Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Syöpä kantasolut ( CSC) ajaa eturauhassyövän kasvain selviytymisen ja etäpesäke. Kuitenkin, kehittämällä erityisiä hoitoja vastaan ​​CSCS haittaa niukkuus näiden solujen eturauhaskudoksiin. Suspensioviljelmässä järjestelmien on raportoitu rikastuttaa CSCS primaariviljelmissä ja solulinjat. Kuitenkin molekyylitason mekanismeista tätä ilmiötä ei ole täysin tutkittu.

Menetelmät /Principal Havainnot

Kuvaamme prostasphere määritys rikastamista CD133

+ CSCS neljässä kaupallisessa PCa solu linjat: 22Rv1, DU145, LNCaP ja PC3. Yliekspressio CD133, määritettynä virtaussytometrianalyysissä, korreloi lisääntyneen klonogeeniset, solunsalpaajaresistentti, ja invasiivisia potentiaalia in vitro. Tämä fenotyyppi on yhtäpitävät kuin CSCS in vivo. Geeniekspressioprofilointi suoritettiin sitten käyttämällä Cancer Reference paneelin ja NCounter järjestelmän NanoString Technologies. Tämä analyysi paljasti useita ilmen- tymisen lisääntymisen selostukset, jotka voidaan tutkia edelleen mahdollisina diagnostisia markkereita tai terapeuttisina kohteina. Lisäksi toiminnallinen merkintä analyysin mukaan ΔNp63α moduloi aktivointi kehittävän väyliä vastuussa lisääntyneestä kantasolujen identiteettiin kasvavien solujen suspensioviljelmissä.

Johtopäätökset /merkitys

Olemme päätellä, että profilointi geneettinen mekanismeja CSC rikastamiseen auttaa meitä ymmärtämään paremmin molekyyli polkuja että taustalla CSC patofysiologiassa. Tätä alustaa voidaan helposti sovittaa rikastuttaa ja määrittämään todellinen potilaan näytteitä, jotta suunnitella potilaskohtaista hoitoja, joiden tarkoituksena erityisen vastaan ​​CSCS.

Citation: Portillo-Lara R, Alvarez MM (2015) rikastus syöpä Stem fenotyyppi Sphere Cultures of eturauhassyöpäsolulinjat Esiintyy kautta aktivointi kehitykselliset polut välittämän transkription Regulator ΔNp63α. PLoS ONE 10 (6): e0130118. doi: 10,1371 /journal.pone.0130118

Editor: Gagan Deep, University of Colorado Denver, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 09 helmikuu 2015; Hyväksytty: 18 toukokuu 2015; Julkaistu: 25 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Portillo-Lara, Alvarez. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: tärkeimmät tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Tietopaketti (S1 File), joka sisältää kaikki geenin ilmentymisen arvot kokeissa. Geenien ilmentyminen tiedot toimitettiin Gene Expression Omnibus tietovaraston NCBI. Tietoja voidaan käyttää tällä GEO verkkosivuilla https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/alla GSE67248 hakunumerolla.

Rahoitus: Kirjoittajat kiitollisena tunnustavat rahoitusta Zambrano-Hellion Family ( Project ZH-varsi), Monterreyn (Seed rahoitus CAT-122), ja Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología México (CONACyT). Kirjoittajat ovat kiitollisia (CONACyT) taloudellisen tuen RPL muodossa tohtorin Scholarship.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on toiseksi yleisin pahanlaatuinen kasvain ihminen maailmanlaajuisesti, mutta sen etiologia on edelleen suurelta osin ratkaisematta. Kuten muillakin epiteelikudoksissa, solu homeostaasin aikuisten eturauhasen ylläpidetään hierarkkisesti järjestäytynyt soluja erilaisilla proliferatiivinen potentiaali [1]. Somaattiset lyhytsanomapalvelukeskuksille sijaitsee Tämän hierarkian huipulla näytteille joitakin ainutlaatuisia ominaisuuksia, kuten: kyky itse uudistaa ja erottaa pitkin useita solu suvusta, lokalisoitu kasvu erikoistuneissa fysiologisia mikroympäristöihin (markkinaraon), ja vaikka ne ovat normaalisti lepotilassa, ne näyttää merkittävä proliferaatiopotentiaali [2]. Hierarkkinen kantasolujen (SC) malli syövän pätee PCa peräisin kautta korjauksilla geneettiset ja epigeneettiset tekijät, jotka säätelevät leviämisen normaalin lyhytsanomapalvelukeskukset [3]. Nämä poikkeavasti ilmaisi polkuja lopulta johtaa muutosta normaalin lyhytsanomapalvelukeskukset osaksi pahanlaatuisia syövän kantasolut (CSCS). CSCS säilyttää joitakin ominaisuuksia, jotka liittyvät niiden ei-pahanlaatuinen kollegansa, ja niiden ajatellaan olevan vastuussa kasvaimen aloittamista, etenemistä ja uusiutumisen sekä etäpesäkkeitä.

