Krooninen sairaus

tiivistelmä

kasvutekijän reseptorin (EGFR) yli-ilmentymisen ja aktivoinnin tuloksen lisääntyneeseen proliferaatio ja migraatio kiinteitä kasvaimia kuten munasarjasyöpä. Viime vuosina yhä enemmän todisteita osoittaa, että EGFR on suora ja toimiva kohteena miR-7. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että miR-7 ilmentyminen oli merkittävästi vaimentua erittäin metastaattinen epiteelin munasarjasyöpä (EOC) solulinjojen ja metastaattinen kudoksissa, kun taas ilmaus, EGFR korreloi positiivisesti etäpesäkkeitä sekä EOC potilaiden ja solulinjoissa. Yli-ilmentymisen miR-7 merkittävästi tukahdutti valmiuksia soluinvaasiota ja muuttoliike ja johtivat morfologisia muuttuu mesenkymaalisten fenotyyppi epiteeliosaan kaltainen fenotyyppi EOC. Lisäksi yli-ilmentyminen miR-7 voimistunut CK-18 ja β-kateniinin ilmaisun ja vaimentua vimentiinista ilme, mukana EGFR esto ja AKT /ERK1 /2 inaktivointia. Samanlainen miR-7 transfektion hiljentäminen EGFR tätä siRNA EOC soluissa myös voimistunut CK-18 ja β-kateniinin ilmaisun ja vaimentua vimentiinista ilmaisun, ja vähentynyt fosforylaatio sekä Akt ja ERK1 /2, joka vahvistaa, että EGFR on tavoite miR -7 kääntämään EMT. Farmakologinen esto PI3K-AKT ja ERK1 /2 sekä tehostaa merkittävästi CK-18 ja β-kateniinin ilmaisun ja tukahdutetaan vimentiinista ilmaisua, mikä osoittaa, että AKT ja ERK1 /2 väyliä tarvitaan miR-7 välittävien EMT. Lopuksi ilmaus miR-7 ja EGFR perusterveydenhuollossa EOC Hyväksytty etäpesäkkeitä kudosten tutkittiin. Se osoitti, että miR-7 korreloi käänteisesti EGFR. Yhdessä tuloksemme ehdotti, että miR-7 inhiboi kasvaimen etäpesäke ja käänteinen EMT kautta AKT ja ERK1 /2-reitin inaktivointia vähentämällä EGFR ilmentyminen EOC solulinjoissa. Siten miR-7 voi olla mahdollinen prognostinen markkeri ja terapeuttinen kohde munasarjasyöpä etäpesäkkeiden intervention.

Citation: Zhou X, Hu Y, Dai L, Wang Y, Zhou J, Wang W, et ai. (2014) MicroRNA-7 Estää tuumorimetastaasin ja Kääntää epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon kautta AKT /ERK1 /2 inaktivaatio kohdistaminen EGFR epiteelikasvaimet munasarjasyöpä. PLoS ONE 9 (5): e96718. doi: 10,1371 /journal.pone.0096718

Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korean Tasavalta

vastaanotettu: 08 joulukuu 2013; Hyväksytty: 10 huhtikuu 2014; Julkaistu: 09 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (Grant nro 81072138), Medical-engineering cross hanke Shanghain Jiao Tong-yliopiston (YG2010MS24). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on merkittävä syy kuolemista gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia ja viides johtava syy syöpään liittyvien kuolemien naisten maailmassa [1]. Mukaan National Cancer Institute (NCI) raportti, noin 22280 uutta tapausta diagnosoidaan munasarjasyövän Amerikassa vuonna 2012, ja 15500 potilasta kuolee tähän sairauteen, ja 5 vuoden pysyvyys heille on noin 30%. On arveltu, että etäpesäke edelleen johtava syy uusiutumisen ja kuoleman munasarjasyöpä, ja silti molekyylimekanismeja liittyy hankintaan metastaattisen kyvyn ihmisen munasarjasyövän ovat huonosti tunnettuja.

MikroRNA (miRNA) ovat luokka pienten ei-koodaavan RNA noin 20-22 nukleotidin pituisen jotka toimivat transkription jälkeisen sääntelyviranomaisten kohdistamalla 3 tulkitsemattoman alueet (UTR) mRNA ja aiheuttaa joko estäminen käännöksen tai mRNA: n hajoaminen [2]. MiRNA edistää monipuolista soluprosessien lukien proliferaatio, apoptoosin, invaasio ja morfogeneesiin [3], [4], [5]. Lisäksi erilaisia ​​miRNA on havaittu, että toimivat klassinen onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille [6], [7], [8]. MiR-7 on luonnehdittu tuumorisuppressorina useissa ihmisen syövissä. Se on suunnattu useita proto-onkogeenien, kuten insuliinin kaltainen kasvutekijä-1-reseptorin (IGF1 R) [9], epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) [10], p21-aktivoitu kinaasi 1 (PAK1) ja niihin liittyvät Cdc42 kinaasi 1 (Ack1 ) [11]. On osoitettu, että yli-ilmentyminen miR-7 esti schwannoma solujen kasvuun sekä kulttuuriin ja vierassiirrekokeissa kasvainmuodosta in vivo, joka korreloi downregulation EGFR, PAK1 ja Ack1 [11].

