Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Perimän uudelleenjärjestelyjä joihin ETS perheen transkriptiotekijöiden esiintyy 40-70% eturauhassyövän tapauksista. ERG ja ETV1 ovat yleisimpiä ETS jäsenistä havaittu tässä geneettisiä muutoksia. Korkea esiintyvyys Järjestelyjen ja sen biologinen merkitys edustaa uutta terapeuttista tavoite eturauhassyövän hoitoon.

Menetelmät ja havainnot

raportoi äskettäin kehitystä YK-4-279, joka on pienmolekyylisalpaaja- EWS-FLI1 onkoproteiinin in Ewingin sarkooma. Koska ERG ja ETV1 kuuluvat samaan luokkaan ETS tekijöitä FLI1 testasimme kykyä YK-4-279 estämään biologisten toimintojen ERG ja ETV1 proteiineja eturauhasen syöpä. YK-4-279 esti ERG ja ETV1 välitteisen transkription aktiivisuuden lusiferaasianalyysissä. YK-4-279 myös vähentynyt ERG ja ETV1 myötävirtaan kohde-mRNA ja proteiini ilmaisun

ETV1

-fusion positiivinen LNCaP ja

ERG

fuusio positiivisia VCAP soluja. YK-4-279 vähensi motiliteettia LNCaP solujen naarmu määrityksessä ja invasiivisen fenotyypin sekä LNCaP ja VCAP solujen HUVEC invaasiomääritys. Fusion-negatiivinen PC3-solut vastetta YK-4-279. SiRNA välittämä ERG knockdown in VCAP soluissa johtivat lääkkeen reagointikykyä. Samanaikaisesti ohimenevä ERG ilmentymistä PC-3-solujen lisännyt invasiivisia potentiaali, joka väheni YK-4-279.

Johtopäätös

Nämä tiedot osoittavat, että YK-4-279 estää ERG ja ETV1 biologista aktiivisuutta fuusio-positiivisten syöpäsolujen mikä alentaa motiliteetin ja hyökkäystä. Siksi YK-4-279 voi vaikuttaa etäpesäkkeitä eturauhasen syöpä ja se voidaan edelleen arvioida sen kliiniset sovellukset eturauhassyövässä lisäksi Ewingin sarkooma.

Citation: Rahim S, Beauchamp EM, Kong Y, Brown ML, Toretsky jA, Uren A (2011) YK-4-279 Estää ERG ja ETV1 välittämä Eturauhassyöpä Cell Invasion. PLoS ONE 6 (4): e19343. doi: 10,1371 /journal.pone.0019343

Editor: James McCubrey, East Carolina University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 joulukuu 2010; Hyväksytty: 28 maaliskuu 2011; Julkaistu: 29 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Rahim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli anteliaasti tukee Cancer Center Support apurahan P30-CA051008 käytöstä Biacore molekyylien vuorovaikutus resurssin. Tukeminen työtä myös tuli Lasten Cancer Foundation (Baltimore MD), Go4theGoal, Dani säätiö, Alexin limonadi seistä Foundation, Liddy Shriver sarkooma Initiative, Burroughs Wellcome Clinical tutkijan palkinto Translational Research (JT), ja NIH R01CA133662 (JT) , R01CA138212 (JT), R01CA108641 (AU). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: Patenttihakemus on jätetty tekijät yhdistepuolijohdekiteiden YK-4-279. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin syöpä ja toiseksi suurin syy syövän kuolleisuus miehillä. Kromosomitranslokaation johon ETS perheen transkriptiotekijöitä esiintyy 40-70% eturauhasen syöpiä, mukaan lukien kaikkein kliinisesti aggressiivinen muotoja [1], [2], [3], [4], [5]. Nämä translokaatioita tuottavat kimeerisiä geenejä, jotka fuusioituvat promoottorialueen androgeenin reagoiva geenin, kuten

TMPRSS2

, että koodaava alue ETS tekijöistä, useimmiten

ETV1

tai

ERG

[6], [7]. Järjestelyjen johtavat androgeeniriippuvaisessa sääntelyä ETS transkriptiotekijöiden ja niiden yli-ilmentyminen. ETS proteiinit ovat proto-onkogeenien, jotka on liitetty patogeneesiin [8]. Ne ohjaavat ilmentymistä kohdegeenien osallisena solujen lisääntymisen, apoptoosin, invaasio ja angiogeneesi. Yli-ilmentyminen ETS tekijöistä eturauhassyövän soluissa lisätä solujen invaasiota ja indusoi eturauhasen epiteelinsisäisen neoplasia (PIN) siirtogeenisissä hiirimalleihin [9]. Ehtyminen ETS tekijöistä

in vitro

vähentää liikkuvuutta ja invasiivisuus. ERG ja ETV1 ehtyminen myös vähentää kasvaimen kasvua

in vivo

[7]. Viimeaikaiset tulokset osoittavat myös, että

TMPRSS2-ERG

ilmentyminen uudelleen käyttöön kastraatio kestävä eturauhassyövän [10]. Näin ollen, ETS proteiinit edustavat uutta kohde ehkäisyyn tai hoitoon metastaattisen sairauden.

