Krooninen sairaus

tiivistelmä

vapautuminen miRNA ilmentyminen voi myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn ja muut patologis-fysiologia liittyvä syöpä. Käyttämällä TLDA, ilmaus 762 miRNA tarkastettiin 18 paria gingivo poskeen syöpää vieressä kontrollisilkkipaperia. Expression of merkittävästi vapautettu miRNA edelleen validoitu syöpä ja tutkitaan kahdentyyppisiä precancer (valkotäpläisyydestä ja punajäkälä) kudoksiin alukkeenpidennyksellä erityisiä TaqMan määrityksissä. Biologiset vaikutukset näiden miRNA arvioitiin bioinformatically. Expression of

HSA-miR-1293, HSA-miR-31, HSA-miR-31 *

ja

HSA-miR-7

merkittävästi säädelty ja niitä on

HSA -miR-206, HSA-miR-204

ja

HSA-miR-133a

olivat merkittävästi alassäädetty kaikissa syöpänäytteissä. Expression of vain

HSA-miR

-31 merkittävästi säädellään ylöspäin valkotäpläisyydestä mutta yhtään punajäkälä näytteissä. Analyysi ilmaisun heterogeenisyys jaettu 18 syöpä näytteet klustereita 13 ja 5 näytteet ja paljasti, että ilmentyminen 30 miRNA (mukaan lukien edellä mainitut 7 miRNA), oli merkitsevästi vapautettiin klusterin 13 näytettä. Tietokannasta kaivos- ja polku analyysi havaittiin, että nämä miRNA voivat merkittävästi kohdistaa monien geenien läsnä eri syöpään liittyviä reittejä kuten ”proteoglykaanien syöpä”,

PI3K-AKT

jne joka tärkeitä rooleja ilmaisun eri molekyyli- piirteitä syöpä. Expression of

HSA-miR-31

oli merkitsevästi säädellään ylöspäin sekä syövän ja leukoplakia kudoksissa ja siten voi olla yksi molekyyli merkkiaineiden valkotäpläisyydestä joka voi johtaa gingivo bukkaaliin syöpä.

Citation: De Sarkar N, Roy R, Mitra JK, Ghose S, Chakraborty A, Paul RR, et al. (2014) pyrkimys miRNA Bio-Marker: Track Back Lähestyminen Gingivo Suun Cancer Two Erilaisia ​​Precancers. PLoS ONE 9 (8): e104839. doi: 10,1371 /journal.pone.0104839

Editor: Ratna B. Ray, Saint Louis University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 15 heinäkuu 2014; Julkaistu: 15 elokuu 2014

Copyright: © 2014 De Sarkar et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki oleelliset tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Kaikki raha tuli Department of bioteknologisen, Intian hallituksen ja Intian Statistical Institute professori Bidyut Roy. Rahoittaja ei ole roolia tutkimuksen suunnittelu, tietojen kerääminen, analyysi, päätös julkaista ja käsikirjoitus valmisteilla.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Gingivo posken okasolusyöpä (GBSCC) on yksi yleisimmistä (-60%), syöpiä suuontelon, etenkin tupakan käyttäjien Intiassa. Koko joukko pään ja kaulan okasolusyöpä seisoo viidenneksi yleisin maligniteetti maailmanlaajuisesti [1]. Mutta pään ja kaulan alueen syöpä käsittää ~24% kaikista syövistä Intiassa kirjattu tertiaarisen sairaalassa, Tata Memorial Centre, Mumbai ja noin ~13.5% heistä ovat peräisin suuontelon [2]. Viisi vuotta eloonjäämisaste (-50%) kärsivien potilaiden pään ja kaulan okasolusyöpä ei ole juuri parantunut, vaikka intensiivisen tutkimuksen aikana viimeisen 15 vuoden niin, varhainen havaitseminen on edelleen keskeinen kysymys paremman selviytymisen [3].

