Krooninen sairaus

tiivistelmä

Glioblastoma (GBM) on yleisin ensisijainen aivokasvain, noin 40% kaikista keskushermoston syöpäsairauksia. Huolimatta tavallinen hoito koostuu kirurginen resektio, sädehoito ja /tai kemoterapia, ennuste GBM on huono; mediaani selviytymisen 14,6 kuukautta. Syöpä kantasolujen tai syöpä-aloittavat solun malli on tarjonnut uuden paradigman ymmärtämiseksi kehityksen ja uusiutumisen GBM hoidon jälkeen. Berbamine (BBM) on luonnollinen yhdiste johdettu

berberis amurensis

kasvi, ja yhdessä sen johdannaiset, on osoitettu olevan kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta useissa syövissä. Täällä raportoitu, että uusi synteettinen berbamine johdannainen, BBMD3, inhiboi solujen elinkelpoisuus ja indusoi apoptoosia syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja (CSCS) on ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla, kun CSCS neljästä GBM potilailla (PBT003, PBT008, PBT022 ja PBT030) viljeltiin. Nämä CSCS kasvoi neuropallojen ja ilmaisi CD133 ja nestiinifenotyypin merkkiaineina. Hoidon BBMD3 tuhosi neuropallon morfologia, ja johti apoptoosin induktion että CSCS. Apoptoosin induktio näissä CSCS riippuu kaspaasi-3 ja lohkaisu poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP). MicroRNA-4284 (miR-4284), osoitettiin olevan yli-ilmentynyt noin 4-kertaiseksi CSCS seuraavat BBMD3 hoitoon. Lisäksi transfektio synteettistä antisense-oligonukleotidi ihmisen miR-4284 osittain esti syöpää ehkäisevistä vaikutuksista BBMD3 on GBM johdettu CSCS. BBMD3 myös lisääntynyt fosforylaation c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK) /stressi-aktivoidun proteiinikinaasin (SAPK), mikä nostaa ilmaisun fosforyloidun c-Jun ja yhteensä c-Fos; pääkomponentit transkriptiotekijän AP-1. JNK-c-Jun /AP-1-signalointireitin on tärkeä rooli apoptoosin vasteena UV-säteilyä, ja joitakin lääkehoitoja. Targeting glioblastooma kantasolujen kaltaisia ​​soluja BBMD3 on siis uusi, ja se voi olla lupaus tehokas terapeuttinen strategia hoitamiseksi GBM potilaita.

Citation: Yang F, Nam S, Brown CE, Zhao R, Starr R, Horne DA, et ai. (2014) romaani berbamine Johdannaissopimukset Estää elinkykyyn ja indusoi apoptoosia Cancer Stem-Like ihmis- Glioblastoma kautta Up-asetus miRNA-4284 ja JNK /AP-1 Signaling. PLoS ONE 9 (4): e94443. doi: 10,1371 /journal.pone.0094443

Toimittaja: Jeffrey K. Harrison, University of Florida, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 marraskuu 2013; Hyväksytty 17. maaliskuuta 2014; Julkaistu: 14 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitusta tutkimuksessa on jonkin avustusta National Institutes of Health /National Cancer Institute # CA-1155674 RJ ja käynnistysvaiheen rahoitusta RH päässä Beckman Research Institute. Tutkimus raportoitu tässä julkaisussa mukana suoritetut työt Translational biomerkkiaineiden Discovery Core, joka tukee osittain National Cancer Institute of National Institutes of Health alle palkinnon numero P30CA33572. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