Noin 70% epiteelisolujen munasarjasyöpä (EOC) ilmaista aktivoitu EGFR [12]. EGFR yli-ilmentyminen ja aktivaatio johtaa lisääntynyt proliferaatio ja migraatio kiinteitä kasvaimia kuten munasarjasyöpä [13]. Aktivointi EGFR tyrosiinikinaasin tuloksia aktivoitumiseen useita solunsisäisiä signaaleja, jotka kulminoituvat paitsi soluproliferaatioon, vaan myös muita prosesseja, jotka ovat ratkaisevan tärkeitä syövän etenemisessä, mukaan lukien solujen vaeltamiseen, angiogeneesi, etäpesäke, ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT). Nämä tapahtumat välittyvät eri alavirtaan tavoitteita EGFR (esim proteiinikinaasi (AKT) ja ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi 1/2 (ERK1 /2)) [14], [15], [16]. Mielenkiintoista on, että se on osoitettu, että miR-7 suoraan kohteena EGFR-mRNA: n 3′-UTR: n, ja sitten estää ilmentymistä sen mRNA: n ja proteiinin [17]. Vaikka EGFR signalointi on tärkeä ja hyvin tutkittu suhteessa EOC etenemistä, vähän tiedetään miten miR-7 välittävät EGFR signalointi moduloimiseksi EOC solujen etäpesäke.

Tässä tutkimuksessa, tunnistamme ensimmäistä kertaa, että miR -7 tärkeä rooli EOC etäpesäkkeitä. Lisäksi osoitamme, että miR-7 kääntää EMT kautta AKT /ERK1 /2 inaktivointia kohdistamalla EGFR EOC, joka aikaansaa uuden käsityksen mekanismit etäpesäke munasarjasyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

potilaat ja etiikka

Pariksi näytteitä ensisijainen epiteelin munasarjasyöpä kudoksiin ja metastaattinen kudosten (omentum tai vatsakalvon) saatiin potilailta, joilla FIGO III-IV edennyt EOC, joille oli tehty kasvaimen rajaamisvai- at ​​Renji sairaala, koulu Medicine, Shanghai Jiao Tong-yliopiston vuosina 2010 ja 2012. niistä 17 pariksi näytteet snap-jäädytettiin nestetypessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempää RNA, 25 pariksi näytteitä formaliinilla ja parafiiniin. Näytteitä kliinisesti ja patologisesti osoitettiin kuitenkin merkittävä asianmukaisesti. Tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board of Renji sairaala, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong-yliopiston ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta. Kaikki kliiniset tutkimuksen suorittanut periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistuksen.

Materiaalit

MiR-7 plasmidia ja negatiivisen kontrollin (NC) syntetisoitiin Shanghai IBS Company. Sekvenssi plasmidin ja NC ovat seuraavat: 5′-UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU-3 ’; Negative Control: 5’-GAAATCTACTGCGCGTGGAGAC-3 ’(IBS yritys). TaqMan Kit (Applied Biosystems) määritetty määrällistä miRNA käytettiin arvioimaan ilmentymisen miR-7 ja U6. EGF-reseptori Rabbit mAb (# 4267), Phospho-EGF-reseptori (Tyr992) Rabbit mAb (# 2235), Phospho-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) Rabbit mAb (# 4370), Phospho-Akt (Ser473 /Thr308), kani mAb (# 4060 /# 2965), Akt (pan) Rabbit mAb (# 4691), LY294002 (PI3K Kinase Inhibitor) (# 9901), U0126 (MEK1 /2 Inhibitor) (# 9903), vimentiinistä kani mAb (# 5741 ), ja β-kateniinin kani mAb ja E-kadheriinin Rabbit mAb (# 3195) ostettiin Cell Signaling Technology (CST). sytokeratiini-18 (CK-18) mAb (T410) pAb (BS1204) hankittiin Bioworld Technology. P44 /42 MAPK Rabbit mAb saatiin Santa Cruz ((sc-33746)). GAPDH hiiren mAb ostettiin ABmart (# M20006). 800CW konjugoitua vuohen anti-kani IgG: tä ((926-32210), erittäin rajat adsorboitu ja 800CW konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG (926-32211), erittäin cross adsorboitu ostettiin Li-Cor Biosciences. EGFR ja ohjauksella lyhyen häiritseviä RNA: ita (siRNA ) olivat Sanong Biotech.Has-miR-7-LNA detektiokoetinta ostettiin Exiqon (38485-15).

