Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hyaluronaani sidottu proteiini 1 (HAPLN1), jonka on osoitettu olevan erittäin ilmaistaan ​​pahanlaatuinen keuhkopussin mesotelioomatapausten (MPM), havaittiin seerumissa käyttäen sähkökemiallista pinta-painamista menetelmällä. Ensimmäinen, havaitsemismenetelmä on optimoitu käyttäen naudan seerumin albumiinia (BSA) mallina proteiinin matkia optimaaliset edellytykset, jälki samanlaisia ​​proteiinien molekyylipainon HAPLN1. BSA painettu kultaa elektrodi terminaalisen hydroksyyliryhmän alkaani tioleja, joka muodosti itseasentuvalla yksikerroksisen (SAM) noin BSA. Analyytin (BSA) ja pestiin sitten pois, ja sen merkintä (tyhjä ontelo muistimetallin) käytettiin havaitsemiseen BSA: ta liuokseen, käyttäen sähkökemiallista avoimen piirin potentiaali menetelmällä, nimittäin potentiometrisesti. Tekijät pitää optimoida olosuhteet sisältävät inkubaatioaika, proteiinipitoisuus, toteamisraja ja koko elektrodin. Matrix laserdesorptio -ionisaatio lennon (MALDI-TOF MS) käytettiin varmistamaan valikoivuus painatuksia. Kun saatu painamista säätöparametrit, HAPLN1 oli painettu kahtena ja havaitsemiseen spiked HAPLN1 onnistuneesti suoritettu seerumissa.

Citation: Mathur A, Blais S, Goparaju CMV, Neubert T, Pass H, Levon K ( 2013) kehittäminen Biosensori keuhkopussin mesoteliooma Cancer biomarkkereiden käyttö Surface Imprinting. PLoS ONE 8 (3): e57681. doi: 10,1371 /journal.pone.0057681

Editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 10, 2012; Hyväksytty: 28 tammikuu 2013; Julkaistu: 13 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Mathur et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus on rahoittanut armeijan avustuksen (W911NF-09-1-0499) varten Potentiomeric havaitsemiseen taudinaiheuttajia. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mahdollinen parannuskeino syöpään olisi todennäköisempää, jos tauti voitaisiin havaita varhaisessa vaiheessa optimoimiseksi hoitomenetelmien. Solunulkoisen matriisin (ECM) on sen merkitys paitsi fyysiset eri soluissa, mutta myös solu-vuorovaikutuksiin, solu signalointi ja solujen korjaus prosesseja. Siksi ECM proteiinit itse aiheuttaa mahdollisen seurannan kohde heijastaa meneillään olevista muutoksista. Jos muutoksia tapahtuu, koska läsnä on sairaus, kuten syöpä, havaitseminen nämä muutokset olisi oletetun ilmaiseminen syövän ennen oireiden ilmaantumista. Esimerkiksi, heparanaasin entsyymiä [1], endo-ß-glucoronidase, on monitoiminen entsyymi vaikuttaa päävaiheita kehittäminen lukuisia erityyppisiä syöpiä, kuten ma- [2], ei-pieni keuhkosyöpä [3], ruokatorven [4] , pään ja kaulan [5], rintojen [6] ja haiman [7] syöpiä esimerkkeinä.

HEPARANASE pilkkoo entsymaattisesti hepariinisulfaatti- ja seriiniproteinaa- ja metalloproteinaasien on keskeinen rooli soluväliaineen remodeling liittyy sekä in situ kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden liittyvät hyökkäystä syöpäsoluja. Entsymaattisesti inaktiivinen muoto heparanaasin on osoitettu vaikuttavan solun signalointi, ja mikä lisää syövän kasvun voimistumista useiden geenien ilmentymisen [8]. Kaupalliset biomarkkereita seurantaan asbestin aiheuttama mesoteliooma aktiivisuus ovat Mesothelin ja liukenevia Mesothelin liittyvä peptidi (SMRP). Osteopontiinin (OPN) ja CA125 on vastaavasti liittyneet syöpään liittyvät heparanaasin aktiivisuutta lisäksi hyaluronaani, TRA ja ferritiini. ECM remodeling tapahtumat voivat varmasti tavoite diagnoosin varhaisessa vaiheessa syöpä hyökkäys [9] sekä tavoitteet anti-syöpä hoitoja. Hyaluronihappo (hyaluronaani, hyaluronate, HA) on lineaarinen, on hyvin suuri moolimassa glykosaminoglykaani, on yksi runsaimmin ECM-proteiineja. HA on osoitettu esiintyvän suurina määrinä ja peräsuolen, munasarjan epiteelin, ja rintasyöpiä [10] – [12] ja myös kasvaimen kasvun inhibitio on osoituksena kun HA sitovat motiivit ovat kärsineet [13]. HA yliekspressio on suuresti riippuvainen CD44, joten sääntelyä virtsarakon syövän kasvua, invaasio ja angiogeneesi oli osoittautunut tapahtua CD44 HA-syntaasi-1 ilme [14]. Koska HA ilmaisua näyttää selvästi kohonnut ulkonäkö syöpä ei ole yllättävää, että Ivanova et al ovat osoittaneet, että myös HAPLN1 proteiini, joka auttaa yhdistämään proteoglykaanien on HA ydin, on osoitettu olevan koholla syöpäsoluja.