glioblastoma (GBM) on yleisin ja tappava primäärisen aivokasvaimen. Huolimatta uudet edistysaskeleet multimodaalisuutta hoitoon, johon kuuluu leikkaus, sädehoito ja kemoterapia, ennuste on edelleen erittäin huono potilaille, joilla on tyypillisesti keskimääräinen eloonjäämisaika alle 15 kuukautta [1], [2]. Suurin osa GBM vaurioiden nopeasti kehittyä vähemmän pahanlaatuisen esiasteleesio jolle on vain vähän tai ei lainkaan kliinisiä, säteilyyn tai morfologisia todisteita, ja se on osoitettu, että erittäin tuumorigeenistä alapopulaation syöpäsolujen, nimeltään GBM kantasoluja, edistää vastustuskykyä kemo- ja sädehoidon [3] – [5]. Nämä syövän kantasoluja tai kasvaimeen aloittamista solujen jakaa joitakin kriittisiä ominaisuuksia, joilla on normaali hermo kantasoluja, kuten ilmaus useiden biomarkkereiden, ja kyky itseuudistumisen, erilaistumista ja lisääntymistä. Huonon ennusteen GBM potilaista hetkellä käytettävissä olevat hoidot, kehitettäessä toimivia protokollia hoitoon GBM tarvitaan kiireesti. Kuitenkin edetä hidastuu protokollan kehittäminen on edelleen riippuvainen edistämisestä ymmärrystämme prosessien ajo syövän invaasio, puhkeamista vastustuskykyä hoitotoimenpiteiden ja mekanismit ajo kasvaimen uusiutumisen GBM potilailla. Näin ollen tehokas hoito GBM edellyttää suoraan kohdentamalla GBM kantasoluja tuumorimassan sisällä, sillä ne ovat soluja, jotka ovat resistenttejä vakiona hoitojen [6]. Tältä osin Brown et al [7] äskettäin tarjonnut perusteet kehittää immunoterapeuttista lähestymistapa hävittämiseksi GBM kantasolu väestö raportoimalla että ihmisen kasvain kantasolujen /aloittamista solujen GBM potilaat voivat tunnistaa ja tappoi CD8

+ sytotoksisten T-lymfosyytit.

tämän lisäksi immunologisia lähestymistapaa, microRNA (miRNA), joka on suhteellisen uusi luokka pienten ei-koodaavan RNA-molekyylin eukaryoottisissa soluissa, on osoitettu säätelevän monenlaisia ​​geeniekspression kuviot kautta transkription jälkeinen mekanismi [8]. Ja huomattava määrä todisteita osoittaa nyt, että miRNA avainasemassa patogeneesissä syövän, ja ne voivat toimia joko onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla [9]. On myös raportoitu, että korkea ilmentyminen miR-196 ja miR10b GBM potilailla korreloi huonoon ennusteeseen [10], ja että alas-säätely miR-128 johtaa vähenemiseen itseuudistumisen kyky gliooma kantasolujen estämällä Bmi1 geenin ilmentymistä. Siten miRNA nopeasti kehittymässä lupaavia kohteita varten kehittää uusia, mutta erittäin selektiivisiä syövän vastaisten terapeuttisten aineiden kanssa.

Useita vuosia sitten, berbamine (BBM), luonnon bis-benzylisoquinoline alkaloidi, identifioitiin perinteisen kiinalaisen lääketieteen

Berberis amurensis

, ja sekä useita sen johdannaisten, oli esitetty vaikuttavan kasvainten vastainen aktiivisuus lymfooma, myelooma, maksasyövän, keuhkosyövän ja rintasyövän sekä alhainen epäspesifinen myrkyllisyys [12] – [16] . BBM oli raportoitu indusoivan apoptoosia ihmisen myelooman, ja tukahduttaa kasvun, muuttoliike ja hyökkäys korkeasti etäpesäkkeitä ihmisen rinta- syöpäsolujen estämällä NF-kappaB (NF-KB) aktiivisuuden ja sen loppupään tavoitteita, kuten sykliini D1, Bcl-x L ja surviviini [13], [14]. Näin alhainen epäspesifinen myrkyllisyys BBM, ja eräät sen johdannaiset, tekee jatkuvaa kehittämistä näiden uusien yhdisteiden mahdollisesti lupaavien yhtä tehokkaita syöpälääkkeitä erilaisia ​​syöpätyyppejä. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi, meidän lab tutki kolmetoista novel BBM johdannaiset (BBMDs), joka syntetisoitiin luonnon BBM. Olemme havainneet, että BBMD3 on voimakkain tämän sarjan uusia BBMDs syöpäsolujen tappamiseksi. BBMD3 esillä yli 6-kertainen syövänvastainen aktiivisuus melanoomaa ja eturauhasen syöpäsolujen verrattuna luonnon BBM. Tämä johtui inhibitio JAK2 /STAT3 signalointireitin [17]. Viime aikoina olemme myös raportoitu, että BBMD3 estää solujen elinkelpoisuuden, ja indusoi apoptoosia ihmisen osteosarkooma-soluja, jotka, tässä tapauksessa, johtui aktivointi JNK /AP-1-signalointireitin [18].