CSCS myös ajateltu olevan vastuussa kehittämisestä vastustuskyvyn perinteisiin hoitoihin [4,5]. Perinteiset radio- ja kemoterapian aineina mielletään alle käsitystä, että kaikki solut kasvain ovat fenotyypiltään yhtäläiset. Kuitenkin CSCS luottaa luontaisista mekanismeista, jotka tekevät ne suhteellisesti sitkeämpi kuin terminaalisesti erilaistuneita soluja, mukaan lukien niiden hitaasti jakautuviin luonne, korkea ilmentyminen ATP-sitova kasetti (ABC) kalvo kuljettajat, ja kestävyys DNA-vaurioita ja oksidatiivista stressiä [6]. Siksi CSC-erityisiä hoitoja on potentiaalia hävittämään tauti sen alkuperä, ja säästää ei-tuumorigeenisiä lyhytsanomapalvelukeskukset ja minimoidaan haitalliset vaikutukset, jotka liittyvät muuten nondiscriminating hoitoja.

Nykyinen menetelmiä eristämistä ja tutkimus CSCS perustuvat ilmaus pintamerkkiaineita ensimmäinen tunnistettu normaalissa eturauhasessa lyhytsanomapalvelukeskukset (CD44

+ /α

2β

1

hi /CD133

+) [7]. CD133 erityisesti, on laajalti käytetty biomarkkerina eristämiseksi soluista, jotka ilmentävät varren kaltainen fenotyyppi eri normaalien ja pahanlaatuisten kudosten [8,9]. Eristetty tutkimus CSCS mahdollistaa analyysin molekyylitason mekanismeja vastuussa pahanlaatuisten solujen eloonjäämistä, erillään esiintyviä terminaalisesti erilaistuneita kasvainsoluja tai ei-tuumorigeenisiä SC populaatioissa. Kuitenkin terapeuttisten strategioiden kehittämisen perustuu CSC kohdistaminen on rajoitettu puutteen vuoksi sopivien kokeellisissa malleissa.

Human primaarikasvaimen näytettä (PTS) pidetään tarkin edustus kasvaimen in vivo . Kuitenkin monimutkaisuus fysiologisen yhteydessä vaikuttaa usein tulosten tulkintaan. Sitä vastoin ihmisen syöpäsolulinjoissa (CCLS) ovat dynaamisia työkaluja, joita voidaan käyttää leikellä monia eri molekyyli- prosessien karsinogeneesissä. Vaikka PTS edelleen suositaan CCLS, niiden erittäin rajoitettu pääsy tekee in vitro -malleissa ”go-to” valinta useat tutkimusryhmät maailmanlaajuisesti.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että CCLS ovat samanlaisia ​​in vivo pahanlaatuisia kasvaimia, kuten ne myös muodostuvat Organisaatiotasoja eriasteisia erilaistumista [10-12]. Virtaussytometrianalyysi Eturauhassyövän solulinjojen osoittaa, että vaikka se lisätyistä vuosia, ne sisältävät vielä havaittavissa numerot kantasolujen kaltaisia ​​soluja, vaikkakin usein erittäin alhainen prosenttiosuuksia. Pfeiffer et al. kertoi, että CD133

+ solujen DU145 solulinjassa muodostavat noin 0,01% koko väestöstä, kun taas DuCaP, LAPC-4, LNCaP, PC3, ja 22Rv1 tuottaa havaittavaa CD133 ilme, kun analysoitiin fluoresenssi soluerottelu (FACS ) [13]. Siten vaikka CCLS edustavat erittäin helposti ja käytännöllinen vaihtoehto PTSs, eristäminen CSCS tästä lähteestä on edelleen vaikeaa, koska pieni määrä erilaistumattomien solujen sisältämien kaupallisten solulinjoissa.