Pahanlaatuinen keuhkopussin mesoteliooma on harvinainen maligniteetti asbestin aiheuttama altistuminen, joka on huono ennuste. Ruston link-proteiinin HAPLN1 tutkitaan ehdokkaaksi biomarkkerina, havaittu yliekspressoituvan mesoteliooma vaiheessa 1 yhdessä erittäin ilmaistaan ​​syöpä biomarkkereiden osteopontiinissa (OPN1) sijaitsee samassa geenissä setti [15]. Immunomäärityksiä käytetään yleisesti syövän havaitsemiseksi biomarkkerit, koska ne osoittavat parempia selektiivisyys, mutta se voi olla aikaa vievää ja kallista. Biologisia ominaisuuksia merkkiaineita, kuten heparanaasin korostavat suunnitella kustannustehokkaita menetelmiä, joilla voidaan havaita varhaisessa vaiheessa tällaisten biomarkkereiden seerumissa ja kudoksissa sekä diagnostisia ja prognoositarkoituksessa sekä seurantaan syöpähoitojen.

Myös havaitseminen hyvin alhainen pitoisuus kuten biomarkkereita ELISA-testit on vaikeaa. Siksi on kiireesti kehittää uusia teknologioita, jotka ovat nopeita ja erittäin herkkä havaitsemaan pieninä pitoisuuksina biomarkkereita. Varhainen diagnoosi antaa enemmän aikaa syövän hoitoon, mikä on ratkaisevan tärkeää tallentaa elämää. Molekyylimuottipolymeerit harkitaan sopivana korvikkeena vasta-aineisiin perustuvia järjestelmiä biosensorit ansiosta parempi vakaus ja uudelleenkäyttöä bio-tunnustamista pinnat [16]. Biosensorit koostuvat kahdesta osasta, bio-reseptorin elementti ja signaalitransduktion komponentti. Bio-reseptorin pinta valmistettu molekyylimuottipolymeerit olisi kaksi suuruusluokkaa edullisempi vasta-aineita. Koska hinta hydroksianalogin alkaanitioli polymeeri maksaisi noin $ 0,2-0,6 mg

-1 verrattuna vasta, jotka vaihtelevat kohteesta riippuen. Vasta-aineilla kohdentamiseksi ihmisen HAPLN1 proteiini maksaisi noin $ 900 $ 1000 mg

-1. Jopa alhaisen tiheyden tällaisten vasta-aineiden immunoaffiniteetti- patruunat on korkeampi hinta kuin molekyylimuottipolymeerit, maksaa välillä $ 10 $ 100 mg-1. Korkea hinta HAPLN1 vasta nostavat HAPLN1 Elisa sarjat kaupallisesti saatavilla 10 $ /testi. Kun taas painettu kultapinnoitetulle Tunnistinsirussa (1 cm x 1 cm) maksaisi noin $ 1.2 /testi ja sitä voidaan käyttää toistuvasti useille testeille toisin kuin vasta-aineita, joita ei voida käyttää uudelleen.

Tutkimuksessamme pyrimme kehittämään työkalu varhaista havaitsemista biomarkkereita. Kohdeproteiinin molekyylit adsorboida pinnalla kullan elektrodin kanssa tiolien ja ne yhdessä muodostavat hyvin pakattu yksikerroksisen. Poistamalla proteiinimolekyylien SAM muodosta jälki kolot ja funktionaalinen hydroksyyliryhmä pääryhmän tiolien tarjoavat spesifisyyttä onkaloon. Täydentävyyteen kooltaan, muodoltaan ja hydrofobisuus tarjoaa affiniteetti saman molekyylin, jota on painettu.

painettu elektrodia käytetään sitten määrittämään malliin puskurissa käyttäen potentiometrisesti. Kuten veloitetaan proteiinimolekyylin puskurissa sitoutuu onteloihin se muuttaa potentiaali aistinelektrodin. Synteesi jälki pinta on yksinkertaista eikä vaadi mitään kallista tekniikkaa valmisteluun. Se on vanha, mutta lupaava teknologia, joka on kehittänyt haasteista on kohdannut aikaisemmin.