superperheen on mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasien (MAPK: t) sisältää: c-Jun N-terminaalinen proteiinikinaasi (JNK) /stressi-aktivoidun proteiinikinaasin (SAPK); p38; ja ekstrasellulaarisen signaali säädelty kinaasi (ERK). Yleisesti, JNK ja p38 ovat keskeisiä välittäjiä vastaus stressiä ja tulehdusta, kun taas ERK kaskadi on useimmiten indusoituu vasteena kasvutekijän stimulaatio [19], [20]. JNK stressi polku mukana useissa eri solunsisäisiin prosesseihin, kuten solun kasvussa, erilaistumiseen, transformaatio ja apoptoosin [21], [22]. JNK proteiinikinaasit koodaavat kolme geeniä, joista

jnk1

ja

JNK2

ilmaistaan ​​kaikissa kudoksissa, ja

JNK3

geeni rajoittuu suppeampi malli ilmaisun kuten aivot ja sydän [22]. JNK tunnistettiin alun perin sen kyvystä spesifisesti fosforyloida transkriptiotekijä c-Jun sen N-terminaalisen trans-aktivoitumisen domeeni Ser63 ja Ser73 [23]. c-Jun on tärkeä osa aktivoiva proteiini-1 (AP-1), joka on dimeerinen transkriptiotekijä, ja se koostuu proteiineista useista geeniperheiden [24]. Vaikka JNK /c-Jun tai JNK /AP-1-reitin on kaksi rooleja apoptoosin, on selvää, että aktivointi JNK-reitin on mukana apoptoosin erityisiä solukuolema ärsykkeet, kuten UV-säteilytys ja hoidon tiettyjen lääkkeet [25] – [27].

meidän esillä olevassa tutkimuksessa osoitamme, että uusi synteettinen BBM johdannainen (BBMD3) indusoi apoptoosia syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja, jotka ovat viljeltiin GBM potilaista. Samalla osoitetaan, että solujen tappaminen liittyy säätely ylöspäin miRNA-4284 ja JNK /AP-1 signalointireitin.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja vasta-

BBMD3 syntetisoitiin saattamalla luonnollinen BBM NH

2 sisältäviä substituentilla. Rakenne ja puhtaus analysoitiin käyttäen NMR-spektroskopialla. BBMD3 näkyy yli 98%: n puhtaudella NMR-analyysillä. Ihmisen miRNA estäjät (synteettisten oligonukleotidien) vastaan ​​HSA-miRNA-4284 ja on-miRNA-27a ostettiin GeneCopoeia. RNAiFect Transfektio reagenssi hankittiin Qiagen Inc. Rekombinantti ihmisen epidermaalinen kasvutekijä (EGF) ja fibroblastikasvutekijä perus (FGF) saatiin R kun valvonnan vastaanotetun sama määrä vain ajoneuvon.

elinkykyyn määritykset

Solujen elinkelpoisuus määritykset suoritettiin CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Promega, joka sisältää 3- (4 , 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium (MTS). Kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisella levyllä ympättiin 5000 solua suspendoitiin elatusaineeseen. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla lääkettä. Kun oli kulunut 24 h tai 48 h hoito, MTS lisättiin soluihin mukaan toimittajan protokollan, ja absorbanssi reaktion muodostuva tuote viljellyt solut mitattiin 490 nm: ssä käyttäen ELISA-levyn lukijalla.

apoptosis Assay

Soluja (2 x 10

5), jotka ovat peräisin neuropallojen ympättiin 6-kuoppaisille levyille, joissa täydellinen kantasolujen väliaineessa. Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin vielä 48 tuntia, jossa on esitetty pitoisuuksien BBMD3. Käsittelyn jälkeen kaikki solut kerättiin, ja apoptoottisten solujen havaittiin käyttämällä anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences). Solut värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja propidiumjodidilla (PI) mukaan toimittajan ohjeita. Elinkelpoisia ja apoptoottisia soluja havaittiin virtaussytometrialla meidän Analytical Cytometry Core täällä City of Hope National Medical Center. Apoptoottiset solut sisältävät sekä varhainen apoptoottinen osa (anneksiini V-positiivisia) sekä myöhäinen apoptoottiset osa (anneksiini V ja PI-positiivisia).

valokuvaus

Normal NS kulttuuri, käsittelemättömät GBM NS johdetut viljelmät potilaasta aivokasvaimia (eli PBT003, PBT008, PBT022, PBT030) tai PBT003 NS käsiteltiin eri pitoisuuksilla BBMD3 valokuvattiin 10X suurennoksella käyttäen Nikon ECLIPSE TE2000-U mikroskoopilla.

