säätelyssä EMT tuumorisoluissa E-kadheriinin eri paikoissa on edelleen tuntematon.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää mahdollisia vaikutuksia ja sääntelyn mekanismeja p120ctn isoformit 1A ja 3A EMT keuhkojen syöpäsoluja. Ensin kävi ilmi, että kalvon tai sytoplasmisen ekspression p120ctn korreloi ilmentyminen E-kadheriinin ja vimentiinin tai imusolmukkeen etäpesäke immunohistokemiallisesti. Olemme lisäksi havainneet ekspressiotasot p120ctn, E-kadheriinin ja vimentiinin keuhkosyövän soluissa Western blot ja seulotaan, jotka ilmentävät sekä matala ja korkea p120ctn ja E-kadheriinin kalvon tai sytoplasmaan. Ilmentymisen muutosten EMT-sukua olevien molekyylien ja solujen invaasiota tutkittiin myös mukaan pudotus endogeenisen p120ctn-1A tai yliekspressio transfektoimalla p120ctn-1A ja 3A plasmidit soluihin.

Materiaalit ja menetelmät

materiaalit

tutkimus suoritettiin hyväksyntää Institutional Review board China Medical University. Kirjallinen suostumus antoivat osallistujien tietonsa tallennetaan sairaalan tietokantaan ja niiden yksilöitä voidaan käyttää tässä tutkimuksessa. Kaikki kliiniset tutkimukset tehtiin periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Näytteitä kerättiin 78 tapauksia okasolusyöpä keuhkosyövän ja keuhkoadenokarsinooma diagnosoitu First Affiliated sairaala China Medical University (Sheny-ang, Kiina). Näytteet olivat peräisin 46 mies- ja 32 naaras potilasta, joiden keski-ikä 57 vuotta. Näytteet luokiteltu keuhkojen kasvain histologiseen kriteerien (2004) Maailman terveysjärjestön (WHO) [21] okasolusyöpä keuhkosyöpä (32 tapausta) tai keuhkon adeno- karsinooma (46 tapausta). Kolmekymmentä tapausta hyvin erilaisia, ja neljäkymmentäkahdeksan oli kohtalaisesti tai huonosti eriytetty. Imusolmukemetastaaseja oli läsnä 43 tapausta, mutta ei toisessa 35. Valitsimme tapauksissa imusolmukemetastaaseja verrata etäpesäkenystyröiden kanssa primaarikasvaimen. Tuumorin luokitus suoritettiin kasvain-solmu-etäpesäke (TNM) lavastus järjestelmä International Union syöpää vastaan ​​(UICC) [22]. Oli 39 tapauksia vaiheessa I-II, ja 39 tapausta vaiheessa IIIa-IIIb. Yksikään potilaista ei ollut saanut sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen leikkausta, ja niille annettiin standardi hoito leikkauksen jälkeen. Kaikki näytteet kiinnitettiin formaliiniin, valettiin parafiiniin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla patologista analysointia ja diagnoosi.

Soluviljely

Normaalit ihmisen keuhkoputken epiteelin (HBE) solut ja A549, H1299, H460 ja H157 solulinjat saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). SPC-A-1, LTEP-A-2 ja LK2 solulinjoja ostettiin Shanghai Cell Bank of Kiinan Academy of Science. Ihmisen keuhko ADC Anip973 ja AGZY83a solulinjoja ostettiin Shanghai Bioleaf Biotech Co., Ltd (https://www.bioleaf.com) ja tallennetaan Patologian osasto, Harbin Medical University. Soluja viljeltiin RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (Invitrogen), 100 IU /ml penisilliiniä (Sigma, St. Louis, MO, USA) ja 100 mg /ml streptomysiiniä (Sigma) .

