Krooninen sairaus

tiivistelmä

Yksi menetelmä parantaa syövän hoitoon on käyttää nanohiukkasten huumeiden funktionalisoitu kohdistaminen ligandien jotka tunnistavat reseptorit ilmaisseet selektiivisesti syöpäsoluja. Teoriassa tällainen kohdistaminen ligandeja olisi erityisesti toimittaa nanohiukkasten huumeiden kasvain, kasvaa lääkkeen pitoisuus kasvain ja toimittaa lääkkeen vaikutuskohta sisällä kasvainkudoksen. Kuitenkin vuotavat verisuonistoon kasvainten yhdistettynä huono imunestejärjestelmän avulla passiivinen kertyminen, ja myöhempi säilyttäminen, nanokokoisten materiaalien kasvaimissa. Lisäksi suuri nanohiukkasten koko voi haitata kasvain levinneisyys. Sinänsä roolia aktiivisen kohdistaminen nanohiukkasten toimitus on kiistanalainen, ja on vaikea ennustaa, miten kohdennettua nanohiukkasten huumeiden käyttäytyy

in vivo

. Kirjoittajat raportoivat

in vivo

tutkimuksissa α

Vp

6-erityisiä H2009.1 peptidi kohdennettuja liposomaalinen doksorubisiini, mikä lisäsi liposomaalisen toimituksen ja myrkyllisyyttä keuhkosyöpäsoluissa

in vitro

. Olemme systemaattisesti vaihteleva Ligandiaffiniteetin, ligandi tiheys, ligandi vakautta, liposomi annostus, ja kasvainmuodoista arvioida roolia aktiivisen Liposomien kohdentaminen on a

Vp

6. Suorassa Toisin kuin

in vitro

tuloksia, osoitamme eroa

in vivo

kohdistamista tai teho H2009.1 tetrameerisen peptidin liposomaalinen doksorubisiini, verrattuna kontrolliin peptidiä ja ei-peptidi liposomeja. Tutkitaan liposomin keskittymisen ja jakauma kasvain osoittaa, että liposomi, eikä H2009.1 peptidi, ajaa kasvain kertymistä, ja että sekä kohdennetut H2009.1 ja kohdistamattomia liposomit pysyvät verisuonia alueilla, joilla on vain vähän kasvaimen levinneisyys. Näin H2009.1 kohdistettuja liposomeja eivät onnistu parantamaan lääkkeen tehoon koska liposomin lääke alustan estää H2009.1 peptidi sekä aktiivisesti kohdistaminen kasvain ja sitoutumisen kasvainsoluihin koko kasvain kudosta. Siksi käytetään suuri affiniteetti ja korkea spesifisyys ligandin kohdistaminen yli-ilmaisivat kasvain biomarkkereiden ei takaa tehostetun tehosta -liposomilääkeaineen. Nämä tulokset korostavat monimutkaisuus

in vivo

kohdistamista.

Citation: Gray BP, McGuire MJ, Brown KC (2013) liposomaalinen Drug Platform ohitukset peptidiligandin kohdistaminen on Cancer biomarkkereiden, riippumatta ligandiaffiniteetin tai tiheys. PLoS ONE 8 (8): e72938. doi: 10,1371 /journal.pone.0072938

Editor: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 31, 2013; Hyväksytty: 14 heinäkuu 2013; Julkaistu: 23 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Gray et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Welch Foundation apurahan # I-1622 ja National Institutes of Health /National Cancer Institute (NCI) avustus # 1R01CA164447 (ja KCB). BPG tukivat apurahan päässä Cancer Research ja ehkäisy Institute of Texas (RP 101496). Jaettu kuvantaminen resurssit UT Southwestern tukevat osittain jota NCI tukea avustuksen Harold Simmons Cancer Center (P30 CA142543). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpä on numero yksi kuolinsyy maailmassa, ja määrä syöpään liittyvien kuolemien odotetaan lisääntyvän tulevina vuosikymmeninä [1]. Yksi paradigman parantaa syövän hoidossa on kehittää kohdistaminen hoitomuotoihin, joissa käytetään kasvain-ligandeja selektiivisesti lääkeaineiden syöpäsoluja, mikä lisää lääkkeen kerääntymistä kasvaimen ja vähentämällä ei-toivottuja toksisuuksia huumeiden kudoksiin muissa kehon alueilla. Kasvain-ligandien kertyvät valikoivasti tuumoreissa johtuvat spesifisyyttä reseptoria ilmaisi valikoivasti kasvaimen tai kasvaimen verisuoniston solut (eikä ilmaisema normaalit solut). Nanohiukkasten lääkkeet ovat erityisen houkuttelevia käytettäväksi kasvaimen-ligandeja, koska kapseloinnin lääkeaineen nanohiukkasten, joka estää lääkeaineen, kunnes sen vapautumista nanohiukkasten ja voi lisätä verenkiertoa ajan.

