Krooninen sairaus

tiivistelmä

Yleensä suurin osa munasarjasyöpä ei voida havaita ennen laajamittaista ja kauko etäpesäkkeitä esiintyy, mikä on tärkein syy korkea kuolleisuus munasarjasyöpään. Siksi on kiireellistä löytää etäpesäkkeiden liittyviä biomarkkereita havaitsemiseksi munasarjasyövän sen okkultismin etäpesäkkeitä vaiheessa. Altered glykosylaatio on universaali piirre maligniteetin ja tietyntyyppisten glykaanirakenteet ovat tunnettuja merkkiaineita kasvain progressioiden. Siten tämä Tutkimuksen tavoitteena paljastaa tiettyjä muutoksia

N

glykaanit vuonna secretome metastaattisen munasarjasyövän. Käytimme kvantitatiivinen glykomiikan perustuva lähestymistapa metabolisen vakaa isotooppi merkintöjä vertailla ero

N

-glycosylation of secretome välillä munasarjasyövän solulinja SKOV3 ja sen korkea metastaattinen johdannainen SKOV3-ip. Kiehtovan, joukossa yhteensä 17

N

glykaanit tunnistettu,

N

glykaanit kanssa kahtiajakautuneen GlcNAc olivat kaikki merkitsevästi väheni SKOV3-ip verrattuna SKOV3. Tämä muutos kahtiajakautuneen GlcNAc glykomuodot sekä sen vastaavat yhdessä munasarjasyövän metastaattinen käytös edelleen vahvistaa myönnettäessä glycotransferase tasolla useita tekniikoita, kuten reaaliaikaisen PCR, Western blotting, siirtokuoppaan määritys, lektiini blotting ja immunohistokemia analyysi. Tutkimus havainnollistaa etäpesäke liittyvä

N

glykaani muutoksia munasarjasyövän secretome

in vitro

ensimmäistä kertaa, joka on arvokas lähde biomarkkereiden löytö samoin. Lisäksi

N

glykaanit kanssa kahtiajakautuneen GlcNAc valottavat havaitsemista munasarjasyövän varhaisessa vatsakalvon etäpesäke vaiheessa joka voi toteuttaa parantaa ennustetta munasarjasyöpä potilaille.

Citation: Zhang X, Wang Y, Qian Y, Wu X, Zhang Z, Liu X, et al. (2014) Discovery Erityiset Etäpesäke-Related

N

glykaani Muutokset epiteelikasvaimet Munasarjasyöpä perustuvat määrällisiin glykomiikan. PLoS ONE 9 (2): e87978. doi: 10,1371 /journal.pone.0087978

Editor: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 syyskuu 2013; Hyväksytty: 02 tammikuu 2014; Julkaistu: 06 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Basic Research Program of China (973 Program) (2012CB8221004, 2013CB910503), National High-tech-T ihmisen MGAT5 eteenpäin (5′-GACCTGCAGTTCCTTCTTCG-3 ’) ja ihmisen MGAT5 reverse (5′-CCATGGCAGAAGTCCTGTTT-3′); ihmisen glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GADPH) eteenpäin (5’-CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3 ’) ja ihmisen GAPDH reverse (5′-TGAGCGATGTGGCTCGGCT-3’). Ihmisen GADPH mRNA toimi sisäsyntyinen ohjaus normalisointia. Reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin kolmena kappaleena.

Plasmidit ja Gene Yliekspressio

SKOV3-ip ja SKOV3- solut transfektoitiin käyttäen X-tremeGENE HP DNATransfection Reagent (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa ) kanssa pcDNA3.1-MGAT3 tai pcDNA3.1-MGAT5 plasmidit, vastaavasti (jonka tutkija laboratoriossamme) mukaan valmistajan ohjeiden. Ja pcDNA3.1 vektoria käytettiin negatiivisena kontrollina. 48 h transfektion jälkeen, yliekspressio MGAT3 ja MGAT5 varmistettiin Western blot -analyysillä.

Sirna ja pudotus on MGAT3

SKOV3- solut transfektoitiin MGAT3 erityisiä siRNA Transfection Reagent Complex, (Santa Cruz Biotech, Inc., sc-44469), joka valmistettiin valmistajan protokollan. Salattu siRNA käytettiin negatiivisena kontrollina. 48 h transfektion jälkeen, solulysaatteja valmistettiin Western blot analyysi määrittää geenin pudotus tehoa.

