Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sporadic iällä kolorektaalisyöpää (EOCRC), joka on määritelmän mukaan ole tunnistettu perinnöllinen alttius on kasvava ongelma, joka pysyy huonosti. Molecular analyysi voisi parantaa tunnistamisen erillisiä alatyyppejä peräsuolen syöpiä (CRC) terapeuttisia vaikutuksia ja siten auttaa luomaan että satunnaista EOCRC on erillinen yksikkö. Vuodesta 954 potilasta resektoitiin CRC meidän laitos, 98 potilasta valittiin. Potilasta iältään 45-60 vuotta ei otettu auttaa määrittelemään ”nuori” ja ”vanha” ryhmiä. Kolmekymmentäyhdeksän tapaukset satunnaisia ​​EOCRC (patients≤45 vuotta mikrosatelliittimerkkien vakaa kasvaimia) verrattiin molempien mikrosatelliittimerkkien vakaa kasvaimia iäkkäät potilaat (36 tapauksissa potilaat 60-vuotiaat) ja potilasryhmiä microsatellite epävakautta. Kukin ryhmä testattiin

TP53

,

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

mutaatioiden ja läsnä methylator fenotyypin. Geeniekspressioprofiilit käytettiin myös reitin analyysiä. Verrattuna mikrosatelliittimarkkereita vakaa CRC vanhoista potilaista, satunnaista EOCRC leimasi distaalinen sijainnin, usein synkronoitu etäpesäkkeitä ja harvoin synkronoitu adenoomia mutta ei ole erityisiä morfologisia ominaisuuksia. Edesauttamalla historia CRC oli yleisempää satunnaista EOCRC potilailla puutteesta huolimatta tunnistettu perinnöllinen (p = 0,013). Geneettiset tutkimukset osoittivat myös ilman

BRAF

mutaatioita (p = 0,022) ja methylator fenotyypin (p = 0,005) satunnaisissa EOCRC verrattuna vanhempiin potilaille. Geeniekspressioanalyysissä sekaantunut avain reittejä kuten Wnt /beta kateniinin, MAP-kinaasin, kasvutekijän signalointi (EGFR, HGF, PDGF) ja TNFR1 väylän satunnaista EOCRC. Wnt /beta kateniinia aktivaatiota vahvistettiin poikkeava ydin- beeta kateniinin immuunivärjäysmenetelmällä (p = 0,01). Tämä tutkimus viittaa vahvasti siihen, että satunnainen EOCRC on selvä kliinis-molekyyli kokonaisuus esittelyssä kuin distaalinen ja aggressiivinen tauti liittyy kromosomi epävakautta. Lisäksi useita signalointireittejä, kuten TNFR1 polku on tunnistettu mahdollisina biomarkkereita sekä diagnosointiin ja tämän sairauden hoidossa.

Citation: Kirzin S, Marisa L, Guimbaud R, De Reynies A, Legrain M, Laurent -Puig P, et ai. (2014) satunnaiset varhain alkanut peräsuolen syövän on erityinen Sub-Type of Cancer: morfologisen, Molecular and Genetics Study. PLoS ONE 9 (8): e103159. doi: 10,1371 /journal.pone.0103159

Editor: Peh Yean Cheah, Singapore General Hospital, Singapore

vastaanotettu 18 maaliskuuta 2014; Hyväksytty: 26 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 01 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Kirzin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Tiedot ovat saatavilla NCBI, GEO tietovaraston hakunumero: GSE39084.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat apurahan Ligue Régionale Contre le Cancer, Comité du Gers ja ohjelma Carte d’Identité des Tumeurs maasta Ligue Nationale Contre le Cancer. Kirjoittajat kiittää Institut National Contre le Cancer heidän tuestaan ​​kliinisten ja laboratoriossa geneetikko. Kirjoittajat kiittää Cancéropôle Grand Sud-Ouest tarjota kliinisen merkintöjä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yleisimmin iäkkäillä aikuisilla iän mediaani diagnoosin oli 70 vuotta [1]. Kuitenkin mukaan Yhdysvaltain rekistereissä esiintyvyys CRC nuorilla aikuisilla kasvaa jatkuvasti, nopeudella 1,5% vuodessa vuosina 1992 ja 2005 vuotiailla aikuisilla 20-49 [2]. Varhain alkava CRC (EOCRC) on aggressiivinen tauti huono erilaistumista ja on klassisesti sijaitsee vasemman paksusuolen. Yksilöt voidaan alttiita EOCRC kautta perinnöllisyys ja tulehduksellinen suolistosairaus. Kaikkein hyvin määritelty perinnöllinen muodot CRC ovat Lynch oireyhtymä ja familiaalinen adenomatoottisen polypoosin (FAP), joiden osuus 2-4% ja alle 1% kaikista CRC tapauksissa vastaavasti [3]. Suhteellinen osuus tulehduksellisten suolistosairauksien ja FAP on EOCRC on vaatimaton, koska molemmat ehdot voidaan helposti tunnistaa niiden kliinisiä piirteitä ja hallinnoi seulomalla ja ennalta estävä hoito vakiintuneiden ohjeiden. Sen sijaan, Lynch oireyhtymä ei näy tietyn fenotyypin ja johtaa usein karsinooma, jotka muodostavat kolmasosa EOCRC tapauksissa [4]. Näin ollen suurin osa EOCRC ovat satunnaisia ​​tapauksia, joissa ei ole geneettiset markkerit osoittavat taipumusta.

