Krooninen sairaus

tiivistelmä

RNU2 olemassa kaksi toiminnallista muodoissa (RNU2-1 ja RNU2-2) erottaa toisistaan, kun läsnä on ainutlaatuinen 4-emäkset motiivi. Yksityiskohtaista tutkimusta aineistoja saatu syvä sekvensointi viiden ihmisen keuhko- primaarikasvainten paljasti, että molemmat muodot ilmentävät suurella nopeudella 19-22nt fragmentti (miR-U2-1 ja -2) sen 3′-alue ja sisältää 4-emäkset motiivi . Syvä sekvensointi riippumattomien altaat seeruminäytteiden terveiltä luovuttajilta ja keuhkosyöpäpotilaita paljasti, että miR-U2-1 ja -2 ovat pervasively käsitellään keuhkokudoksessa avulla endonukleolyyttinen cleavages ja vakaasti viedään verta. Sitten, mikrosiruja -hybridisaatiokokeissa sovitetun normaalin /tuumorin näytteissä paljastui huomattava yli-ilmentyminen miR-U2-1 14 18 keuhkojen ensisijainen kasvaimia. Myöhemmin qRT-PCR miR-U2-1 käyttäen seerumia 62 keuhkosyöpäpotilaita ja 96 eri tarkastukset osoittivat, että sen ekspressiotasot tunnistaa keuhkosyöpää sairastavien potilaiden 79% herkkyys ja 80% tarkkuus. miR-U2-1 ilmentyminen korreloi läsnäolo tai puuttuminen keuhkosyöpään potilailla, joilla on krooninen keuhkoahtaumatauti (COPD), muut sairaudet ja keuhkojen – ei ole syöpä, ja terveillä verrokeilla. Nämä tiedot viittaavat siihen, että RNU2-1 on uusi kaksitoimisen ncRNA, joka tuottaa 19-22nt fragmentti, joka voi olla hyödyllistä havaita keuhkosyövän ei-invasiivisesti korkean riskin potilailla.

Citation: Mazières J, Catherinne C , Delfour O, Gouin S, Rouquette I, Delisle MB, et al. (2013) Vaihtoehtoiset käsittely U2 Small Nuclear RNA Tuottaa 19-22nt Katkelma kannalta merkityksellinen havaitseminen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Human Serum. PLoS ONE 8 (3): e60134. doi: 10,1371 /journal.pone.0060134

Editor: Liang-Hu Qu, Sun Yat-sen University, Kiina

vastaanotettu: 23 marraskuu 2012; Hyväksytty: 21 helmikuu 2013; Julkaistu: 20 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Mazières et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Ohjelma , erityisemmin verinäytteen, tukivat avustusta Midi-Pyrénées alueneuvoston. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tietojen analysointi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ilmoittavat, että heillä ei ole kilpailevia intressejä. Liittämisellä Useiden tekijöiden Kefeidi Yhtiö ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikkaa.

Johdanto

Etsintä ei-proteiinia koodaavan RNA (ncRNA) transcriptome in ihmisen soluja ja kudoksia on jo pitkään keskittynyt profilointi MikroRNA. Syntymistä suurikapasiteettisten Next Generation Sequencing teknologiat (NGS) on auttanut tuomaan esiin uudentyyppisiä ncRNAs ja tasoitti tietä tutkimuksessa toimintakyvyn yhteenliittymien [1]. Useimmat uudet ncRNA lajit ovat nyt havainneet, käyttäen NGS lähestymistapoja [2] – [5]. Koska toiminnalliset ncRNAs arvellaan suojattava hajoamista nojalla niiden yhdessä proteiinien ja pakkausten hiukkasiksi, ja siksi ovat vakaita, NGS tarjoaa ainutlaatuisen etu, että voimme havaita samanaikaista ilmentymistä tuhansia toiminnallisen pienten RNA-transkriptien yhdessä kudostyypin, paljastaen uuden tason monimutkaisuutta tuotannossa pienten ncRNAs ihmisen solujen, kudosten ja elinten erilaisissa fysiologisissa olosuhteissa [2], [4], [8]. Erittäin korkea herkkyys NGS menetelmiä on myös mahdollistanut löydettiin aiemmin tuntemattomista ”isomirs” valmistettu transkription jälkeinen muokkaus mekanismit, yhden nukleotidin ei-mallin 3 ’adenosiini tai urasiili lisäyksiä toimii yhtenä esimerkkinä [6], [7]. Lisäksi kävi viime aikoina osoittanut, että yksittäinen ncRNA voi tuottaa eri tuotteita ei yksinkertaisesti käyttämällä satunnaisia ​​hajoamista mutta myös erityisillä virityksen moniportaisuudesta tapahtuvaa käsittelyä Dicer [9] tai muiden entsyymien [10], [11]. Tällaiset vaihtoehtoiset ncRNA käsittely voi selittää, miten yksi ensisijainen transkripti ncRNA ehkä subserve useampia toimintoja, analoginen vaihtoehto silmukoinnin ennalta mRNA dokumenttinsa. Täten kasvava kokoelma Bifunktionaalisten ncRNAs tarjoaa uutta näkemystä ihmisen biologiassa katsottuna linssin läpi NGS.