Total Protein valmistelu ja Protein Assay

jälkeen 24 tunnin inkuboinnin 5 uM BBMD3, solut, jotka ovat peräisin potilaan aivokasvaimia (eli PBT003, PBT008, PBT022 ja PBT030) kerättiin ja pestiin kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Sitten kukin solupelletti lisättiin 150 ui Cell Signaling lyysipuskuria (EMD Millipore), johon olimme sijoitettu proteaasiestäjäseostabletit tabletti (Roche, Inc., Indianapolis, IN). Sen jälkeen kolme peräkkäistä sykliä jäädyttäminen kuivajää /etanoli kylpy ja sulatus 37 ° C vesihauteessa, koko proteiinipitoisuus lysaattia määritettiin käyttämällä Bio-Rad Protein Assay Kit.

Immunoblottausmääritys analyysi

Kaksikymmentä mikrogrammaa kokonais-proteiinia ratkaistava ennalta valettu 4-15% kaltevuus Tris-HCI polyakryyliamidigeelissä ostettu BIO-RAD (Hercules, CA). Geelielektroforeesin jälkeen proteiinit siirrettiin Hybond-C kalvoja (Amersham), blokattiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa (RT) 10% rasvatonta kuivamaitoa, joka liuotettiin PBST (1 x PBS, joka sisälsi 0,1% Tween-20 ), ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden (tunnustaa proteiinien esitetty tekstissä) suspendoitiin PBST, joka sisältää 2% rasvatonta maitojauhetta. Pesun jälkeen kalvoja PBST, piparjuuriperoksidaasi leimattua anti-hiiri- tai anti-kani-vasta-aineita inkuboitiin kalvojen kanssa 1 tunnin ajan RT: ssä. Paikan Hybond-C kalvolle antigeenisten proteiinien spesifisesti sitoutuneet vasta-aineisiin havaittiin SuperSignal West Pico substraatti (Pierce).

kvantitatiivinen analyysi on MikroRNA

Yhteensä microRNA eristettiin PBT003 , PBT008, PBT022 ja PBT030 neuropallojen jälkeen 15 tunnin hoidon 5 uM BBMD3 tai ajoneuvon hallinnan käyttäen miRNeasy Mini kit (Qiagen). Kvantifiointi suhteellinen runsaus kunkin yksittäisen mikroRNA kanssa tai ilman BBMD3 hoitoa, valmistui genomiikkaa Core klo City of Hope National Medical Center. Lyhyesti, mikro-RNA: n sekvensointi suoritettiin käyttäen Illumina HiSeq2000 seuraten valmistajan protokollaa (TruSeq Pieni RNA Sample Prep Kit, valaista, Inc.) pienin optimointi. 500 ng mikro-RNA ligoitiin 3 ’adapteri (5’ TCTCTGTAGGCACCATCAATC) T4-RNA-ligaasia 2 1 tunnin ajan 22 ° C: ssa. Ligatoitumattomat 3 ’sovittimet blokattiin hehkutus ne RT-aluketta (5’ ATTGATGGTGCCTACAGAGA) 75 ° C: ssa 5 minuutin ajan ja 25 ° C: ssa 15 minuuttia. Määrälliset denaturoitu mikro-RNA-kirjasto ladattiin 1 ml hybridisaatio- puskuria lopulliseen konsentraatioon kaksikymmentäkaksi.

käsittely mikro-RNA estäjät

8000 yksittäisistä soluista, jotka ovat peräisin PBT008 ja PBT030 neuropalloja täysin kantasolujen elatusaineet ympättiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevyillä. Viisi tuntia myöhemmin, 60 nM miR-4284 tai miR-27a anti-sense-inhibiittorit transfektoitiin soluihin RNAiFect transfektioreagenssia. Ohjaus-solut transfektoitiin kontrollina mikro-RNA: n estäjä. 24 tuntia transfektion jälkeen mikro-RNA-inhibiittorit, 5 uM BBMD3 lisättiin soluviljelmään levyt. 24 tunnin kuluttua BBMD3 hoidon, solujen elinkelpoisuus määritettiin.