Vuodesta 1993 miRNA on noussut yhdeksi merkittävimmistä biologinen sääntelyviranomaiset, mikä tärkeä rooli valvontaan ja hienosäätöä kohteensa (mRNA) ilmentyminen [4] – [9]. Viime vuosina, on osoitettu, että MikroRNA (miRNA) ovat mukana ihmisen tuumorigeneesissä ja se voisi toimia joko tuumorigeenisiä /onkogeenisiä tai antituumorigeenisiä molekyylejä. Siten, se tekee uuden kerroksen molekyyli tapahtumia ihmisen syövässä. Geenien ilmentyminen tutkimukset osoittivat, että monet miRNA sääntely on purettu eri syöpätyyppejä ja toiminnalliset tutkimukset selvensi, että miRNA ovat mukana useissa molekyyli- ja biologiset prosessit, jotka ohjaavat tumorigeneesin [10] – [12]. Niinpä sen lisäksi, että eri mittakaavoissa vaihtelevuuden suhteen uusien mutaatioiden genomiin tai geneettistä taustaa potilaista (so iturataa mutaatio), vaihtelu ilmentyminen eri miRNA on myös tärkeä näkökohta tutkimuksessa. Tämän uskomus, tutkittiin ilmaus vapauttaminen 762 miRNA vuonna GBSCC ja on myös tarkistanut samantyyppinen ilmaisun vapauttaminen voitiin havaita precancerous valkotäpläisyydestä ja punajäkälä kudokset suuontelon. On pyritty ymmärtämään, miten nämä miRNA voi olla osallisena syövän käyttäen koulutusjakson analyysi ja tietoa lit

e

lassa ja tietokantoja.

Materiaalit ja menetelmät

Näytteet

Tämä tutkimus hyväksyi ”Näytä komitea suojelemiseksi tutkimuksen riskiä, ​​Intian tilastoinstituutin”. Kaikki yksilöt tässä tutkimuksessa ovat antaneet kirjallisen tietoon perustuva suostumus julkaista asian yksityiskohtia. Kaikki osallistujat allekirjoittivat kyselylomake, joka sisältää väestö-, tupakkaa tottumus ja jossa kuvataan, että hän /hän ei vastusta käyttöön veren ja kudosnäytteiden tässä tutkimuksessa ja osallistuu tähän tutkimukseen vapaaehtoisesti. Etuyhteydettömät syöpäpotilaiden (n = 18), punajäkälä (n = 12) ja valkotäpläisyydestä (n = 18) katsottiin tämän tutkimuksen Guru Nanak Institute of Dental Science and Research, Panihati, Kolkata, (taulukko 1, taulukko 2 , taulukko 3). Yksi kudos punch syöpään /precancer päällä ja toinen lyönti viereisistä ”kliinisesti” normaali sivusto (vähintään 1,5 tuuman päässä rajalta vaurion) otettiin biopsiat suun patologi. Yksi osa koepala kudosten käytettiin histopatologisia vahvistusta ja loput osa kudosten pidettiin erillään ”RNA myöhemmin” -80 ° C: ssa ja käytettiin 2 kuukauden kuluessa.

RNA eristäminen ja TLDA määritys

RNA: n eristämistä tehtiin käyttämällä Mirvana kittiä (Life Technologies, USA). RNA tuotto kvantifiointi tehtiin Nano Drop ja eheys tarkistettiin Agilient n Bioanalyzer (Agilent RNA6000 Nano Kit), tässä järjestyksessä. RIN numero katkaisun valittiin ≥6.9. Parallel ilmentymistestissä 762 miRNA suoritettiin käyttämällä TLDA-A (V2) ja TLDA-B (V3) kortin 7900HT FAST Real Time PCR-järjestelmä (Applied Biosystems, USA) käyttäen TLDA tasainen lohko [13]. Ensisijainen analyysi tehtiin käyttämällä SDS ja Data Assist (Life Technologies, USA) ohjelmistopaketteja saada ilmaisun kannalta Ct, ACt ja ΔΔCt arvot jossa Ct = Cycles, jossa PCR-tuote määrä saavuttaa tietyn vähimmäismäärän, ACt = Ct

a miRNA syöpäkudoksen – Ct

geometrinen keskiarvo ilmaus 3 vakain endogeeninen kontrolli miRNA että kudosten ja ΔΔCt = ACt

on miRNA syöpäkudoksen – ACt

tuon miRNA hallinnassa kudoksessa . Niistä analysoitiin 762 miRNA viisi oli ehdokkaita endogeenisen valvontaa. Kuitenkin perusteella niiden ilmaisun vakautta kaikissa näytteissä, RNU-48, RNU-44 ja U6 /MMU-6 valittiin endogeeninen valvontaa. Saada ACt kuin normalisoitu mitta ilmentymisen miRNA sekä syövän /precancer ja kontrollisilkkipaperia, ilmaus kaikkien miRNA kudoksissa normalisoitiin itsenäisesti käyttäen geometrinen keskiarvo ilmentymisen valittujen 3 endogeenisen ohjaus miRNA samassa kudoksessa. Ct-arvo on alle 40 tarkasteltiin ainoastaan ​​lisäanalyysiä.