Nämä äskettäin löydetty luokkien pienten RNA tuottaman ncRNAs toisen toiminnon kanssa jakaa joitakin yhteisiä piirteitä kanssa microRNA. Nyt on laaja näyttö siitä, että useat tRNA tuottaa tRNA johdettua sääntelyä pieniä RNA: t (smRNAs) [9], [11] – [13]. Runsaat pieni RNA: t 18-22 nt, käsitellään sekä 5′- ja 3 ’päissä kypsä tRNA, samoin kuin 3 ”perävaunu alueet pre-tRNA. Kypsä 3 ’väestö (kutsutaan myös tyypin I) havaittiin olevan Dicer riippuvainen ja kompleksoitu Argonautes 1-4. Sen sijaan, pre-tRNA 3 ”trailer väestöstä (tyyppi II) on Dicer riippumaton ja näennäisesti liittyy toiminnan RNaasi Z. Lisäksi tyypin II RNA: t havaittiin kompleksoitu Argonautes 3 ja 4, ja paljon vähäisemmässä määrin ja Argonautes 1 ja 2 [13]. Keskittynyt nucleoli useita snoRNAs toiminto käsittelyssä ribosomien RNA: iden (rRNA) aikana ribosomien alayksikköä biosynteesin ja kokoonpano. Kuitenkin suurin osa niistä toimii opas entsymaattinen muuttuminen kohde- rRNA ja spliceosomal U6 snRNAs nukleotidien valitaan RNA: RNA antisense vuorovaikutukset [14], [15]. SnoRNAs luokitellaan kahteen ryhmään, C /D laatikko snoRNAs jotka katalysoivat 2 ’O riboosi metyloinnin [16], ja H /ACA laatikko snoRNAs jotka ottavat pseudouridine muutokset [17]. Viimeaikaiset bioinformatics analysoida pieniä RNA kirjastot ovat ehdottaneet, että on olemassa smRNAs johdettu tiettyjä snoRNAs seuraavien käsittely [18] – [21]. H /ACA ja C /D-laatikko on johdettu ncRNAs käyttää erilaisia ​​biogeneesin polkuja riippuen edeltäjäyhdisteen snoRNA käsitellään [21] – [23]. H /ACA-johdetut ncRNAs ovat pääasiallisesti 20-24 nt pitkä ja peräisin 3′-päästä. Niiden tuotanto on riippumaton Drosha, mutta vaatii toimintaa Dicer [18]. Sen sijaan C /D peräisin ncRNAs ovat joko 17-19 nt tai 27 nt pitkä ja pääasiassa peräisin 5’-päästä [21]. Suuri valikoima heidän sekundaarirakenteilla ehdottaa Dicer riippumaton käsittely perustuu Ago2 endonukleaasiaktiivisuus samanlainen ennalta miR-451 käsittely [24]. Useita esimerkkejä smRNAs peräisin tRNA tai snoRNA esiasteita on jo osoitettu olevan mahdollisia biologisia toimintoja [9], [11], [27], [28].

Short lukee valmistetaan myös monenlaisia muuntyyppisten rakenteeltaan ncRNAs kuten 7SL, 5S, Y1 ja Y3 [25]. Holvi RNA: t, jotka ovat mukana monilääkeaineresistenssin ja solunsisäinen kuljetus ihmisillä on äskettäin osoitettu ja tuottaa joukon ~23-nt RNA: iden on Drosha riippumaton mutta Dicer välittämää käsittelyvaiheen [26]. Yksi holvin johdettujen ncRNAs sitoutuu Argonaute proteiineihin ja välittää mRNA: n pilkkominen, matki- malla se avain mikro-RNA-kaltaisia ​​ominaisuuksia.

Kaikki nämä esimerkit osoittavat, että vaihtoehtoisia käsittely ncRNAs voi olla tärkeä mekanismi, jonka avulla toiminnallinen monimuotoisuus ncRNAs saavutetaan, ja lisäksi merkitsee sitä, että uusi kerros sääntelyyn ja valvonnan asettamat ncRNAs geenien ilmentyminen voi olla olennainen biologiaan. Voi vain kuvitella mahdollisia vaikutuksia smRNAs peräisin ncRNAs toisen toiminnon ilmaus metabolisen välituotteiden eri fysiologisia valtioissa, samoin kuin vaikutus keskeisten välittäjäaineiden signaalitransduktion muuttuneeseen patofysiologisia valtioissa, kuten syövän.