Olemme viime aikoina raportoitu pienmolekyylisalpaaja- kimeerisen proteiinin EWS-FLI1 in Ewingin sarkooma [11]. YK-4-279 estää EWS-FLI1 aktiivisuutta, indusoi apoptoosia Ewingin sarkooma solulinjojen ja hidastaa kasvaimen kasvua hiiren ksenograftimalleissa. FLI1, ERG ja ETV1 ovat luokan I ETS tekijät ja jakaa yli 60% identiteetti ja 80% homologiaa niiden aminohapposekvenssien [12]. Koska tiivistä homologian FLI1 kanssa ERG ja ETV1 testasimme kykyä YK-4-279 estävän ETS geenin aktiivisuus eturauhasen solulinjoja, jotka osoittavat androgeeniriippuvaisessa ERG ja ETV1 ilme. Tuloksemme osoittavat, että YK-4-279 voivat estää ERG ja ETV1 riippuvainen transkriptionaalisen aktiivisuuden ja siten johtaa vähentyneeseen solun liikkuvuus ja invaasiota.

Tulokset ja keskustelu

VCAP ja LNCaP-solut androgen reagoiva ja satama ERG ja ETV1 uudelleenjärjestelyt

eturauhassyöpä vaatii androgeenien toimiakseen oikein ja androgeenien reagointikykyä voidaan käyttää pohjana ryhmittelyyn eturauhassyövän solulinjoissa kumpaankaan kahteen ryhmään: androgen-herkkien ja androgeenin kestävä. Useimmissa ETS uudelleenjärjestely tapauksissa ETS geeni asetetaan suoraan sääntely androgen reagoiva geenin promoottori. Näissä tapauksissa, androgeenin välittää yli-ilmentyminen onkogeenisen ETS tekijä. Jotta vaikutuksen tutkimiseen ETS estäjien eturauhassyövässä, valitsimme työskennellä VCAP ja LNCaP solulinjoja. Vcap cell line satamat TMPRSS2-ERG uudelleenjärjestely, joka tapahtuu kautta interstitiaalinen poistamista 3 Mb välisellä alueella TMPRSS2 ja ERG kromosomissa 21 (Fig. 1a) [6]. LNCaP-solulinja sisältää geneettistä translokaatio, jossa koko ETV1 lokus on asetettu viimeisen intronin prostataspesifisen MIPOL1 kromosomi 14 (Fig. 1a) [7]. ERG ja ETV1 uudelleenjärjestelyt ovat poissulkevia VCAP ja LNCaP-soluissa, ja eivät ole läsnä PC-3 solulinja. Näin ollen PC-3 solulinjassa valittiin negatiivisena kontrollina meidän tutkimuksia. Me validoitu että molemmat VCAP ja LNCaP-solut ovat androgen-herkkien, osoituksena nousu prostataspesifisen antigeenin (PSA) lauseke stimulaation vaikutuksesta synteettisen androgen analogi R1881 (Fig. 1b). VCAP ja LNCaP-solut ilmentävät ERG ja ETV1 proteiineja perusolosuhteissa vuoksi läsnäolo

ETS

uudelleenjärjestelyjä näissä soluissa. Androgeenien hoito Näiden solulinjojen, mutta ei PC-3, johtaa lisääntyneeseen ERG ja ETV1 mRNA ja proteiini (Fig. 1 c ja d). Nämä tulokset vahvistaa, että sekä VCAP ja LNCaP-solut androgeeniresponsiivinen taas PC-3-solut eivät ole. Androgeenien reagointikykyä VCAP ja LNCaP kääntää tehostetun ETV1 ja ERG ilmaisun takia eturauhassyöpäspesifisten kromosomi uudelleenjärjestelyjä.

a) Eturauhasen solut analysoitiin ETS uudelleenjärjestely tila suorittamalla PCR käyttämällä uudelleenjärjestely spesifistä aluketta. VCAP solut elinympäristön TMPRSS-ERG uudelleenjärjestely taas LNCaP solut sisältävät jäsensi ETV1. VCAP ja LNCaP-solut ilmentävät ERG ja ETV1 proteiinia vastaavasti perusolosuhteissa. PC-3-solut eivät sisällä myöskään uudelleenjärjestelyn eivätkä ilmaise ERG tai ETV1. b) VCAP ja LNCaP-solut ilmentävät PSA vastauksena R1881 hoitoon. PC-3-solut eivät ole androgeeniresponsiivinen. Soluja käsiteltiin 10 nM R1881 48 tuntia ja PSA ilmentyminen analysoitiin reaaliaikaista qPCR. Tulokset normalisoitiin aktiini. *; p 0,0001, N.S. .; ei-merkitsevä. c) R1881 stimulaatio johtaa lisääntyneeseen ERG ja ETV1 mRNA VCAP ja LNCaP-soluissa, mutta ei PC3-soluissa. RNA eristettiin androgen stimuloiduista soluista ja käytetään suorittamaan reaaliaikaista qPCR. Aineisto on normalisoitu geeni-ilmentymisen puuttuessa androgen. d) ERG ja ETV1 ilmennetään Vcap ja LNCaP-soluissa, mutta ei PC-3-soluja. Androgeenistimulaation lisännyt ERG ja ETV1 proteiinin VCAP ja LNCaP. Eturauhasen solut eivät ilmaista FLI1 proteiinin pohjapinta tai androgen kannustanut olosuhteissa. MOLT4 käytettiin positiivisena kontrollina solujen linja FLI1 ilme.