Analysis

Data Leikkaaminen.

Jos ilmaus mitään erityistä miRNA havaittiin olevan läsnä at-vähintään 9 18: sta syöpää normaali pariksi kudoksiin, sitten vain, se on pidetty jatkojalostustuotteisiin analyysiä. Merkinnästä TLDA määrityksen V2 (A-kortti) ja V3 (B-kortti) seuraavasti miRBase release-14 [13] – [14]. Nyt ekspressiotietojen näistä miRNA pidettiin lisäanalyysiä, joiden merkintä on edelleen voimassa miRBase release-19 [15] – [16]. Tällä tavoin ilmaus 531 miRNA pidettiin myöhempää alavirtaan analyysi.

Tilastollinen analyysi.

Aluksi yksi näyte Kolmogorov-Smirnov (KS) testiä ilmentymistä tiedot kaikista 531 geenien suoritetaan itsenäisesti niin tarkistaa normaalisuus ero ilmaisun arvoja kaikissa näytteissä [(Zi = {(Ci-Ni) – (keskiarvo C- keskiarvo N)}, joten Zp = ΣZi /SD Z, KS koe tehtiin Zp, Ci: i

th Cancer näytteen ACt arvo, Ni: i

th Normal näytteen ACt arvo] ja lopulta ilmaisua todettiin normaalijakaumaa. on huomattava, että ACt-arvot on loki muuttaneet, niin , ei enää log transformaatio tehtiin tämän joukon ekspressiotietojen. Seuraaja normaalius testin avulla tailed parillista t-testi suoritettiin [(Ci-Ni) 1 / 1]. Nollahypoteesi yhden pyrstö pariksi t -testi oli ”ilmaus tietyn miRNA ei ole suurempi kuin 2 kertaa ylös /alas säädellään”. Joten luonnollisesti, vaihtoehtoinen hypoteesi oli ”ilmaus tietyn miRNA on 2 taittaa ylös /alas säädellään. Testi ylössäätöä (alempi tail) suoritettiin jos mediaani tietyn miRNA: n ΔΔCt on pienempi kuin nolla. Samoin testi alassäätöä suoritettiin jos mediaani tietyn miRNA: n ΔΔCt on enemmän kuin nolla. Useita testaus korjaukset käyttäen Benjamini-Hochberg menetelmä suoritettiin 5% merkitsevyystaso [17] ja korjattu katkaista p-arvo oli 0,00065.

Cluster analyysi miRNA ilmaistuna syövän kudoksissa.

K-mediaani klusterointi menetelmää käytettiin koko karsitaan datajoukon onko genomin laaja miRNA ilmaisua vaihtelua yksilöiden välillä olivat tarpeeksi suuria luotettavasti jakaa näytteet useisiin sub klustereita. Tätä klusterointi, valitun etäisyyden metrinen oli Euclidean. Koska ilmaus monet miRNA oli poissa meidän tietokokonaisuus, se oli luomassa ”Absent data” tilanne. Tämä tilanne tunnetaan puolueellisuus klustereiden jos suosituin klusterointi method- K-välineiden hyväksyttiin. Joten valinta klusterointi oli K-mediaani. Määrä luotettavia klustereita, tiedot muodostaisivat, määritettiin käyttäen ”kyynärpää” -menetelmää.

TaqMan Pitoisuus.

Expression of merkittävästi de-säännelty miRNA, havaittu syövän kudoksissa mukaan TLDA menetelmällä , myös validoitu samassa syövän kudoksissa ja tutkitaan valkotäpläisyydestä ja punajäkälä kudoksista TaqMan-määritys (7900HT Fast Real Time PCR-järjestelmä, Applied Biosystems, USA). Koettimet ja alukkeet toimitti Invitrogen India Ltd ja tiedot haettiin kuin ”fold muutos” verrattuna viereiseen valvontaa. Normalisoituminen ilmentymisen kunkin geenin kussakin näytteessä tehtiin käyttäen geometrinen keskiarvo on sama 3 endogeenisen valvontaa, so.

RNU-44, RNU-48

ja

mmu-6

, saada ΔΔCt arvoon että miRNA.