toisin snoRNAs ja tRNA: ita, tiedetään vähän snRNAs, jotka ovat komponentteja silmukointiyksikkövälitteiseen monimutkainen, ohjaa tarkka poisto introni-sekvenssejä pre-mRNA: t [29]. Kuitenkin viimeaikaiset NGS kokeissa ehdotti, että spliceosomal snRNAs U1, U2, U6 ja U12 kerääntyä pieniä RNA-sekvenssit, [25], kun taas immunosaostuksella Argonaute proteiinien annettiin tunnistamisen Ago-sitoutuneen RNA-fragmentit U1, U2 ja U12 [30]. Viime aikoina, fragmentti RNU2-1 osoitettiin yli-ilmentynyt haiman ja paksusuolen ja peräsuolen syöpien suhteessa normaaliin kudokseen ne elimet [31]. Voidaan paremmin arvioida onko ilmaus pienten ncRNA fragmenttien vaihtoehtoisista käsittely liittyy jonkin taudin esiintyminen, mittasimme tasoja fragmenttien tuottaman snRNA U2 useiden menetelmien keuhkokudoksen ja seerumin potilaiden keuhkosyöpä, ja verrattuna ne RNU2 tasoja seerumissa potilaiden riski keuhkosyöpä (potilailla, joilla on COPD) sekä terveisiin. RNU2 on yksi voimakkaasti ilmentyvän ncRNAs, ja se ilmentyy ensisijaisesti keuhkokudoksessa [32]. Yhdistämällä NGS, microarray -hybridisaatiokokeissa ja qRT-PCR, suoritimme yksityiskohtainen analyysi RNU2 johdettujen smRNAs keuhkojen ensisijainen kasvaimia, pariksi viereisen normaali keuhkokudosanalyysin samoista potilaista, ja seerumin näytteitä keuhkosyöpään potilailla ja terveillä verrokeilla, samoin kontrolleina muiden keuhkosairauksia – ei syöpä. Tulokset viittaavat siihen, että miR-U2, joka on 19-22nt tuote RNU2 vaihtoehto käsittelyn, mahdollistaa erottelun potilailla, joilla on keuhkosyöpä kuin COPD, mutta ei syöpää, ja nostaa esiin mahdollisuuden, että seerumin perustuva mittaukset miR-U2 tasot voivat olla käytetään ei-invasiivisia, kustannustehokas, varhainen seulonta työkalu valita potilaita lisäarviointia kehittyneet kuvantamisen diagnostiikka kuten spiraali CT skannaus.

Materiaalit ja menetelmät

näytteitä Collection

Tissue yksilöitä ja seeruminäytteet kerättiin sairaalassa Rangueil ja sairaala Larrey, Toulouse, Ranska. Kirjallinen suostumus saatiin kaikille yksilöille ennen ilmoittautuminen tässä tutkimuksessa, ja tutkimuksen hyväksyi asianmukaiset institutionaaliset tarkastuslautakunta. Kaikki ennätykset anonymisoidaan suojelemaan yksittäisiä luottamuksellisuuden. Kliiniset tiedot kerättiin kunkin ajankohtana kudoksen tai verinäytteen. Kliininen vaihe määräytyy 7

th International Association for Study of Lung Cancer pysähdyspaikan järjestelmä [33]. Kahdeksan potilasta kahdeksantoista jotka leikattiin keuhkosyöpään, pariksi primäärikasvain ja distaalinen normaali kudosnäytteiden kerättiin. Veri keuhkosyöpäpotilaiden kerättiin diagnoosin aikana, mutta ennen kasvaimen resektiota tai erityistä hoitoa. Viisi ml verta kerättiin jokaisen yksilön SST putkiin ja käsitellään välittömästi. Putkia sekoitettiin muutama inversiot, ja sitten laittaa huoneenlämpötilassa 30 min hyytymistä. Sitten putkia sentrifugoitiin (1000 g, 4 ° C) 10 min. Lopuksi seerumifraktio jaettiin 1 ml: n putkiin ja varastoitiin välittömästi -80 ° C: ssa siihen asti, kunnes käyttöä. 45 tervettä kontrollinäytteitä hankittiin myös Asterand ja käsitellään samalla tavalla. Järjestimme Kohortin viiteen ryhmään. Kolme kontrolliryhmää sisältää henkilöitä ilman keuhkosyöpä: 1) vain ihmisiä ilman mitään oireita sairauden aikaan veren piirtää. Niitä voidaan pitää ”terve” yksilöitä. 2) potilailla, joilla on keuhkosairaus, joka ei ole keuhkoahtaumatauti. Tämä ryhmä koostuu pääasiassa kärsivien henkilöiden astma, keuhkoputkentulehdus, ja keuhkojen infektiot. 3) Keuhkoahtaumatautipotilailla ilman todisteita keuhkosyöpään aikaan veren piirtää. Potilaat, joilla on keuhkosyöpä jaettiin kahteen ryhmään: 1) kaikilla potilailla, joilla keuhkosyöpä ilman COPD oireita, ja 2) kärsivien potilaiden sekä keuhkosyöpään ja keuhkoahtaumatauti.