Pegyloitu liposomaalinen doksorubisiini (DOXIL ® /CAELYX®) oli ensimmäinen nanohiukkasten kliinisesti hyväksytty syövän hoitoon. DOXIL® on noin 100 nm kooltaan, sisältää antrasykliini kemoterapia-doksorubisiini [2], ja on nykyisin hyväksytty hoitoon munasarjasyöpä [3], multippelimyelooma [4], ja Kaposin sarkooma [5] sekä Yhdysvalloissa ja Eurooppa ja käytettäväksi rintasyöpäpotilaiden Euroopassa [6]. Lukuisat kliiniset kokeet, joihin lääke on käynnissä, mukaan lukien tutkimukset ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [7]. Johtuen kliininen menestys DOXIL®, useimmat kohdistaminen ligandit konjugoitu nanohiukkasten kohdennettuja lääkeaineen on konjugoitu liposomaalisen muotoja doksorubisiinin. Sekä vasta-aine ja peptidi kohdistaminen ligandeja on käytetty lisäämään tehokkuutta ja vähentää toksisuutta liposomaalisen doksorubisiinin aktiivisesti tuumorien ja kasvaimen verisuoniston soluihin [8-25]. Erityisen kiinnostavia, anti-HER2 liposomaalisen doksorubisiinin ja anti-EGFR liposomaaliset doksorubisiini koostumukset ovat faasin I kliinisissä kokeissa [26,27]. Lisäksi liposomaalinen doksorubisiini konjugoituna peptididerivaatta kasvaimen verisuoniston kohdistaminen NGR peptidi [28] on pohjustettu mahdollisten tulevaisuuden kliinisiä kokeita valmistamalla käyttämällä Good Manufacturing Practices (GMP) [29].

Mukana joukossa monia etuja käyttämällä liposomaalisen doksorubisiinin kohdistamiseen hoitoja on korkea lääke kohdistaminen ligandin suhde johtuu tuhansien doksorubisiinin molekyylien loukkuun kunkin liposomin. Lisäksi pegyloitu liposomaalinen doksorubisiini nauttii pitkä

in vivo

liikkeessä kertaa [30], pidempiä kohdistaminen ligandit ovat toimittamaan lastin kasvain. Tärkeä tekijä -liposomilääkeaineen teho on passiivinen kertyminen nanokokoisia hiukkasia kasvain parannetulla läpäisevyyttä ja säilyttäminen (EPR) vaikutus [31]. Toisin verisuonistoon normaalin kudoksen, kasvaimen verisuonisto on epäsäännöllinen ja epäjärjestyksessä. Nano-kokoinen hiukkaset voivat vuotaa tämän vuotavan verisuoniston ympäröivään kasvainkudoksen ja myöhemmin pidätetyksi kasvain heikon lymfahierontaa järjestelmiä kasvaimia. Näin kasvain kertyminen ligandin kohdistettujen liposomien riippuu paitsi erityisiä kohdistaminen ligandin vaan myös EPR-odotuksiin vaikutukset. Rooli aktiivinen kohdistaminen toimituksen nanohiukkasten kasvaimiin on kiistanalainen [32-36].

Tutkimukset kohdistettuja liposomeja ovat osoittaneet kahden mekanismin parantaa kasvaimen lääkeaineen kertymistä, jotka molemmat johtavat toivottavaa hoitotulosten. Jotkut peptidi kohdistettuja liposomeja, erityisesti suunnattu kasvaimen verisuoniston, kuten NGR-liposomit, antaa enemmän doksorubisiinia että kasvaimia kuin ei-kohdennettu liposomit [9,16], mikä viittaa siihen, että kohdennetut liposomit kertyminen kasvaimeen perustuu sekä peptidin kohdistaminen kykyjä ja EPR vaikutus. Muut vasta-kohdistettuja liposomiformulaatioina, mukaan lukien anti-HER2 ja anti-EGFR liposomit, kerääntyvät kasvaimen tasoisena kuin kohdistettuja liposomeja. Kuitenkin toisin kuin ei-kohdennettu liposomit, kohdennetut liposomit sisäistää syöpäsoluihin ja on paremmat jakelu koko kasvainkudoksen [37,38]. Vaikka kohdistaminen ligandi ei ohita EPR vaikutus ajo kasvain kertyminen näistä liposomiformulaatiot, muuttuneen sijainti lääkeaineen vaikutuskohta sisällä kasvainsolujen lisää tehoa. Koska EPR vaikutus ja eri verisuoniston rakenteen jokaisen kasvain, on vaikea ennustaa, kuinka testaamattoman kohdistaminen liposomiformulaatio kertyy kasvaimia ja vaikuttaa kasvaimen kasvua.