Vuonna 1930 Neuvostoliiton tiedemies MV Polyakov osoittaneet silikageeliä valmistettu liuottimen läsnäollessa lisäaineen osoitti ensisijainen sitova samaan liuottimeen [17]. Linus Pauling ja Frank Dickey julkaistiin vuonna 1949, että piidioksidi osoittaa spesifisyyttä väriaineet painettu pinnalla [18]. Läpimurtoa molekyyli- merkintä tapahtui vuonna 1972, kun Gunter Wulff valmistetaan molekyyli painettu orgaanisia polymeerejä käyttämällä kovalenttista sitova lähestymistapa, joka voi erottaa enantiomeerit glyseriinihappoa [19]. Wulff et ai. käytetyt lähestymistapaa, joka tuli tunnetuin molekyyli kuvaan tutkimusten aikana 70: n ennen kuin toinen teoria otettiin käyttöön vuonna 1981 Mosbach ja työtoverit. He loivat molekyyli painatuksia perustuvat ei-kovalenttisen sitoutumisen mallin [20]. Se oli yksinkertaisuus tämän lähestymistavan, joka laukaisi räjähdyksen 90: n molekyyli- painamista polymeerien. Olemme käyttäneet ei-kovalenttinen sitoutuminen lähestymistapaan käyttöön Wulff et al. jotta jälki HAPLN1 biomarkkereiden käyttämällä funktionaalisia hydroksyyliryhmiä siitä tioleja, jotka muodostavat heikon vuorovaikutusta proteiinin ja hyvin varustettu muotti ympäri sama. Tämä tarjoaa enemmän spesifisyys onteloon, jolloin poistaminen HAPLN1 ontelosta helpompaa. Jälki olosuhteet optimoitiin potentiometrisesti käyttäen BSA (66 kDa) proteiinia (kuvio 1), koska sen samankaltaisuus kooltaan HAPLN1 syöpä biomarkkereiden (65 kDa). Testasimme spesifisyyden painettu onteloita, käyttäen MALDI-TOF, suorittamalla testit osoittavat, että suhteellisesti pienempi proteiini Myoglobin (17 kDa) ei sitoudu BSA painatuksia.

(A-C) Lisätty proteiini sisällä SAM. (D) Pesu. (E-F) sitoutuminen BSA analyytin proteiinia, hemoglobiinin epäspesifinen kontrolli.

Materiaalit ja menetelmät

periaate potentiometrisen havaitseminen

meidän tekniikka, olemme käyttäneet potentiometrian havaitsemiseen kohdeanalyytin HAPLN1. Potentiometri mittaa välinen potentiaaliero referenssielektrodin (Ag /AgCl) ja työelektrodin. Analyytti sitoutuu bioreceptor pinnan työelektrodin puskuriliuoksessa, jolloin muutos potentiaaliero kahden elektrodin välillä. Tämä muutos mitataan sitten järjestelmä. Pienemmät biomacromolecular ionit eivät johda jännitteen, koska ne pysyvät tasapainossa elektrolyytti.

voimakas jännite vastausta tulokset macroions sitova kautta laaja makromolekyyliyhdisteiden vetysidoksen ympäri jälki On työelektrodin (Gold päällystetty piisiru ), suuri biomacromolecule rekombinantti HAPLN1, 65 kDa koko proteiinia kokoaa tiolien, jotka muodostavat järjestetty, tiheä SAM ympäri pitoisuudesta. Tiolit on taipumus itse koota sen kullan pinnalle rikin ryhmän takapäässä tiolien muodostaa rikkiä tallisidoksella kullalla [21]. Järjestäytynyt SAM on tärkeä ”tiiviste” vastaan ​​interferrents ja pieniä reikiä Loisten nykyinen. Makromolekyyli pestään sitten pinnasta, mikä johtaa muodostumisen onteloita. Painatetut elektrodi toimii bioreceptor elementti bioanturin. Siten painettu elektrodi toimii samoilla periaatteilla kuin kaupallinen ioniselektiivisissä elektrodeja, joilla on erityinen ionofori tunnistaa analyytin ioni. Osoitamme, että potentiometrian voidaan käyttää hyvä herkkyys ja selektiivisyys havaitsemaan kohdeyhdisteet syöpä biomarkkereiden puskuriliuoksessa ja teräviä seerumissa. Sähkökemiallinen, joka saatiin tässä tekniikassa on, koska on mahdollista muutoksen jälkeen sitovan mallin proteiinia. Muutos potentiaali mitataan suhteessa viite Ag /AgCl elektrodi [22], [23].