Extraction-puhdistus RNA

RNA uutettiin 0,5 ml seerumia käyttäen Qiagen miRNeasy mini kit, mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Piikki-valvonta (Cel-miR-39) lisättiin sen jälkeen, kun ensimmäinen denaturointia askel.

Arkistoidut tai tuoretta pikajäädytettiin kudosnäytteet homogenoitiin mukaan huhmaressa in TRIzol® Reagent Life Technologies (Carlsbad, CA ) ja RNA uutettiin edelleen mukaan valmistajan protokollaa. Pieni RNA jae eristettiin käyttäen Flash PAGE Fractionator (Ambion). Kaikki microRNA näytteet laimennettiin RNaasi-vapaaseen veteen ja niitä säilytettiin -80 ° C: ssa.

Deep sekvensointi ja tietojen käsittelyä

Kirjasto valmistelu ja sekvensointi kokeita käyttäen RNA: ta puhdistettiin kudoksesta tai seeruminäytteistä Suoritettiin by Fasteris (Sveitsi). Lyhyesti, RNA-fragmentit (16-30 nt tai 25-50 nt) puhdistettiin geelissä, jota seuraa ligaatio yksijuosteista RNA: ta 3 ’ja 5’ sovittimia. Akryyliamidigeelillä puhdistusvaihe suoritettiin ennen käänteistranskriptiolle ja PCR-monistusta tuottamaan DNA siirtomaa mallikirjasto. cDNA: t puhdistettiin geelissä ja kirjasto kvantifioitiin ennen laimennusta stä 10: een nM. Laimennettu cDNA-kirjastot tehtiin sitten sekvensoitiin käyttämällä Illumina HiSeq tekniikkaa. Sekvenssi lukee käsiteltiin yhdistelmällä bioinformatiikan algoritmeja ja manuaalinen kuratointi poistamiseksi 5 ’ja 3′ pää adapterit (taulukko S7). Vain luettu 19nt pitkä tai enää seuraa sovittimen poiston säilytettiin analyysiä varten. 5′- ja 3’-päissä epäsuhta karsittiin kunnes täydellinen-ottelun lukee. Lukee eri kirjastoissa normalisoitiin käyttäen kokonaismäärä säädetään kussakin kirjastossa ja ilmaistaan ​​lukee miljoonasosina (RPM) varten vertaamalla suhteellisia ekspressiotasoja. Vain lukee ainutlaatuisen ottelun ihmisen genomiin käytettiin (NCBI rakentaa 37). Niinpä lukee kartoitus toiminnallisiin RNU2 geenejä karttaa mihinkään muuhun genomista sijainti. Ei sisäistä epäsuhta sallittiin. Suuremmille luottamus, vain RNA vähintään viisi RPM katsottiin edelleen analysoida.

mikrosirut -hybridisaatiokokeissa

Nexterion (Schott) microarray lasiliuskat käytettiin kiinteänä tuen mikrosirulla. Mukautettu talon suunnitellut oligonukleotidit laikullinen heidän pintaan. Merkinnöissä on mikroRNA sovitettiin Castoldi et al. 2006 [34]. Leimattu microRNA jae hybridisoitiin täplikäs paneelit käyttämällä Discovery hybridisaatio asemalle (Ventana, Tucson, AZ). Taulukot skannattiin käyttämällä Axon skannerin (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ja tiedot kerättiin Genepix ohjelmistoa. Kuusi talon suunniteltu piikki-sisäiseen valvontaan käytettiin normalisoinnista. Nämä synteettiset RNA valvontaa lisättiin kokonais-RNA-osa ennen hybridisaatiota. Kaikki sekvenssit, joiden voimakkuus paikalla oli suurempi kuin keskimääräinen paikallinen tausta intensiteetti plus 1,5 kertaa sen keskihajonta luokiteltiin ilmaistiin MikroRNA. Tilastollinen normalisointi tietojen tehtiin laskemalla Log

2-suhde, jossa Log

2-suhde = keskimääräinen intensiteetti signaali duplikoituneen paikkoja /mediaani intensiteetti kaikkien sisäisen valvonnan lohkolle. Normalisoituminen tehtiin per lohko välttää epäyhtenäinen merkintöjä (taulukko S4). Microarray data analysoitiin käyttämällä R Bioconductor paketti [35]. Suhteellinen ekspressio kunkin mikroRNA laskettiin käyttämällä 2

-ΔΔCT menetelmä [36]. ”MeV 4.8.1” (MultiExperimentViewer) [37] käytettiin hierarkkinen klusterointi analyysiin, jossa valitut miRNA ryhmittyivät käyttäen Euklidinen etäisyys.