Plasmidin rakentaminen ja transfektio

IImentämisplasmidien p120ctn isoformeja 1A ja 3A (lahjoittaja Dr. Albert B. Reynolds laitos syöpäbiologian, Vanderbilt University School of Medicine, TN, USA) on on kuvattu aiemmin [16]. Sekvenssit p120ctn-1A-siRNA (Guangzhou Ruibo Co Ltd, Guangzhou, Kiina) käytettiin kokeissa olivat seuraavat: si-h-CTNND1: 5′-CACAAGAUGCCAACCCACU dTdT-3 ’, 3′-dTdT GUGUUCUACGGUUGGGUGA-5’. Solut transfektoitiin ohimenevästi p120ctn-1A-siRNA ja ilmentävien plasmidien p120ctn isoformeja 1A ja 3A käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) tai Attractene Transfection Reagent (QIAGEN GmbH, Hilden, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

immunohistokemia

parafiiniin näytteet leikattiin sarjoittain osaksi 4-um: n paksuisia leikkeitä. Normaali keuhkoputken epiteelin läsnä kasvaimen dioja käytettiin sisäisenä positiivisena kontrollina. Immunovärjäys suoritettiin streptavidiini-peroksidaasia (S-P) menetelmällä. Kudosleikkeissä inkuboitiin p120ctn hiiren monoklonaalinen vasta-aine (1:100, cat. 610134, BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA), E-kadheriinin kanin monoklonaalista vasta-ainetta (1:100, cat. SC-7870; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) tai vimentiinista kanin monoklonaalinen vasta-aine (ready-to-use, kissa. RMA-0547, MaiXin Bio, Fuzhou, Kiina) 4 ° C: ssa yön yli. PBS: ää käytettiin negatiivisena kontrollina. Biotinyloitu vuohen anti-hiiri-seerumin IgG- tai biotinyloidulla vuohen anti-kanin seerumi IgG (ready-to-use, cat. KIT-9922, MaiXin Bio) käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. Pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin streptavidiini-biotiini-konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (ultraherkät, MaiXin Bio), ja sen jälkeen peroksidaasiin reaktio kehitettiin 3,3-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla (MaiXin Bio). Light counterstaining suoritettiin hematoksyliinillä, ja sitten leikkeet dehydratoitiin alkoholia ennen asennettu.

Kaksi tutkijat itsenäisesti tutkinut kaikki kasvain dioja. Viisi sattumanvaraisesti kentät tutkittiin kullekin levylle ja 100 soluja havaittiin kohti korkea suurennus kenttä (400 x). Niiden positiivisten solujen pisteytettiin seuraavasti: 0 = ei värjäytymistä; 1+ = 0-25%; 2+ = 26-50%; 3+ = 51-75%; ja 4+ = 76-100%. Värjäytymisintensiteettiä pisteytettiin seuraavasti: 0 = ei värjäytymistä; 1 = vaaleankeltainen rakeita; 2 = tumman keltainen tai ruskea rakeita. Merkinnässä pisteet määritellään kertomalla positiivisten solujen prosenttiosuuden mukaan värjäytymisen intensiteetti oli viimeinen pisteet jaksossa. Kun kokonaispistemäärä oli ≥3, kun kyseessä määriteltiin positiiviseksi. Kun kokonaispistemäärä oli 3, kun kyseessä määriteltiin negatiiviseksi. Sillä tulokset suurempi kuin 3 pistettä, kun yli 30% kasvainsoluista värjättiin voimakkaasti ja jatkuvasti p120ctn signaalin solukalvon, näyte määriteltiin kalvon positiivinen. Kun alle 30% kasvainsoluista näkyviin kalvon ilmaus mutta värjätään voimakkaasti ja jatkuvasti p120ctn sytoplasmassa, näyte määriteltiin sytoplasmassa positiivinen.