Tilastot

Opiskelijan

t

testiä käytettiin arvioimaan tilastollinen merkitys erot kahden ryhmien ja

p

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

tulokset

neuropalloja viljellään yksilöitä GBM Potilaat kertovia ominaisuuksia Cancer kantasolujen

viljelty ja laajennettu lyhyt- termi kasvaimen neuropallojen seerumivapaassa kantasolujen media, (täydennetty EGF ja FGF), jotka olivat peräisin neljästä ensisijainen GBM potilailla, (eli PBT003, PBT008, PBT022 ja PBT030). Nämä GBM neuropallojen näytteillä samanlainen morfologia kuin normaaleissa hermo kantasoluja (Fig. 1A). On todettu, että GBM kantasolujen kaltaisia ​​soluja (GBMSCs) ja normaaleissa hermo kantasolut (NSCs) jakaa ilmentymisen useita markkereita, kuten CD133 ja nestiinifenotyypin [28]. CD133 on solunpintamarkkeria ilmentyy normaalin ihmisen NSCs, ja sen ilmentyminen säätyy alas eriytetty solulinjoissa. Nestiinifenotyypin on välituote hehkulangan tuotettu proteiini kehityksen aikana kantasoluja peräisin nisäkkään keskushermostossa. Co-ilmentymä CD133 ja nestiinifenotyypin liittyy huonoon ennusteeseen malignia glioomaa potilaille [28]. Havaitsimme Western blot -analyysillä, että CD133 ja nestiinifenotyypin ilmaistiin GBM neuropallojen viljeltiin kustakin neljästä GBM potilailla, kun taas mitään ekspressiota CD133 ja nestiinifenotyypin havaittiin perustettu GMB solulinja (eli U87-soluja), (Fig. 1B). β-aktiinin ilmentymistä tasoilla seurattiin sen varmistamiseksi, että vastaavat määrät solun proteiinia ladattiin kuhunkin kaistaan ​​geelin. Kun viljellään median seerumissa, The neuropallojen peräisin PBT003, PBT008, PBT022 ja PBT030 GBM potilailla on kyky erilaistua pysyvä ja neuroni-kaltaiset solut, (Fig. 1 C). Soluviljelmiä johdettu yksilöitä neljän GBM potilaat (PBT003, PBT008, PBT022 ja PBT030) kasvoi tyypillisiä neuropalloja, ja säilytettävä kyky itseuudistumisen ja ilmaisi hermo kantasolujen markkereita, kuten CD133 ja nestiinifenotyypin kun viljellään serum- vapaan median. Nämä neuropallojen oli myös kyky erilaistua seerumissa sisältävien kasvualustojen. Tässä raportissa siksi määritellään nämä neuropallojen joko GBM kantasolujen kaltaisia ​​soluja tai syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja.

(A) morfologia PBT003, PBT008, PBT022 ja PBT030 neuropallojen Kantasolututkimus viljelyväliaineessa. (B) GBM neuropallojen ilmaisi erityisiä biomarkkereita normaaleille hermo kantasoluja. (C) GBM neuropallojen näytteille kyky erilaistua.

BBMD3 häiritsee rakenne Neuropalloja ja Estää elinkelpoisuus Cancer Stem kaltaisten viljeltyjen solujen päässä Four GBM Potilaat

GBM johdettu syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja, ovat vähemmän herkkiä, (tai tulevat vastustuskykyisiksi), tavanomainen kemoterapia [4], [5]; korostamalla kriittinen tarve löytää uusia ja entistä valikoivasti voimakkaampi lääkkeitä hoitoon glioblastoma. Berbamine, luonnollinen tuote peräisin