qRT-PCR miR-U2 ilmaisu

Expression tasot miR-U2-1 arvioitiin qRT-PCR käyttäen Exiqon mukautetun LNA

TM alukkeita (Exiqon, Vedbaek, Tanska) mukaan valmistajan ohjeiden. Vaikka alukkeet olivat suunnittelun havaitsemiseksi isoformin UGGAUUUUUGGAGCAGGGAG Exiqon alukkeita voidaan havaita muiden isoformien (taulukot S5 ja S6). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Koska puute seerumin taloudenhoito pieniä ncRNAs, me normalisoitu microRNA pitoisuus alkuperäiseen tilavuuteen seerumia (500 pl). Eksogeenista piikki-valvonta (Cel-miR-39) käytettiin myös, jotta tarkistaa tulosten luotettavuus. Laskimme ACt-arvon matriisin kunkin näytteen vähentämällä kynnyksen syklin (Ct) arvo miR-U2 Ct-arvo Cel-miR-39. Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) käytettiin tilastollista analyysiä vertailemalla näyte väestön ja kontrolliryhmiin. Alue käyrän alla (AUC) laskettiin vastaanotin operaattori käyrät (ROC). Tulokset määritetään normalisoinnin Cel-miR-39 piikki-in ja normalisoinnin tilavuus seerumia verrattiin.

Tulokset ja keskustelu

Lung primaarikasvainten erittäin ilmaista 19-22nt ncRNA jalostetut RNU2

ihmisen genomi koodittaa kahta toiminnallista U2 snRNA geenejä, RNU2-1 ja RNU2-2, jotka sijaitsevat 17q21.31 ja 11q12.3 vastaavasti. Genominen järjestys kahden RNU2 geenejä poikkeaa radikaalisti. RNU2-2 on läsnä yhtenä kappaleena taas RNU2-1 järjestetään klusterin 6 -30 peräkkäin toistuvaa kopiota ulottuu 30-150 kb. Jokainen toistuvassa yksikössä on 6,1 kb pitkä, sisältää yhden RNU2-1 geeni ja on hyvin konservoitunut muiden toistuvaa yksikköä. Vaikka RNU2-1 eroaa geenikopiomäärä yksilöstä toiseen, taulukot ovat vakaasti perinnöllinen, jollei annostus korvausta ja transkriptoidaan epätavallisen korkea. Jotta löytää, jos pieni ncRNAs voidaan tehokkaasti jalostettu kaksi toiminnallista RNU2 geenejä ja rajaamiseksi tällaisia ​​tuotteita tarkasti, sekvensoimme pieni RNA transcriptome viiden ihmisen keuhkosyövän primaarikasvainten sekä kolme allasta seeruminäytteitä, yksi terveiltä luovuttajilta ja kaksi keuhkosyöpäpotilaita (taulukko 1). Sekvensoinnin liittyvä näytteitä samanaikaisesti minimoi väärien löytö ncRNAs. ncRNAs, jotka ovat todella yli-ilmentynyt voidaan odottaa löytyy useita itsenäisiä näytteitä. Ensimmäisessä vaiheessa, olemme kartoittaneet lukee sekvensoitu seitsemän valmistetuista kirjastoista primaaristen kasvainten, viisi lyhyttä kokoinen (16-30nt) ja kaksi pitkää kokoinen (25-50nt) suoraan RNA-sekvenssin funktionaalisen RNU2 geenejä. RNU2-1 lokukseen kromosomissa 17 todella poistettiin ihmisen genomin kokoonpano sitten version Build 37 (NCBI Huomautukset Tiedot Gene ID: 6066, päivitetty 20-Apr-2012). Suurin osa lukee viisi lyhyttä kokoinen kirjastot karttoja ainutlaatuisella paikalla asemien 93 ja 114 RNU2-1 (Fig. 1a-b). Pisimmälle ilmaisi lukee vaihtelee 19 22nt pituisia. Tämä RNA-fragmentti kutsutaan miR-U2-1. Merkillistä, pieni RNA sekvensoinnilla kolme allasta seerumin yksilöitä osoittivat, että miR-U2-1 on läsnä verenkiertoa sekä keuhkosyöpäpotilaita ja terveillä koehenkilöillä, paljastaen Kattavan lauseke (Fig. 1 c-d). Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-U2-1 aktiivisesti viedään sijaan passiivisesti vapautuu verenkiertoon. Vain osa miRNA onkin havaittu ulkopuolella solujen [38] – [41], mikä miR-U2-1 voi edustaa ylimääräinen jäsen tässä luokassa.

Pieni lukee havaittu Ensisijainen kasvaimia (a) ja seerumia (c). Pitkän lukee havaittu Ensisijainen kasvaimia (e). Värikoodi näkyy, kuinka monta normalisoitu lukee havaittiin kussakin kirjastossa. Punainen viiva etsii miR-U2. Määrä lukee niiden koon annetaan (b) ensisijaisen kasvaimia, in (d) seerumia.