Soluviljely

HO-8910pm, HO-8910 solulinjat saatiin Solun Bank of Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina), CAOV-3, SKOV3, A2780, A2780 /DDP, ja ES-2-solut saatiin ATCC (Manassas, VA). soluja viljeltiin Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) väliaine (Hyclone), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone) ja penisilliiniä /streptomysiiniä (1:100, Sigma) kosteassa atmosfäärissä inkubaattorissa 5% CO 2 37 ° C: ssa. Ellei toisin on osoitettu, soluja kasvatettiin 70-80% konfluenssiin, sitten seerumia yön yli seerumivapaassa RPMI-1640-väliaineeseen ennen hoitoa.

miRNA ja siRNA transfektio

80-90% konfluentteja -solut transfektoitiin ihmisen miR-7-plasmidia (miR-7) tai negatiivinen kontrolli (NC) ja 30-40% konfluentteja soluja transfektoitiin EGFR siRNA tai siRNA-NC Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Kokonais-RNA uutettiin 24 tunnin kuluttua transfektion, ja solun kokonaisproteiinista uutettiin 48 tai 72 tuntia transfektion jälkeen.

Käänteinen transkriptio kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

kokonais-RNA eristettiin TRIzol Reagent (Invitrogen ). Aikuinen miR-7 käänteistranskriptoituneet erityisiä RT alukkeilla, määrällisesti TaqMan koetin, ja normalisoida U6 pieni ydin- RNA käyttäen TaqMan miRNA määrityksiä (Applied Biosystems). mRNA ilmaisun analyysi tehtiin kvantitatiivisen PCR: llä käyttämällä SYBR vihreä väriaine, jossa suhteelliset muutokset lasketaan ΔΔCt menetelmällä. Käytetyt alukkeet olivat seuraavat: GAPDH-F, 5-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3; GAPDH-R, 5-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3; EGFR-F, 5-AGCCATGCCCGCATTAGCTC-3; EGFR-R, 5-AAAGGAATGCAACTTCCCAA-3.

Western blotting

Koko solu-uutteet valmistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [18], ja yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin 8% tai 10% SDS -sivu ja elctrotransferred PVDF-kalvolle (Millipore). Membraanit blokattiin sitten 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa, Li-Cor salpaaja (Li-Cor). Jatkuvasti ravistaen, kalvoja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C, minkä jälkeen inkuboitiin 1 tunnin ajan sopivan sekundaarisen vasta-aineet on leimattu 800IRdye. Immunoreaktiivisuus havaittiin ja kvantitoitiin infrapuna Odyssey kuvantamisen System (Li-Cor).

Migration määrityksissä

Solut (8 x 10

4) kerättiin ja suspendoitiin uudelleen serum- RPMI-1640-alustassa ja otetaan ylempään kuoppiin Boyden kammion (Corning). Väliaine, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia lisättiin alempaan kammioon. 8 tunnin kuluttua inkuboinnin solujen jäljellä yläpinnalla kalvojen poistettiin, solut, jotka olivat tunkeutuneet läpi 8 um huokoskoko kiinnitettiin, värjättiin ja laskettiin mikroskoopilla 200-kertaisella suurennuksella. Tulokset laskettiin keskiarvo yksi kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Invasion määrityksissä

Solut (3 x 10

4) pantiin yläkammiot päällystettiin 50 ui Matrigel (1:05 ​​laimennus seerumittomassa väliaineessa). Väliaineessa, jota täydensi 10% seerumia, lisättiin ulomman kupin. 24 tunnin inkubaation jälkeen solut jäljellä yläpinnalla kalvojen poistettiin, solut, jotka olivat tunkeutuneet läpi Matrigel ja 8 um huokoskoko kiinnitettiin, värjättiin ja laskettiin mikroskoopilla 200-kertaisella suurennuksella. Tulokset laskettiin keskiarvo yksi kolmesta itsenäisestä kokeesta.

immunohistokemia (IHC) ja kromogeeninen in situ -hybridisaatio (CISH) B

immunohistokemia (IHC) suoritettiin käyttäen piparjuuriperoksidaasiin (HRP) polymeeripintaan anti-hiiri IHC DAB (diami-nobenzidine) -pohjaisen kit (MaxVision, Fuzhou, Kiina), valmistajan mukaan protokollan. Antigeeni haku suoritettiin käyttäen boraattipuskuria (pH = 8), jota seurasi inkubointi vetyperoksidia ja lisäksi esto vaiheet. Vasta-aineita käytettiin 1:50. IHC tutkittiin ja kuvattiin käyttäen Olympus BX51 valomikroskoopilla (Tokio, Japani) on 1:200. Positve signaaleja tunnistettiin voimakas ruskea merkintöjä niiden solukalvojen.