Olemme hiljattain kuvattu kehityksen peptidin kohdennettujen liposomaalisen doksorubisiinin muotoiluja spesifinen suppeasti ilmaistuna reseptorin α

Vp

6 [39]. Integriinin α

Vp

6 on nousemassa ihanteellinen syövän tavoite; se ilmaistaan ​​erilaisia ​​syöpiä epiteelin [40-50], ja vain harvoin ilmaistaan ​​normaali kudos [51]. Erityisen kiinnostavaa on yleisyys α

Vp

6 keuhkosyöpä, numero yksi syövän tappaja sekä miesten ja naisten [1]. Yli puolet potilaan ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kasvaimet ilmentävät α

Vp

6, ja integriini ilmaisun ”päällä” alkuvaiheissa NSCLC syövän synnyn ja pysyy koholla koko sairauden etenemisen [52].

Olemme tunnistaneet ja sen jälkeen optimoitu α

Vp

6-peptidin, H2009.1 [53]. Monomeeriset peptidi sitoutuu H2009 adenokarsinooma NSCLC-solut puolet maksimaalisesta sitoutumisaffiniteetti 9,2 nM, ja syntetisoimalla H2009.1 peptidiä faagi rakenne-jäljitteleviä tetrameerisen peptidin lisää affiniteetti kaksikymmentäkolme [54]. Sekä monomeeristen ja tetrameerisen peptidit sisäistää osaksi α

Vp

6 ilmentävien solujen

in vitro

ja kohde kasvaimet

in vivo

. Jonka tavoitteena on kääntää eristettyjen peptidien faaginäyttökirjastot tehokkaiden terapeuttisten toimitus aineita, tarkastelimme paras alusta näyttämiseen H2009.1 peptidien liposomaalinen doksorubisiinia lääkeaineen

in vitro

, vaihtelemalla sekä liposomaalisen peptidin tiheyden ja peptidi valency [39].

In vitro

, tehokkain liposomiformulaatio näyttää H2009.1 tetrameerisen peptidi tiheydellä 1,3% rasvojen kokonaismäärästä. 1,3% H2009.1 tetrameerinen liposomiformulaatio oli 2-kertaa enemmän myrkyllisiä soluille kuin liposomeihin, joissa on ohjattu sekoitetun scH2009.1 peptidin ja yli 10 kertaa enemmän myrkyllisiä kuin paljain, ei-peptidi, liposomit. Huolimatta näistä

in vitro

tuloksiin, on epäselvää, onko sama liposomiformulaatio parhaiten tavoite α

Vp

6-ilmentäviä kasvaimia

in vivo

. Huomattavia eroja

in vitro

osoitteeseen

in vivo

yhteyksissä, mukaan lukien mahdolliset erot reseptorin ilmentymisen ja saatavuus, kasvaimen verisuoniston rakennetta, ja huumeiden biologisen jakautumisen vaikutuksia.

tarkastella paras H2009.1 suunnattu liposomaalinen doksorubisiini muotoilua estämään α

Vp

6 ilmentävä kasvain kasvu

in vivo

, systemaattisesti vaihteleva ligandiaffiniteetin, ligandi tiheys, ligandi vakautta, liposomi annostus, ja kasvaimen malleja arvioida roolia aktiivisen kohdentamisen liposomin kolmessa NSCLC mallia. Huolimatta kohdistaminen erot eri liposomiformulaatiot

in vitro

, kaikki H2009.1 peptidin liposomin alustat omaavat identtiset teho

in vivo

. Lisäksi, ei ole mitään tehoa eroa H2009.1 liposomit ja ohjata ei-peptidi-liposomien. Tämän jälkeen tehdyt tutkimukset osoittavat, että tämä tulos johtuu EPR-pohjainen liposomin kasvain keskittymisen ja epäonnistuminen liposomien tunkeutumaan kasvainkudoksen viime alueita välittömässä läheisyydessä kasvaimen verisuoniston huolimatta laajalti ilmaus α

Vp

6 kasvaimen . Nämä tulokset korostavat monimutkaisuus

in vivo

huumeiden kohdistamista, jopa käytettäessä suuri affiniteetti ligandille, joka tunnetaan valikoivasti tavoite kasvaimia

in vivo

, ja viittaavat siihen, että suuri nanohiukkasten ehkä ole paras kohdistus alustan jokaisen kasvaimen ympäristölle.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Kaikki Fmoc aminohapot ostettiin Novabiochem® (EMD Millipore, Billerica, MA). Sepharose CL-4B ja Sephadex G-50 hankittiin Sigma-Aldrich Inc. (Livermore, CA). Lipidit hankittiin Avanti® Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL) ja doksorubisiinihydrokloridi injektiota Bedford Laboratories ™ (Bedford, OH). Molecular Probes® väriaineet Dil [Dil (C)