väestön keskuudessa lukee läsnä primaarikasvaimia kuin sekä seerumin, havaitsimme kertyminen RNA-fragmenttien alkaen asennossa ”A-94” tai ”A-95” ja päättyy asennossa ”G-113” tai ”A-114” (Fig. 2). Tämä rajoitettu määrä 5 ’ja 3’ pää lukee vastaa selvä ja pieni väestö varianttien tai isomirs, yleisesti ominaisuus on MikroRNA. Yhdessä nämä miR-U2-1 isomirs osuus on yli 75% lukee vastaavat ainoastaan ​​tällä alueella RNU2-1. Niiden ekspressiotasot ovat alueella kanonisen MikroRNA kuten miR16, miR-17, miR-200a tai miR-451 (taulukko S1). Tämä merkittävä kertyminen ainutlaatuinen ja tarkasti pilkotun RNA-fragmentti RNU2-1 selkeitä todisteita suositaan hypoteesia, että erityistä käsittelyä tapahtumia tuottaa uusia toiminnallisia ncRNA, miR-U2-1 sijaan vaihtoehtoinen selitys, että nämä ovat satunnaisia ​​tuotteita RNA: n hajoamisen. Nämä tulokset osoittavat lisäksi, että miR-U2-1 on suojattu endo- ja ekso-nukleolyyttisistä RNaasi ruoansulatusta nojalla pakkausten monimutkaisia ​​nukleoproteiinin hiukkasia. miR-U2-1 voidaan myös kääriä pieniä membranous hiukkasia (eksosomeiksi, mikrorakkulat, apoptoottisten kappaleiden) ennen vientiä kiertoon. Valtaosa MikroRNA havaittavissa seerumissa todellakin keskittyi eksosomeiksi [42], vaikka jotkut saattavat yksinkertaisesti liittyviä proteiineja [43]. Yhdessä tämä viittaa siihen, että käsittely tapahtumien tuottamiseen miR-U2-1 ratkaiseva merkitys biologisia prosesseja ihmisen.

(a) Osoittaa sekvenssin jokaisen lukea havaitaan ja normalisoitu määrä kunkin lukea annetaan jokaiselle kasvain yksilö. (B) kokonaismäärä kunkin luetun osoite näytetään histogrammin. Histogrammit (c) ja (d) lukumäärä näkyy lukee klo monipuolinen 5 ’alkaa ja 3-päihin miR-U2 vastaavasti.

sekvenssit RNU2-1 ja RNU2-2 geenit (187 nt) ovat erittäin konservoituneita. Niiden väliset erot on rajoitettu kahden pisteen mutaatioita, joka sijaitsee 3 ’päässä (asemat 170 ja 187) ja 4-emäksen mutaation sijaitsee asemissa 108-111 (Fig. S1). Merkillistä, RNU2-2 ilmaisee myös samalla alueella, jolla on sama koko (Fig. S2). Mitä suurempi määrä lukee havaita miR-U2-1 verrattuna miR-U2-2 on sopusoinnussa RNU2-1 korkeamman genomista kopiomäärä. Onneksi 4-base ero (GCAG ja AAUA vuonna RNU2-1 ja RNU2-2 vastaavasti) erottaa kaksi U2 geenit sijaitsee sisällä miR-U2-sekvenssit, jotka sallivat syrjinnän näiden kahden tuotteen. Tämä polymorfia ei näytä olevan mitään havaittavaa vaikutusta käsittelyä, mikä viittaa samanlainen biogeneesin mekanismit miR-U2-1 ja miR-U2-2. Kuitenkin erot sekvenssissä miR-U2-1 ja miR-U2-2 voivat heijastaa edelleen toiminnallinen monipuolistaminen, ehkä helpottaa hienosäätöä sääntelyn toimintoa ero kohdistinvalinta tai proteiinitekijöiden sitova.

käyttö NGS tekniikka ei ole ilman sen sudenkuopat. Se on vakiintunut, että pienet RNA: t voivat olla vahingossa rajat kartoitettu väärään genomin alueella. RNU2 geenit ovat monimutkaisia ​​perhe, joka käsittää enemmän kuin 50 pseudogeenejä, mikä tekee rajat kartoitus virheet selvästi mahdollista. Se on viime aikoina raportoitu, että kaksi immunosaostettiin argonaute liittyvä pieni RNA: t 23nt ja 30nt kartoitettiin kahdelle eri U2 pseudogeenejä [30], asemia 168-187 U2 pseudogeenin koodaa kromosomi 6 ja asemia 95-125 U2 pseudogeenistä koodaama kromosomin 10 tässä järjestyksessä. Nämä kaksi fragmenttia kartta toiminnallinen U2-1 RNA: 100% identtisyys. Olimme aikaisemmin totesi, että RNU2-1 lokus kromosomissa 17 todella poistettiin Human Genome Sequence Assembly Build 37 (NCBI Huomautukset Tiedot Gene ID: 6066, päivittää 20-huhtikuu 2012), ja tämä on todennäköisin selitys siitä, miksi nämä RNA-fragmentit kartoitettu näihin pseudogeenien sijaan funktionaalinen RNU2 itse geenin. Samoin kaksi lyhyttä MikroRNA (19 nt), miR-1246 ja miR-1290, ottelu miR-U2-1 100% identiteetti ja yksi yhteensopimattomuus vastaavasti [44]. Mapping lukee myös viisi lyhyttä kirjastot vastaaviin esiasteita näiden kahden MikroRNA [45] paljasti yksiselitteisesti, että kahden mahdollisen esiasteita miR-1246 ja miR-1290 ovat tulosta väärien kartoitus. Kahdella ehdotetulla kypsän MikroRNA todella katkaistu versioita miR-U2-1. Tämä epäsuorasti vahvistettiin miR-1246, kun yrittää sekvensoida sen esiaste samassa kudos, jossa miR-1246 havaittiin epäonnistuneet, mikä viittaa siihen, että oletettu esiaste ei ole [46]. Tämä tulos oli hiljattain riippumattomasti vahvistettu [31]. Mitä tulee miR-1290 on kaksi mahdollista genomista paikoissa, jotka voivat koodata (Kuva. S3), kuitenkin kokeissa havaitaan samalla tasolla kuin taustamelun liittyy sekvensointivirheitä (taulukko S2). Tästä voimme päätellä näistä tiedoista, että kaikki tulokset liittyvät miR-1246 ja miR-1290 voidaan määrittää miR-U2.