Tulokset

Expression profiili syövän kudoksissa by TLDA

Expression data 762 miRNA analysoitiin tällä menetelmällä mutta kun tietoja karsimisesta, ekspressiotietojen 531 miRNA (mukaan lukien 5 endogeeninen valvonta) käytettiin muihin alavirtaan analyysi (File S1). Aikana tilastollinen testi, vähintään 2-kertainen ilmentymisen muutos syöpäkudoksessa verrattuna sen pariksi-ohjaus kudosta pidettiin penkki-merkin ilmaisun vapauttamiseen. Siten ilmaus 7 miRNA havaittiin merkittävästi vapautettu toistuvassa testi korjauksen ja kaikki näistä seitsemästä miRNA oli 4-kertainen keskimääräinen ilmentyminen sääntelyn (eli joko ylös- tai alaspäin-asetus). Validointi ilmaisun miRNA erityisiä TaqMan määritys vahvistettiin myös ilmaisun vapauttaminen syövän kudoksissa, vaikka taitettava muutoksia vähäiseksi verrattuna TLDA tulokseen (taulukko 4). Ero herkkyys näiden kahden RT-PCR-pohjainen (TLDA ja miR-spesifinen TaqMan-määritys) kokeellisia menetelmiä, yhdistettynä siihen, että nämä kaksi koesarjaa suoritettiin kahdessa eri ajankohtina, voi olla vaikuttavia tekijöitä erilaisuuden asteina ilmaisun vapauttaminen miRNA. Suhteellisten sijaintien näistä 7 miRNA yhdessä muiden miRNA geenien eri kromosomien paljasti, että

HSA-miR-133a

ja

HSA

–

mir-7

sijaitsevat kahdessa ( Chr 18 ja Chr 20) ja kolme kromosomeja (Chr 9, Chr 15 ja Chr 19), vastaavasti (kuva 1a). Täällä, määritykset suoritettiin vain kypsä miRNA siten ilmaus

HSA-miR-133a

ja

HSA

–

mir-7

saattaa olla kumulatiivinen summa kypsä muotoja kunkin miRNA. Näistä 7 miRNA, ilmaus 4 miRNA eli.

HSA-miR-1293, HSA-miR-31, HSA-miR-31 *

ja

HSA-miR-7

merkittävästi säädelty ja niille 3 miRNA eli.

HSA-miR-206, HSA-miR-204

ja

HSA-miR-133a

laskivat tuntuvasti säännelty syöpänäytteissä (taulukko 4). Lämpö kartta rakennettiin mukaan kahdella tavalla ilman valvontaa hierarkkinen klusterointi. Joten, kaikki alassäädetty miRNA ryhmitelty yhteen yläosassa juonta taas kaikki sääteli miRNA klusteroitu alaosassa (kuva 1b). Se osoitti arvot ilmaisun (ts ΔΔCt) verrattuna viereiseen ohjaus sekä näytteiden määrä tarjota ekspressiotietojen. Expression of

HSA-mir-1293

saatiin 9 syöpää ohjaus pariksi näytteitä vaan 6 heistä oli ΔΔCt arvot ≤-2 ja loput 3 näytteissä ΔΔCt arvojen välillä 0 ja -2. Niinpä

HSA-mir-1293

, kaikki nämä 9 näytteissä oli ΔΔCt arvot-ve merkki, joka tarkoittaa; kun ilme on saatu, se on aina ajan säädellään mutta 6 heistä osoitti yli 4-kertainen ilmaisun muutos. Vastaavasti ilmaus tiedot

HSA-mir-31 *

saatiin 16 syöpää ohjaus pariksi näytteitä. Näistä 16 näytettä, yksi näyte oli ΔΔCt välillä 0 +2, Kaksi näytettä oli ΔΔCt arvojen 0 -2 Ja loput 13 näytettä oli ΔΔCt arvot ≤-2.

V: Manhattan käyrä p-arvot kaikille 528 miRNA 18 näytettä. AB-linjan (ts vaakasuora viiva keskellä kuva) esittää P-arvo katkaista, p = 0,00065. Suhteellinen sijainti 528 miRNA (vaaka-akseli) ympäri Ihmisen genomin ja niiden vastaavat -log

10 muuttaneet p-arvo (pystyakselille) piirrettiin. B: Heat kartta kaavio ΔΔCt arvoja. Kaksisuuntainen ilman valvontaa hierarkkinen klusterointi 7 miRNA joiden ilmentyminen oli merkitsevästi vapautettu näytteitä. Kukin rivi edustaa ilmaus miRNA ja kukin sarake edustaa näytettä. Sky-sininen värillinen solujen seistä epäonnistui määrityksen eli tietoja ei noissa soluissa. Punainen ja vihreä väri merkitsevät ylä- ja alassäätöä, vastaavasti. Dendogram pitkin pystyakseli edustaa arvojärjestyksen miRNA perusteella ilmaisuja samankaltaisuuden. Etäisyys mittarit hierarkkinen klusterointi oli Euklidinen etäisyys. Lämpö kartta rakennettiin käyttäen Heatmap 2 R: n ”gplot” paketti. C: korreloi ilmaus

miR-206

ja

miR-1

.