Western Blot ja lektiini blot -analyysi

saamiseksi kokosolu proteiinit, solut kerättiin , pestiin fosfaattipuskurilla (PBS), ja sitten lyysattiin SDS lyysipuskuria [50]. Kokonaisproteiinia pitoisuudet määritettiin BCA-määrityksellä (Pierce, Rockford, IL). Yhtä suuret määrät kokonaisproteiinia lysaatit kustakin solulinjasta erotettiin 10% natriumdodekyylisulfaattia polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja siirrettiin sitten PVDF-kalvoille (Roche Applied Science). i. Western blot-analyysi: Kun estää 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä (TBST), 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa, membraaneja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa hiiren monoklonaalisella vasta-aineella MGAT3 (1/1000 laimennettu, sigma) tai MGAT5 (1/1000 laimennettu, sigma), ja sitten sekundäärisen vasta-aineen huoneenlämpötilassa 1 tunti. Pesun jälkeen kalvoja havaittiin tehostettu kemiluminesenssi (ECL) määritys kit. ii. Lektiiniblottianalyysillä blot-analyysi: Kun estää 5% BSA TBST: ssä, kalvoja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa biotinyloidun

Phaseolus vulgaris erythroagglutinin

(E-PHA) (1/5000 laimennettu, Vector Labs) tai

Phaseolus vulgaris leucoagglutinin

(L-PHA) (1/5000 laimennettu, Vector Labs). Seuraavaksi kalvot pestiin neljä kertaa TBST: llä, mitä seurasi inkubointi piparjuuriperoksidaasiin streptavidiinilla (Vector Labs) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen kalvot pestiin neljä kertaa TBST: llä ja havaita ECL -määrityskittiä.

TranswellTM migraatiokokeessa

arvioimiseksi leviämiskyky, solujen vaeltamiseen suoritettiin käyttämällä 24-kuopan formaatissa transwell kammiot ( 8 um suodattimen, jonka huokoset, Corning, Canton, NY). Lyhyesti, SKOV3- solut transfektoitiin MGAT3 erityisiä siRNA tai MGAT5 plasmidi, ja SKOV3-ip-solut transfektoitiin MGAT3 plasmidi 36 tuntia, vastaavasti. Tämän jälkeen solut trypsinoitiin, kerättiin, laskettiin ja suspendoitiin sitten seerumivapaassa RPMI1640 väliaineessa. 2 x 10

4 solua 100 ui seerumitonta RPMI 1640 väliainetta platted kunkin insertin ylemmän kammion. Samaan aikaan, 600 ui RPMI 1640, joka sisälsi 10% FBS: ää lisättiin kuhunkin alempaan kammioon. Sen jälkeen soluja inkuboitiin 12 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Poistamisen jälkeen solut ylemmän kalvon pintaan, solujen alapinnalle kalvon kiinnitettiin ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Seuraavaksi solut, jotka oli suodattimen läpi alempaan kammioon laskettiin mikroskooppisesti 6 satunnaisessa alueilla suodatinta kohden. Solujen lukumäärä, jotka kulki kalvon paljasti leviämiskyky testattujen solujen.

immunohistokemia Analysis

yhteensä 24 munasarjasyövän kudokset fiksoitiin 4% formaliiniin ja upotettiin parafiiniin. Kudosleikkeet kohdistettiin ensin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H huippu tunnistusmenetelmä: kynnys-25% painopisteen; kynnys offset: 0.500 mV.

m /z

arvot ja intensiteetit viedään ASCII-tiedostoja ja huippuintensiteetit kevennettäisiin kanssa korkein huippu 100%. Suhteellinen määrällisesti havaittujen

N

glykaanit oli protokollien mukaisesti aiemmin raportoitu [42]. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen GraphPad Prism (versio 5). Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa. Tiedot ilmaistiin keskiarvoina ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Opiskelijan

t

-testi käytettiin määrittämään merkitystä erot kahden ryhmissä. Wilcoxon Signed Ranks Test käytettiin vertaamaan immunohistokemia tietoja kahteen ryhmään.

p

-arvo alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

kvantitatiivinen /Comparative glykomiikan analyysi Supernatantti välillä SKOV3 ja SKOV3-ip Cell

Voit löytää etäpesäke liittyvä

N

glykaani muutoksen munasarjasyöpäsolu secretome, koko altaan

N

glykaani seos, vapautuu entsyymi peptidi

N

-glycosidase F päässä secretome seoksesta SKOV3 (amidin

15N-Gin leimattu) ja SKOV3–ip-solut (amidin

14N-Gin leimattu), analysoitiin MALDI-QIT-TOF MS ( kuva 2). Yhteensä 17

N

glykaanit tunnistettiin, kuten korkea mannoosi, hybridi, kolmihaarainen, tetra-antennaarisen rakenteita ja kahtiajakautuneen GlcNAc glykomuotojen. Kaikki tunnistetut

N

glykaanit kanssa ehdotetun rakenteen oli kuvassa 2 ja yhteenveto taulukossa 1.