kaksi tehtävää varten RNU2 geenien

Koetulokset keskusteltu tähän mennessä ehdottaa kaksi tehtävää varten RNU2-1 ja RNU2-2 snRNAs. Niiden 5 ’domain sisältää mRNA haara sivuston mukana mRNA, kun taas 3’domain koodaa miR-U2, joka sisältää Sm sitoutumiskohdassa ja voisi olla mukana geenin ilmentymisen säätelyyn. Tämä toiminnallinen osio RNU2 korreloi havaittu eroja rakenteellisia piirteitä, joita esiintyy molekyylin (Fig. 3). 5′-osa sisältää merkittävä määrä posttranskriptionaalisella muutokset kuten 14 pseudouridylations ja 10 metyloidut nukleotidin [47] – [49]. Sen sijaan, muutoksia ei tunnistetaan alavirtaan kannan 90 RNU2, ja tämä domeeni sisältää laajempi sekundäärisen rakenteen, erityisesti silloin, kun prekursori-sekvenssi sisältyy. Nämä silmiinpistävää rakenteelliset eroavuudet ovat todennäköisesti liittyy vastaaviin ero toiminnot puolikkaat RNU2. Vaikka 5′-domeeni on riittävä indusoimaan mRNA in vitro [50] – [52], ei ole näyttöä joko kirjallisuudesta tai meidän NGS kokeissa, että osa 5’-alue RNU2 kerääntyä soluihin. Tämä viittaa siihen, vaihtoehtoinen käsittely mekanismi, joka tuottaa täysikokoinen RNU2 toisaalta, ja miR-U2 toisaalta.

sekundaarirakenteen laskostumisen RNU2 esiaste on esitetty. Ψ paikat ovat peräisin [49]. Metyloituja nukleotideja symbolilla ”

m”. Nukleotidin sininen ja vihreä vastaavat miR-U2-1 järjestyksessä. Vihreä kirjaimet paikallistaa neljän nukleotidin mutaation välillä miR-U2-1 ja miR-U2-2. Musta ja punainen kirjaimin RNU2 ja esiaste-erityisiä RNU2 sekvenssit vastaavasti. Blue nuolet 5′- ja 3-päihin miR-U2 isomirs. Punainen nuoli osoittaa, että 3′-pään RNU2. Kaksi mustaa arrowheads kohta kahteen sisäiseen pilkkomiskohdat tunnistettu tässä työssä.

Jotta voidaan paremmin ymmärtää mekanismia miR-U2 liittämiseen, sekvensoimme kaksi cDNA- kirjastoja ncRNAs pidempään miR-U2 (25-50nt pitkä), jotta voidaan tunnistaa mahdolliset välituotteita (taulukko 1). Määrä pitkän lukee kartoitus RNU2 on huomattavasti pienempi kuin se, joka nähtiin pienen koon cDNA-kirjastojen, mikä viittaa siihen, että välituote kypsymisen hajoaa nopeasti tai lohkottu tuottaa lopullisen kypsän microRNA. Tarkastellaan jakelu lukee (mitattuna RPM) pitkin ennalta RNU2 järjestyksessä, huomaamme kaksi piikkiä vastaa kahta pienempää fragmentteja, jotka kertyvät (Fig. 1 e). Kuten odotettua, yksi piikki karttoja kypsän miR-U2, kun taas yllättäen toinen kartat 3′-päähän kypsän RNU2, alueelle, joka ei tuota vakaata ncRNA koska meillä ei noudata sitä sekvensointialustamme tulokset lyhyellä -kokoisen kirjastot. Tämä RNU2 fragmentti vastaa täsmälleen 30nt mittainen fragmentti sitova Ago1 [30]. Tämä viittaa siihen, että hajoaminen 3′-pää RNU2 vaikeuttaa ohimenevä sitoutumisen sitten, mutta koska suoja sitten 1 on väliaikainen, se ei aiheuta vakaan ncRNA tuote. Vaihtoehtoisesti tämä tuote voisi hajota keuhkojen kudoksia, koska ei ole ylimääräisiä tekijöitä, mutta voisi ilmaista muissa solutyypeissä tai kudoksissa. Määrän vähenemisestä lukee molemmin puolin kahden huipun heijastaa hajoamista välituotteiden kypsymisen viimeistelemällä mekanismeja molemmista päistä, kun taas laaksossa ne paikantaa asemaa endonukleolyyttistä katkaisukohta (endo 3 ’) läheisyydessä asentoon 145 sisällä varsi IV (Fig. 1 e ja Fig. 3). Sen sijaan 5 ”puoli ei sisällä fragmentti suojattu hajoamiselta. Kuitenkin, toinen endonucleolitic pilkkoutumiskohta (endo 5 ’) tulee sijaitsemaan kohtien 70 ja 80 sisällä varren IIb.