Materiaalit tarvitaan sähkökemiallisen mittauksen

naudan seerumialbumiinia (BSA) naudan verestä ( Mw = 66,3 K), Myoglobin hevosen luurankolihasten (Mw = 17,6 K), 11-merkapto-1-undekanoli (97%) (tioli), absoluuttinen etanoli, metanoli ja isopropanoli ostettiin Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Human HAPLN1 (64,68 kDa) täyspitkän ORF (AAH57808, 1-354 aminohapot) rekombinanttiproteiinin GST-tag N-terminaalinen hankittiin Abnova Corporation (Walnut, CA), ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Kaikki proteiinit ja kemikaaleja käytettiin vastaanotetussa muodossa. Kahdenlaisia ​​elektrodeja käytettiin aistinelektrodin: kulta (50 nm) sputteroitiin piikiekko (1 cm x 2 cm) ja kultaa elektrodit (2 mm

2) hankittiin BASI (West Lafayette, IN). Potentiometrinen mittaukset tehtiin 10 ml: ssa 1 x PBS: llä 20 ml: n lasipulloon, joka oli varustettu magneettisekoittajalla. Kun oli laimennettu 1 x pitoisuus, 10 x fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta Sigma Aldrich (St. Louis, MO), jolloin saatiin fosfaattipuskurin pitoisuus 0,01 M ja natriumkloridin konsentraatio 0,154 M, pH 7,4. Kahden elektrodin koostui Ag /AgCl, koska vertailuelektrodin ja piin päällystetty kulta siru kultaa elektrodi työelektrodina. Potentiaalit työelektrodin vastaan ​​vertailuelektrodi mitattiin kanssa Accumet AR15 potentiometrin hankkia Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) ja EMF 16 kanavan Sähkökemiallinen Interface ostettu Lawson Labs (Malverin, PA) B

Materiaalit tarvitaan MALDI TOF

Gold tähyslevyä ostettiin Bruker Daltonics (Billerica, MA). TA-liuosta (0,1% trifluorietikkahappo /asetonitriili, 02:01, vol:vol) ja sinapiinihappoa ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ja matriisin valmistamiseksi immobilisoimiseksi sitoutuneen proteiinin pinnalla kohde levyn . Bruker AUTOFLEX MALDI-TOF ostettu Bruker Daltonics (Billerica, MA) käytettiin määrittämään spesifisyys proteiinin sitoutumista vastaaviin painatuksia pinnalla kohde levyn. Kemikaalinkestävä mukautuva PTFE (Teflon) Nauha hankittiin CS Hyde yritys (Lake Villa, IL). Typpikaasua toimitti Presto-O-Sales and Services (LIC, NY).

BSA Sensor Fabrication

piisiru puhdistettiin sonikoimalla deionisoidulla vedellä, metanolilla ja isopropanoli. Piisiru annettiin kuivua yön yli ja sitten sputteroitiin kullalla. Kulta päällystetty hake pestiin sitten deionisoidulla vedellä ja kuivattiin puhtaalla typpikaasulla. Samoin kultaa elektrodit puhdistetaan 0,1 ja 0,05 mikronin alumiinioksidia ja sonikoitiin sitten deionisoidulla vedellä poistaa kaikki sitoutuneen alumiinioksidin hiukkasia. Koska proteiinien denaturoimiseksi ei-vesiliuoksessa, ja tiolit osoittaa huono liukoisuus vesipitoiseen liuokseen proteiinit liuotettiin deionisoitua vettä kun taas tioleja liuotettiin absoluuttiseen etanoliin. Vaarantamatta sekoitettu liuokset 19:1 ja 18:2 (water: etanoli) kanssa lopullinen tiolin 0,1 mM ja 0,2 mM valmistettiin puhdas lasiastioissa ja vertaile- saavuttaa hyvä liukoisuutta tiolien ja välttää proteiinisaostus. Kullan päällystetty elektrodi upotetaan sitten sisälle sekoitetun liuoksen muodostamiseksi itse koottua yksikerroksista proteiinia ja tioli. Pää tila säiliö on täytetty inertillä typpikaasulla ja peitetään parafilmillä. Inkubointiaika siru sekaliuoksen vaihdeltiin paremman painettu pinta. Kullan siru on huuhdeltava huolellisesti deionisoidulla vedellä poistaa sitoutunut proteiini. Myös eri proteiinien pitoisuudet 30 ug /ml, 10 ng /ml ja 1 ng /ml, käytettiin muodostamaan painatuksia ja sitova tuloksia verrattiin. Elektrodit valmistetaan käytettiin sitten tarkistaa sitovia vaste vaihtelevalla BSA pitoisuudet puskuriliuoksessa.