Western blot-analyysi

Viisikymmentä mikrogrammaa proteiinien erotettiin SDS-PAGE (10%). Sen jälkeen siirtää polyvinylideenifluoridia (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, USA), proteiinit inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa vasta-aineiden kanssa seuraavasti: p120ctn (1:500, cat. 610134), E-kadheriinin ( 1:300, kissa. 610181), N-kadheriinin (1:1000, kissa. 610920) (BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA), vimentiinistä (1:1000, kissa. 5741), etana (1:500, kissa. 3879) (Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA) ja kierre (1:200, cat. sc-15193, Santa Cruz Biotechnology). Inkuboinnin jälkeen anti-hiiri (1:2000, E030110-01) tai anti-kani (1:2000, E030120-01) IgG (EarthOx LLC, San Francisco, CA, USA) 37 ° C: ssa 2 h, proteiini nauhat visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin (ECL, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ja kvantitoitiin käyttäen Bioimaging Systems (UVP, Upland, CA, USA). Suhteellinen proteiinin tasot laskettiin viitaten GAPDH kuin lastaus ohjaus.

immunofluoresenssivärjäyksellä

Soluja kasvatettiin lasipeitinlevyjä kiinnitettiin jääkylmällä 4% paraformaldehydillä 15 min, minkä jälkeen läpäiseväksi kanssa 0,2% Triton X-100 ja inkubointi vuohen normaalia seerumia 30 min ajan 37 ° C: ssa. Soluja inkuboitiin sitten yön yli p120ctn hiiren monoklonaalisella vasta-aineella (1:200, cat. 610134; BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA) ja E-kadheriinin kanin polyklonaalista vasta-ainetta (1:100, SC-7870, Santa Cruz Biotechnology). Ensisijainen vasta-aineita sovellettiin yön yli 4 ° C: ssa, jonka jälkeen inkuboitiin rodamiini /fluoreseiini-5-isotiosyanaatti (FITC) -leimatuilla sekundaarista vasta-ainetta vuohen anti-hiiri tai TRITC-leimattu vuohen anti-kani-IgG (1:100, cat. E031210 -01 ja E031320-01, EarthOx, San Francisco, CA, USA). Tumat vastavärjättiin propidiumjodidilla /4, 6 diamino-2-phenylin-Dole. Epifluorescent mikroskopia tehtiin käyttämällä käännettyä Nikon TE300 mikroskoopilla (Melville, NY, USA), ja konfokaalimikroskopialla suoritettiin käyttäen Radiance 2000 laserskannaus konfokaalimikroskoopilla (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA).

Matrigel solun invaasiomääritys

Matrigel soluinvaasion määritykset suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Corning, Acton, MA, USA). 100-pl solususpensiota (5 x 10

5 solua) lisättiin ylempään kammioon, kun taas alempi kammio täytettiin RPMI 1640, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia. Jokainen ylempi ja alempi kammio erotettiin 8 um huokoinen polykarbonaatti kalvon. Soluja inkuboitiin 24 tuntia 37 ° C: ssa kosteassa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Sen jälkeen kun väliaine heitettiin pois, solut kiinnitettiin metanolilla 30 minuutin ajan ja värjättiin hematoksyliinillä (Sigma). Kunkin suodattimen määrä soluja, jotka tunkeutuivat alapintaan huokoisen kalvon viidestä eri kentästä 400-kertainen suurennus laskettiin sattumanvaraisesti käyttäen Nikon E200 mikroskoopilla. Keskimääräinen laskettiin saadut tiedot kustakin koe toistetaan kolme kertaa.

Tilastollinen

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) for Windows-ohjelmiston . Chi-neliö -testi käytettiin analysoimaan immunohistokemiallisesti tietoja. Riippumaton Näytteet T testiä käytettiin tutkimaan siirtokuoppaan kokeelliset tiedot.