18 (3), 1,1′-dioktadekyyli-3,3,3 ’, 3’-tetrametyyli perkloraattia] ja DiR [DiOC

18 (7) 1,1′-dioktadekyyli-3,3,3 ’, 3’-tetramethylindotricarbocyanine jodidi], hankittiin Life Technologies ™ (Grand Island, NY). Soluviljelyyn, naudan sikiön seerumia (FBS) hankittiin Gemini Bio-Products (West Sacramento, CA) ja molemmat RPMI 1640 ja Trypsiini EDTA, 1 x alkaen Mediatech, Inc. (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).

solulinjat

Kaikki ihmisen NSCLC solulinjoja käytettiin aiemmin perustettu ja tunnettu [55]. Solulinjat saatiin Hamon Center for Therapeutic Oncology Research UT Southwestern Medical Center. Solulinjat testattiin rutiininomaisesti Mycoplasma ja DNA sormenjäljet ​​vahvistaa henkilöllisyytensä. H2009, H1975 ja H460-solulinjoja kasvatettiin kaikki 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 RPMI 1640, johon oli lisätty 5% FBS: ää.

Peptide Synthesis and Purification

Sekä monomeeriset ja tetrameerinen H2009.1 ja scH2009.1 peptidit syntetisoitiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [54]. Lyhyesti, kaikki monomeeriset peptidit ja tetrameerisen ydin tarvitaan, jotta tetrameerisen peptidit syntetisoitiin Symphony Synthesizer (Rainin Instruments, Protein Technologies, Inc., Tucson, AZ) tavanomaisilla Fmoc kiinteän faasin peptidisynteesin. Tetrameerisen peptidit syntetisoitiin reaktiolla 5-kertaisen ylimäärän puhdistettua kysteiiniä, joissa monomeeristen peptidien puhdistetulla maleimidiaktivoitua tetrameerisiä ydin, liuokseen, jossa oli PBS: ää + 10 mM EDTA ravistellen huoneenlämpötilassa 2 tuntia. Kaikki peptidit puhdistettiin käänteisfaasi-korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) käyttäen SPIRIT ™ Peptide C18 5 um, 25 x 2,12 sarakkeessa (AAPPTec®, Louisville, KY) on tuulta ™ HPLC (Waters Corporation, Milford, MA) mukaan julkaistujen eluointiolosuhteet [54]. Matrix laserdesorptio /ionisaatio lennon massaspektrometriaa käytettiin varmistamaan peptidin massa (Voyager-DE ™ PRO, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Massojen monomeeristen peptidien (keskimääräinen massa laskettu /MH +: 1843,02 /1844,18) ja tetrameeristä ytimen (keskimääräinen massa laskettu /MNa +: 1251,49 /1274,27) määritettiin heijastava tilassa käyttäen α-syano-4-hydroksikanelihappoa matriksina. Massojen tetrameeristä peptidien (keskimääräinen massa laskettu /MH +: 8629,01 /8626,77) määritettiin lineaarisessa käyttäen sinapiinihappoa matriisina.

valmistaminen Liposomeja Doksorubisiini

Liposomit valmistettiin liuoksia lipidien hydrattu soijan L-α-fosfatidyylikoliinista (HSPC), kolesteroli, 1,2-distearoyyli-sn-glysero-3-fosfoetanoliamiini-N- [karbonyyli-metoksi (polyetyleeniglykoli) -2000] (DSPE-PEG

20000), ja 1,2-distearoyyli-sn-glysero-3-fosfoetanoliamiini-N- [maleimidi (polyetyleeniglykoli) -2000] (DSPE-PEG

2000-maleiini) 2: 1 kloroformi: metanoli. 0,64% liposomit valmistettiin seoksista 100 mg (131 umol) ja HSPC, 25,4 mg (65,6 umol) kolesterolia, 14,7 mg (5,20 umol) ja DSPE-PEG

20000 ja 3,85 mg (1,31 umol) ja DSPE -PEG

2000-maleimidi. 1,3% liposomit valmistettiin seoksista 100 mg (131 umol) ja HSPC, 25,4 mg (65,6 umol) kolesterolia, 10,9 mg (3,87 umol) ja DSPE-PEG

20000 ja 7,92 mg (2,69 umol) ja DSPE -PEG

2000-maelimide. Liuotin poistettiin hitaasti typpivirrassa 45

° C, ja lipidikalvo jätettiin vakuumiin yli yön. Kuivattu Lipidikalvo hydrattiin 155 mM (NH

4)

2SO

4, pH 5,5, katkonaisesti kuumentamalla 65

° C ja vorteksoimalla. Liposomit sittemmin ekstrudoitiin 20 kertaa kautta kaksinkertainen pinota 100 nm kalvot, ja PD-10 suolanpoistopylväät (GE Healthcare, Waukesha, WI) käytettiin muuttamaan ulomman liposomaalinen puskuri 123 mM Na-sitraattia, pH 5,5. Doksorubisiini oli ladattu etänä (post-liposominmuodostuksen) inkuboimalla liposomeja ja doksorubisiinia 65