valmistelu Imprints MALDI-TOF tähyslevyä

Lukuun sisältävän pinnan 384 kaivoja, loput kulta tähtäintaulu (8 cmx12.5 cm) peitettiin reaktiivinen Teflon teipillä. Kulta tavoite pinta puhdistetaan etanolilla ja deionisoidulla vedellä. Hallittu virtaus inerttiä typpikaasua käytetään kuivaamaan kohdepintaan. Liuos A valmistettiin käyttämällä 19:1 seos 16,17 mg myoglobiinia (eli 1,7 uM) 540 ml: ssa deionisoitua vettä ja 0,22 g 11-merkapto-1-undekanoli (eli 2 mM) 540 ml: ssa absoluuttista etanolia. Tämä liuos muodostui luoda myoglobiinia painatuksia puolet kullan tähyslevyn. Liuos B sisälsi 19:1 suhde seosta (water: etanoli) ja 16,17 g naudan seerumin albumiinia (eli 0,432 uM) liuotetaan 540 ml: aan deionisoitua vettä ja 0,22 g 11 mercapto1-undekanoli (eli 2 mM) 540 ml: ssa absoluuttista etanolia. Tämä valmistettiin luoda BSA painatuksia toisella puoliskolla kullan tähyslevyn. Puolet Au Levy upotettiin liuos A 12 tuntia yhteistyöhön imeä proteiinin ja tioli, minkä jälkeen se kuivattiin puhtaalla typpikaasulla. Samoin toinen puoli kullan tähtäinlevy upotetaan liuokseen B 12 tuntia ja kuivattiin puhtaalla typpikaasulla. Proteiini ja tioli pitoisuudet pysyivät samat kuin käytettiin kuvaan kultaa elektrodi potentiometrisesti. Onkalot ovat täydentävät mallin proteiinien luotiin yksikerroksista poistamalla proteiini molekyylien läpi toistuvia huuhtelu deionisoidulla vedellä. Ratkaisu C valmistettiin ekvimolaariset seoksella 1 ng /ml BSA: ta ja myoglobiinin 540 ml deionisoitua vettä. Tämä liuos muodostui määritystä proteiinin sitoutumista kaksi erilaista onteloita kulta kohde levyn pinnalla. Wells kohdepinnalla jaettiin neljään neljännestä (kuva 2) ja kaivoja rivi I (1-24) P (1-24) kastettiin 10-15 minuuttia liuoksessa C. pinta huuhdeltiin varovasti ja annetaan kuivaa typpikaasua käyttäen. Sitten 1 ui SA matriisin lisätään kohde ja sen annettiin kuivua. No rivillä A (1-24) ja H (1-24) käytettiin verrokkitutkimuksiin. Tavoite Sitten levyä käytettiin MALDI- TOF analyysiä.

Pylväät (1-12) varten myoglobiinia ja sarakkeita (13-24) ja BSA kuvaan sivustoja. Rivit I P upotettiin analyyttiliuos C, joka sisältää sekä analyytin proteiineja.

HAPLN1 Sensor Fabrication

HAPLN1 proteiini on yli ilmaistu suurin mesotelioomatapausten ja näin ollen sitä pidetään potentiaali biomarkkereiden syövän havaitsemiseen. Puhtaaseen lasiastiaan 20 ug HAPLN1 (64,68 kDa) proteiinin, liuotettiin 10 ml: aan deionisoitua vettä (eli 0,03 uM) ja 4 mg 11-merkapto-1-undekanoli liuotettiin 10 ml: aan etanolia (eli 0,1 mM) . Liuos, joka on muodostettu liuottamalla molemmat ratkaisut 19:1 suhde (water: etanoli), siten että lopullinen pitoisuus tiolin liuos tulee 0,1 mM. Kolme kultaa elektrodit A, B ja C kastettiin liuokseen 12 tuntia ja sitten elektrodit huuhdeltiin huolellisesti deionisoidulla vedellä, jotta sitoutuneen proteiinin pinnalla.