P

arvojen 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Kalvo ilmaus p120ctn positiivisesti korreloi E-kadheriinin ilmentymisen ja negatiivisesti korreloi vimentiinista ilme ja imusolmuke etäpesäke

Normaali keuhkoputken epiteelin kudosten osoitti p120ctn kalvoon (kuvio 1A), kun taas osuus keuhkosyövän ilmentävien kudoksien p120ctn kalvoon oli merkittävästi pienempi (35%, 27/78), kuin että p120ctn sytoplasmisen ekspression (65 %, 51/78). E-kadheriinin ilmaistiin kalvon normaaleissa keuhkoputken epiteelissä kudoksissa (kuvio 1A), kun taas määrä positiivisen ilmentyminen oli vähentynyt (28%, 22/78), ja että negatiivisia ilmentyminen kasvoi merkittävästi (72%, 56/78) E-kadheriinin keuhkosyövässä kudoksissa. Vimentiinista negatiivisesti ilmentyy normaaleissa keuhkoputken epiteelin kudosten (kuvio 1A), kun taas määrä positiivinen ekspressio lisääntyi 32% (25/78) on keuhkosyöpä kudosta. Näyttää siltä keuhkosyöpä kudoksiin sytoplasmisen /ydinvoiman lokalisointi p120ctn yleensä ilmaista vimentiinista verrattuna niihin kanssa kalvomainen lokalisointi (41,2% [21/51] versus 14,8 [4/27]) .. Sytoplasmiset /ydinvoiman lokalisoinnin p120ctn osoittivat lisääntynyttä imusolmuke- etäpesäke (29/51) verrattuna kalvomainen lokalisointi (8/27). Tilastollinen analyysi osoitti, että lokalisointi p120ctn oli läheisessä suhteessa E-kadheriinin ilmentymisen, vimentiinistä ilmaisun ja imusolmuke etäpesäke (

P

0,05) (taulukko 1). Toisin sanoen, p120ctn kalvo ilmentyminen korreloi positiivisesti E-kadheriinin ilmentymisen ja korreloi negatiivisesti vimentiinista ilmaisun ja imusolmukkeen etäpesäke (kuvio 1 B); välin, p120ctn sytoplasminen ilmentyminen korreloi negatiivisesti E-kadheriinin ilmentymisen ja korreloi positiivisesti vimentiinista ilme ja imusolmuke etäpesäke (kuvio 1 C).

(A) E-kadheriinin ja p120ctn olivat kalvo positiivinen, ja vimentiinistä oli negatiivinen normaaleissa keuhkoputken epiteelisoluissa. (B) E-kadheriinin oli kalvo positiivinen, ja vimentiinistä oli negatiivinen p120ctn kalvo-positiivisten keuhkosyövän soluja. (C) E-kadheriinin oli negatiivinen, ja vimentiinistä oli positiivinen p120ctn sytoplasman-positiivisten keuhkosyövän soluja.

lokalisaatio p120ctn vastaa E-kadheriinin keuhkojen syöpäsoluja

tarkasteltiin proteiinin ekspressiotasot p120ctn ja E-kadheriinin normaaleissa HBE soluissa ja yhdeksän keuhkosyövän solulinjat Western blot ja totesi, että he kaikki ilmaisivat pääasiassa isoformit 1A (120 kDa) ja 3A (100 kDa) of p120ctn ( kuvio 2A). Vaikka proteiinin ekspressiotasot p120ctn eivät liittyneet E-kadheriinin, lokalisointi (kalvo tai solulimassa) on p120ctn oli aina sopusoinnussa E-kadheriinin. Sitten seulotaan solut, jotka ekspressoivat korkeita tasoja p120ctn ja E-kadheriinin kalvon (H460-solut) tai solulimassa (SPC-solut), samoin kuin ne, jotka ilmentävät alhainen p120ctn ja E-kadheriinin kalvon (H4299-solut) tai solulimassa ( LK2 solut) lisätutkimuksia varten (kuvio 2B).

(A) Western blot -analyysit osoittivat ilmentymistä p120ctn ja E-kadheriinin yhdeksässä keuhkosyövän solulinjat ja HBE. (B) immunofluoresenssianalyysin avulla, ekspression E-kadheriinin ja p120ctn havaittiin rajoittunut solukalvon at solu-solu vyöliitos H460 ja H1299 soluja, kun taas ne molemmat rajoittuvat sytoplasmaan SPC ja LK2 soluja.