Chromogenic in situ -hybridisaatio (CISH) B suoritettiin käyttäen Has-miR-7 koetin Exiqon (elohopea LNA detektiokoetinta 5 ’ja 3’-DIG (digoksigeniiniä) -leimattuna). Koetin detektoitiin käyttämällä digoksigeniinivasta vasta-ainetta (Abcam), LSAB2 System-HRP (Dako Denmark A /S, Glostrup, Tanska) ja nestemäinen DAB + Alustan Kromogeeni System (Dako) mukaan valmistajan ohjeiden. CISH tutkittiin ja kuvattiin käyttäen Olympus BX51 valomikroskoopilla (Tokio, Japani) on 1:200. Positiiviset hybridisaatiosignaaleista tunnistettiin voimakas ruskea merkintöjä niiden solun cytoplasms.

tulokset IHC ja CISH olivat itsenäisesti tekee kaksi patologia sokea tavalla. Pisteytys perustui voimakkuus ja laajuus värjäys ja arvioitiin seuraavalla histologinen pisteytys menetelmää. Värjäytymisintensiteettiä luokiteltiin seuraavasti: 0, negatiivinen värjäys; 1, heikko värjäytyminen; 2, kohtalainen värjäytyminen; 3, vahva värjäytyminen. Keskimääräinen osuus värjäämällä solut per yksilö määritettiin semi-kvantitatiivisesti ja pisteytettiin seuraavasti: 0 värjäystä 1%, 1 1-25%, 2 26-50%, 3 51-75%, ja 4 75% tutkituista soluista. Histologinen pisteet (H-pisteet) jokaisesta näytteestä laskettiin kaavalla: H-pisteet = osuus pisteet x intensiteetti pisteet. Yhteensä pisteet 0-12 laskettiin ja luokiteltiin negatiiviseksi (-, pistemäärä: 0), heikko (+, pistemäärä: 1-4), kohtalainen (++, pistemäärä: 5-8) tai vahva (+++, pistemäärä: 9-12).

tilastollinen

tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 12.0 tilastollisen analyysin ohjelmistopaketti. Kussakin in vitro kokeessa, joka on vähintään kolme kaivojen /ruokia käytettiin ja saatiin samanlaisia ​​tuloksia. Jokainen koe toistettiin vähintään kolme kertaa, keskiarvo toistojen laskettiin ja tätä arvoa käytettiin tilastolliseen analyysiin. Kokeelliset tiedot ilmoitetaan keskiarvoina sekä keskihajonta (SD). Erot ryhmien välillä arvioitiin käyttämällä Studentin t-testiä vertailtaessa vain kaksi ryhmää tai analysoitu yksisuuntaisella ANOVA jälkikäteen testi, kun enemmän kuin kaksi ryhmää verrattiin. Korrelaatio EGFR ja miR-7 analysoitiin Spearmanin rank-testi. Tulokset IHC ja CISH analysoitiin käyttäen Wilcoxonin testi. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä P 0,05, * P 0,05 ** P 0,01.

Tulokset

miR-7 ilmentyminen korreloi käänteisesti EOC etäpesäkkeitä

tutkia ilmaisu ja merkitys miR-7 EOC etäpesäkkeitä, havaitsimme miR-7 ilmentymisen 17-pariksi metastasoitunut EOC kudosten ja ensisijainen EOC kudoksiin. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qRT-PCR) osoittavat, että kudosten omentum tai vatsakalvon etäpesäkkeitä ilmaistuna alhaisempi miR-7 verrattuna ensisijaisen EOC kudosten, joka osoittaa käänteisen suhteen ilmentymisen miR-7 ja metastaattisen asema EOC kudosten ( kuvio 1A). Lisäksi valitsimme HO-8910 ja sen erittäin metastaattinen klooni HO-8910pm. HO-8910pm perustettiin ja tunnettu Cell Bank, Kiinan tiedeakatemia [19], [20], [21]. Huomasimme, että miR-7 ilmentyminen oli merkittävästi vähentynyt erittäin metastaattinen klooni HO-8910pm verrattuna HO-8910 (kuvio 1 B). Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että alas-säätely miR-7 korreloi lisääntynyt EOC etäpesäkkeitä ja että miR-7 saattaisi tukahduttaa EOC etenemistä. Määrittää optimaalisen solulinjojen jatkotutkimuksiin, mittasimme ilmentymisen miR-7 seitsemässä EOC solulinjoissa (HO-8910pm, HO-8910, A2780, A2780 /DDP, SKOV-3, CAOV-3 ja ES-2) . Meidän tiedot osoittivat, että ilmentyminen miR-7 oli matalin ES-2-solulinja (P 0,05) (kuvio 1C), joka on toinen EOC solu erittäin metastaattinen potentiaali. Siksi me valitsemme HO-8910PM ja ES-2 tutkia mekanismeja miR-7 estävä etäpesäke EOC seuraavissa kokeissa.