CRC on heterogeeninen sairaus, joka on klassisesti jaettu kolmeen osa-tyyppiä [5] mukaan molekyylitason mekanismeja ajo sen muunnos: ( i) Kromosominen epävakaus (CIN), tärkein tapa, joka on ominaista microsatellite vakaa kasvaimet (MSS), heterotsygotian menetys ja suurten kromosomi muutoksia kasvaimeen ja onkogeeneihin [9]; (Ii) Kun epigeneettisiä muutoksia kutsutaan CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP), joka aiheuttaa transkription hiljentämisen metyloimalla CpG-rikkaiden alueiden promoottori kasvaimeen synnyssä. CIMP vastaa valtaosa satunnaista MSI kasvainten hiljentäminen promoottorin MMR-geenin

hMLH1

[7], [8]; (Iii) mikrosatelliittien epävakaus (MSI), joka on tunnusomaista Lynch oireyhtymä ja on ominaista kertyminen kehyssiirtymän mutaatioiden microsatellite sekvenssit vuoksi puute mismatch korjaus (MMR) geenien [6]. Kuitenkin tämä nykyisin käytetty molekyyli luokittelu CRC perustuu vain muutamia yhteisiä DNA-markkereita.

Toistaiseksi molekyylitason markkereita satunnaista EOCRC ei ole perusteellisesti tutkittu ja niiden yksittäisiä kommentteja kohti syövän synnyn ei ole selvitetty. Genome mentymisprofiili (GEP) analyysi voisi parantaa molekyyli- luokittelu CRC ja auttavat tunnistamaan kliiniset yhteisöjä ja biomarkkerit, jotka voivat ennustaa hoitovaste. Olemme hiljattain käytetty tällaista lähestymistapaa tunnistaa kuusi molekyyli- alatyyppiä CRC että syntyä erillisiä biologisia reittejä [10].

tarkoitus Esillä oli tutkia satunnaista EOCRC käyttämällä yhdistäen tyhjentävä kliinis -pathological tietoja geneettisiä analyysejä, jotta voidaan määrittää erityiset kliiniset piirteet ja molekyyliprofiilien tätä kokonaisuutta. Tässä tutkimuksessa olemme ensimmäinen tunnistettu homogeeninen ryhmä satunnaista EOCRC joka määriteltiin joiden syöpä diagnoosi on alle 45-vuotiaita, joilla ei tunnistettuja perinnöllinen alttius CRC ja joilla on MSS profiilin. Me seuraavaksi verrataan tietyn geneettisen, epigeneettiset ja geenien ilmentyminen tietoja tästä ryhmästä kanssa muista hyvin määritellyt ryhmät CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Tämä tutkimus suunniteltiin tutkimaan satunnaisia ​​EOCRC tapauksissa ( MSS kasvaimen nuoriin verrattuna) ja verrata niitä vastapuolen MSS kasvainten vanhemmilla potilailla. Olemme myös CRC: MSI (molemmat nuoria ja vanhoja potilaita), koska ne muodostavat hyvin tunnettu malli CRC syövän synnyn.

Patient ja otoksen valinta

huhtikuusta 1999 joulukuussa 2005 954 potilasta hoidettiin ja seurattiin CRC meidän laitokselle. Potilaat alle 45-vuotiaiden (tästä lähin kutsutaan ”nuori” potilaat) ja yli 60 ( ”vanhat”) katsottiin vertailun. Hylkäämisperusteet olivat: poissa jäädytetty kudos; diagnoosi FAP tai IBD; preoperative Chemo /sädehoidon; Näytteet, joissa on vähemmän kuin 50% kasvainsoluja; ja tuntematon MMR tila. Johtuen suuri osa vaiheen IV MSS kasvaimia nuoriin verrattuna, MSS kasvaimia nuoret ja vanhat potilaat sovitettu mukaan kasvaimen vaiheesta. Sen jälkeen näyte valinta, 98 potilasta oli käytettävissä tutkimuksessa, kuten kuvassa 1. Neljä potilasryhmille määriteltiin: MSS-Y (MSS-kasvain 45 vuotta), 39 tapausta; MSI-Y (MSI kasvain 45 vuotta), 9 tapausta; MSS-O (MSS kasvain 60-vuotiaat), 36 tapausta; ja MSI-O-ryhmä (MSI kasvain 60-vuotiaat), 14 tapausta.