Eri toiminnot p120ctn isoformin 1A EMT ovat riippuvaisia ​​E-kadheriinin solunosasijaintia

knockdovvn endogeenisen p120ctn isoformin 1A siRNA-p120ctn-1A alensivat E-kadheriinin ilmentymisen ja lisääntynyt N-kadheriinin, etanat ja vimentiinin ilmentymisen H460-soluissa (kuvio 3A). Kuitenkin knockdown endogeenisen p120ctn-1A siRNA-p120ctn-1A osoittivat päinvastainen tuloksia SPC soluissa, josta löysimme lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen ja väheni N-kadheriinin, etana ja vimentiinistä ilmaisu (kuvio 3B). Verrattuna hallinnassa, ablaatio p120ctn isoformin 1A myös lisännyt H460 soluja invasiivisuudesta (17,33 ± 1,25 vs. 36,33 ± 1,70,

P

0,01) (kuvio 3C), kun taas vähensi SPC solujen invasiivisuus (23,0 ± 0,82 vs. 13,0 ± 0,82,

P

0,01) (kuvio 3D). Nämä tulokset paljastivat, että p120ctn isoformi 1A on eri rooli on EMT ja solujen invasiivisuus eri E-kadheriinin subsellulaaristen paikoissa.

(A) ablaatio p120ctn isoformin 1A väheni E-kadheriinin ilmentymisen ja lisäsi N-kadheriinin, etana ja vimentiinista ilmaisun H460-soluissa. (B) SPC-soluja käsiteltiin kuten kohdassa (A) ja vastakkainen tulokset saatiin. (C) ablaatio p120ctn isoformin 1A tehostettu invasiivisuus on H460-solujen (**

P

0,01). (D) ablaatio p120ctn isoformin 1A laski invasiivisuus SPC solujen (**

P

0,01).

inhiboiva toiminta p120ctn isoformin 3A EMT ei vaikuta eroja E-kadheriinin solunosasijaintia

Voit tarkistaa, onko p120ctn isoformeja 1A ja 3A minkälainen rooli säätelyssä EMT, niiden ilmentymisplasmideja transfektoitiin väliaikaisesti keuhkosyövän soluihin, joilla on alhainen ilmentyminen p120ctn (H1299 kalvolla E-kadheriinin ilmaisun ja LK2 kanssa sytoplasman E-kadheriinin ilmentymisen). Länsi-blot-analyysi osoitti, että yli-ilmentyminen p120ctn isomuodon 1A johti lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen ja väheni N-kadheriinin, vimentiinistä ja etana ilmentymistä (kuvio 4A); päinvastoin, vähentynyt E-kadheriinin ilmentymisen ja lisäsi N-kadheriinin, vimentiinistä ja etana ilmentymistä havaittiin LK2 soluissa (kuvio 4B). Yliekspressio p120ctn isoformin 1A vähensi myös H1299 solun invasiivisuudesta (52,0 ± 2,65 vs. 33,33 ± 2,64,

P

0,01) (kuvio 4C), kun taas parantanut LK2 solun invasiivisuudesta (18,0 ± 0,82 vs. 39,66 ± 2,05,

P

0,01) (kuvio 4D) .. yliekspressio p120ctn isomuodon 3A lisännyt E-kadheriinin ilmentyminen väheni N-kadheriinin, vimentiinistä ja etana ilmentymistä (kuvio 4A, 4B) ja vähensi solujen invasiivisuus (52,0 ± 2,65 vs. 29,66 ± 1,53,

P

0,01; 18,0 ± 0,82 vs. 8,33 ± ilmaisun 0,47,

P

0,01) (kuvio 4C, 4D ) sekä näistä solulinjoista. Nämä tulokset vahvistivat lisäksi, että p120ctn isoformi 1A oli erilainen vaikutus EMT riippuen solunosasijaintia E-kadheriinin. He myös paljasti, että p120ctn isoformi 3A yllä on inhiboiva rooli EMT keuhkosyövän soluja, onko E-kadheriinin paikallistettiin kalvon tai sytoplasmaan.