N

linkatun glykaanien alkaen 01:01 seoksesta SKOV3 -IP (Gln-14 leimattu) ja SKOV3 (Gln-15 leimattu) supernatantti. Rakenteet tulkittiin manuaalisesti perustuu niiden

m /z

arvojen mukaan useiden aiemmin julkaistu kirjallisuus [46], [47], GlycoWorkbench [48] sekä Glycan Mass Spectral Database [49]. Gln-14 osoittaa amidin

14N-Gin; Gln-15 osoittaa amidin

15N-Gln. Vihreä ympyrä osoittaa mannoosi; keltainen ympyrä merkitsee galaktoosia; sininen neliö osoittaa

N

-acetylglucosamine; Punainen kolmio osoittaa fukoosin.

kvantitatiivinen analyysi

N

glykaanit päässä secretome seoksesta SKOV3 ja SKOV3–ip soluihin perustuva signaali intensiteettiä. Intensiteetti suhde (SKOV3-ip /SKOV3) 0,83 ja 1,2 asetettiin raja arvioida alas- tai ylöspäin säätelyn

N

glykaani tasoilla SKOV3–ip soluissa, verrattuna SKOV3- soluihin koska suurin variaatiokerroin (CV) (n = 9) oli alle 20% tässä tutkimuksessa [43]. Suhteellinen kvantitointi kaikkien havaittujen

N

glykaanit välillä SKOV3-ip ja SKOV3- solut yhteenveto taulukossa 1. Tulokset osoittivat, että kolme neljästä runsaasti mannoosia rakenteet olivat säädellään ylöspäin SKOV3–ip soluissa.

N

glykaanit sisältävien hybridi, kolmihaarainen, ja tetra-antennaarisen rakenteita tai ilman fukoosia kohosivat SKOV3–ip soluissa. Samanlainen suuntaus havaittiin kolmessa glykaaneja monimutkaisten kaksiantenniset rakenteisiin. Kaikista muutoksen

N

glykaanit, kaikki

N

glykaanit kanssa kahtiajakautuneen GlcNAc todettiin ilmeisesti väheni SKOV3–ip soluissa, niiden SKOV3-ip /SKOV3 suhteet vaihtelevat +0,73-+0,12, kun taas kaikkien β-1,6 GlcNAc-haarautunut

N

glykaanit kohosivat SKOV3–ip soluissa. Näistä muuttunut

N

glykaanit keskityimme

N

glykaanit kanssa kahtiajakautuneen GlcNAc, osittain siksi ne kaikki vähenivät ja he olivat ilmeisesti muuttunut

N

glykaanien. Lisäksi alati kasvava todistusaineisto on osoittanut, että bisecting glykaanien voi vaikuttaa kasvaimen etenemiseen ja etäpesäkkeiden [52] kantavassa sisältäviä rakenteita kahtiajakautunut GlcNAc varmistettiin vielä tandemmassaspektrometrialla (MS /MS). Edustavia tandem MS-spektrit

m /z

2012,7 [M + Na]

+ ja

m /z

2377,8 [M + Na]

+ näytettiin kuvioissa S1A -B.

on huomattava, että siaalihappoa, tyypillisesti esitetty päätelaite monosakkarideja glykaanirakenteeseen osan monien glykoproteiinien, on olennaiset rooleja monissa fysiologisissa ja patologisissa prosesseissa. Sialyloiduilla glykaanien ovat labiileja ja helposti kadota suoraan massaspektrometrianalyysissä derivatisoimattoman

N

glykaanit. Kuten permethylation voi vakauttaa siaalihappotähteistä muuntamalla erittäin polaarisia -OH ja -COOH

– ryhmät eri monosakkarideja osaksi ei-polaarisista [38],

N

glykaanit jälkeen permethylation analysoitiin myös. Tulokset osoittivat, että enemmän

N

glykaanit eri sialylaatioastetta havaittiin vertaamalla analyysin tuloksia ilman permethylation. Vaikka signaali yhden

N

glykaanin kanssa kahtiajakautuneen GlcNAc voitaisiin hajauttaa useampi signaali

N

glykaanit eri sialylaatioastetta trendi muutoksen kaikkien kahtiajakautuneen GlcNAc rakenteet olivat sama riippumatta permetyloitu vai ei (katso kuva S2). Signaali intensiteetti bisecting

N

glykaani ilman permethylation (kuvio S2A,

m /z

2012,6 esimerkiksi) oli korkeampi kuin permetyloitu

N

glykaanit at

m /z

2489,4,

m /z

2850,3 ja

m /z

3211,4, jotka sisältävät 0, 1 ja 2 siaalihappoa vastaavasti (kuvio S2B). Se on ehkä siksi osa alkuperäistä kahtiajakautunut signaalin voimakkuus (kuvio S2A) vaikuttivat vastaavaksi fragmenttien glykaanit kanssa samaa rakennetta samalla sisälsi lisää 1 ja 2 siaalihappoa (kuvio S2B). Lisäksi glykaanirakenteeseen profiilien permethylation olivat monimutkaisempia (so on enemmän huippuja). Siten ehdotetaan, että permethylation vaihe todennäköisesti voitaisiin jättää pois määrälliset glykomiikan tarkastelussa on neutraali

N

glykaanit joka on irrelative että siaalihappoa, kuten kahtiajakautuneen GlcNAc glykomuodon tässä tutkimuksessa.