Consort joka kuvaa valintaa potilaiden yhden toimielimen, perusteella käytettävissä jäädytettyä kudosta ja levityksen jälkeen poissulkukriteereitä. Neljä ryhmää määriteltiin ottamalla huomioon ikä ja MMR tila. Tutkimuksen tarkoituksena oli mahdollistaa vertailun MSS varhain alkanut CRC muiden hyvin määritelty ryhmien CRC. FAP: Familiaalisen adenomatoottisen polypoosin. IBD: tulehduksellinen suolistosairaus. MMR tila: Mismatch korjaus tila. MSS: microsatellite vakaa. MSI: Mikrosatelliittimarkkerien epävakaa.

eettisen komitean hyväksyntä

Kaikki potilaat prospektiivisesti rekisteröity keskeinen suojattuun tietokantaan ilmoitettu komissiolle Nationale Informatique et Liberté (1365952). Käyttö kerättyjen kasvainten hyväksyi Toulouse Hospital lauta (CRB-Cancer Toulouse, DC-2008-463, AC-2008-820, CPP2). Kirjallinen suostumus saatiin kaikissa aineissa.

Opintoja parametrit

Seitsemänkymmentäyhdeksän muuttujat kohteisiin poimittiin tietokannasta ja analysoitu. Näihin sisältyvät kliiniset tiedot (familiaalinen sukupuu, syöpämuodon, kliininen esitys diagnoosi, hoitomuotojen, selviytyminen) ja kasvainten ominaisuuksiin (täydellinen patologinen data, läsnäolo synkroninen adenooma vuonna resektoitua näytteen MMR tila, läsnäolo geneettiset ja epigeneettiset muutokset). Kliininen seuranta potilaista suoritettiin julkaistujen kansallisten ohjeiden [11]. Survival käyrät laadittiin alkaen diagnoosin mukaan Kaplan-Meier laskelmat. Tiedot tutkitaan muuttujien on esitetty taulukossa S1.

MMR tila ja familiaalinen sukupuu

MMR tila määritettiin diagnoosi (ennen tutkimusta) arvioimalla mikrosatelliittien epävakaus asema käyttämällä pentaplex PCR ja käyttäen immunohistokemia (IHC) testaamiseksi ilmentymisen MLH1, MSH2 ja MSH6, kuten aikaisemmin on kuvattu [12]. Mismatch korjaus puutteet (dMMR kasvaimet) määriteltiin MSI ja /tai menetystä ilmentymisen yksi MMR proteiineista, kun taas taitava MMR (pMMR) kasvaimia vastasi MSI-alhainen tai MSS ilmentävien kasvainten MMR proteiineja.

sukutaulu kaikkien nuorten potilaiden arvioitiin yhdellä perinnöllisyyslääkärin (RG). Geneettinen testaus 2 suurten MMR geenien

hMLH1

ja

hMSH2

suoritettiin tapauksessa MSI kasvainten tai henkilökohtaisia ​​tai perheen syöpä historiassa oli läsnä nuorilla potilailla. Diagnoosi Lynch oireyhtymä virallisesti vahvistanut tunnistaminen haitallinen ituradan mutaation MMR-geenin. Tapauksia MSI kasvainten näyttämällä puuttuminen MSH2 tai MSH6 värjäyksen IHC pidettiin todennäköisenä Lynch oireyhtymä.

Mutaatioanalyysi

genotyypin keskeisten mutaatioita esiintyy kolorektaalisyövässä (

KRAS

,

BRAF

,

TP53

ja

PI3KCA

) suoritettiin seuraavat DNA uutetaan jäädytetty kudoksesta. Seitsemän yleisin Kodoneissa 12 ja 13

KRAS

, ja kodonin V600E mutaatio

BRAF

arvioitiin alleeliset hybridisaatiolla käyttäen Taqman, kuten aiemmin on kuvattu [13]. Suora sekvensointi

TP53

eksonit 5-9 ja

PI3KCA

eksonit 9 ja 20 suoritettiin rinnakkain käyttäen Sangerin menetelmää (Beckman Coulter, Danvers, MA, USA).

Methylator fenotyyppi arviointi

CIMP profiilit määritettiin käyttämällä paneelissa viiden markkereita, kuten on kuvattu WEISENBERGER

et al

:

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

ja

SOCS1

. Sen jälkeen, kun DNA bisulfiittikäsittelyn, kaksi multiplex metylaatiospesifinen PCR: t suoritettiin. Fragmentti analyysi suoritettiin kapillaarielektroforeettisesti automaattiseen sekvensseri (Beckman Coulter, Danvers, MA, USA). Methylator fenotyyppi-positiivisten tapausten (CIMP +) oli 3 tai enemmän metyloidut promoottoreita taas CIMP-negatiivisia oli alle 2 metyloitu promoottorit, määritellään jo vahvistettujen perusteiden mukaisesti [14].