(A, B) molemmat H1299 (E-kadheriinin kalvo lokalisointi) ja LK2 solut (E-kadheriinin sytoplasmisen lokalisointi) transfektoitiin väliaikaisesti p120ctn isoformin 3A plasmidin lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen ja väheni N-kadheriinin, vimentiinistä ja etana ilmaisun. (C, D) ohimenevä transfektointi p120ctn isoformin 3A plasmidit H1299 ja LK2 solujen alensivat solussa invasiivisuus (**

P

0,01). (E) E-kadheriinin jäi lokalisoitu kalvolle H1299 soluissa ja sytoplasmassa LK2 solujen transfektion jälkeen p120ctn isoformin 3A plasmidi.

Keskustelu

Ilmiö EMT kasvainsoluissa johtaa usein alentuneeseen solujen tarttumista ja lisätä liikkuvuutta, ja tämä siirtymä liittyy alentunut E-kadheriinin ilmentymisen ja lisääntynyt ilmentyminen N-kadheriinin, vimentiinistä ja muut mesenkymaaliset biomarkkerit [3], [4], [5], [ ,,,0],6], [7]. Koska tärkeä tekijä vakauttava E-kadheriinin, p120ctn on rooli estämällä tai edistämällä kasvainsoluproliferaation ja invaasio, joka on riippuvainen siitä, onko E-kadheriinin ilmaistaan ​​vai ei [16], [17]. Lisäksi p120ctn isoformit 1A ja 3A ovat osoittaneet erilaisia ​​vaikutuksia E-kadheriinin ilmentymisen ja kasvainten solujen invasiivisuus, jotka perustuvat eroihin lokalisoinnin E-kadheriinin [18]. Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että p120ctn todennäköisesti säätelee EMT syöpäsoluja vaikuttamalla E-kadheriinin ilmentymisen ja että p120ctn isoformeja 1A ja 3A pelata erilaisia ​​rooleja EMT ilmentävät E-kadheriinin eri subsellulaarisessa paikoissa.

ensimmäinen löydetty että p120ctn kalvo ekspressio korreloi positiivisesti E-kadheriinin ilmentymisen ja korreloi negatiivisesti vimentiinista ilmaisun ja imusolmuke etäpesäke, kun taas sytoplasminen ilmentyminen p120ctn oli negatiivinen korrelaatio E-kadheriinin ilmentymisen ja korreloi positiivisesti vimentiinista ilmaisun ja imusolmuke etäpesäke immunohistokemiallisesti . Vaikka nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten [13], [14], ne Lisäksi ehdotetaan, että p120ctn todennäköisesti vaikuttaa EMT vaikuttamalla ilmentyminen E-kadheriinin ja vimentiinista ja siten solujen invaasiota ja etäpesäkkeiden ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ( NSCLC).

vahvista eri vaikutuksia p120ctn isomuotojen 1A ja 3A EMT soluissa, jotka ilmentävät E-kadheriinin eri paikoissa, valitsimme H460 ja H1299 solujen E-kadheriinin kalvo ilmaisun ja SPC ja LK2 solujen E-kadheriinin sytoplasmista ilmentymisen tarkempaa analysointia varten. Ilmentävien plasmidien p120ctn isoformeja 1A ja 3A rakennettiin, ja täyspitkä p120ctn siRNA syntetisoitiin Näissä kokeissa. Koska sekvenssi kuin aminohapot 1-101 ja p120ctn isoformin 1A on samanlainen kuin p120ctn isoformin 3A [24], [25], ei voitu suunnitella häiriöitä sekvenssin erityisesti p120ctn isoformin 3A. Siksi meidän piti lisätutkimuksia vaikutuksesta kaksi isoformia EMT ja solujen invasiivisuus keuhko- syöpäsoluja eri E-kadheriinin paikoissa nimenomaan kaatamalla p120ctn isoformi 1A H460 ja SPC solujen korkea p120ctn ilme ja transfektoimalla cDNA plasmidiperhe eksogeenisen p120ctn isoformit 1A ja 3A osaksi H1299 ja LK2 solujen alhainen ilmentyminen p120ctn.