(A) Suhteellinen ilmentyminen miR-7 17-pariksi EOC kudoksia alkaen omentum tai vatsakalvon etäpesäkkeitä ja ensisijainen EOC kudosten havaittiin qRT-PCR. U6 pieni ydin- RNA käytettiin sisäisenä kontrollina, ja kertaluokkamuutos laskettiin ΔΔCt menetelmällä (B) Ilmaisu taso miR-7 yhdet matalan ja korkean metastaattinen EOC solulinjoissa. (C) Ilmaisu taso miR-7 seitsemässä EOC solulinjoissa. (* P 0,05. ** P 0,01).

miR-7 downregulates EGFR EOC soluissa

havaitsemiseksi oleva mekanismi, jonka miR-7 estävät EOC hyökkäyksen ja etäpesäke, etsittiin miR-7 tavoitteet käyttäen kuten TargetScan ja Pictar. Se tunnistettiin 181 ehdokas kohdegeeneissä kuten EGFR. On osoitettu, että miR-7 downregulates EGFR suoraan kohdentamalla EGFR mRNA 3′-UTR [17]. Olimme erityisen kiinnostuneita EGFR sen positiivisten rooleja syöpäsolujen maahanmuutto- ja invaasion ja sen yli-ilmentymisen EOC. Tutkimme lisäksi ilmaisun ja merkityksen EGFR EOC etäpesäkkeiden tunnistamalla EGFR-proteiinin ilmentymistä 17-pariksi metastasoitunut EOC kudosten ja ensisijainen EOC kudoksiin. Western blotting -analyysi osoitti, että kudosten omentum tai vatsakalvon etäpesäkkeitä ilmaistuna korkeampi EGFR verrattuna ensisijaisen EOC kudoksiin, mikä osoittaa positiivisen korrelaation ilmaisun EGFR ja metastaattisen asema EOC kudoksissa (kuvio 2A, kuvio S1A). Samalla olemme myös havainneet EGFR-proteiinin ilmentyminen western blottauksella sekä HO-8910 ja HO-8910pm soluissa. Huomasimme, että EGFR oli merkittävästi lisääntynyt erittäin metastaattinen klooni HO-8910pm verrattuna HO-8910 (kuvio 2B, kuvio S1B). Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että EGFR korreloi positiivisesti EOC etäpesäkkeitä ja että EGFR voitaisiin edistää EOC etenemistä.

(A) proteiini ilmentymistä EGFR 17-pariksi EOC kudoksia omentum tai vatsakalvon etäpesäkkeitä ja ensisijainen EOC kudoksissa tutkittiin western blot. (B) proteiini ilmentymistä EGFR HO-8910 ja HO-8910pm solulinjoissa tutkittiin western blottauksella. (C) ekspressiotaso miR-7 HO-8910pm ja ES-2-solut, jotka on transfektoitu miR-7 tai NC analysoitiin qRT-PCR: llä. (D) ekspressiotaso EGFR-mRNA: n HO-8910pm ja ES-2-solut, jotka on transfektoitu miR-7 tai NC analysoitiin qRT-PCR: llä. (E) ilmentyminen EGFR-proteiini analysoitiin western-blottauksella HO-8910pm ja ES-2-solut, jotka on transfektoitu miR-7 tai NC, Glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) käytettiin sisäisenä kontrollina. (* P 0,05. ** P 0,01).

Varmista rooleja miR-7 säätelyyn EGFR ilmaisun EOC soluissa, sekä HO-8910pm ja ES-2 solut olivat transfektoitu miR-7 plasmidiin tai miR-NC. qRT-PCR osoitti, että miR-7 ilmentyminen kasvoi merkittävästi (kuvio 2C), kun taas EGFR mRNA ilmentyminen väheni huomattavasti (kuvio 2D) jälkeen miR-7 transfektiota molemmissa solulinjoissa. Lisäksi Western blotting-analyysi osoitti, että EGFR-proteiinin ilmentyminen väheni merkittävästi sen jälkeen, kun miR-7 transfektio sekä HO-8910pm ja ES-2-solut (kuvio 2E, kuvio S1C). Tuloksemme viittaavat siihen, että miR-7 downregulates EGFR EOC.

miR-7 tukahduttaa EOC soluinvaasiota ja muuttoliike in vitro

Sen tutkimiseksi, miR-7 säätelee solujen invaasiota ja muuttoliike EOC sekä HO-8910pm ja ES-2-solut transfektoitiin miR-7 plasmidiin tai miR-NC. TranswellTM muuttoliike ja invaasion määritykset suoritettiin sitten. Olemme havainneet, että transfektio miR-7 suppressoi merkitsevästi hyökkäyksen sekä HO-8910pm soluja (kuvio 3A) ja ES-2-soluja (kuvio 3B). Vastaavasti, muuttoliike kapasiteetti oli myös merkittävästi alas-säädellä sekä HO-8910pm-miR-7-soluissa ja ES-2-miR-7-soluja vastaan ​​HO-8910pm-NC-solujen ja ES-2-NC-soluissa (kuvio 3A, kuvio 3B) . Nämä tulokset osoittavat, että miR-7 osallistuu säätelyyn solumigraation ja hyökkäyksen EOC.