Jousitus kulttuuri järjestelmiä käytetään yhä enemmän rikastuttaa erilaistumaton solupopulaatioiden PTSs ja CCLS. Solut kasvatetaan käyttäen tarttumattomia alustoille ja seerumittomassa alustassa kasvavat kolmiulotteinen pallomainen soluklusterien (tumorspheres), jotka edistävät leviämisen kantasolujen fenotyyppien [14,15]. Tämä on monimutkainen ilmiö, jossa harvinaisen eriytymättömiä soluja stimuloidaan harjoittaa symmetrinen jako laajentaa SC osastoon. Vaikka useat variaatioita tumorsphere määrityksen on raportoitu, geneettiset mekanismit, jotka laukaisevat kantasolujen proliferaatiota sferoidiviljelmiä ei ole täysin tutkittu.

Modern geeniekspressioanalyysissä työkalujen avulla tutkimuksen transkription muutosten lisääntynyt herkkyys ja spesifisyys , verrattuna perinteisiin microarray lähestymistavat, jotka rajoittavat merkittäviä teknologisia haasteita [16]. Esimerkiksi NCounter Nanostring järjestelmä tuottaa digitaaliset lukemat kunkin molekyylin kohde-mRNA: n, käyttäen vähintään määriä lähtöainetta, ja ilman cDNA-synteesiä varten [17]. Lyhyesti, tämä järjestelmä käyttää paria talteenoton ja toimittaja antureista, jotka on räätälöity kunkin mRNA kohdesekvenssiin. Hybridisaation jälkeen transkriptio /koetin-kompleksit immobilisoidaan, linjassa sähkökentässä, jonka tunnuksena, ja luetteli perustuvat värikoodatut tunnisteita, jotka on kytketty reportteri koetin.

Kytkin dynamiikkaa in vitro -malleja, joilla on korkea -throughput geeniekspressioprofilointi voisi tukea kehittämään tehokkaampia CSC kohdistettuja terapeuttisia strategioita. Täällä olemme sopeutuneet tumorsphere kulttuurin protokolla tehokkaan rikastamista CD133

+ CSCS neljässä kaupallisessa PCa solulinjoissa: 22Rv1, DU145, LNCaP ja PC3. Kaikki solulinjat pystyivät muodostamaan erittäin lisääntyvien ja uudistuva palloja kun päällystetty seerumittomassa ankkurista riippumaton olosuhteissa että käytimme. Osoitamme, että CSC-liittyviä piirteitä (esim CD133 ilme, sekä lisääntynyt proliferatiivinen, invasiivisia, ja solunsalpaajaresistentti potentiaali) on merkittävästi rikastettu kaikissa prostasphere kulttuureissa. Geeniekspressioprofilointi vanhempien ja rikastetun kulttuureissa käyttäen NCounter NanoString järjestelmä esiin useita ilmen- tymisen lisääntymisen selostukset, jotka osallistuvat perustamiseen pahanlaatuisen varren fenotyyppi. Lisäksi toiminnallinen merkintä viittaa siihen, että CSC-rikastamiseen havaittiin prostasphere kulttuureissa kautta tapahtuvaa aktivointia kehityksellisten reittejä moduloidun osittain transkription sääntelijä ΔNp63α.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kulttuuri protokollat

Kaikki solulinjat ostettiin suoraan ATCC. Soluja käytettiin seuraavia jatkoviljelmälukemista: 22Rv1, passage 11; DU145, passage 16; LNCaP, passage 13; PC3, passage 18. geenin ilmentymisen profilointi kokeissa, PC3-soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla ultra-low kiinnitys kulttuuri levyjä EpiGRO ihmisen eturauhasen Complete Media Kit (hPCM, Millipore). Muilta kokeiden, neljä solulinjoja kasvatettiin kolmella eri kulttuurin protokollia: a) DMEM-FBS: yksikerrosviljelmiä DMEM-F12 (Gibco), jota oli täydennetty 5% naudan sikiön seerumia (FBS, Invitrogen) ja 100 U /100 ug /ml penisilliiniä-streptomysiiniä (Gibco); b) DMEM-PLUS: tarttumattomat alalla (prostasphere, PS) viljelmiä kasvatettiin 6-kuoppaisilla ultra-low kiinnitys viljelylevyille (Corning) DMEM-F12, johon oli lisätty 20 ng /ul hEGF (Gibco), 20 ng /ul bFGF (Gibco), 1 x B27 ilman A-vitamiini (Invitrogen), 1 x insuliini-transferriini-seleeni A (Invitrogen) ja 100 U /100 ug /ml penisilliiniä-streptomysiiniä; ja c) hPCM-PLUS: pallo kulttuureissa hPCM, vielä täydennetty 20 ng /ul hEGF ja 20 ng /ul bFGF. Yksikerrosviljelmiä pidettiin enintään yhtymäkohdassa taso 80%, ja viljelyalusta vaihdettiin 48 tunnin välein. Prostasphere viljelmiä ympättiin tiheydellä 2×10