berberis amurensis

kasvi, näyttää olevan sytotoksista aktiivisuutta erilaisia ​​syöpiä; kehotetaan valmistamiseksi sarja analogeja berbamine. Nämä analogit arvioitiin sen määrittämiseksi, onko jokin niistä saattavat olla tehokkaampia tappamaan syöpäsoluja kuin kanta-aineella. Olemme havainneet, että syövänvastainen tehokkuus yhtä uusista synteettisiä johdannaisia, (ts BBMD3), melanooman ja eturauhasen syöpäsolujen ylitti muiden analogien [17]. Näin ollen tutkimme syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on BBMD3 on GBM kantasolujen kaltaisia ​​soluja, jotka olivat peräisin neuropallojen viljeltiin GBM potilaan PBT003, PBT008, PBT022 ja PBT030. Tutkimuksen aikana, näitä soluja käsiteltiin 24 tai 48 tuntia, kun läsnä on täydellinen kantasolujen elatusaineessa, joka sisälsi 1, 3, 5, 8 tai 10 uM BBMD3. Ohjaus soluviljelmiä käsiteltiin vain vehikkeliä (DMSO) sijasta BBMD3, ja solujen elinkyky määritettiin, kuten on kuvattu menetelmät. BBMD3 esti voimakkaasti elinkelpoisuuden kunkin sarjan GBM varren-, kuten syöpäsolujen, jotka ovat peräisin potilaan neuropallojen, on ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 2A). 48-tunnin käsittely neuropallojen 10 uM BBMD3 inhiboi solujen elinkelpoisuuden lähes 100%, ja häiritsi rakenne neuropallojen annoksesta riippuvalla tavalla. Kuvio 2B esittää, että PBT003 johdettu neuropalloja, käsiteltiin 0, 1, 3, 5 tai 10 uM BBMD3 48 tuntia, häiritsi pallomainen morfologia neuropallojen seuraavista BBMD3 hoidon, ja että häiriöitä neurospherical muoto on companied ulkonäkö kelluvan kuolleita soluja.

(A) soluja PBT003, PBT008, PBT022 ja PBT030 neuropallojen käsiteltiin 0, 1, 3, 5, 8, 10 uM BBMD3 24 ja 48 tuntia, ja elinkelpoisuus määritettiin käyttämällä MTS-määritys, kuten on kuvattu menetelmät. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Päällekkäin pylväsdiagrammi esittää keskimääräistä 3 kokeen, ja

virhepalkit

edustavat ± keskihajonta keskiarvosta (SD). (B) BBMD3 häiritsee rakenne neuropallojen, ja indusoi solukuoleman annoksesta riippuvalla tavalla näiden PBT003 peräisin neuropalloja, kun soluja käsitellään 48 tuntia lääkeaineen kanssa.

BBMD3 indusoi kaspaasi -3 Dependent Apoptosis of Cancer Stem kaltaisten viljeltyjen solujen Four GBM Potilaat

Koska BBMD3 hoito tappoi GBM johdettu syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja, me tutki soluntappokyky välitti apoptoottisen prosessin. -Soluja (2 x 10

5) päässä PBT003, PBT008, PBT022 ja PBT030 neuropallojen ympättiin kuuden kuopan kudosviljelylevyille, ja käsiteltiin 48 tunnin ajan eri pitoisuuksilla (0, 1, 3, 5, 10 uM) BBMD3. Kaikki solut kerättiin ja analysoitiin ilmentymisen anneksiini V käyttäen anti-anneksiini V-FITC-vasta-ainetta ja propidiumjodidivärjäys seuraa suhteellisen kvantifioinnin kautta virtaussytometrialla. Apoptoottisia soluja, kuviossa 3A on esitetty, oli anneksiini V, positiivinen (varhainen apoptoottisia soluja), tai anneksiini V ja propidiumjodidilla kaksinkertainen positiivinen (myöhäinen apoptoottisia soluja). Tuloksemme osoittavat, että BBMD3 indusoi apoptoosia näissä GBM kantasolujen kaltaisia ​​soluja annoksesta riippuvaisella tavalla. 48-tunnin käsittely 10 uM BBMD3 tappoi lähes kaikki kasvainsolut. Kaspaasi-3, kriittinen indusoija apoptoottisen prosessin [29], johti pilkkominen poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP), joka auttaa solut säilyttävät elinkelpoisuus [30]. Edelleen vahvistaa, että solun tappaminen aiheuttama BBMD3 on apoptoottinen prosessi, Western blotting-analyysit suoritettiin havaita kaspaasi-3 ja pilkkominen PARP on kokosolulysaattia jälkeen 24 tunnin hoidon 5 uM BBMD3. BBMD3 lisäsi pilkkominen kaspaasi-3 aktiiviseen muotoonsa, ja lohkaisu PARP osaksi inaktiivisessa muodossa soluissa, jotka ovat peräisin neljästä neuropallojen viljelmät (Fig. 3B). Nämä tiedot viittaavat kohti BBMD3 apoptoosin indusoimiseksi näissä GBM kantasolujen kaltaisten solujen aktivoinnin kautta kaspaasi-3 cascade. Tuloksemme osoittavat myös, että useita mekanismit voivat olla mukana induktioon solun tappamisen ja menetys solujen elinkelpoisuuden, koska tuolloin vaiheessa määritetään, PBT003 NS inkuboitiin 5 uM BBMD3 indusoi lähes täydellinen menetys solujen elinkelpoisuuden, ja apoptoosin nopeudella noin 60%; kun taas PBT030 NS solujen elinkelpoisuus oli noin 20%, kun oli inkuboitu 5 uM BBMD3, kun apoptoosi oli lähes 100% tämän kulttuuriin.