Differential ilmentäminen MGAT3 in SKOV3-ip ja SKOV3 Solulinjat

Kuten kahtiajakautuneen GlcNAc jäännös syntetisoitiin erityisiä glycosytransferase (MGAT3), muutos

N

glykaanit kanssa kahtiajakautuneen GlcNAc voitaisiin korreloida vastaavaan muutoksen MGAT3. Näin ollen, reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin vertaamaan mRNA: n ilmentymisen tasot MGAT3 välillä SKOV3 ja SKOV3-ip solulinjat. Tulokset osoittivat, että MGAT3 on ilmennetty eri kahden solulinjojen. MRNA taso MGAT3 oli merkitsevästi korkeampi SKOV3- soluissa kuin siinä, SKOV3–ip-soluja (61-kertainen,

p

0,001, kuvio 3A). Sitten ekspressio MGAT3 tässä kahdessa solulinjassa tutkittiin lisäksi on proteiinin tasolla Western blot -analyysillä. Alempi runsaasti MGAT3 havaittiin SKOV3–ip-soluja toisin SKOV3- soluja (kuvio 3B). Siksi vähentynyt MGAT3 ilmaisua sekä mRNA ja proteiini tasoilla SKOV3–ip soluja mukaisesti vähentynyt kahtiajakautunut GluNAc muutoksia SKOV3-ip solusupernatantissa ilmenee kvantitatiivisen glykomiikan analyysi.

(A) mRNA ekspressiotasot MGAT3 in SKOV3-ip ja SKOV3 solulinjoissa. MRNA tasot MGAT3 normalisoitiin kanssa GAPDH tasoilla. Mean kertainen muutokset laskettiin 2

-ΔΔCt menetelmällä. (B) proteiini ekspressiotasojen MGAT3 in SKOV3-ip ja SKOV3-solulinjoja. Solulysaatit eristettiin 10% SDS-PAGE western-blottauksella käyttämällä vasta-ainetta vastaan ​​MGAT3. Ihmisen beeta-aktiini toimi endogeeninen kontrolli. 293T-solulinjaa käytettiin positiivisena kontrollina. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM. Kukin määritys suoritettiin vähintään kolme kertaa.

p

-arvo alle 0,05 osoittaa tilastollista merkittävyyttä Studentin

t

-testissä.

Effects of MGAT3 siirtolaisuutta Kyky munasarjasyöpäsoluja

tiedot edellä osoittivat, että tasot MGAT3 ja sen catalysate,

N

glykaanit sisältäviä kahtiajakautunut GlcNAc, olivat merkittävästi pienemmät SKOV3–ip soluja verrattuna että SKOV3- soluissa. Koska SKOV3–ip-solut ovat erittäin metastaattinen johdannaiset SKOV3- solujen, nämä tulokset viittaavat siihen, mahdollisen roolin MGAT3 ja sen catalysate, bisecting glykaanien, on munasarjasyövän solun liikkuvuus. Jotta voidaan testata tämän, MGAT3 geenin yli-ilmentynyt SKOV3–ip-soluihin transfektion jälkeen. Western blot-analyysi osoitti merkittävää kasvua MGAT3 ekspression transfektion jälkeen verrattuna SKOV3-ip-ohjaus soluja (kuvio 4A). Taso, joka puolittaa glykaanit kohonneet myös vastaavasti (kuvio 4B). Vahvistamaan, onko yliekspressio MGAT3 vaikuttaa siirtymisen kyky, trans-no muuttoliike määritykset suoritettiin. Kuten on esitetty kuviossa 4C ja 4D, muuttoliike kyky MGAT3 transfektoiduissa soluissa oli alentunut merkittävästi lukemaan 52%, että kontrollisoluissa. Samaan aikaan knockdovvn MGAT3 vuonna SKOV3- soluissa suoritettiin MGAT3 kohdistuksen siRNA transfektiota. Western blot-analyysi osoitti, tehokas masennus MGAT3 ilmentymisen SKOV3 transfektion jälkeen (kuvio 5A). Taso bisecting Glykaanit alassäädetty vastaavasti (kuvio 5B).