RNA ja mikrosiruanalyysillä

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja tarkistetaan puhtauden, eheys ja määrä. Sitten näytteet monistettiin, merkitty ja hybridisoitiin koskevasta Affymetrix Human Genome U133 Plus2 GeneChip-, seuraten valmistajan yhden syklin tavoite merkintöjä protokolla (Affymetrix, Santa Clara, CA). Hake skannattiin kanssa Affymetrix GeneChip- Scanner 3000 ja raaka intensiteetit uutettiin myöhemmin kuvien GCOS 1.4 ohjelmistoa (Affymetrix). Data normalisoitiin käyttäen Robust Multiarray Keskiarvon (RMA) menetelmällä, toteutetaan R pakkauksessa affy [15]. Tiedot ovat saatavilla NCBI Gene Expression Omnibus arkistoon (hakunumero: GSE39084).

valvomaton analyysi

Class löytö tehtiin yksimielisesti klusterointi ilmaisun profiileja, kuten aiemmin on kuvattu [16]. Probe sarjaa ensin suodatetaan pitää näitä ilmaistaan ​​(ts normalisoitu intensiteetti arvo yli 15) vähintään 10% näytteistä, joiden varianssi merkittävästi suurempi kuin mediaani varianssi kaikkien koetinsarjojen (p 0,01). Sitten, 7 luetellaan saatiin jotka sisälsivät 1%: sta 50% kaikkein variantin koetinsarjojen (perustuu vankka variaatiokerroin). Kullekin koetin asetetaan listan, näytteet ryhmittyivät käyttäen 1-Pearsonin korrelaatio etäisyyden metrinen ja Ward sidos, jolloin saadaan 7 dendrogrammissa. Väliseinät in k klustereita (k 2-8) olivat peräisin kustakin dendrogrammissa yksimielisyys osio laskettiin kullekin k: n arvolla, jolloin saatiin 7 konsensus osioita.

Ohjattu analyysi

Associations välillä kliinisen ja molekyylien merkinnät ja näytteen ryhmät testattiin tilastollista merkittävyyttä käyttäen Chi-Square-testin tai Fisherin tarkkaa testiä tarvittaessa. Geenit ilmentyvät eri välillä kasvaimia nuorten ja vanhojen MSS potilasta valittiin perustuen Limma moderoitu t-testi p-arvot säädetty useille testausta Benjamini Hochberg menetelmä ( 0,05) [17]. Väylät päässä BioCarta tietokannasta testattiin rikastamista vapautettu geenien yhdistämällä seuraavista tavoista: Globaltest (R paketti globaltest), SAM-GS, ja Tuckey [18], [19]. P-arvot kunkin menetelmän muunnettiin joukkoon ja keskimääräinen sijoitus laskettiin tilauksesta polkuja.

Beta kateniinin signalointireitin aktivaatio

Immunohistokemia suoritettiin formaliinilla kiinnitettyä ja parafiiniin upotettuja lohkot alkaen 98 potilasta tutkimuksen hiirellä monoklonaalinen vasta beta kateniinin (klooni 14, BD Biosciences, laimennus 1/200, Ventana XT Autostaineriin (Tucson, AZ, USA). Kaikki objektilasit tarkistettiin kahdella patologit sokeaksi potilasryhmien ( JS ja SK). aktivointi beta kateniinin signalointireitille määriteltiin vahva tumavärjäystä yli 50% kasvainsolujen kanssa tai ilman diffuusia sytoplasman värjäytymistä ja menetyksen kanssa solukalvon värjäytymisen [20].

tulokset

kliinis-patologinen ominaisuudet satunnaista EOCRC

satunnaista EOCRC ryhmä koostui 39 potilasta, jakautuvat seuraavasti: 17 oli 40-45 vuotta vanhoja, 13 oli 35-40 vuotta, 5 olivat 30-35 vuotta, 2 oli 25-30 vuotta ja 2 oli alle 25-vuotiaita. Tällainen jakauma ikä vastaa tietojen julkaistu Yhdysvaltojen rekisteriin [1]. Verrattuna kasvaimia MSS vanhojen potilaiden, satunnaista EOCRC (MSS nuoret potilaat) näytetään erottavia piirteitä. Peräsuolen kasvaimet olivat runsaampia satunnaista EOCRC (41% vs. 8,3%, p = 7,4

e-04) harvemmin adenoomia nähty resektoitiin yksilöt (8% vs. 33%, p = 0,013). Erityisesti 15 (38%) satunnaisista EOCRC potilaalla oli suvussa (ensimmäisen tai toisen asteen sukulainen) CRC verrattuna 3 (9%) ryhmässä MSS vanhojen potilaiden (p = 0,013). Sukutaulu analyysi näistä 15 potilasta osoitti, että 3 heistä oli selkeä autosomaalinen dominantti siirto perintönä kuvion useita perheenjäseniä vaikuttaa. Kaksi 3 olivat samasta perheestä mutta ituradan mutaatio on tunnistettu tähän mennessä. Loput 12 potilaista oli määrittelemättömän lähetystavasta vain yhden jäsenen nousussa perhe ottaa CRC, yleensä korkeassa iässä ( 60-vuotiaat). Mukaisesti Ranskan suositusten,