4 solua /ml, ja kasvatusliuos korvattiin täysin 96 tunnin välein päivänä 4, ja 8 Vanhempien ja prostasphere viljelmiä kasvatettiin 12 päivän ajan 37 ° C: ssa 95% suhteellisessa kosteudessa 5% CO

2 ja 95% ilma-atmosfäärissä. Lopussa kulttuurin protokollan, solut kasvavat yksikerroksisessa ja jousitus viljelmiä entsymaattisesti hajotettiin käyttämällä 0,05% trypsiiniä-EDTA-liuosta (Gibco) ja StemPro Accutasella (Gibco), vastaavasti, mukaan valmistajan ohjeita.

immuunifluoresenssivasta merkintöjä, solujen lajittelu, ja virtaussytometria-analyysi

Erotellut solut leimattu fluoresoivasti mukaisesti valmistajan ohjeiden käyttämällä kahta monoklonaalista vasta-ainetta: Anti-ihmisen CD133 /2 (293C3) -PE (Miltenyi Biotec) ja Anti-Human CD44 PE-Cyanine5 (eBioscience). Magneettinen-aktivoitujen solujen lajittelu (MACS) suoritettiin käyttäen anti-fykoerytriini mikrohelmet (Miltenyi Biotec) ja CD133 /2 (293C3) -PE monoklonaalinen vasta-aine mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Virtaussytometria-analyysi suoritettiin FACSCanto II virtaussytometrillä, jossa on 488-nm laser. Vähintään 10

4 tapahtumia kirjattiin kussakin käsittelyssä. Anti-hiiri IgG2b-PE isotyyppikontrollilla (Miltenyi) ja värjäämättömiä soluja käytettiin kontrolleina. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kolme kertaa.

NCounter NanoString geeniekspressioprofilointi.

Kokonais-RNA uutettiin PC3 prostaspheres ja puhdistettiin käyttäen RNeasy Mini tai Micro sarjat riippuen määrästä lähtöaine (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Eheyden puhdistettua RNA-näytteet arvioitiin käyttäen NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä 260/280 nm. Detection of mRNA-transkriptien sitten suoritettiin multipleksoidun hybridisaatioreaktioiden käyttäen NanoString NCounter Analysis System. Kaksi eri NCounter Gene Expression koodistoja käytettiin analyysi: GX Human Cancer Viite Kit koostuu 230 syöpään liittyvien geenien ja mittatilaustyönä ITESM codeset koostuu 14 PCa liittyvien geenien (NanoString Technologies). Tietojen hankinta ja normalisointi suoritettiin käyttäen nSolver Analysis ohjelmistoversion 2.0 (NanoString Technologies). Keskimääräinen kertainen muutokset (suhde, n = 3) ja kunkin geenin laskettiin normalisoitu data ja luokittelun Microsoft Excel. Geenejä kertamuutos 1,5 valittiin lisäanalyysiä varten (taulukko 1). Yleiset määritelmät kunkin geenin haettiin GeneCards tietosanakirja verkkosivun (www.genecards.org) [18].

Prostasphere itseuudistumisen määritys

solujen prosenttiosuus rikastetun kulttuureissa pystyy tuottamaan uuden prostaspheres määritettiin maljaamalla solut tiheydellä 1×10

3 solua /ml, kun hPCM-PLUS media. Päivänä 10 kulttuurin aloilla ( 100 um) pisteytettiin, hajotettiin, ja osa-viljeltiin samoissa olosuhteissa. Tämä prosessi toistettiin kahdesti, jotta saadaan 2

nd ja 3

kolmannen sukupolven prostaspheres päivänä 20 ja 30, tässä järjestyksessä. Sphere muodostumisen tehokkuus (SFE) laskettiin määrä prostaspheres syntyy useissa solujen kylvetään, kerrottuna 100. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin kolme kertaa. Myöhemmät kokeet suoritettiin käyttämällä ensimmäisen sukupolven aloilla vain.