(A) TranswellTM maahanmuutto ja invaasio, joissa käytetään HO-8910pm transfektoitujen solujen miR-7 tai negatiivinen kontrolli (NC). Kuvat ovat näkyvät vasemmalla, ja kvantifiointia 6 satunnaisesti valitun kentät näkyy oikealla. (B) TranswellTM maahanmuutto ja invaasio, joissa käytetään ES-2-solut transfektoitu miR-7 tai NC. Kuvat ovat näkyvät vasemmalla, ja kvantifiointia 6 satunnaisesti valitun kentät näkyy oikealla. Esitetyt arvot on ilmoitettu keskiarvoina ± SD. (* P 0,05. ** P 0,01).

yli-ilmentyminen miR-7 kääntää EMT vuonna EOC solussa

EOC soluissa, havaitsimme, että miR-7 transfektio johti morfologisia muutoksia pitkänomaisesta, kara-muotoinen, mesenkymaalisten fenotyyppi on pyöristetty, epiteelin kaltainen fenotyyppi, soluja yhdistämällä ryhmissä (kuvio 4A). Nämä muutokset ovat käänteinen prosessit EMT, joka on tärkeä syy epiteelin syövän saada kykyä ja metastaasit. Lisäksi olemme tutkineet proteiinin ilmentymistä epiteelin markkerit E-kadheriinin, CK-18 ja β-kateniinin, sekä mesenkymaalisten markkeri vimentiinista Western-blottauksella. Vaikka ei ollutkaan mitään E-kadheriinin ilmentymisen molemmissa solulinjoissa jälkeenkin miR-7 transfektion CK-18 ja β-kateniinin ilmentymistä kasvanut dramaattisesti, kun taas vimentiinistä ilmentyminen laski sekä HO-8910pm ja ES-2-solujen jälkeen miR-7 transfektio ( Kuvio 4B, kuvio S2). Tuloksemme viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen miR-7 kääntää EMT in EOC solulinjoissa.

(A) Phase-kontrasti kuvia ES-2-solut infektoitiin MIR-7 tai NC. (B) proteiini ilmentymistä E-kadheriinin, CK-18, β-kateniinin ja vimentiinin HO-8910pm ja ES-2-solut, jotka on transfektoitu miR-7 tai NC tutkittiin western-blottauksella, GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. (* P 0,05. ** P 0,01).

lusiferaasireporttiterilla määrityksissä

Ymmärtääksemme molekyylitason mekanismi, jonka miR-7 tukahduttaa EOC invaasio ja etäpesäkkeiden, käytimme eri laskennallisia menetelmiä etsiä miR-7 tavoitteet, kuten Targetsan ja pictar. Nämä menetelmät löytyi 181 mahdollinen ehdokas geenejä. Olimme erityisen kiinnostuneita EGFR sen positiivisten rooleja syöpäsoluinvaasiota. Analyysi 3′-sekvenssin, EGFR tunnistettavissa kolme mahdollista sitoutumiskohtia miR-7. Sen määrittämiseksi, onko EGFR on välittömänä kohteena miR-7, rakensimme sen 3′-UTR: n fragmentteja, joissa villityypin ja mutantti-sitoutumispaikat työnnetään alueelle immediatedly alavirtaan reportterigeenin (kuvio 5A), lusiferaasireportterilla määritykset osoittivat että miR-7 transfektio aiheutti huomattavaa lusiferaasiaktiivisuuden pienenemiseen, joka sisälsi villityypin 3′-UTR-fragmenttien sitovat kohdat (kuvio 5B).

(A) kaavio EGFR 3’UTR reportteri-konstrukti. (B) Villityypin tai mutantin toimittaja plasmidit kotransfektoitiin miR-7 tai NC-ES-2. (* P 0,05. ** P 0,01).

miR-7 tukahduttaa AKT ja ERK1 /2-reitin aktivaatio riippuvainen sen EGFR eston EOC soluissa