MUTYH

mutaation analyysi tehtiin vain 1 potilaalla, joilla oli 8 adenooma, mutta tämä analyysi oli negatiivinen [21]. Henkilökohtainen historia CRC havaittiin vain vanhojen potilaiden (mukaan lukien sekä MSS ja MSI kasvaimet). Kaikki kasvaimet MSI nuorille potilaille syntyi yhteydessä Lynch oireyhtymä, ja 3 potilasta (21,5%) päässä MSI vuotiaiden ryhmässä myös Lynch potilaita. Kun otetaan huomioon koko tutkimuspopulaatiossa, toinen merkittäviä eroja havaittu ryhmien välillä olivat sidoksissa MMR puute, nimittäin useammin proksimaalisen sijainti (p = 2,0

e-05), huono solujen erilaistumiseen (p = 0,033) ja usein mucinous komponentti ( p = 0,012). Tärkeimmät ominaisuudet tutkittua populaatiota on esitetty taulukossa 1.

Sporadic EOCRC on aggressiivinen tauti usein, joilla oli etäpesäkkeitä diagnoosi. Sijainti etäispesäkekasval- oli pääasiassa maksassa ja keuhkoissa, kuten havaittiin CRC. Erityinen eloonjääminen profiilin havaittiin kullekin ryhmälle potilaita, joilla eloonjäämiseen parempi MSI kuin MSS potilailla. Huolimatta huomattavan taakan etäpesäkkeiden (23,1% vs. 5,6%, jossa on useita metastaasien diagnoosin), satunnaiset EOCRC potilailla oli parempi 5 vuoden eloonjäämisaste kuin MSS vanhoja potilaita, vaikka tämä ei ollut merkittävä (69% vs. 42%, p = 0,09). Viisivuotinen kokonaiselinaikaan oli suunnilleen sama MSI potilaille, vaikka MSI nuoret potilaat kokivat useammin varhain toistumisen (kuva 2).

Jokainen ryhmä oli erityinen eloonjäämiseen profiili vaikka yksikään ei ollut merkittävästi erilainen toisistaan (p = 0,15). MSS: microsatellite vakaa. MSI: Mikrosatelliittimarkkerien epävakaa.

geneettiset ja epigeneettiset ominaisuudet satunnaista EOCRC

Mutaatiotutkimukset profiilit

KRAS

,

BRAF

ja

TP53

ja CIMP asema vahvistettiin kaikille potilaille (taulukko 2).

PI3KCA

genotyypitys suoritettiin 74 kasvaimia. Mutaatioiden profiilia satunnaista EOCRC kasvainten oli samanlainen kuin MSS kasvainten vanhoista potilaiden

KRAS

,

TP53

ja

PIK3CA

geenejä, mutta oli selvästi erilainen

BRAF

mutaatioita ja CIMP profiileja. Yksittäisiä EOCRC kasvaimia ei sisälsi

BRAF

mutaatioita (p = 0,022) eikä muotoutuneet CIMP + profiilin (p = 0,005) verrattuna kasvainten MSS vanhojen potilaiden. MSI kasvainten vanhassa potilailla oli korkea

BRAF

mutaatio (36%) ja usein muotoutuneet CIMP + profiilin (62%). MSI nuorten potilaiden poikkesi MSI vanhojen potilaiden puuttuminen methylator fenotyypin (p = 0,006) ja

BRAF

mutaatioita.

transcriptome analyysi

Microarray tiedot olivat saatu 70 potilasta. Valvomatta analyysit paljastivat, että riippumatta klusterien lukumäärä ja prosenttiosuus variantin geenejä käytetään, olevat osiot johdonmukaisesti ja liittyy vahvasti MMR asemaan ja ryhmiä. Muut muuttujat merkitsevästi liittyvä ilman valvontaa osiot olivat kasvaimen sijainti, CIMP tila ja mutatoitunut BRAF. Nämä muuttujat olivat itse tiiviisti MMR tila. Ikä oli hieman liittynyt joitakin ilman valvontaa osioita (saatu käyttämällä 5% ja 20% kaikkein vaihtelevia geenejä). Konsensus osion 5 rypäleitä läheisimmin liittyy neljä ryhmää määritellään MMR asema ja ikä (kuva 3). Ryhmä 1 (C1) oli lähes yksinomaan koostuu puutteellinen MMR kasvaimia. Cluster C2 rikastettiin asiantunteva MMR ja BRAF-mutatoitunut kasvaimia. Klusterit C3 ja C4 sisälsivät enemmän CIMP +, C4 on lähes yksinomaan koostuu taitava MMR kasvainten vanhoista potilaista. Cluster 5 (C5) rikastui satunnaista EOCRC kasvaimia löytyy vasemman paksusuolessa.