Colony muodostavien solujen (CFC) määritykset

Suspension CFC määritykset suoritettiin käyttäen StemXVivo metyyliselluloosa konsentraattia (R 1,5) toiminnallisten rikastamiseen analyysi.

tilastollinen analyysi

tulokset jatkuvia muuttujia ilmoitetaan keskiarvoina ± keskihajonta (StdDev). Parittaiset useita vertailut suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA), jota seurasi Tukeyn HSD testi (* P 0,05). Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen JMP versio 9.0.

Tulokset

22Rv1, DU145, LNCaP ja PC3 pystyvät kasvamaan itseuudistuvien aloilla, jotka voidaan sarjatuotantona käsitelty in vitro

Tumorsphere muodostava kyky evaluoitiin käyttäen istutustiheyteen 2×10

4 solua /ml 6-kuoppaisille ultra-low kiinnityslevyt, jotka sisältävät 2 ml hPCM-PLUS väliaineessa. Kaikki neljä PCa solulinjat muodostetaan pallomaisia ​​pesäkkeitä päivällä 4 kulttuuriin. Vanhempien adherenttiviljelmiä lisättyjen samanaikaisesti enintään yhtymäkohta tason 80%. Päivä 12 tumorspheres ja yksisolukerrokset (kuvio 1A) hajotettiin ja analysoitiin ekspression CSC liittyvän biomarkkerit CD133: a ja CD44. Expression of CD44 havaittiin heterogeenisesti korkealla tasolla PC3 ja DU145-soluissa, kun taas minimi mitään havaittavaa ilmentymistä havaittiin 22Rv1 ja LNCaP-soluja (S1A kuvio). Kuvio 1B osoittaa, että CD133 havaittiin johdonmukaisesti erittäin alhaisilla tasoilla ( 0,5%) kaikissa solulinjoissa. Paneeli osoittaa myös, että toisin kuin vanhempien kulttuureissa, prosenttiosuus CD133

+ tapahtumia kasvoi merkittävästi (

p

0,05) kaikissa prostasphere viljelmät 22Rv1 (0,067% ± 0,058%: sta 4,267% ± 1,419%), DU145 (0,433% ± 0,252%: sta 2,433% ± 0,709%), LNCaP (0,033% ± 0,058%: sta 4,033% ± 1,966%), ja PC3 (0,133% ± 0,058%: sta 4,467% ± 1,358%) solut . Prostaspheres nopeasti saavuttanut halkaisijat 100 pm päivällä 12 kulttuuri (kuvio 2A). 22Rv1 ja DU145 solut muodostivat pienikokoinen ja pyöreä palloja hyvin rajattu rajoja, kun taas LNCaP ja erityisesti PC3 solut muodostivat enemmän epäsäännöllinen rakenteita koostuu suurempia yksittäisiä soluja. Palloja muodostavan tehokkuus (SFE) arvioitiin heti ensimmäisestä (päivä 10), toisen (päivä 20), ja kolmannen (päivä 30) sukupolvi aloilla. SFE poikkeuksetta kohoaminen (

p

0,05) jokaisen uuden sukupolven kaikissa solulinjoissa (kuvio 2B). Mielenkiintoista, suora havainnointi PC3 ja DU145 soluja kasvatettiin suspensiossa ilmeni muitakin silmikoituminen prostaspheres tässä vaiheessa (S1B kuvio). Tämä havainto viittaa potentiaalia muodostumista haarautuvia rakenteita perustettu aloilla.