YK-4-279 estää ERG ja ETV1 transkriptioaktiviteettia

YK-4-279 kohdistettu EWS-FLI1 onkoproteiinia in Ewingin sarkooma [11]. Kuitenkin, sivuston vuorovaikutusta EWS-FLI1 ei tunneta. Kun otetaan huomioon läheinen homologia FLI1, ERG ja ETV1, tutkimme vaikutuksia YK-4-279 on ERG ja ETV1 toiminto. Ensin arvioidaan ekspressio FLI1 eturauhasen soluissa. Ihmisen akuutti lymfaattinen leukemia solulinjan MOLT4 käytettiin kontrollina FLI1 ilmaisun, perusolosuhteissa. Mikään eturauhasen solujen tässä tutkimuksessa käytetyt näihin FLI1 (Fig. 1 d). Näin ollen, vaikutukset YK-4-279 eturauhasen solut eivät esiinny seurauksena kohdistaminen FLI1. Seuraavaksi validoitu suoraa vuorovaikutusta YK-4-279 ja yhdistelmä-ERG ja ETV1 proteiineja käyttäen pintaplasmoniresonanssin (SPR). YK-4-279 sidottu ERG affiniteetilla (K

D) 11,7 uM ja sidotaan ETV1 affiniteetilla 17,4 uM (Fig. 2a, S1). Arvioimme YK-4-279 ja vaikutukset, kun ERG transkriptionaalista aktiivisuutta käyttäen transfektoitiin lyhytaikaisesti 207 bp: n fragmentti ja Id2 geenin promoottori, joka ohjaa ekspressiota lusiferaasin proteiinia. Tämä minimaalinen Id2 promoottorialue sisältää kaksi ETS sivustoja ja on aikaisemmin osoitettu sitovan ERG [13]. Kotransfektoimalla ERG ja Id2 toimittaja lisännyt lusiferaasiaktiivisuudessa. Promoottorin aktiivisuus väheni samanaikaisesti käsittelemällä soluja YK-4-279, ilman mitään huomattavaa laskua ERG-proteiinin tasot (Fig. 2b).

a) Sidonta kinetiikka YK-4-279 ERG ja ETV1 määritettiin pintaplasmoniresonanssilla. YK-4-279 sidottu ERG ja ETV1 kanssa K

D 11,7 uM ja 17,9 uM. SPR sensogrammien annetaan täydentäviä lukuja (Fig. S1). b) Lusiferaasimääritys suoritettiin Cos-7-soluissa kotransfektoitiin ERG ja Id-2 toimittaja lusiferaasi-konstrukti. Id-2 promoottorin aktiivisuus väheni, kun YK-4-279 hoito vaikuttamatta ERG proteiinin tasoja. *; p 0,001. c) Vcap soluja käsiteltiin 50 nM siERG tai 10 uM YK-4-279 48 tuntia ja mRNA: n ja proteiinin ekspressiotasot ERG tavoitteet arvioitiin. YK-4-279-hoito johti vähentyneeseen ekspressioon Plau, ADAM19 ja PLAT mRNA. Plau ja PLAT proteiinin tasot alenivat myös. Tulokset olivat verrattavissa saatu siRNA välittämän ERG knockdown. d) LNCaP-soluja käsiteltiin 1 uM YK-4-279 ja ETV1 kohdegeenin tasot arvioitiin. YK-4-279 hoito johti vähentynyt geenin ilmentyminen MMP13 ilman merkittävä väheneminen ETV1 tasoilla. *; p 0,01.

Seuraavaksi arvioimme vaikutuksia YK-4-279 on endogeenistä ERG ja ETV1 kohdegeenien VCAP ja LNCaP solulinjoja. Keskityimme useat jäsenet plasminogeeniaktivaattori reitin kuten Plau, PLAT, MMP13 ja ADAM19. Nämä geenit välittävät invasiivisen fenotyyppi useissa syövissä ja on raportoitu kohdistu suoraa ETS transkriptiotekijöiden [9], [14], [15]. Altistaminen VCAP solujen 10pM YK-4-279 48 tunnin ajan, johti merkittävästi vähentää mRNA ja proteiini tasoilla useiden ERG kohdegeenien, kuten Plau, PLAT ja ADAM29. Taso alassäätöä oli verrattavissa saavutettavasta siRNA välittämän ERG knock-down in VCAP soluissa (Kuva. 2c). Samoin YK-4-279 johti alas-säätely ETV1 kohdegeenin MMP-13 LNCaP-soluissa (kuvio. 2d). On huomattava, että tämä estäminen ERG ja ETV1 proteiinin aktiivisuutta saatiin ilman mitään merkittävää laskua ERG tai ETV1 proteiinin tasot. Nämä tulokset viittaavat siihen, että YK-4-279 kykenee estämään ERG ja ETV1 transkriptionaalista aktiivisuutta eturauhassyövän soluissa, mikä johtaa vähentyneeseen geenien ilmentymisen, jotka osallistuvat soluväliaineen hajottamisessa ja etäpesäkkeiden.