valvomaton luokittelu ilmaisun profiileja: dendrogrammissa lähimpänä klustereiden että konsensus osio k = 5. Legend: io, MSI /Vanha ; iy, MSI /Young; niin, MSS /Vanha; sy, MSS /Young; d, puutteellinen MMR; p, taitavia MMR; R, oikea paksusuoli; L, vasen paksusuolen; Re, peräsuoli; M, mutatoitunut; W, villityypin.

seuraavaksi suoritettu valvottu analyysi MSS kasvain (n = 54), joka toimittanut luettelon 297 koetinsarjojen osuus 219 syrjivä geenit (p 0,001). Tämä setti tarjotaan selvä ero satunnaista EOCRC kasvaimet ja kasvaimet vanhoista MSS potilaista (kuva 4). Laaja kuvaus näistä geeneistä on esitetty taulukossa S2. Ainoa avain CRC oncogenesis geeni, joka oli erittäin vapautettiin satunnaista EOCRC oli beeta kateniinin (

CTNNB1

). Suuri määrä syrjiviä geenejä pystyimme suorittamaan polku analyyseja ymmärtää paremmin satunnaista EOCRC syövän synnyn. Neljäkymmentäyhdeksän reittejä merkittävästi rikastettiin ero geeniekspression satunnaista EOCRC verrattuna MSS kasvaimia vanhoista potilaista. Täydellinen kuvaus niistä on esitetty taulukossa S3. Niistä 20 oli mukana solusignalointia, 10 tulehduksessa ja apoptoosin, 7 tarttuvuus ja /tai motiliteetti, 7 kehitysbiologian ja 3 soluproliferaatioon (kuva 5). Useita reittejä, jotka olivat säädellään ylöspäin satunnaista EOCRC liittyivät suurten signalointireittien mukana CRC kuten MAP-kinaasin ja PI3KCA /AKT tai liittyvät kasvutekijät (EGF, HGFR- ja PDGF) ja angiogeneesiä (VEGF). Kaksi suurta reittejä mukana tarttuvuus ja /tai motiliteetti asetuksen (integriini signalointipolkujen ja solu-soluadheesion signalointi) olivat säädellään ylöspäin satunnaista EOCRC. Mielenkiintoista, useimmat polkuja liittyvät tulehdukseen ja /tai apoptoosin, jotka löydettiin jopa säännelty satunnaista EOCRC suoraan tai epäsuorasti liittyvät TNF-R1-reitin (TNFR1 koulutusjakson, HIV-1Nef, FAS signalointireitistä, TNF /Stress Related signalointi) .

lämpöä kartta osoittaa ilmentymisen 219 geenejä. Perustuen ekspressiotasoja, geenit ryhmiteltiin neljään ryhmään erittäin yli-ilmentynyt geenien (punaiset laatikot ympäröi musta reunus) ja yksi klusterin ali-ilmentynyt geenien MSS kasvaimet (siniset laatikot ympäröi musta reunus) nuorista potilaista verrattuna MSS kasvainten iäkkäät potilaat. MSS: microsatellite Stable. MSI: Mikrosatelliittimarkkerien Epävakaus.

Pathway analyysi ryhmittelyyn 49 merkittävimmin rikastettu väyliä ero geenien ilmentymisen välillä satunnaista EOCRC ja MSS kasvaimia vanhoista potilaista. Väylät ryhmiteltiin viiteen luokkaan, eli soluadheesiota /motiliteettia, tulehdus /apoptoosin, solujen proliferaatiota ja signalointi ja kehitysbiologian. Jakauma tärkeimmistä kanoninen polkuja keskuudessa luokat yksityiskohtaisesti sekä niiden paremmuusjärjestykseen. Tämä sijoitus tilaus on merkitty # symboli ja sen jälkeen rivin numero (# 1 tarkoittaa, että tämä reitti on vapaimpiin joukossa 49 polkuja).

Beta kateniinin immunohistokemia

microarray data yllä tunnistettu beta kateniinia olevan ainoa avain CRC oncogenesis geeni vapaimpiin satunnaista EOCRC. Siksi tavoitteena oli arvioida beta kateniinia aktivoinnin avulla immunohistokemiallisesti. Kaikki tapaukset MSS kasvainten nuoriin verrattuna (39 tapausta) ja 33 tapausta (33/36) MSS kasvainten vanhoista potilasta validoitu beta kateniinia aktivoinnin avulla immunohistokemiallisesti. Beta kateniinin aktivaatio havaittiin 17 tapauksessa (44%) peräisin MSS-nuorten potilaiden ja 5 tapauksessa (15%) peräisin MSS vanhoja potilaita (p = 0,01), jossa on ydin- +/- sytoplasmista värjäytymistä (kuva 6).