A) mikroskooppinen tutkimus vanhempien yksisolukerrosten (ADH) vieressä prostasphere rikastettu (SUS) viljelmät. ADH kulttuureissa DMEM-FBS on tunnusomaisia ​​epiteelin morfologia, ja ovat tiiviissä yhteydessä toisiinsa. SUS kulttuurien hPCM-PLUS näyttää heterogeeninen morfologit aina tiukka, pyöreä palloja (22Rv1 ja DU145) suurempiin enemmän epäsäännöllinen rakenteita (LNCaP ja PC3). Kuvat edustavat 12 päivän ikäisten yksikerroksisen ja ensisijainen pallo kulttuureissa. Asteikko bar = 200 pm. B) virtaussytometrianalyysin juuri eristettyjä vanhempien (ADH) ja prostasphere (SUS) solujen tunnistamiseksi CD133

+ osapopulaatioiden. Edustavia dot kuvaajat PE-leimattua CD133

+ (293C3) soluja. Prosenttiosuudet esitetty vastaavat keskiarvoa kolmen erillisen kokeen.

A) Morfologiset luonnehdinta ensisijainen prostaspheres kasvatettu hPCM-PLUS. Kaikki PCa solulinjat muodostettiin havaittavaa palloja päivällä 4 kulttuuriin. 22Rv1 ja DU145 aloilla koostuvat pienempiä ja tiiviisti pakattu yhteen soluja. LNCaP ja PC3-solut näyttävät suuremmilta ja väljemmin järjestetty. Asteikko bar = 100 pm. B) Sphere muodostava tehokkuus (SFE) on prostasphere kulttuureissa. Eturauhassyövän soluja ympättiin tiheydellä 1×10

3 solua /ml 6-kuoppaisille ultra-low kiinnityslevyt in hPCM-PLUS ja inkuboitiin 10 päivää. Tuloksena prostaspheres voitaisiin sarjoittain käsitelty in vitro jopa kolmen sukupolven (G1-G3). SFE pallojen kasvanut tasaisesti kaikissa PCa solulinjoissa jokaisen sukupolven. Ei vielä vahvistusta yritettiin tässä vaiheessa. Kolme riippumatonta kokeet suoritettiin, kukin kolmena rinnakkaisena. Asteikko bar = 100 pm. (*

p

0,05).

CD133

+ prostasphere soluilla lisääntynyt kyky muodostaa klooneja sekä pysyvä ja puolikiinteät pesäkkeitä muodostavat solu (CFC) määritykset

pesäkkeitä muodostavaa tehokkuutta (TAE) ja vanhempien viljelmiä sekä prostasphere johdetut solut testattiin rinnakkain, puolikiinteä (kuvio 3A) ja kiinni (kuvio 3C) CFC määritykset. CFE arvot Yksikerrosviljelmissä ja prostasphere viljelmät olivat samankaltaisia ​​määrityksiä mutta havaitsimme jatkuvasti korkeampi määrä yksittäisiä pesäkkeitä puolikiinteässä (kuvio 3B) verrattuna kiinnittynyt olosuhteissa (kuvio 3D). Kaikki neljä prostasphere rikastetun solulinjoissa näkyy suurempi kyky muodostaa klooneja kummassakin määrityksessä verrattuna niiden ei-rikastettu kollegansa (

p

0,05). PC3-solut, osoitti suurinta kyky muodostaa klooneja varten kiinnittyvä ja puolikiinteän määrityksissä. CFE-arvot olivat johdonmukaisesti korkeampia CD133

+ solut (

p

0,05) verrattuna vanhempien ja lajittelemattoman prostasphere soluja kaikissa solulinjoissa, paitsi LNCaP-solulinjasta. Emme pysty havaitsemaan tilastollisesti merkitsevää eroa CD133

+ solujen ja lajittelemattoman prostaspheres (

p

0,05) tarttuu CFC määrityksessä. Kuitenkin CD133

+ LNCaP ei näyttävät olevan enemmän klonogeeniset kuin lajittelematonta prostaspheres käytettäessä keskeyttämistä variantti määrityksen.

A) edustaja micrographs suspension pesäkkeiden vanhempien (ADH) ja CD133

+ solut. B) Vähärasvainen pesäkkeitä muodostavien solujen (CFC) määritys. Vanhempien (ADH) ja prostasphere (SUS) viljelmiä hajotettiin päivänä 12 kulttuurin. CD133

+ -solut eristettiin MACS käyttämällä 293C3-vasta-ainetta. 1×10

3 soluja kustakin ehto istutettiin 35 mm petrimaljaa StemXVivo metyyliselluloosan tiivistettä ja DMEM-FBS tai hPCM-PLUS. Tulokset ilmoitetaan keskiarvoina ± StdDev. (*

p

0,05). C) edustaja micrographs tarttuneiden pesäkkeiden vanhempien (ADH) ja CD133

+ soluja. D) Tarttuneesta pesäkkeitä muodostavien solujen (CFC) määritys. Solut käsiteltiin edellä kuvatulla varten puolikiinteä CFC määritystä. Sitten 1×10

3 Solut siirrostettiin 35 mm: n petrimaljoille DMEM-FBS tai hPCM-PLUS. Tulokset ilmoitetaan keskiarvoina ± StdDev. (*

p

0,05).