YK-4- 279 inhiboi ETS välittämän eturauhasen syöpäsoluinvaasiota

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että

ETS

geenin uudelleenjärjestäytymistä välittäjänä invaasio eturauhassyövässä [7], [9]. Sen kysymyksen siitä YK-4-279 kykenee estämään ERG ja ETV1 välittämän invaasio, käytimme impedanssi perustuu endoteelisolujen invaasiomääritys [16]. Tämä tekniikka käsittää haastava yksisolukerroksena ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC: t), jossa toinen kerros metastaattinen soluja, jotka pitävät ja hyökätä HUVEC yksikerroksista. Vetämisen endoteelisolujen risteyksissä ja invaasiota eturauhassyöpäsolujen voidaan seurata reaaliaikaisesti mittaamalla lasku sähkövastus kullan elektrodit [17].

sytotoksisuuskoetta suoritettiin määrittää suurin siedettävä annos ja YK-4-279 eri eturauhassyövän solulinjoissa. YK-4-279 ei osoittanut mitään merkittävää vähenemistä solujen kasvua 1 uM LNCaP-solujen ja 10 uM VCAP ja PC3-soluissa, sen jälkeen 2 päivää hoidon jälkeen (tietoja ei esitetty). Nämä annokset valittiin edelleen toiminnallisia määrityksiä sen varmistamiseksi, että inhiboivia vaikutuksia YK-4-279 on hyökkäyksen ja liikkuvuus, ei ole seurauksena solukuoleman. Kun HUVEC-solut altistettiin LNCaP ja VCAP soluja, se johti jyrkkä lasku sähkövastuksin osoitus soluinvaasiota. Hoidettaessa näitä soluja YK-4-279 johti merkittävästi vähentynyt invaasio HUVEC solujen LNCaP ja VCAP soluja. Yhdistettä yksinään ei ollut vaikutusta HUVEC yksisolukerrosta. YK-4-279 eivät estäneet hyökkäyksen

ETS

-fusion negatiivinen PC-3-solut. (Fig. 3a ja b). Sen varmistamiseksi, että havaitut vaikutukset johtuivat estämällä ETS proteiinien vähensimme ERG proteiinin ilmentymistä VCAP soluihin käyttäen siRNA. Tämä johti kumota YK-4-279 estoa invaasion (Fig. 3c). Seuraavaksi ilmennettiin lyhytaikaisesti ERG PC-3-soluja, ja määritettiin näiden solujen endoteelisolujen invaasiomääritys. ERG ilmaisu yksin PC-3-solujen välittänyt kun nämä solut enemmän invasiivisia fenotyyppi. Hoito YK-4-279 estivät merkittävästi ERG välittämä kasvu invaasiota (Fig. 3d). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että YK-4-279 kykenee estämään ETS-välitteistä hyökkäys eturauhassyöpäsolujen, sekä solujen endogeenisen ja eksogeenisen korkean ilmentymisen ETS proteiineja.

a) HUVEC-soluja, jotka muodostavat konfluentin yksikerroksista altistettiin LNCaP, VCAP ja PC-3-solujen kanssa tai ilman YK-4-279. YK-4-279 esti VCAP (10 uM) ja LNCaP (1 uM) solujen invaasio HUVEC, kun taas PC-3-soluja ei vaikuttanut. Eturauhasen soluja esikäsitelty YK-4-279. Kokeet suoritettiin kahtena rinnakkaisena ja kestävyys normalisoitiin aikaan lisäämällä tunkeutuvat soluihin. b) Invasion kvantifioitiin 10 tunnin kuluttua lisäämällä eturauhasen syöpäsoluja. Tulokset on ilmaistu suhteessa ei-käsiteltyjen olosuhteissa. *; p 0,01. c) ERG ilmentyminen väheni Vcap soluissa käyttäen C-päätteen siRNA koetin. ERG Knockdown in VCAP soluissa johti menetykseen YK-4-279 estoa hyökkäystä. Vcap soluja pre-käsiteltiin 10 uM YK-4-279 ja 2 päivää ennen haastava HUVEC yksikerroksinen. *; p 0,01, d) Ohimenevä ERG ilmentymistä PC-3-solujen välittänyt kun solut enemmän invasiivisia fenotyyppi. Myöhemmin YK-4-279 hoito johti vähentynyt hyökkäystä. PC-3-soluja käsiteltiin YK-4-279 24 tuntia ennen haastava HUVEC yksikerroksista.