Sensor vastauksena HAPLN1 piikki seeruminäytteistä

HAPLN1 leimatun elektrodeja käytettiin myös potentiometrisillä vastaus syövän biomarkkereiden Piikitin seerumissa. 100 nM kantaliuoksesta 01:08 seerumissa ja puskurin suhdetta valmistettiin laimentamalla 100 ui ihmisen seerumin kanssa 650 ul: ssa 1 x PBS-liuosta ja 250 ui kaupallista 102 ug /ml HAPLN1 liuosta (eli yhteensä 25,5 ug HAPLN1). HAPLN1 pitoisuus varastossa Sitten liuos 6,5 ug /ml (100 nM). 10 ui liuosta käytettiin titrauksessa 10 ml PBS-puskuria, ja korkein pitoisuus proteiini on 10

-9 M. Jäljellä standardit valmistettiin pitämällä samalla laimennusnopeuden (1:08) seerumia puskurissa mutta analyytin pitoisuus pieneni kymmenen kertaa serial 6,5 mikrog /ml (100 nM) standardin piikki ratkaisu.

tulokset

optimointi parametrit BSA Sensor

BSA proteiinimolekyylien olivat painatus terminaalisen hydroksyyliryhmän alkaani tioleihin kullan pinnalla. Koska tiolit muodostavat järjestäytyneen yksikerroksista kanssa aikaa kulta pinta oli ratkaisevaa tutkia itämisaika aika kultapinnoitetulle piisiru sisällä proteiini-tiolia ratkaisu saavuttaa vakaan painatuksia. Tässä kokeessa BSA sekoitetussa liuoksessa oli 30 ug /ml, ja kuvio 3a esittää vaikutuksen inkubaatioajan vakautta painatuksia. Kolme elektrodia valmistettiin pitämällä hakkeen sisällä liuos 2, 6 ja 12 tuntia. Liuosseos tässä kokeessa oli suhdeluku 18:2 (water: etanoli) ja 0,2 mM 11 mercapto1-undekanoli. Kaikki mittaukset tehtiin fosfaattipuskurissa keittosuolaliuosta (pH 7,4), 10 ml liuosta. Logaritminen potentiaalin kasvua havaittiin lisäämällä BSA pitoisuus puskurissa vain elektrodin, joka inkuboitiin 12 tunnin ajan. Tulokset osoittivat, että vakaampi painatuksia muodostettiin kun siru pidettiin liuoksessa 12 tuntia. Kokeet suoritetaan sitten optimoida olosuhteet saavuttaa vakaan proteiinin painatuksia. Potentiometrinen vaste tutkittiin vaihtelemalla BSA painettu elektrodin muodostamiseksi onteloita. Tässä kokeessa kaksi elektrodia valmistettiin käyttämällä kahta eri pitoisuuksia 30 mikrog /ml ja 1 ng /ml BSA sekoitetut liuokset proteiinia ja tioli.

. Vaikutus vedessäoloaikaa 2 tuntia (___), 6 tuntia (…) ja 12 tuntia (—). B. Vaikutus proteiinikonsentraatio 30 ug /ml (▴, x) ja 2 ng /ml (◊, △). C. Vaikutus proteiinia 10 ng /ml (□) ja 1 ng /ml (▴) ja valvonta SAM vain (x, ◊).

Nämä sekoitetut liuokset valmistettiin 19 :1 suhde (water: etanoli), jonka lopullinen pitoisuus on 0,1 mM 11-merkapto-1-undekanoli. Inkubointiaika pidettiin 12 tuntia, koska tämä on esitetty tukemaan muodostumista vakain painatuksia.

Kuten on esitetty kuviossa 3b, logaritminen kasvu potentiaalin muutos tapahtuu kasvua proteiinipitoisuus . Vastaus elektrodi on valmistettu 30 ug /ml proteiinia kuvaan pitoisuus on paljon suurempi verrattuna muihin elektrodi valmistetaan pienemmällä proteiinin painamista pitoisuutta. Tämä osoittaa, että joukko onteloita, jotka on muodostettu pinnalle kasvaa lisää proteiinin pinnalle adsorboidun. Isoelektrisen pisteen proteiini on määritelty pH, jossa nettovaraus on proteiinin pinnalla on nolla. Koska BSA molekyyleillä on isoelektrinen piste on 4,7 niillä on negatiivinen nettovaraus, puskuriliuoksessa, jonka pH on 7,4. Mitä enemmän varautuneita molekyylejä sitoutuvat elektrodin pintaa, se johtaa jyrkkä muutos mahdollisia. Tulokset toistettiin onnistuneesti vahvistusta. Kuva 3b osoittaa myös suuremman potentiaalisen muuttuessa 19:1 (water: etanoli) suhde, kun verrataan 18:2 suhde kuviosta 3a. Tämä tulos osoittaa, että enemmän onteloita on muodostettu tiolin liuoksessa vähenee. Sopeuttaminen prosessia ja valmistella herkempiä elektrodeja, alhainen painamista pitoisuudet 1 ng /ml ja 10 ng /ml valittiin perustuvat aiempien kokeelliset tiedot. Kokeet suoritettiin kullalla elektrodi paljon pienempiä pinta-ala (2 mm

2). Työelektrodi valmistettiin 19:1 (water: etanoli) suhteen, jossa lopullinen konsentraatio on 0,1 mM 11-merkapto-1-undekanoli. Kuten kuviossa 3c elektrodi osoittaa erityisesti hyvää sitoutumista vaste 15-20 mV hyvin pieninä pitoisuuksina BSA verrattuna alhaisen sitoutumisen vaste 2-4 mV havaittu valmis ohjauselektrodit, joilla on vain SAM niiden pinnalla.