Prostasphere viljelmät ovat vastustuskykyisempiä kemoterapeuttisen lääkkeen Doketakseli

CSCS on arveltu olevan vastuussa PCa vastustuskyky kemoterapeuttisia huumeita. Olemme arvioineet pohjapinta chemoresistance parentaalisen yksikerrossoluissa inkuboimalla kaikissa solulinjoissa, jossa oli kasvavia määriä Doketakseli (0,625-10 ug /ml) 24 tuntia (kuvio 4A). Solujen elävyys laski johdonmukaisesti, mutta 22Rv1 ja LNCaP osoitti korkeampi herkkyys huumetta. Havaitsimme ero vasteen 5 ja 10 ug /ml Doketakseli; Siksi käytimme näitä pitoisuuksia edelleen arvioida chemoresistance of prostaspheres. Chemoresistance molemmille pitoisuudet Doketakseli kasvoi merkittävästi (

p

0,05) kuin havaitut kantasolulinjoista kaikissa tumorsphere kulttuureissa (kuvio 4B). Prostasphere johdettuja DU145-solut, erityisesti, osoitti korkeinta solujen elinkelpoisuus molemmissa pitoisuuksina: 85,58% ± 7,32% 10 ug /ml, ja 91,35% ± 8,74% 5 ug /ml. Tilastollisesti merkitseviä eroja ei havaittu CD133-lajitellaan ja lajittelemattomat prostasphere kulttuureissa.

A) perustaminen pohjapinta herkkyys vanhempien kulttuurien Doketakseli. 1×10

4 solut 12 päivän ikäisiä yksikerrosviljelmiä inkuboitiin 100 ui DMEM-FBS: ää lopulliseen konsentraatioon 10, 5, 2,5, 1,25, ja 0,625 ug /ml Doketakseli. 22Rv1 ja LNCaP klusterin yhteen ja niillä on suurempi herkkyys lääke verrattuna DU145 ja PC3-soluissa. Tulokset ilmoitetaan keskiarvoina ± StdDev. B) arviointi chemoresistance vanhempien ja prostasphere soluja. 1×10

4 solut kiinni (A) ja prostasphere (S) inkuboitiin 100 ul: lla DMEM-FBS tai hPCM-PLUS media, että lopullinen pitoisuus on 5 ja 10 ug /ml Doketakseli. Prostasphere solut näyttettäviä lisäsi merkittävästi chemoresistance Docetaxel. Kuvassa elinkelpoisten solujen osuus suhteessa ei-käsiteltyyn kontrolliryhmään. Tulokset ilmoitetaan keskiarvoina ± StdDev (*

p

0,05).

CD133

+ prostasphere soluilla lisääntynyt invasiivisen potentiaali verrattuna vanhempien yksikerrosviljelyissä in vitro

Advanced PCa on taipumus levitä luun ja imusolmukkeiden. Siksi teimme Transwell invaasiomääritys määrittää metastaattisen potentiaalin vanhempien ja rikastettua kulttuureissa. Inkuboinnin 48 tuntia, numerot solujen hyökkäsi läpi TranswellTM insertin olivat merkittävästi korkeammat prostaspheres kuin vanhempien yksikerrossoluissa (

p

0,05) (kuvio 5A). Seuraavaksi tarkastellaan lähemmin roolia CD133

+ solujen kulkeutumista PCa soluja ja näin ollen perustamalla etäpesäkeleesioita. CD133

+ soluja kaikissa solulinjoissa oli merkitsevästi enemmän invasiivisia kuin lajittelemattoman prostaspheres (

p

0,05). Mielenkiintoista, CD133

+ DU145 soluja, osoitti suurinta invasiivisia potentiaali (416,55 ± 40,161 /kenttä). Kuviossa 5B esitetään edustavat fotomikrograafeja satunnainen kentät tunkeutuvat soluihin kiinnittynyt, prostasphere, ja CD133

+ solut.