knockdovvn p120ctn isoformin 1A H460-soluissa tuhosi epiteelisolujen kiinnitysalueisiin. E-kadheriinin ilmentyminen myös vaimentua tappioiden sen tärkeä vakauttava tekijä, p120ctn isoformi 1A, mikä oli yhdenmukainen aiempien tutkimusten [20], [26]. Vähentynyt E-kadheriinin ilmentymisen ja häiritsi solu-soluadheesion voivat aiheuttaa EMT [27], [28], [43], [44], mikä johtaa lisääntyneeseen N-kadheriinin, vimentiinistä ja etana ilmaisun ja parannettu solu invasiivisuus. Toisaalta, yli-ilmentynyt p120ctn isoformit 1A ja 3A on osoitettu sitoutuvan E-kadheriinin sijaitsee kalvon ennakoivasti tuumorisoluissa [29] ja sitten estää hajoamista E-kadheriinin ja vakauttaa sen ilmentyminen, muodostumista osaltaan edistävät tehokasta epiteelin soluadheesion kompleksit [30], [31], [32]. Koska nämä sarja prosesseja ylläpidetään normaalin solun soluadheesiota yhteys ja estivät EMT, siellä nostettiin E-kadheriinin ilmentymisen ja väheni N-kadheriinin, vimentiinistä ja etana ilmaisun sekä esti solun invasiivisuus sisään H1299 soluissa.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että vaikka p120ctn isoformi 1A voisi sitoutua E-kadheriinin sytoplasmassa, he eivät voi muodostaa tehokkaan tarttumisen komplekseja kalvon välillä epiteelisolujen [33]. Lisäksi sytoplasminen E-kadheriinin ei todennäköisesti ole täyspitkä E-kadheriinin vaan lohkaistaan ​​E-kadheriinin fragmentteja, kuten E-cad /sE-cad (80 kDa) ja E-cad /ctf2 (33 kDa) [34]. E-cad /ctf2 fragmentti voi sitoutua p120 sytoplasmassa ja sitten translokoituvat tumaan ja sitoutuvat transkription repressori Kaiso aktivoida Wnt /b-kateniinin reitti [35], [36], lopuksi edistää EMT kasvaimen solut ja parantaa solujen invaasiota ja etäpesäkkeiden [37]. Lisäksi toiset ovat osoittaneet, että p120ctn-1A liittyy epänormaali ilmentyminen E-kadheriinin ja huonoon ennusteeseen [38]. Nämä tutkimukset kuvitettu että sytoplasmisen p120ctn isoformin 1A voi olla tärkeä rooli edistettäessä kasvainsolun EMT, invaasiota ja etäpesäkkeiden. Edellä esitetyn perusteella havaitsimme toisaalta, että vaikutus p120ctn isomuodon 1A edistää kasvainsolujen EMT, invaasiota ja etäpesäkkeiden, olisi nostaa sen ablaatio, mikä lisää E-kadheriinin ilmentymisen, väheni N-kadheriinin, vimentiinistä ja etana ilmaisun ja esti invasiivisuus SPC soluissa. Toisaalta, transfektoimalla p120ctn isoformin 1A plasmidin LK2 soluja, jotka ilmentävät sytoplasmista E-kadheriinin alensivat E-kadheriinin ilmentymisen, lisääntynyt N-kadheriinin, vimentiinistä ja etana ilmaisun ja parantaa solun invasiivisuus. Vaikka tarkka asema p120ctn aikana EMT induktio on vielä selvennettävä, aiemmat tutkimukset ehdotti, että knockdown kaikkien isomuotojen p120ctn voisi aiheuttaa EMT välillisesti [27], [28], [43], [44]. Kaikki inductions perustuivat väheni E-kadheriinin ilmentymisen ja solujen välistä adheesiota aiemmissa tutkimuksissa, mikä vahvistettiin myös tutkimuksemme H460 solujen E-kadheriinin membraanilokalisaatiota. Toisin kuin H460 soluja, Knockdown on p120ctn isoformin 1A SPC solujen E-kadheriinin sytoplasmista ekspressiota ei vähennä E-kadheriinin ilmentymisen ja solujen välistä adheesiota. Sen sijaan löysimme lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen ja laski solu invasiivisuus, mikä osoittaa, että EMT voinut indusoida Tämän reitin SPC soluissa.