YK-4-279 estää ETV1 välittämän potevilla LNCaP

Seuraava testasimme vaikutuksia YK-4-279 inhibitioon motiliteetin LNCaP-solujen naarmu määrityksessä. Kaikki kokeet edellisissä kuvissa tehtiin varhainen LNCaP (p 30). Kuitenkin alhainen-passage LNCaP-solut eivät ratkea tätä tekniikkaa, koska ne löysästi kiinnittyvät soluviljelmämallissa lautasen pinta. Samoin VCAP solut kasvavat möhkäleitä eivätkä muodosta yksisolukerroksena. Siksi teimme tyhjästä määritykset käyttämällä korkean passage LNCaP (p 60). High-kanavan LNCaP-solut kasvavat paljon nopeammin ja pystyvät muodostamaan yksisolukerroksena [18]. Ne ilmentävät myös korkeita pohjapinta tasoja ETV1 (Fig. 4a) [19]. Ennen suorittamiseksi tyhjästä määrityksen, YK-4-279 testattiin sen sytostaattinen luonne ja sen havaittiin olevan mitään vaikutusta solun lisääntymistä pitoisuuksina, joita käytetään tyhjästä määrityksessä (kuvio. S2). YK-4-279 hoitoon LNCaP johti vähentynyt merkittävästi soluliikkuvuus että scratch määrityksessä, kun taas mitään vaikutuksia havaittiin motiliteettia negatiivisen kontrollin solulinjaan, PC-3 (Fig. 4b). Naarmu määritys suoritettiin myös esikäsittely LNCaP-solujen kanssa 10 ug /ml mitomysiini C: ssa 2 tunnin ajan ennen naarmuuntumisen pintaan. YK-4-279 kykeni inhiboimaan LNCaP soluliikkuvuus in mitomysiini käsitelty olosuhteet samoin (Fig. S3) Nämä havainnot viittaavat siihen, että vaikutukset YK-4-279 LNCaP-solujen tyhjästä määrityksessä ei sytotoksisuuden vuoksi, vaan ainoastaan ​​takia inhibition solun liikkuvuus.

a) High-kanavan LNCaP-solut analysoitiin ETV1 ekspressiotasoja. HP-LNCaP-solut ekspressoivat konstitutiivisesti suurempia määriä ETV1, verrattuna PC-3-soluja. b) YK-4-279 esti potevilla naarmu määrityksessä korkean passage LNCaP, kun taas PC-3-soluja vastaa. Solun liikkuvuus kvantifioitiin mittaamalla etäisyyden vaeltavat solun rajat. Liikkuvuus ilmaistiin suhteessa ajoneuvon käsitelty olosuhteissa. *; p 0,0001.

EWS-FLI1 onkoproteiinin riippuu sitoutumisen RNA helikaasia A (RHA) sen onkogeenisten toiminta [20]. YK-4-279 indusoi apoptoosia Ewingin sarkooma soluja estämällä vuorovaikutusta EWS-FLI1 ja RHA. Koska mahdollinen mekanismi aktiivisuuden YK-4-279 eturauhassyövässä, testasimme onko vuorovaikutus ETS perheenjäsen ja RHA on läsnä eturauhasen soluissa samoin. Vaikka ERG ei vuorovaikutuksessa RHA eturauhassyöpäsoluissa, YK-4-279 ei kykene tämän vuorovaikutuksen estämiseksi (Fig. S4). Testasimme myös YK-4-279 pystyy estämään ERG tai ETV1 sitoutuminen ETS sivustoja DNA käyttämällä pintaplasmoniresonanssia. YK-4-279 eivät estäneet ERG tai ETV1 DNA sitova (Fig. S5a). Lisäksi kromatiinin immunosaostus suoritettiin arvioimaan ERG sitoutumisen Plau promoottorin läsnä ollessa, YK-4-279. Tulokset vahvistivat, Biacore havainnot, että YK-4-279 ei häiritse ERG DNA: ta sitovan (Kuva S5b). On huomattava, että Ewingin ilmentävät katkaistua FLI1 proteiinia, joka sisältää vain eksonit 6-9 ja FLI1. ETS translokaatioita eturauhassyöpä, toisaalta, johtaa ilmaus lähes täyspitkän ETS perheenjäsen. Sen vuoksi oletamme, että YK-4-279 saattaa estää ETV1 ja ERG toiminto eturauhassyöpäsoluissa estämällä proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia, jotka ovat erilaisia ​​kuin EWS-FLI1 kumppaneita Ewingin sarkooma. Näin ollen lisätutkimuksia tarvitaan määrittää tarkka molekyylitason mekanismi YK-4-279 estoa ERG ja ETV1 toiminta eturauhasen syöpäsoluja.

tulos ETV1 esto näyttää olevan voimakkaampi kuin ERG esto, kannalta solun motiliteettia ja hyökkäystä. Kuitenkin tämä ilmiö ei voida lopullisesti johtuvan paremmin ETV1 esto, koska tasapuolisen vertailun data mutkistaa se, että ERG ja ETV1 ilmentyvät eri solulinjoissa. Näin ollen laatu vaste voi myös olla tekijä eroja LNCaP ja Vcap soluja. Lisäkokeita, kuten mittaamalla suuruuden ERG ETV1 vasteen samassa solulinjassa, vaadittaisiin lopullisesti tätä asiaa esiin.