. Poikkileikkaus kasvaimen MSS-vuotiaalla potilaalla näkyy vain solukalvojen värjäytymistä. B. poikkileikkaus kasvaimen satunnaista EOCRC (MSS-Young) potilas osoittaa vahvaa sytoplasmista ja tumavärjäystä menetyksen kanssa solukalvojen värjäytymistä, mikä Wnt /beta kateniinia aktivointi.

Keskustelu

tulokset tämän tutkimuksen mukaan satunnaista EOCRC on selvä kliininen ja molekyylitason kokonaisuus. Ensimmäistä kertaa tarjoamme integroidun analyysin sekä laaja kliininen data ja genomiikan peräisin huolellisesti seulotaan peräkkäisten potilasta, joita oli hoidettu ja seurataan yhdellä laitos. Tämä translaationäkökulmasta on antanut meille mahdollisuuden tarkentaa aiemmin rajattu kuvaus tästä erityinen muoto CRC ja karistanut käsityksen sen erityinen tuumoribiologiassa.

Tällä hetkellä ei ole olemassa hyväksyttyjä selkeää määritelmää varhain puhkeamisiälle alalla CRC. Siksi useimmat tutkimukset raportoi tästä aiheesta kuuluvat potilaat 40-50-vuotiailla välillä [22], [23]. On kuitenkin asteittain nousu taajuus CRC välillä 40 ja 50 vuotta iän, joten on todennäköistä, että näissä tutkimuksissa on sekoitus tietyn EOCRC yksikön ja viivästyneen CRC. Tämän kysymyksen käytimme että käsitteen sekä aikaisen ja myöhäisen puhkeamisen CRC: potilaiden välillä 45 ja 60-vuotiaita jätettiin jotta varmistetaan selkeä osio kahden yksikön ja välttää päällekkäisyyttä näitä kahta CRC. Toinen hämmentävä tekijä analysoitaessa EOCRC monissa tutkimuksissa on puute ero perinnöllinen muotojen CRC, erityisesti Lynch oireyhtymä, ja todellinen satunnaista muodossa CRC. Kuitenkin, Lynch oireyhtymä itse osuus kolmasosa EOCRC tapauksissa [24]. Siksi tässä tutkimuksessa täydellinen sukupuu perustettiin kliininen geneetikko kaikille nuorille potilaille. Lynch oireyhtymä tapauksessa havaittiin käyttämällä vankka kriteerit ja oli selvästi erotettu satunnaista EOCRC. Tästä huolimatta tässä tutkimuksessa satunnaista EOCRC potilailla oli korkea suvussa (38%). Vähemmistö heistä esitetään autosomaalinen hallitseva lähetyksen perintö (8%), joka todennäköisesti vastaa perinnöllinen sairaus, johon geeni herkkyys ei ole vielä tunnistettu (X-oireyhtymä). Toisaalta, se tunnustetaan yhä, että muutamia pieniä alttius loci voisi olla vastuussa monimutkainen muoto CRC perinnöllisyyden [25]. Siksi tällainen geneettinen taipumus voisi myös olla mukana joillakin potilailla EOCRC. Tätä hypoteesia tukee alhainen synkronisen adenooma havaitsimme satunnaista EOCRC potilailla, jotka voivat heijastaa nopeutetun syövän synnyn toissijainen altistavia tekijöitä.

Jo pitkään on tunnustettu, että morfologinen erityispiirteet EOCRC ovat köyhiä solujen erilaistumiseen, kolloidi komponentti ja lymfaattinen strooman reaktio [22], [26] – [29]. Nämäkin tiedot todennäköisesti sekoitti sisällyttämällä Lynch oireyhtymä potilailla, jotka tyypillisesti liittyvät näihin histologisia ominaisuuksia. Vuonna vain kaksi tutkimukset, jotka ovat nimenomaan analysoitu MSS-nuorten potilaiden (toisessa 24 ja toisessa 55 tapausta), ei ollut yhdistyksen välillä mucinous histologia, huono erilaistuminen, kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä ja varhain alkanut taudin [30], [ ,,,0],31]. Tutkimuksemme on vahvistanut nämä tiedot ja me lisäksi osoittaa, että huono solujen erilaistumista ja mucinous komponentti selkeästi liittyy MSI asemaan riippumatta potilaan iästä. Sitä vastoin emme noudata yhdistyksen välillä imusuonten invaasio, hermoa invaasio tai sinettisormus solu logian satunnaista EOCRC, kuten kerrottiin kahdessa edellisessä edellä mainittujen tutkimusten (tuloksia ei ole esitetty) [30], [31].