Koska erilaisten mahdollisten prosessointireaktiosarjat varten RNU2, todennäköisin ensimmäinen vaihe käsittää 3′ katkaisu asemassa 187. Voimme löytää mitään lukea vastaavia odotettavissa erityisiä esiaste, joka osoittaa varhainen ja nopea tapahtuma. Tämä ensimmäinen vaihe käsittää emäksen-kuoret esimuotopartikkeleiden välinen spesifinen sekvenssi (asemat 190-200) ja sijoittaa 100-110 ja RNU2 joka on keskeinen rakenteellinen piirre tarvitaan ohjaamiseksi 3′-pään käsittelyä [53]. Yllättävää kyllä, tämä emäspariutumista tapahtuu MIR-U2 alue ja rajataan tarkasti kaksi rakenteellisesti ja toiminnallisesti erillistä puolikasta RNU2 (Fig. 3). Sitten, ilman Ago1-sitovia, sitova Sm proteiinin, todennäköisesti yhdessä muiden tekijöiden, kuten U2A ’ja U2B ”, voi vakauttaa täyspitkä RNU2. Sen sijaan Ago1 sitoutuminen miR-U2-sekvenssit voivat aiheuttaa siirtyminen endonukleolyyttinen pilkkoutuminen reitti, joka katkaisee asemissa 70-80 ja 145 vastaavasti. Useita ja vieressä pieniä RNA-sitoutumiskohdat Ago1 tiedetään helpottavat yhteistoimintaa vuorovaikutusta, joka vakauttaa Argonaute sitova [54]. Koska Ago1 ei ole entsymaattista aktiivisuutta, RNaasi on rekrytoitiin miR-U2 kypsymisen, samoin miR kaltaisia ​​ncRNAs tuotetaan snoRNAs ja tRNA. Lopuksi, tämä ohimeneviä esiaste nopeasti leikataan molemmista päistä, jolloin saadaan kypsä miR-U2.

yksinomainen sitoutuminen miR-U2 Ago1 [30], toisin kuin useimmat kanoninen MikroRNA, jotka sitoutuvat myös Ago2 [ ,,,0],55], ehdottaa eri rooli miR-U2. Vaikka kyseessä oleva data osoittaa, että MikroRNA säädellä geeniekspressiota sytoplasmassa ja P-elimet, neljä Argonaute proteiineja ja useita MikroRNA on äskettäin löydetty tumassa ihmisen soluja. Kuljettaminen pieniä RNA: iden kompleksi sitten proteiinien tumaan riippuu importiinissa-8 [56]. Tämä mekanismi viittaa niiden mahdollista vuorovaikutusta kromatiinin ja avaa jännittävä vaihtoehto niiden suoraa osallistumista vaikuttavat ydin- prosessit, kuten liittämiseen tai transkriptio kohdentamalla geenin promoottori alueille. Mielenkiintoista, useat viimeaikaiset tutkimukset paljastivat toiminnallinen erottelua Ago1 ja Ago2 [57] sekä ero jakauma tumassa vastauksena promoottori-kohdennettuja siRNA aikana transkription geenien [58] viittaa siihen, että sitten proteiinit välittävät ydinvoiman lokalisoinnin pienen RNA: iden . Lisäksi määritellään biologista aktiivisuutta pieniä RNA: iden, Ago proteiinit voivat myös määritellä pituuden kypsän MikroRNA [59].

Näin voimme harkita mahdollisuutta, että miR-U2 voisi olla epigeneettiset rooleja DNA-tasolla jossa se voi toimia säätelijänä ilmentymisen suuria kromosomaalisia alueita. On todellakin tiedetään, että monet promoottorit kasvaimeen synnyssä osoittavat korkeampaa metylaation, mikä viittaa mahdolliseen yhteyteen syöpäriskiä. miR-U2 voisi esimerkiksi osallistua ohjaava sytosiinin metylaatio, prosessi, joka tiedetään olevan herkkiä ympäristön ärsykkeisiin.