Viimeaikaiset raportit ovat osoittaneet, että ETS knock-down eturauhasen syöpäsolujen voi johtaa alentuneeseen leviämisen soluissa, jotka ilmentävät näitä onkoproteiineja [21], [22]. Vaikka kokeet käsikirjoituksen suoritettiin annoksina ja aikavälein, jotka eivät ole myrkyllisiä soluille, on ei näytä olevan suoraa korrelaatiota ilmentymisen ETS-proteiinien ja YK-4-279 sytotoksisuutta. ETS-uudelleenjärjestely negatiivinen PC-3 ja DU-145-solut osoittavat minimaalinen vaste YK-4-279 hoito (IC50 100 uM). Päinvastoin, YK-4-279 on myrkyllistä sekä Vcap (IC50 = 9,55 gM 72 tunnin jälkeen) ja LNCaP-soluja (2,75 uM 72 tunnin jälkeen). Siksi YK-4-279 voidaan arvioida myös sen sytotoksisia potentiaalit ETS-uudelleenjärjestely positiivisia syöpäsolujen tulevissa tutkimuksissa.

androgeeniriippuvaisessa yli-ilmentyminen ERG ja ETV1 proteiinia eturauhasen syöpäsoluja on ollut suoraan sekaantunut lisääntyneeseen ja metastaasit. Lisäksi useat tutkimukset ovat korreloineet lisääntyneen ilmentymisen näiden proteiinien huonon ennusteen, korkeammat Gleason tulokset ja harvemmin toistumisen vapaa elinaika. Tällä hetkellä androgeeniriippuvaisessa signalointireitteihin eturauhassyövässä kohdistuvat kautta kastraatio ja androgeenireseptorin antagonistit. Vaikutukset näistä hoidoista voi olla osittain johtuvan downregulation järjestetty uudelleen ETS tekijöistä. Siten onnistuneen kehittämisen pienmolekyylisalpaajilla ERG ja ETV1, kuten YK-4-279, edustaa uutta linjaa hoitomuotoja, joilla pyritään estämään tai hoitamaan etäpesäkkeitä, samalla säästää potilasta pitkän aikavälin vaikutuksia hoitojen kohdistaminen androgeenireseptorin pathway.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Vcap, LNCaP, PC-3 ja DU-145-solut saatiin ATCC: stä (American Type Culture Collection, Manassas, VA ). HUVEC-solut saatiin Lonza Biosciences (Allendale, NJ). Vcap-soluja ylläpidettiin DMEM, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia. LNCaP, PC-3 ja DU-145-soluja ylläpidettiin RPMI-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% HEPES. HUVEC-soluja viljeltiin EBM-2 media (Lonza), jota oli täydennetty EGM-2 luoti kit (Lonza), joka sisältää kasvutekijöitä, antibiootteja ja 5% FBS: ää.

Western-blotit

Protein lysaatit olivat valmistettu ja western-blotit suoritettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [23]. ERG (sc-354), ETV1 (sc-1953) FLI1 (sc-356), PLAT (sc-5241) ja aktiini (sc-1615) vasta-aineet hankittiin valmistajalta Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Anti-Plau-vasta-aine hankittiin Calbiochem (Gibbstown, NJ).

mRNA: n eristäminen ja qPCR

mRNA eristettiin käyttäen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja cDNA valmistettiin käyttäen transcriptor ensi- juosteen cDNA-synteesi-kittiä (Roche, San Francisco, CA) valmistajan protokollan mukaisesti. qRT-PCR suoritettiin käyttämällä SYBR vihreä (Roche) on Mastercycler realplex

4 instrumentti (Eppendorf, New York, NY). Geenien ilmentyminen oli normalisoitiin aktiini. Alukeparit on lueteltu Täydentävä taulukossa S1.

uudelleenjärjestely tila

Genominen DNA eristettiin PC-3, LNCaP ja Vcap soluja käyttäen Wizard genomisen DNA Extraction Kit (Promega, Madison, WI) mukaan valmistajan protokollia. PCR suoritettiin käyttäen alukkeita, jotka reunustavat uudelleenjärjestelyn sivustoja. Primer sekvenssit löytyvät Täydentävä taulukossa S1.