From kliininen kannalta, tuloksemme samaa mieltä kliininen kuvaus satunnaista EOCRC äskettäin julkaisemassa Chang et al .: Sporadic EOCRCs läsnä kasvaimista distaalinen sijainti ja usein etäpesäkkeitä [30]. Esillä olevassa tutkimuksessa silmiinpistävän korkea synkronoitu metastaattisen taudin EOCRC ryhmässä (41%) johti meidät vastaamaan MSS vanhoja potilaita kasvaimen vaiheesta, jotta ei bias geeniekspression vertailuja. Vaikka ei ole tilastollisesti merkitsevä, nuorille potilaille yleensä on parempi eloonjäämisasteesta mukaan taudin vaiheesta verrattuna vanhemmilla potilailla. Tietenkin, nuoremmat potilaat ovat todennäköisesti tehdään aggressiivisempia hoitoa, kuten kemoterapiaa tai toistuva kirurginen resektio metastaattista sairautta, joka voi parantaa huonompi ennuste annetaan EOCRC. Vaikka osittain ristiriitaisia ​​isompien tutkimuksia, joista osa oli Kokonaisanalyysit perustuu rekistereitä, esillä oleva työ antaa luotettavia tuloksia samoista edellä mainituista syistä [32] – [35]. Kaiken satunnaista EOCRC esittelee aggressiivinen tauti, jossa distaalinen sijainti, korkea kasvain vaiheessa eikä selvää histologisia erityisyyttä.

Tämä tutkimus on ensimmäinen, joka antaa yleiskuvan taajuuden standardin paneelin geenimutaatioita samoin kuten epigeneettiset muutokset nimenomaan satunnaista EOCRC. Perustettu peräsuolen syövän synnyn luokituksia, yhdistämällä KRAS ja BRAF mutaatioiden kanssa CIMP ja MSI asema antavat mahdollisuuden selvittää kolmesta viiteen erillistä molekyylien alaryhmiä CRC [36], [37]. Esimerkiksi KRAS ja P53 mutaatioita klassisesti liittyy CIN-kolorektaalisyövissä taas BRAF mutaatiot liittyvät vahvasti satunnaista muotoihin CIMP + /MSI + CRC. Muutama tutkimukset ovat tutkineet mutaationopeudet satunnaisissa EOCRC tapauksissa ja osoittaneet, että 0-8%: lla on

BRAF

mutaatioita, 0-4%

PIK3CA

mutaatioita, 6-78%

KRAS

mutaatioita, ja 64%

TP53

mutaatioita [30], [31], [37] – [40]. Olemme tunnistaneet korko

KRAS

ja

TP53

mutaatioita (vastaavasti 37% ja 44%) kuin samankaltainen kuin CIN kasvaimia, mutta puuttuminen

BRAF

mutaatioita ja ole todisteita methylator fenotyypin [41]. Erot tiedoilla kirjallisuutta mutaatio hinnat EOCRC saattaa liittyä puuttuminen selvä ero MSS ja MSI kasvainten aikaisemmista tutkimuksista, jotka ovat voineet vaikuttaa mutaationopeudet, etenkin

KRAS

ja

BRAF

[39], [40]. Kaiken kaikkiaan meidän geneettinen tutkimus suosii oletusta, että satunnaista EOCRC on alaryhmä CIN kasvainten ole

BRAF

mutaatio eikä methylator fenotyypin.

klustereiden saatu valvomatta analyysit osoittivat, että erot geenien ekspressioprofiileja (GEP) oli määräytyy pääasiassa MMR asema ja vähemmässä määrin CIMP asema, kun taas ikä oli vain vähän vaikutusta. Nämä tulokset ovat aiemmin osoittaneet tutkimukset osoittavat, että MSI ja MSS kasvaimet ovat ero ekspressioprofiileja, mikä vahvistaa esillä olevat tulokset [42]. Vaikka GEPs oli erittäin merkittävä ohjattuun analyyseissä rajoitettu MSS kasvaimia, jotka osoittavat joukon 219 geenejä erottaa nuoret vanhoista potilaiden tulokset ilmaisun paneelit on harkittava varoen, koska geenin luettelot eivät usein toistettava. Sen sijaan polku analyysit ovat osoittautuneet toistettavissa, ja tuo biologinen merkitys geeniekspression paneelit [43]. Lukuisat reittejä klassisesti mukana CRC oncogenesis olivat säädellään ylöspäin satunnaista EOCRC, kuten MAP-Kinase, mTOR ja VEGF /angiogeneesiä, mutta polkuja liittyvät kasvutekijän signalointi ovat myös mukana (EGF, HGF-reseptori ja PDGF). Havaitsimme myös

CTNNB1

kuin yksi yli-ilmentynyt geenien MSS-nuorilla potilailla verrattuna MSS vanha potilaiden ja käytetään immunohistokemia osoittaa, että tämä johtaa yli-aktivointi beta kateniinin satunnaista EOCRC.