Validation käyttäen MALDI-TOF

tässä kokeessa 1 ui matriisi asetettiin päällekkäin kuoppaan painettu Maldi levylle ja annettiin kuivua. MALDI levy analysointiohjelmisto algoritmi keräämään tietoja pyyhkäisynopeudella 2000 laser shot /s kunkin täplän hyvin valittiin. Koska puolet 384 kuoppiin MALDI levy painuivat BSA ja toinen puoli myoglobiinin proteiinia, satunnaisesti viisi kaivot valittiin myoglobiinia painettu kaivoista ja vastaavasti viisi valittiin BSA painettu kaivoja, määrittämään proteiinin sitoutuneen onteloita. Kuten on esitetty kuviossa 4, kolme-merkki symboli m /z x-akselilla käytetään massaspektroskopia tarkoittamaan dimensioton määrä, on muodostettu jakamalla massan ionin yhtenäinen atomimassayksikköä sen vastaava määrä.

. Myoglobin painettu kaivoja ja B. BSA painettu kuoppiin.

Y-akseli näyttää signaalin voimakkuuden, vaan käyttää laskee sekunnissa (cps), yhteinen menettely on suhteuttaa intensiteetin suhteellinen runsaus kanssa käyttöä, jos sisäinen standardi. Kuten kuviossa 4a on esitetty myoglobiinin jonka molekyylipaino 17 kDa havaittiin sitoutua vain myoglobiinia painettu kaivoihin huippu esiintyy 17 kDa: n kullekin hyvin, eikä myoglobiinin havaittu BSA onteloita, kuten on esitetty kuviossa 4b. BSA havaittiin olevan liian suuri molekyylipaino näissä ionizations olosuhteissa.

HAPLN1 Sensor

Kun BSA tutkimukset optimoida edellytykset painamista Biomacromolecules, HAPLN1 painettu elektrodit valmistettiin alhaisen pitoisuuden havaitseminen biomarkkereiden. Kolme painettu elektrodit tutkittiin tarkistaa vasteen havaitsemisen jälkeen. Kaksi erillistä koetta osoittavat jyrkkä 25 mV muutoksen mahdolliset erittäin alhaisilla HAPLN1 pitoisuudet 10

-12 M, kun HAPLN1 titrattiin puskuriliuosta (kuvio 5a). Kontrollina, BSA myös titrattiin samoissa olosuhteissa osoittaa hyvin vähäinen vaste korkeilla BSA pitoisuuksina. Koe suoritettiin sitten seerumin Piikkipallolla HAPLN1 pitoisuus. Kuviossa 5b on esitetty, että painettu elektrodi on suuri drift seerumin mutta osoittaa merkittävää potentiaalia muutos 10

-9 M pitoisuus HAPLN1 seerumissa.

. HAPLN1 sitoutuminen HAPLN1 painatuksia (kaksi erillistä koetta), Ohjaus BSA vastaus HAPNL1 painatuksia. B. Spiked HAPLN1 analysoitavan seerumin ratkaisu HAPLN1 painatuksia.

Keskustelu

syövän havaitseminen biomarkkerit kanssa edullinen ja helppo käyttää menetelmässä on tärkeää jatkuva seuranta useiden markkereita. HAPLN1 on esimerkki kasvava merkitys alalla kuten esimerkiksi Nelson et al [24] äskettäin valmistunut transcriptome analyysin verisuonisto (BEC) ja imusuonten endoteelisolujen (LEC) ja ryhmittely analyysi osoitti selvästi ero geenien ilmentyminen varten BECS ja LEC . HAPLN1 oli toiseksi korkein ilmaistu geeni LEC ja kasvaimia hyödyntää näiden metastaattisen mahdollisten edistävää molekyylejä, havaitut korkeat HAPLN1 ilmaisu voi johtaa uusiin terapeuttisia hoitoja etäpesäke syövän imusolmukkeisiin. Kaksiulotteinen molekyyli imprinting tekniikkaa on käytetty menestyksekkäästi jälki ja havaita pieniä molekyylejä [25] – [29] kaltaisia ​​peptidejä mutta painamista makromolekyylejä pysyi haastava tehtävä. Biologiset makromolekyylit kuten proteiinit on korkea molekyylipaino ja sen vuoksi niiden suuri koko estää adsorption pinnan ja poistamista valmiista jälki [30] – [33].