(A) Apoptoottiset solut analysoitiin anneksiini V-FITC reaktiivisuus ja PI-värjäyksellä virtaussytometrialla. Soluja PBT003, PBT008, PBT022 ja PBT030 neuropallojen käsiteltiin BBMD3 (0, 1, 3, 5, 10 uM) 48 tunnin ajan. Apoptoottisia soluja tunnistettiin olevan reaktiivinen anneksiini V-FITC-vasta-ainetta (alkuvaiheessa apoptoosin) tai PI ja anneksiini V-FITC /PI double-positiivinen (myöhäisvaiheessa apoptoosin) soluja. Kukin koe suoritettiin kahtena tai kolmena kappaleena, ja toistettiin kahdesti itsenäisenä jäljitellä. Päällekkäin pylväsdiagrammin edustaa keskiarvoa havaitut arvot näistä rinnakkaisnäytteiden ja

virhepalkit

edustavat ± keskihajonta keskiarvosta (SD). (B) laajuus katkaisun kaspaasi-3 ja PARP määritettiin sen jälkeen, kun 24 tunnin hoidon BBMD3 käyttäen Western blotting-analyysit. β-aktiini toimii sisäisen valvonnan.

BBMD3 myös Vähentää Elinkelpoisuus ja indusoi apoptoosia Non-varsi GBM Cells

Kuten olemme raportoitu, BBMD3 on sytotoksinen johtuvan -kuten GBM kasvainsoluja; viittaa siihen, että sen pitäisi olla myös sytotoksisia kuin varsi GBM syöpäsoluja. Tämän mahdollisuuden tutkimiseksi, käytimme viljeltyjä U87 soluja, jotka ovat vakiintunut ei-varsi GBM tasyöpäsolulinja. Havaitsimme, että U87 solut eivät ilmaista hermostoputken kantasolujen merkkiaineita CD133 ja nestiinifenotyypin (ks. 1B verrattuna varsi GBM tuumorisolulinjoja). Kuten odotimme, BBMD3 inhiboi solujen elinkelpoisuuden ja indusoi apoptoosin U87-solut (Fig. 4A) samalla tavalla kuin nähdään GBM kantasolujen kaltaisia ​​soluja (Fig. 2A ja 3A). Tuloksemme osoittavat, että BBMD3 voi tappaa sekä varsi kaltaiset ja ei-varsi GBM syöpäsoluja.

(A)

Vasen paneeli

, U87-soluja käsiteltiin 0, 1, 3, 5, 8, tai 10 uM BBMD3 24 ja 48 tuntia, ja elinkelpoisuus määritettiin käyttäen MTS-määritys, kuten on kuvattu menetelmät.

Oikea paneeli

, U87-soluja käsiteltiin 0, 1, 3, 5, tai 10 uM BBMD3 48 tuntia ja apoptoottisia soluja analysoitiin anneksiini V-FITC reaktiivisuus ja PI-värjäyksellä virtaussytometrialla. (B)

Vasen paneeli

esittää morfologia normaalin ihmisen neuropallo.

Oikea paneeli

esittää elinkelpoisuuden normaalin sikiön aivojen johdettu ja kasvaimen johdettu neuropallojen seuraavat 24 tuntia hoidon 1, 5, tai 10 uM BBMD3. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja replikoituu itsenäisenä kokeessa vähintään kaksi kertaa. Päällekkäin pylväsdiagrammin edustaa keskiarvoa havaitut arvot näistä rinnakkaisnäytteiden ja

virhepalkkeja

llä ± keskihajonta keskiarvosta (SD).