Sidonta Kinetics

Vakaan tilan sidosaffmiteetti mitattiin Biacore T100 väline. Rekombinantti ERG ja ETV1 (Origene, Rockville, MD) proteiinit immobilisoitiin CM5 pelimerkkejä amiiniyhdistämisellä ja 6 eri pitoisuuksia YK-4-279 ruiskutettiin pinnalle kahtena rinnakkaisena. SPR sensogrammien ja K

D-arvot saatiin käyttämällä Biacore T100 ohjelmistoa.

Luciferase Assay

Cos-7-solut ko-transfektoitiin kanssa lentiviruksen ekspressoivan plasmidin eniten yleisesti katkaistun ERG mRNA, ja vektorin, joka sisältää Id2 geenin ilmentämistä ajava promoottori lusiferaasigeeniin. Transfektio suoritettiin käyttäen Fugene 6 (Roche) valmistajan menettelyohjeen mukaisesti protokollia. Lentivirusvektoria ekspressoi LacZ käytettiin negatiivisena kontrollina. Solujen annettiin ilmaista ERG: ssa 48 tuntia ja sen jälkeen niitä käsiteltiin 10 uM YK-4-279. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin 24 tunnin kuluttua käyttämällä kahta lusiferaasianalyysissä mukainen pakkaus valmistajan protokollan (Promega, Madison, WI). Tulokset normalisoitiin kokonaisproteiinipitoisuus. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen GraphPad Prism 4.0.

Androgeenien ja YK-4-279 hoidon

androgen hoitoon, solut ympättiin fenolipunattomalla väliaineessa, joka sisälsi 10% hiilellä erotettua FBS: ää, ja annettiin kiinnittyä solun viljelymaljalle yössä. Sen jälkeen solut seerumia 48 tuntia fenolipunattomalla median ja stimuloitiin sitten 10 nM R1881: n (Sigma, St-Louis, MO) ja 2 päivää.

YK-4-279 liuotettiin DMSO: hon valmistella 10 mM varastosta. Logaritmisesti kasvavia soluja käsiteltiin 1 uM tai 10 uM YK-4-279 48 tuntia ennen arviointiin geenien ilmentymisen.

siRNA ERG Knockdown

Transient ERG Knockdown suoritettiin käyttämällä mukautettua siRNA (5′-CGACATCCTTCTCTCACAT-3 ’) on suunnattu C-päähän ERG (Dharmacon, Lafayette, CO) [21]. 50 nM siRNA: ta transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) valmistajan mukaan protokollia. Solut analysoitiin ERG pudotus 5 päivää transfektion jälkeen siRNA.

Transient ERG Expression

PC-3-solut transfektoitiin pLenti6 /V5-DEST plasmidin (Invitrogen), joka ilmaisee eniten yleisimmin löytyi katkaistu ERG isoformin. Transfektio suoritettiin käyttämällä Fugene 6-reagenssia (Roche) valmistajan menettelyohjeen mukaisesti protokollia 48 tuntia.

HUVEC Invasion

Anti-invasiivisia potentiaali YK-4-279 mitattiin käyttämällä tekniikka sähköinen solun impedanssin tunnistus (ECIS) on ECIS Z instrumentti (Applied biofysiikka, Troy, NY) ja xCELLigence järjestelmä (Roche). Lyhyesti, 250.000 HUVEC-solut ympättiin 8W10E + paneelit, elektrodi piirit hyvin alhaalla mittaamaan sähkövastus. Muodostuksen jälkeen konfluentin HUVEC yksikerroksista (app. 21-24 tuntia), tunkeutuvat eturauhassyövän soluja lisättiin tiheydellä 100,000 solua per kuoppa DMEM: ssä tai RPMI-elatusaineeseen, joka sisälsi osoitetun lääkeaineen pitoisuuksia. Kasvainsoluja esi-käsiteltiin 24-48 tuntia YK-4-279 ennen lisäämistä. Tällä kertaa pisteen tuumorisolujen lisäksi hyväksyttiin 0 h hoito ja invaasio seurattiin seuraavan 12 tunnin muutoksia mittaamalla resistanssi solun elektrodi interphase. Kokeet suoritettiin kahtena kappaleena. Resistance normalisoitiin aikaan lisäksi hyökkäävän soluja.

Scratch Pitoisuus

Solut ja annettiin muodostaa konfluentin yksikerrosmateriaalia. Solun pinnalla oli naarmuuntunut käyttäen p-200 pipetin kärjen. Solujen annettiin täyttää naarmuuntunut pinta-ala ja seurataan aikana 72 tuntia. Kuvat otettiin käyttäen Nikon Eclipse Ti mikroskooppi (Nikon, Melville, NY). Solun liikkuvuus kvantifioitiin mittaamalla etäisyyden vaeltavat solun rajat.