Oli syytä huomata, että sama tulos havaittiin LK2 ja H1299 solujen transfektoitu p120ctn isoformin 3A plasmidi, sekä näyttää lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen, väheni N-kadheriinin, vimentiinistä ja etana ilmaisun ja estivät solujen invasiivisuus. Nämä tulokset viittaavat siihen, että p120ctn isoformi 3A on funktio estämällä EMT keuhkosyövän soluja, ja tämä on riippumaton solun E-kadheriinin lokalisointi. Past tutkimus oli myös vahvistanut siirtyminen p120ctn isoformista 3A p120ctn isoformin 1A ilmaisu induktion jälkeen EMT [9], [10], [11], joka epäsuorasti osoittaa, että p120ctn isoformi 3A saattaa estää EMT samalla p120ctn isoformi 1A edistää EMT. Lisäksi olemme myös havainneet, että p120ctn ja E-kadheriinin proteiinin ilmentymisen tasot olivat huomattavasti transfektion jälkeen p120ctn-3A plasmidin LK2 ja H1299-soluissa, mutta p120ctn ja E-kadheriinin oli vielä rajoittuu pääasiassa solukalvoon on solu-solu- vyöliitos in H1299 soluissa. Sen sijaan E-kadheriinin ja p120ctn olivat lähes yksinomaan sijaitsee sytoplasmassa LK2 soluissa (kuvio 4E). Kuten soluadheesiomolekyyli, E-kadheriinin tiedetään vain sijaitsee solukalvon kanssa kyky estää EMT, kun taas sytoplasmaan, se on usein pilkotaan hienoksi ja näin ollen toimii eri molekyylit sijaitsevat solukalvolla [ ,,,0],34]. Siten sytoplasminen E-kadheriinin teoriassa olla merkitystä estämisessä EMT. Edellä esitetyn perusteella analyysiin, me arveltu, että voi olla joitakin vuorovaikutus p120ctn isoformia 3A ja etanan joka on tärkeä merkitys tukahduttamaan EMT keuhkosyövän soluihin, jotka ilmentävät sytoplasmista E-kadheriinin, mutta tämä hypoteesi vaatii lisätutkimuksia.

Mikä tärkeintä, huomasimme myös, että knockdovvn p120ctn-1A SPC solujen soluliman E-kadheriinin alensivat kierre ilmaisu (kuvio 3B). Samaan aikaan, transfektio LK2 soluja, jotka oli myös sytoplasmisen lokalisointi E-kadheriinin, jossa p120ctn isoformin 1A plasmidi lisännyt kierre ilmentyminen (kuvio 4B). Kuitenkaan mitään muutoksia kierre ilmentyminen havaittiin muualla kokeissa (kuvio 3A, 4A). Transkriptiotekijänä ja master-geenin säätelijä EMT [39], [40], kierre voi downregulate E-kadheriinin ilmentymisen [41] ja upregulate N-kadheriinin ja muut mesenkymaaliset biomarkkerit [42].