A) TranswellTM invaasiomääritys. 1×10

5 vanhempien (ADH), prostasphere (SUS), ja CD133

+ soluja siirrostettiin 200 ui seerumitonta DMEM-F12 ilman fenolipunaista on Transwell-insertit päällystettiin 50 ul: Geltrex LDEV-free vähentää kasvutekijän kellarissa kalvo matriisi. Solujen annettiin tunkeutua matriisin läpi 24 tunnin ajan. Tulokset ilmoitetaan keskiarvoina ± StdDev. (*

p

0,05). B) edustavat kuvat Transwell insertit osoittaa tunkeutuvat solut värjättiin kristalliviolettiliuoksella.

tunnistaminen yli-ilmentynyt geenien prostasphere rikastettua kulttuureissa ja CD133

+ solujen

geeniekspressioprofilointi syöpä kudoksiin on mahdollista parantaa nykyisten ja ennustavia luokituksia, ja paljastaa käsityksen taustalla CSC patofysiologiassa. Tässä pyrittiin tunnistamaan ilmentynyt geenien magneettisesti lajitellun ja lajittelemattoman PC3 prostasphere soluja, verrattuna vanhempien yksikerrosviljelmissä. Geenien ilmentyminen tiedot toimitettiin Gene Expression Omnibus tietovaraston NCBI ja pääsee tällä GEO verkkosivuilla (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) alle GSE67248 hakunumerolla. Taulukossa 1 luetellaan voimistunut selostukset (suhde 1,5) in CD133 + lajitellaan ja lajittelemattomat prostasphere soluja (katso taulukko A S1 Tiedoston koko joukko tietoja). Kuvio 6A esittää hierarkkisen klusterointi suhteellisen kertaiseksi muutoksia 244 geenit analysoitiin, koko 12 päivää kulttuurin. Tämä graafinen esitys osoittaa, kuinka viljelyolosuhteet aiheuttaa maailmanlaajuisia muutoksia geenien ilmentymisen kautta aikaa. Toiminnallinen merkintä klusterointi voimistunut geenien, joilla on samankaltaisia ​​biologisia toiminto sisältyy: sisältävien proteiinien ennustettu glykosylaatiokohtia ja sekvenssit kohdistaa ne eritysreitille, kalvoon liittyviä proteiineja, proteiineja, jotka osallistuvat solujen adheesiota ja solun pinnan rakenne organisaation, ja proteiineja, joilla on tyrosiinikinaasiaktiivisuutta.

A) Heat kartan kertaiseksi muutoksia geenien ilmentyminen prostaspheres päivänä 4 (P2), päivä 8 (P3), päivä 12 (P4), ja eristetty CD133

– (P4_N) ja CD133

+ (P4_P) jakeet suhteessa vanhempien viljelmät vuorokautena 0. Arvot vastaavat loki2 muuttaneet suhteet välineet (n = 3). Kuvassa käyttäytymistä 244 geenien määritettiin koko sen ajan, solut pidetään viljelmässä. B) Gene ontologia (GO) analyysi ilmen- tymisen lisääntymisen transkriptien CD133

+ soluja. GO Biologiset prosessit rikastunut CD133

+ solut kaikki liittyvät kehitykseen väyliä (

p

* 0,01). Reunaleveyden heijastaa suhteellinen päällekkäisyyden solmujen (% jaettu geenejä). Reuna väri koodaa useita yhteisiä jäsenten välillä koko GO luokka ja käyttäjän määrittämiä tausta (koodistoja). Sphere koko on suhteessa määrä geenejä, jotka liittyvät kyseiseen luokkaan. C) Molecular vuorovaikutukset transkription sääntelijä ΔNp63α kanssa ilmen- tymisen lisääntymisen geenien havaittiin CD133

+ soluja.

ATM

,

TP63

,

IGFBP3

,

Notch1

,

BRCA2

,

IL1A

ja

TOP2

geenit yläreguloituja CD133

+ solujen ja näyttävät välittävän loppupään aktivointi kehittävän molekyyli polkuja. ΔNp63α tetrameerin esitetty keskellä kuvassa tiedetään fyysisesti vuorovaikutuksessa näiden geenien. Wang et ai.