° C: ssa 1 tunti. Vapaa doksorubisiini poistettiin käyttäen Sephadex G-50 -pylvääseen, joka tasapainotettiin HEPES-puskuroitua suolaliuosta. Peptidit konjugoitiin liposomien reaktiota 24 tunnin ajan suhteessa 2: 1-peptidi: DSPE-PEG

2000-maelimide liuokseen, jossa oli HEPES-puskuroitua suolaliuosta, ja ylimääräinen peptidi poistettiin käyttäen Sepharose CL-4B sarakkeita.

valmistaminen Dil tai DiR leimatun liposomeja

Dye leimattuja liposomeja valmistettiin kuten kuvattu, paitsi että ne eivät ole täynnä doksorubisiinia. 1,3% liposomiformulaatio valmistettiin lisäämällä Dil tai DiR väriainetta osaksi lipidien seosta 2: 1 kloroformi: metanoli. Dil tai DiR väriaineita liuotettiin etanoliin pitoisuutena 2,5 mg /ml, ja lisättiin lipidi- seosta suhteessa 3,75 ng väriä /0,5 mg lipidiä. Liuotin poistettiin hitaasti typpivirrassa 45

° C, ja lipidikalvo jätettiin vakuumiin yli yön. Kuivattu Lipidikalvo hydrattiin 155 mM (NH

4)

2SO

4, pH 5,5, katkonaisesti kuumentamalla 65

° C ja vorteksoimalla. Liposomit sittemmin ekstrudoitiin 20 kertaa kautta kaksinkertainen pinota 100 nm kalvot, ja PD-10 suolanpoistopylväät (GE Healthcare, Waukesha, WI) käytettiin muuttamaan ulomman liposomaalinen puskurin HEPES puskuroitua suolaliuosta. Peptidit konjugoitiin liposomien reaktiota 24 tunnin ajan suhteessa 2: 1-peptidi: DSPE-PEG

2000-maelimide liuokseen, jossa oli HEPES-puskuroitua suolaliuosta ja ylimääräinen peptidi poistettiin käyttäen Sepharose CL-4B sarakkeita.

perustaminen hiiri kasvainmuotoja

eläinten protokollia hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitean UT Southwestern Medical Center (Animal Welfare Assurance Number A3472-01, protokolla numero 2010-0280). Kaikki kuvantaminen tehtiin isofluraani, ja jokainen pyrittiin minimoimaan kärsivät mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Nainen NOD /SCID-hiirten (alkaen UT Southwestern Medical Center Mouse Breeding Core Facility) injektoitiin miljoona H2009, H1975, tai H460-solut oikeaan kylkeen. Kaikki solut injektoitiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa, pH 7,4, ja valmistettiin injektiota varten inkuboimalla soluja 0,05% trypsiini-EDTA: a (Gibco®, Life Technologies ™, Grand Island, NY) 10 minuutin ajan, reaktio pysäytettiin trypsiini median, ja pesemällä solut fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella ennen lopullista suspension fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen pitoisuutena 10000000 solua per ml.

terapeuttisen in vivo kokeet

Ihon alle H2009 kasvaimia perustettiin kyljen NOD /SCID-hiiriin. Kun palpoitavissa kasvaimia oli muodostunut, 18 päivää sen jälkeen, kun kasvainsolujen istutuksen jälkeen hiiret käsiteltiin HBS (kontrolli) tai eri liposomiformulaatiot, joka perustuu kokonaispitoisuus doksorubisiinin. Eri liposomiformulaatiot ja hoidon annoksilla on kuvattu yksityiskohtaisesti Tulokset-osassa. Kaikissa kokeissa, hiiret käsiteltiin kerran viikossa 3 viikon ajan, päivinä 18, 25 ja 32, kautta häntälaskimoinjektio. Kasvaimet mitattiin riippumaton tiedemies, ja kasvainten tilavuudet laskettiin kaavalla

V

=

(pxl

2

)

/2.

tilastolliset menetelmät

tilastollinen merkitsevyys kasvaimen koon eroista lääkkeellä käsiteltyjen ryhmien ja kontrolliryhmän laskettiin yksisuuntainen ANOVA Dunnettin monivertailutesti ja eri lääkkeellä käsiteltyjen ryhmien, käyttäen yksisuuntainen ANOVA Tukeyn useita vertailutestillä. Tilastollinen merkitys eroista eloonjäämiskäyrien laskettiin Kaplan-Meier -käyrät log-rank testejä. Kaikki laskelmat määritettiin käyttäen GraphPad Prism.