suuri määrä sitoutumiskohtia ja toiminnallinen ryhmät proteiinin pinnalla voi lisätä liittyviä ongelmia ei-spesifisen sitoutumisen molekyylitasolla painettu proteiinien (vähimmäistuontihintoja), mikä johtaa huonoon selektiivisyyteen [34]. Sen vuoksi on tärkeää optimoida kaikki tarvittavat parametrit ja olosuhteet vakauden säilyttämiseksi niin suuria rakenteita koko prosessin painamista. Valitsimme BSA-proteiinia (65 kDa) optimoinnin prosessi, koska sen samankokoisia syövän biomarkkereiden ehdokas HAPLN1. Kuviossa 3a ja kuviossa 3b vakaampi painatuksia on muodostettu 12 tunnin inkubaation ajan ja kasvu vastaus tapahtuu, kun enemmän kohdemolekyylit merkintä 30 ug /ml verrattuna 1 ng /ml pitoisuus. Samanlaisia ​​olosuhteita käytettiin Wang et al [35] osoittaa, kuinka painojälki muodostuu erikokoisia proteiinit ovat erittäin spesifisiä niiden jäljen elektrodin avulla potentiometrisillä havaitsemista. MALDI TOF tekniikkaa on käytetty uutta menetelmää työmme vahvistaa spesifisyyden jälki sivuston, myös osoittanut potentiometrisesti havaitsemiseen. Kuvio 4 esittää myoglobiinin proteiinit sitoutuvat spesifisesti sen painettu onteloita eikä BSA onteloita. Uskomme, että koska myoglobiinin proteiinit ovat kooltaan paljon pienempiä (17 kDa) verrattuna BSA, myoglobiinia eivät sovi BSA muottiin ja näin ollen ole sitovia suurempiin BSA onteloita. Tulokset BSA erityisyyttä ei ole voitu vahvistaa MALDI-TOF heikon Laitteiden herkkyyden korkean molekyylipainon sisältäville proteiineja. Olemme käyttäneet potentiometrisillä havaitsemiseen optimoimiseksi elimiä BSA ja havaitsemiseksi HAPLN1 puskurissa ja teräviä seerumissa. Tuloksemme kuviossa 5a 25 mV vaste HAPLN1 on HAPLN1 painettu elektrodin verrattuna alhaisen vasteen BSA-proteiinia puskuriin ja samanlaisia ​​tuloksia saatiin piikki seerumissa. Vaikka näytämme potentiometrisessä saadun vasteen on spesifinen proteiini painettu ja on seurausta proteiinin sitoutuminen, selkeä käsitys tällä hetkellä puuttuvat sähkökemiallisen signaalin (mahdollinen muutos) aiheuttama proteiinin adsorptiota. Useita mekanismeja on ehdotettu muun muassa Thompson et al. Hän ehdottaa tekijöitä, jotka voivat osallistua muuttua työn toiminto [36] kultaa kun proteiini sitoutuu kullan pinnalle ja siten osoittaa, miten työn muutos toiminto aiheuttaa pinnan muutos potentiaalia. Tulevaisuudessa kokeissa aiomme edelleen tarkistaa spesifisyyden HAPLN1 proteiinin sitoutumista jälki onteloita pinta plasma resonanssin teknologia (SPR) ja myös saada kliinistä tietoa vahvistettavaksi.

Johtopäätökset

Meidän tuloksemme osoittavat käyttö SAM muodostaen vesiliukoisia hydroksyloitu alkaanitiolit juurruttaminen Biomacromolecules. BSA osoittautui olevan tehokas malli proteiinin ohjauksen optimoimiseksi parametrit, kuten proteiinin pitoisuus, suhde molekyylikomponentit, ja inkubaatioaika siru sopeuttaminen prosessi painamista havaitsemiseksi pieninä pitoisuuksina proteiineja. Molecular Imprinting pohjainen bioanturin onnistuneesti rakennettu tunnistamaan pahanlaatuinen keuhkopussin mesoteliooma syöpä biomarkkereiden HAPLN1 ja osoitti suurta herkkyyttä havaitsemalla alhainen pitoisuus biomarkkereiden seerumin /puskuriliuokseen. Anturi osoitti toteamisrajalla pikomaolaarisessa pitoisuuksien kanssa vasteaika 2-5 minuuttia. Alhaiset kustannukset anturi perustuu siihen, ettei kalliita monoklonaalisia vasta-aineita, ylimääräisiä merkintöjä molekyylejä ja yksinkertaisuus avoimen piirin potentiaali mittaus potentiometri, joka on myös erittäin helppo käyttää (samanlainen kuin pH-mittari).