Aiemmat tutkimukset osoittivat että EGFR säätelee AKT ja ERK1 /2 aktiivisuutta munasarjasyöpä [15], [22]. Koska miR-7 voivat lähettää transkription ilmentymisen inhiboimiseksi EGFR, me arveltu, että miR-7 säätelee AKT ja ERK1 /2-reitin aktivointi. Tutkia vaikutuksen miR-7 AKT ja ERK1 /2, transfektoimme HO-8910pm ja ES-2-solujen miR-7 plasmidiin tai miR-NC, ja tutkittiin sitten fosforylaation AKT ja ERK1 /2 western-blottauksella. Transfektion miR-7 tukahdutetaan fosforylaation AKT at Ser473 ja ERK1 /2: n Thr202 /Tyr204, kuitenkin, miR-7 ei merkittävästi muuttanut AKT fosforylaation Thr308 (kuvio 6A). Koska aktivointi EGFR pelaa merkittävä rooli etäpesäkkeiden moniin syöpiin, myös havaita sen fosforylaatiotilaa jälkeen miR-7 transfektion HO-8910pm ja ES-2-soluissa. Kuitenkin meidän tutkimuksissa ei havaittu EGFR fosforylaatiota ennen ja jälkeen miR-7 transfektion taas miR-7 transfektio ei estävät yhteensä EGFR-proteiinin ilmentymisen (kuvio 6A, kuva S3 (A-C)). Todisteena että miR-7 on monia kohdegeenien, etsimme onko miR-7 välittämä AKT ja ERK1 /2-reitin aktivaatio on riippuvainen sen EGFR eston. HO-8910pm ja ES-2-solut transfektoitiin EGFR siRNA tai negatiivinen kontrolli. Osoitimme, että hiljentäminen EGFR tätä siRNA munasarjasyöpäsoluja vähentynyt fosforylaatio AKT at Ser473 ja ERK1 /2 klo Thr202 /Tyr204 Länsi blotting mutta ei ollut merkittävää muutosta fosforylaatioon AKT at Thr308 (kuvio 6B, kuva S3 ( DE)).

(A) HO-8910pm ja ES-2-solut transfektoitiin miR-7 tai NC, EGFR, AKT ja ERK1 /2-fosforylaation analysoitiin western-blottauksella. (B) HO-8910pm ja ES-2-solut transfektoitiin EGFR siRNA tai NC, EGFR, AKT ja ERK1 /2-fosforylaation analysoitiin western-blottauksella. (* P 0,05. ** P 0,01).

miR-7 kääntää EMT kautta EGFR /AKT ja EGFR /ERK1 /2-reitin

Voit selvittää EGFR /AKT ja EGFR /ERK1 /2 signalointireitteihin olivat mukana käänteinen EMT by miR-7, transfektoimme EGFR siRNA osaksi HO-8910pm ja ES-2-solut ja sitten tutkia proteiinin ilmentymistä E-kadheriinin, CK-18, β kateniinia ja vimentiinista western blottauksella. Huomasimme, ettei E-kadheriinin ilmentymisen ennen ja jälkeen EGFR siRNA transfektion molemmissa solulinjoissa kuitenkin CK-18 ja β-kateniinin ilmaisua kasvanut dramaattisesti, kun taas vimentiinistä ilmaisu laski sekä HO-8910pm ja ES-2-solujen jälkeen EGFR siRNA transfektio (kuvio 7A, kuvio S4 (AC)). Sitten käytimme PI3K /AKT-estäjällä LY294002 ja ERK1 /2-estäjän U0126 nimenomaan estää Akt ja ERK1 /2 polkuja, tässä järjestyksessä. Kuten odotettua, PI3K /AKT-estäjällä LY294002 estyy AKT-fosforylaation, kun taas ERK1 /2-inhibiittori U 0126 inhiboi ERK1 /2: n fosforylaatiota HO-8910pm ja ES-2-soluja (kuvio 7B, FigureS4 (D-G)). Edelleen, sekä AKT ja ERK1 /2-estäjät parannettu CK-18 ja β-kateniinin ilmentymistä ja tukahdutettiin vimentiinista ilmaisun HO-8910pm ja ES-2-solut (kuvio 7C ja kuvio S4 (H-M)). Tuloksemme osoittivat osallistumista EGFR /AKT ja EGFR /ERK1 /2 reittejä MIR-7 päinvastaiseksi EMT in munasarjasyöpäsoluja.

(A) HO-8910pm ja ES-2-solut transfektoitiin EGFR siRNA tai NC, proteiinin ilmentyminen E-kadheriinin, CK-18, β-kateniinin ja vimentiinin tutkittiin western-blottauksella. (B) HO-8910pm ja ES-2-soluja käsiteltiin LY294002 (20 umol /l) tai U0126 (10 umol /l), AKT ja ERK1 /2-fosforylaation analysoitiin western-blottauksella. (C) HO-8910pm ja ES-2-soluja käsiteltiin LY294002 (20 umol /l) tai U0126 (10 umol /l), proteiinin ilmentymisen CK-18, β-kateniinin ja vimentiinin tutkittiin western-blottauksella. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina (* P 0,05. ** P 0,01).

miR-7 ja EGFR ovat käänteisesti ilmaistaan ​​EOC ensisijainen ja etäpesäkkeiden kudosten

käytetyt CISH ja IHC havaita ilmentymisen miR-7 ja EGFR saman kudostyypin. Me määrittää, onko miR-7 ilmentyminen liittyi EGFR ilmaisun EOC tissuses. Kudos sisälsi 25 paria ensisijaisen EOC kudosten ja niiden yhteensovitettujen metastaattisen kudoksiin. CISH analyysi osoitti avoin väheneminen miR-7 Metastasoituneessa kudoksissa verrattuna niiden vastaavan ensisijaisen EOC kudoksissa (kuvio 8A, taulukko 1). Sitä vastoin IHC tulokset paljastivat, että EGFR oli suurempi metastaattisen kudoksissa kuin ensisijaisen EOC kudoksissa (kuvio 8B, taulukko 2). Lisäksi tilastollinen analyysi osoitti, että EGFR-ekspressio korreloi käänteisesti miR-7 ilmentymistä (taulukko 3).