in vivo ja ex vivo Near Infrared Imaging

Hiiret, ihonalainen H2009, H1975, tai H460 kasvaimia oikeaan kylkeen injektoitiin kautta häntälaskimoon DiR- leimattu liposomeja pitoisuutena 22,22 umol fosfolipidiä /kg. Tämä fosfolipidi /kg pitoisuus korreloi saman määrän fosfolipidiä (ja näin ollen sama määrä liposomeja), kuten on läsnä hoidon 4 mg /kg liposomaalista doksorubisiinia. H2009 ja H460 kasvain hiiriin injektoitiin DiR-leimatun versiot 1,3% H2009.1 tetrameerisiä, AcH2009.1 tetrameerisiä, scH2009.1 tetrameerisiä, tai paljaalla liposomeja 3 hiirtä per liposomin ryhmää. Hiirillä H1975 kasvaimia annettiin injektiona DiR-leimatun versiot 1,3% H2009.1 tetrameerisiä, scH2009.1 tetrameerisiä tai alasti liposomeja 3 hiirtä per liposomin ryhmää. Kullekin hiirelle, Nair® käytettiin poistaa kaikki karvat alaosassa elin. 24, 48, ja 72 tunnin kuluttua liposomien injektion jälkeen hiiret kuvattiin varten DiR väriaineen fluoresenssin käyttäen IVIS® Lumina (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Sen jälkeen kun koko hiiren kuvantaminen 72 tuntia, kaikki hiiret lopetettiin ja elimet poistettiin

ex vivo

fluoresoiva kuvantaminen. Kunkin hiiren elimet oli kuvattu molemmin puolin, ja keskiarvo säteilevä hyötysuhde arvon molemmin puolin käytetään todellista arvoa liposomin kertymistä kyseisessä kudoksessa.

mikroskopia Dil Liposomien tuumorisektioiden

Hiiret, ihonalainen H2009, H1975 tai H460 kasvaimia injektoitiin häntälaskimon kautta Dil-leimatulla liposomien pitoisuutena 22,22 umol fosfolipidiä /kg. Kunkin kasvaimen tyyppi, hiiriin injektoitiin Dil-leimattujen versioiden 1,3% H2009.1 tetrameerisiä, scH2009.1 tetrameerisiä tai paljaalla liposomit, 3 hiirtä per liposomin ryhmää. Yksi hiiri Kunkin ryhmän eläimet tapettiin 24 tuntia, toinen hiiri 48 tuntia, ja kolmas hiiri 72 tuntia. Kun uhri, kasvaimet poistettiin ja jäädytettiin sisällä cryomolds käyttäen Tissue-Tek® O.C.T. Yhdiste kiinnitysväliaine (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).

mikroskopia, kasvaimet leikattiin 10 um käyttäen Leica CM3050S kryostaattiin (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL). Osiot saatiin ylä-, keski-, ja pohjasta kasvain. Sillä verisuoniston tahra, joka on CD31 primaarista vasta-ainetta (Rat anti-hiiri-CD31, luettelo # 550274, BD Biosciences, San Jose, CA) käytettiin klo 1:50 ja fluoreseiini vuohen anti-rotta-sekundaarista vasta-ainetta (luettelo # A10528, Life Technologies ™, Grand Island, NY), käytettiin 1: 100-laimennos. Objektilasit asennettu Dapi Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL) ja kuvattiin Leica CTR5500 mikroskooppi (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) ja DeltaVision

PDV

dekonvoluutiolla mikroskooppi (Applied Precision, Inc., Issaquah, WA).

β

6 värjäys tuumorisektioiden

tuumorisektioiden valmistaa kasvaimia sisältävien Dil-liposomeja värjättiin β

6 lauseke käyttäen β

6 primaarista vasta-ainetta (luettelo # MAB2076Z, EMD Millipore, Billerica, MA) kanssa 1:50 ja fluoreseiini vuohen anti-rotta-sekundaarista vasta-ainetta (luettelo # A10528, Life Technologies ™, Grand Island, NY), jonka 1: 100 laimennus. Objektilasit kuvattiin Leica CTR5500 mikroskooppi (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) ja DeltaVision

PDV

dekonvoluutiolla mikroskooppi (Applied Precision, Inc., Issaquah, WA).

Tulokset

In vivo -tehokkuus H2009.1 Tetrameeristä Peptide Liposomit Targeting α

Vp

6

tutkia α

Vp

6-specific H2009.1 peptidi voidaan käyttää lisäämään

in vivo

toimituksen tehoa ja liposomaalisen doksorubisiinin kohti α

Vp

6-ilmentäviä NSCLC kasvaimia, ryhdyimme tutkimaan vaikutuksia liposomaalisen peptidin tiheyden ja valenssi on terapeuttisia tuloksia tuumoria kantavissa hiirissä. Me aloitettiin käsittelemällä kasvaimen kantavien hiirten kanssa 1,3% H2009.1 tetrameerisen peptidin liposomiformulaatio, joka osoitti parhaat