Normal Human neuropallojen ovat vähemmän herkkiä BBMD3 kuin GBM Johdetut neuropallojen

berbamine ja sen johdannaisten on myös raportoitu aiheuttavan vähemmän sytotoksinen vaikutus kohti normaalia ihmisen soluihin [17] kuin kohti GBM ja muita syöpäsoluja. Arvioitava edelleen ero sytotoksisuutta BBMD3 kohti normaalia neuropalloja, testasimme vaikutuksia BBMD3 ihmisen normaaleista neuropalloja, jotka ovat peräisin normaalista sikiön aivoissa. Kuvio 4B esittää morfologian normaalin neuropallojen, ja vaikutukset BBMD3 normaaleilla neuropallojen ja neuropallojen peräisin neljästä GBM potilaista 24 tunnin lääkkeelle altistamisen. Verrattuna kasvaimen peräisin neuropallojen, normaali neuropallo elävyys on vähentynyt altistuminen kasvavia pitoisuuksia BBMD3, mutta nämä normaalit neuropallo viljelmät ovat vähemmän herkkiä sytotoksisia vaikutuksia BBMD3 kuin neuropallon johdetut viljelmät 4 GBM potilailla.

BBMD3 Kasvattaa Expression of miR-4284 ja miR-27a PBT003, PBT008, PBT022 ja PBT030 neuropalloja

Vaikka miRNA on tunnettu vain muutamia vuosia, niiden on havaittu pelata ratkaiseva rooleja prosessien välittäjänä kasvainten synnyssä, angiogeneesissä, solujen invaasiota, ja apoptoosin erilaisissa kasvaintyypeissä. Siksi tutkittiin, BBMD3 hoito voisi muuttaa ilmaisun profiilia miRNA GBM kantasolujen kaltaisia ​​soluja. Neuropalloja, jotka ovat peräisin PBT003, PBT008, PBT022 ja PBT030 GBM potilasta, hoidettiin 5 uM BBMD3 16 tuntia, kun taas kontrolli-soluja käsiteltiin vain vehikkeliä (DMSO). Yhteensä miRNA eristettiin näistä neuropallo kulttuureista, ja jokaisen näistä miRNA kvantifioitiin. Verrattuna kontrolleihin, BBMD3 käsittely sääteli kuvaamaan joitakin miRNA, ja alassäädetty ilmentymä muiden miRNA. Taulukossa 1 on esitetty keskimääräinen miRNA ilmentymisen profiili suhteessa käsittelemättömään kontrolliin GBM kantasolujen kaltaisia ​​soluja, kunkin neljän GBM potilaista BBMD3 hoidon. miR-7 on kaikkein alassäädetty miRNA, pienentynyttä ilmaus 1,06 kertaiseksi. Sen sijaan kahden eniten säädelty miRNA ovat miR-4284 ja miR-27a; lisäämällä 4,48 ja 2,25 kertaiseksi. Kerrottiin, että säätely ylöspäin miR-23a, 27a, ja 24-2 indusoi sekä kaspaasiriippuvaisen ja riippumattaman apoptoosin ihmisen alkion munuaissoluissa [31]. Tähän mennessä emme ole pystyneet löytämään mitään julkaisemista kuvaavat sääntelytehtävän (t) miR-4284.

miR-4284 estäjä Estää vaikutukset BBMD3 elinkelpoisuudesta GBM Neuropalloja

vahvista onko lisääntynyt ilmentyminen miR-27a ja miR-4284 aiheuttama BBMD3 hoito korreloi lasku GBM neuropallo elinkelpoisuutta, tutkimme onko miR-27a ja miR-4284 anti-sense-sekvenssit voivat estää sytotoksinen aktiivisuus BBMD3. Ensimmäinen askel oli tutkia, ovatko nämä inhibiittorit yksinään estivät solujen elinkykyä. 60 nM ihmisen anti-sense miRNA estäjät (so synteettisten oligonukleotidien) vastaan ​​HSA-miRNA-4284 ja HSA-miRNA-27a transfektoitiin soluihin, jotka ovat peräisin PBT008 ja PBT030 neuropalloja. Jotka eivät liity anti-sense mikro-RNA-inhibiittoria käytettiin negatiivisena kontrollina, ja 48 tuntia transfektion jälkeen näiden miRNA-inhibiittorit, solujen elinkelpoisuus määritettiin. Tulokset on esitetty kuviossa. 5A osoitti, että miR-27a ja miR-4284-inhibiittorit yksinään ei tehokkaasti vähennä solun elinkelpoisuuden suhteessa kuin transfektoidut solut (untran). Sitten vaikutus testattiin miR-27a ja miR-4284 estäjien sytotoksista aktiivisuutta BBMD3 käyttäen PBT008 ja PBT030 neuropalloja.