Kromatiini immunosaostus (ChIP) B

PC-3-solut transfektoitiin pLenti6 /V5-DEST plasmidin (Invitrogen), joka ilmaisee yleisin katkaistu ERG isoformin. Transfektio suoritettiin käyttämällä Fugene 6-reagenssia (Roche) valmistajan menettelyohjeen mukaisesti protokollia 24 tuntia. Soluja käsiteltiin sitten 6 tunnin ajan 10 uM ajoneuvon tai YK-4-279. ChIP suoritettiin käyttäen EZMagna proteiini A ChIP Kit Millipore mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Immunosaostus suoritettiin käyttäen 2 ug ERG-vasta-aineen (SC- 354x, Santa Cruz Biotechnology), 2 ug Normaali kanin IgG: tä (Sigma Aldrich) ja 1 ug Pol II (Millipore). PCR suoritettiin käyttäen alukkeita aiemmin julkaistu positiivisille ERG sitoutumisesta Plau promoottori eturauhasen soluissa [9]. PCR-profiili 94 ° C-5 min: 1 sykli, 94 ° C-30 sekuntia, 55 ° C-30 sek, 72 ° C-1 min: 35 sykliä, 72 ° C-5 min: 1 sykli käytettiin Eppendorf Realplex4 pösyklilaitteessa.

tilastollinen analyysi

Ryhmät verrattiin käyttäen kaksisuuntaista Studentin t-testiä (Prism 4, GraphPad Software, La Jolla, CA) ja p 0,05 katsottiin merkitseväksi .

tukeminen Information

Kuva S1.

SPR sensogrammien varten YK-4-279 sitoutumisen ERG ja ETV1. Vakaan tilan sitoutumisaffiniteetteja mitattiin injektoimalla 6 eri pitoisuuksia YK-4-279 yli rekombinantti ERG ja ETV1 proteiinit immobilisoidaan pinnalle CM5 pelimerkit Biacore T100 väline. SPR sensogrammien saatiin käyttämällä Biacore T100 ohjelmistoa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0019343.s001

(TIF) B Kuva S2.

YK-4-279 ei ole sytostaattinen aine. VCAP (10000 solua /kuoppa), LNCaP-korkea passage (10000 solua /kuoppa), LNCaP-varhainen (10000 solua /kuoppa) ja PC-3 (5000 solua /kuoppa) soluja ympättiin yön yli xCELLigence E-16 levyt ja annetaan kiinnittyä hyvin pohja. XCELLigence E-16 levyt hyvin pohja on peitetty pienoiskoossa kulta-elektrodit, jotka mittaavat muutoksia sähkövastuksen pinnalle elektrodien. Muutokset sähköinen resistanssi ovat edustettuina dimensioton parametri kutsutaan solu-indeksi, ja se on suoraan verrannollinen alueen hyvin pohjasta joita elektrodeja. Noin 20 tuntia ymppäyksen jälkeen eturauhasen syöpäsoluja, kasvatusliuos korvattiin tuoreella väliaineella, joka sisälsi 1 uM (LNCaP, PC-3) tai 10 uM (Vcap) YK-4-279. Solujen lisääntyminen seurattiin yli 72 tuntia.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0019343.s002

(TIF) B Kuva S3.

YK-4-279 estää LNCaP solun liikkuvuus. Solut maljattiin ja annettiin muodostaa konfluentin mono-kerros. Soluja käsiteltiin 10 ug /ml mitomysiini-C: ssa 2 tuntia ennen tyhjästä määritystä, kuten aiemmin on kuvattu [24], [25]. Sen jälkeen, kun mitomysiini-C hoitoon, lisättiin tuoretta väliainetta lisättiin ja solun pinnan oli naarmuuntunut käyttäen p-200 pipetin kärjen. Solujen annettiin täyttää naarmuuntunut pinta-ala ja seurataan aikana 60 tuntia. Soluliikkuvuus kvantifioitiin mittaamalla ala tyhjästä ei peitetty vaeltavien solujen .. Liikkuvuus ilmaistiin suhteessa ajoneuvon käsitelty olosuhteissa. *; p 0,0001

doi: 10,1371 /journal.pone.0019343.s003

(TIF) B Kuva S4.

ERG vuorovaikutuksessa RHA in VCAP soluissa. Yk-4-279 estä vuorovaikutusta ERG ja RHA. 9 x 10

7 VCAP soluja ympättiin 15 cm ruokia ja annettiin kiinnittyä ja levitä 48 tuntia. Soluja käsiteltiin 10 uM YK-4-279: ssa 24 tuntia. Immunosaostus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [11].

Doi: 10,1371 /journal.pone.0019343.s004

(TIF)

Kuva S5.

YK-4-279 ei estä ERG tai ETV1 DNA: han sitoutumisen. a) Rekombinantti ERG tai ETV1 proteiinit immobilisoidaan pinnalle Biacore CM5-siru amiiniyhdistämisellä. Villityypin kaksijuosteisia oligonukleotideja (ATGTAGACCGGAAGTAACTA), joka sisälsi konsensus Ets sitoutumiskohta ”GGAA” injektoitiin 5 uM kolmena kappaleena pinnan yli siru läsnä tai poissa ollessa 50 uM YK-4-279. Sitoutuminen DNA rekombinantteja ERG tai ETV1 mitattiin käyttämällä Biacore T100 ohjelmistoa.