in vitro

teho on rajoitettu ei-spesifinen myrkyllisyys [39]. Tässä 1,3% liposomiformulaatio, 1,3% koko lipidi on modifioitu maleimidi mahdollistaa kysteiinin sisältäviä peptidejä on kytkeä lipidin kysteiinin kautta-maleimidi kemia. Siten 1,3% lipidejä, joissa jokaisessa liposomin kantavat H2009.1 peptidi, jolloin noin 1400 peptidejä per liposomiin. Kytkemällä H2009.1 tetrameerisen peptidin 1,3% liposomiformulaatio johtaa nanohiukkasten perustuva moniarvoiset näyttö luonnostaan ​​moniarvoisten tetrameerisen peptidin, jolloin tuloksena on kerrostettu monivalenssinen, joka johtaa suurempi spesifisyys ja suuremman toksisuuden kohti α

Vp

6-ilmentäviä NSCLC-solujen

in vitro

kuin modifioitujen liposomien monomeerisen H2009.1 peptidi.

H2009 NSCLC-solut, jotka ilmentävät α

Vp

6, ruiskutettiin NOD /SCID-hiiriin, jolloin muodostuu ihon alle H2009 ksenografteja. Päivänä 18, sen jälkeen kun hiiret oli muodostunut palpoitavissa kasvaimia, niitä käsiteltiin HEPES puskuroitua suolaliuosta (HBS) kontrollina; vapaa, ei-liposomiin kapseloitu, doksorubisiini; α

Vp

6 kohdistetut 1,3% H2009.1 tetrameerisiä liposomaalinen doksorubisiini; tai ohjata liposomaalinen doksorubisiini muotoiluja. Kaksi eri liposomiformulaatioita käytettiin ei-kohdennettu valvonta: 1,3% ”alasti”, no peptidi, liposomit ja 1,3% scH2009.1 tetrameerisen liposomeja. 1,3% paljaalla liposomit toimivat normaali, ei-peptidi-kohdennettuja liposomi-ohjaus, joka on vain kerääntyä passiivisesti kasvaimia perustuu EPR vaikutus. 1,3% scH2009.1 tetrameerisiä liposomeja näyttää sekvenssiltään sekoitettua version H2009.1 peptidin, joka ei kohdistu α

Vp

6; Siksi nämä liposomit toimivat kontrollina spesifisyyden H2009.1 peptidin ja vakuuttaa, että maksun ja hydrofiilisyyden peptidi ei ajo kasvain kertymistä. Hiirille häntälaskimon kautta suonensisäisiä injektioita kerran viikossa 3 viikkoa 4 mg /kg kutakin liposomiformulaatiota, joka perustuu koko doksorubisiinin, päivinä 18, 25 ja 32 sen jälkeen, kun kasvainsolujen istutuksen. Tämä hoito-ohjelma antaa suurimman sallitun käyttöiän annos NOD /SCID-hiiriin aikana 2 viikkoa [56]. Injektio viikossa valittiin perustuu aiempiin tutkimuksiin; useammilla injektioilla pienemmällä annoksella ovat osoittautuneet olevan samanlaisen tehokkuuden kuin suurempi viikoittainen annos muiden liposomien, joilla on sama lipidiformulaatio [2,16,57,58].

Kuten kuviossa 1A, kaikki liposomi formulaatiot inhiboi merkittävästi kasvaimen kasvua verrattuna kontrolliryhmään HBS hoidetussa ryhmässä, jossa on p-arvot alle 0,001. Kuitenkin, mitään eroa ei havaittu mitään liposomiformulaatioiden. Tavoiteltu 1,3% H2009.1 tetrameerinen liposomien inhiboi kasvaimen kasvua samassa määrin kuin sekä ohjaus scH2009.1 tetrameerinen tai paljaalla liposomeja. Kasvain kasvu on lähes sama jopa päivä 64, jossa vaiheessa scH2009.1 tetrameerisen käyrä erottuu hieman, mutta on silti sisällä virhemarginaalin on H2009.1 tetrameerinen ja alastomia Liposomiryhmissä. Tärkeää on, tämä vaikutus on toistettavissa; data kuviossa 1A edustavat yhdistelmä useiden erikseen kokeita.

ihonalainen H2009 kasvaimia perustettiin vuonna kylkeen NOD /SCID-hiirissä. Kasvain hiiriä hoidettiin HBS (kontrolli) ja joko 4 mg /kg (

–

B

) tai 2 mg /kg (

C

–

D

) vapaan doksorubisiinin tai 1,3% H2009.1 tetrameerisiä, scH2009.1 tetrameerisiä tai alastomia liposomit, joka perustuu kokonaispitoisuus doksorubisiinin.