(A) Expression of miR-7 ensisijaisen EOC ja sen täsmäsi metastaattisen kudosta CISH. (B) ilmentäminen EGFR perusterveydenhuollossa EOC ja sen Hyväksytty metastasoituneen kudosta IHC. (* P 0,05. ** P 0,01).

Keskustelu

miRNA ovat nousseet kriittinen sääntelyviranomaisten syövän synnyn ja pahanlaatuisten etenemistä syöpä kohdentamalla onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille [23], [24]. Siihen on viitattu, että miR-7 inhiboi kasvaimen invaasiota ja etäpesäkkeiden glioblastooma, schwannooma, keuhkosyöpä, rintasyöpä ja monet muut syövät [25], [26], [27]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet biologisen roolin miR-7 ihmisen EOC etäpesäkkeitä. Huomasimme, että miR-7 alassäädetty metastaattisessa epiteelin munasarjasyöpä (EOC) kudoksiin verrattuna ensisijaisen EOC kudoksiin. miR-7 ilmentyminen väheni myös merkittävästi erittäin metastaattinen klooni HO-8910pm verrattuna HO-8910. Lisäksi osoitimme, että ilmaus miR-7 oli matalin ES-2 solulinja, joka on toinen EOC solu erittäin metastaattista potentiaalia joukossa seitsemän EOC solulinjoja (HO-8910pm, HO-8910, A2780, A2780 /DDP, SKOV -3, CAOV-3 ja ES-2). Siksi meidän havaintojen mukaan miR-7 ilmentyminen korreloi käänteisesti EOC etäpesäkkeitä.

Mielenkiintoista, kukin miRNA voi mahdollisesti säädellä satoja geenien transkription jälkeisellä tasolla sitoutumalla erityisiä sekvenssit kohde-mRNA-molekyylien perustuu aiheesta ”epätäydellinen täydentävät”. On osoitettu, että yli-ilmentyminen miR-7 inhiboi kasvaimen invaasiota ja etäpesäkkeiden kohdistamalla insuliinin kaltainen kasvutekijä-1-reseptorin (IGF-1 R) mahasyövän [9]. miR-7 on myös raportoitu kohdistaa FAK rintasyöpäsoluissa [28]. Viime vuosina yhä enemmän todisteita osoittaa, että EGFR on suora ja toiminnallinen kohde miR-7 [10], [17]. Reseptorityrosiinikinaasia EGFR perheen säätelee olennaista solujen toimintoja, kuten lisääntymistä, eloonjääntiä, muuttoliike, ja erilaistumiseen. Julkaistut tiedot osoittavat, että EGFR: llä on tärkeä rooli syövän etenemistä [12], [27]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että kudoksia omentum tai vatsakalvon etäpesäkkeitä ilmaistuna korkeampi EGFR verrattuna ensisijaisen EOC kudoksiin. Samalla olemme havainneet, että EGFR oli yläreguloituja erittäin metastaattinen klooni HO-8910pm verrattuna HO-8910. Nämä tulokset viittaavat siihen, että EGFR liittyy läheisesti munasarjasyöpä etäpesäkkeitä. Aiemmat tutkimukset osoittivat myös, että EGFR yli-ilmentyminen ja aktivaatio johtaa lisääntynyt etäpesäke ihmisen munasarjasyöpäsoluja [18], [29]. Ei kuitenkaan tutkimus suoritettiin sen määrittämiseksi, onko miR-7 kohdistuu EGFR moduloimiseksi käyttäytymistä EOC etäpesäke. Täällä osoitti, että sekä EGFR mRNA ja EGFR-proteiinin ilmentyminen väheni merkittävästi sen jälkeen, kun miR-7 transfektion EOC solulinjoissa. Olemme myöhemmin todettu, että sekä hyökkäys ja muuttoliike kapasiteetti olivat huomattavasti alassäädetty jälkeen miR-7 transfektion EOC in vitro. Nykyinen kokeelliset tulokset vahvistivat ensimmäistä kertaa, että miR-7 tukahdutetaan EOC soluinvaasiota ja muuttoliike. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että miR-7 tukahduttaa solujen invaasiota ja muuttoliikkeen ainakin osittain, suoraan kohdentaa EGFR EOC.

EMT viittaa biologisen prosessin että epiteelisolujen muuntua mesenkyymisolujen kautta