) Kasvaimen kasvu käyrät hiirissä, joita käsiteltiin 4 mg: lla /kg eri liposomiformulaatioiden osoittavat, että α

Vp

6-kohdistaminen 1,3% H2009.1 tetrameerinen liposomit inhiboivat kasvaimen kasvua samaan määrin kuin ohjaus scH2009.1 tetrameerisiä ja alasti, ei peptidi, liposomit. (

B

) Kaplan-Meier-eloonjäämiskäyriä hiirissä, joita käsiteltiin 4 mg: lla /kg eri liposomiformulaatioiden osoittavat, että kaikki liposomin hoidot lisäävät merkittävästi eloonjäämistä verrattuna kontrollihiiriin (p 0,0001 varten H2009.1 tetrameeristä ja alastomia liposomit ja p = 0,0007 varten scH2009.1 tetrameerista liposomit), ja käsittelemällä H2009.1 tetrameerisen liposomit kasvattaa selviytymisen verrattuna hoitoon ohjaus scH2009.1 tetrameeristä liposomeja (p = 0,0068). (

C

) Kasvaimen kasvu käyrät hiirissä, joita käsiteltiin 2 mg /kg eri liposomiformulaatioiden osoittavat, että vapaan doksorubisiinin ja kaikki liposomiformulaatioiden huomattavasti estää kasvaimen kasvua verrattuna kontrollihiiriin, ja kaikki 3 liposomiformulaatioina estää kasvaimen kasvua samassa määrin tasoilla huomattavasti parempi kuin vapaan doksorubisiinin. (

D

) Kaplan-Meier-eloonjäämiskäyriä hiirissä, joita käsiteltiin 2 mg /kg eri liposomiformulaatioiden osoittaa mitään merkittävää selviytymisen eroa hiiret käsiteltiin joko vapaan doksorubisiinin tai liposomin formulaatioissa. (

E

F

) vertailtava kasvaimen kasvua (

E

) ja eloonjäämisen (

F

) hoidettujen hiirien 4 mg /kg tai 2 mg /kg 1,3%: H2009.1 tetrameerinen liposomeja osoittaa, että 4 mg /kg hoito oli merkittävästi parempi tuumorin kasvun ja merkittävästi lisääntynyt eloonjääminen (p = 0,0005). Nuolet osoittavat hoito päivää. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0.001verses ohjaus, ellei toisin ole merkitty suluissa.

Kaiken Hiirien selviytyminen on eri hoito määritettiin myös. Vapaa, ei-liposomiin kapseloitua, doksorubisiini osoittautui hiirille myrkyllinen tässä 4 mg /kg tapahtuvan annostelun. Vapaan doksorubisiinin hoidetut hiiret kuolivat kaikki päivänä 32, ennen kuin se sai kolmas ja viimeinen annos lääkettä. Näin ollen, kaksi injektiota 4 mg /kg doksorubisiinia, yhteensä 8 mg /kg doksorubisiinia, on riittävä lääkeaineen aiheuttamaa toksisuutta meidän tutkimuksissa. Kaikki muut hiiret elivät, kunnes ne tapettiin, koska niiden kasvaimia saavuttaa pituus 2 cm: n (kuvio 1 B). Kuten odotettavissa kasvaimen kasvun käyrät, oli merkittävä selviytymisen ero kontrolliryhmän ja kaikkien liposomin hoitoryhmissä (p 0,0001 1,3% H2009.1 tetrameerinen ja alastomia liposomit ja p = 0,0007, että 1,3% scH2009 0,1 tetrameeristä liposomeja). Kun taas kolme 1,3%: H2009.1 tetrameerinen liposomin käsitellyt hiiret elivät pidempään kuin mitä tahansa 1,3% paljaalla liposomin käsitellyillä hiirillä, nämä erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä. Kuitenkin, oli merkittävä säilyminen eroa käsiteltyjen hiirten 1,3%: H2009.1 tetrameerinen ja scH2009.1 tetrameeristä liposomit (p = 0,0068). Näin ollen vaikka hoidon 1,3% H2009.1 tetrameerisiä liposomit ei parantunut terapeuttinen teho on 4 mg /kg annostuksen hoito verrattuna ei-kohdennettu alasti liposomeja, nämä α

Vp

6 kohdistetut liposomit elonjäämisetua kontrolliin verrattuna peptidin scH2009.1 tetrameerinen liposomeja.

Effects of Liposome Annostus on in vivo tehokkuus on H2009.1 Peptide liposomit

Koska ei ollut lisääntynyt terapeuttista hyötyä 1,3% liposomien näyttämällä H2009.1 tetrameerisen peptidi jakeet hallita alasti liposomeja, päättelimme, että α

Vp

6 kohdistamisesta on H2009.1 peptidin liposomeja voidaan naamioida teho paljain liposomeja hoitoon pitoisuuksilla 4 mg /kg (12 mg /kg yhteensä). Tämä voi johtaa kyllästämällä reseptoria niin, että erot aktiivisten ja passiivisten kohdentaminen ovat vähentyneet.