Normalisoitu lauseke (ACt) näistä 7 miRNA syövän ja kontrollisilkkipaperia olivat enimmäkseen ei-päällekkäisiä ja ACt-arvot eri miRNA koko kontrollisilkkipaperia osoitti myös melko laaja vaihtelu (kuvio 2). Joten saada oikea suhteellinen ekspressio, on tärkeää verrata ilmentymisen miRNA syöpäkudoksen kanssa valvonnan kudoksen samasta yksilöstä. Tässä kuviossa miRNA sijoitettiin mukaan lisäämällä p-arvot (ylhäältä alas) pystysuunnassa. ACt-arvot 8 miRNA eri kasvain- ja kontrollinäytteiden oli piirretty vaaka-akselilla osoittaa jakelua ACt-arvoja kaikissa näytteissä. On selvää, että enemmän päällekkäisyys vaihtelee ilmentymisen miRNA syövän ja kontrollisilkkipaperia, vähemmän on taso merkitys. Täällä,

HSA-mir1293

alhaisimman p arvo 0,000028 oli sijoitettu päällä ja

HSA-mir-1

kanssa p-arvo 0,00094 (hieman alle korjattu merkitsevyystaso) laitettiin alaosassa pystyakselilla (kuva 2).

vaaka rasiakuvaaja esitetään jaettavaksi ilmaisun (ACt) on miRNA vaaka-akselilla. P-arvot miRNA piirretään nousevassa järjestyksessä (ylhäältä alas). Expression of

on-miR-1

ei merkittävästi vapautettu ja osoitettu verrata muiden 7 miRNA. Jokainen laatikko ja hiuksenhienosti pari (Gray Cancer ja valkoinen Normaali) edustaa vaihteluväliä ACt arvoja miRNA päässä TLDA tiedot. Tämä alue edustaa ilmaus kaikkien onnistuneesti analysoitiin näytteet tietoja että miRNA.

ilmentäminen miRNA vuonna precancerous valkotäpläisyydestä ja punajäkälä näytteet

joukossa 7 miRNA joka havaittiin merkittävästi vapautettiin syöpänäytteissä (taulukko 4), ilmentyminen vain

miR-31

merkitsevästi säädellään ylöspäin valkotäpläisyydestä kudoksissa, joissa sillä ilmentymä yksikään näistä 7 miRNA vapautui merkitsevästi punajäkälä kudoksissa. Expression of

miR-31 *

ja

miR-204

oli myös ylä- (4,75 taittuu) ja alassäädetty (1,99 taittuu), vastaavasti, leukoplakiaan kudoksissa, mutta ei merkittävästi erilainen.

Tietokanta kaivos- ja bioinformatiikan analyysit

Julkaistu raportit seuraavilla 7 miRNA oli myös osoittanut samansuuntaiset ilmaisu- sääntelyn purkamisen joidenkin syöpien, kuten pään ja kaulan [10], [18] – [20]. Kaikkiaan 561 ainutlaatuinen tavoitteita tunnistettiin kun nämä 7 miRNA käytettiin hakemaan tavoitteet käyttäen miRWalk [21] ja edelleen rajat validoitu PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed).

HSA-miR-31 *

on validoitu tavoite,

RhoA

, joka on tiettävästi sekaantunut suuhun kasvain [18].

HSA-miR-1293

toistaiseksi tiedetään kohdistaa

GCN1L1

(taulukko 5) ja

HSA-miR-1293

välittämä alaspäin säätely tämän kasvaimen antigeenin geeni ( eli

GCN1L1

) avulla voitaisiin huonoon ennusteeseen kasvain [22]. IPA työkalu käytettiin ”tauti termi haku” (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) ja merkittävimmät ”tauti termi” syöpä luokkaan IPA oli ”pää ja kaula” syöpä. IPA ei pystynyt antamaan mitään osunut

HSA-miR-1293

ja pidetään

HSA-miR-31

ja

HSA-miR-31 *

synonyymiksi joten tuotos oli 5 miRNA. Lisäksi havaittiin, että IPA pidetään

HSA-miR-206

synonyymi

HSA-miR-1

, koska niillä on sama siemen sekvenssi [23]. Havaittiin myös, että ilmaisua vapauttaminen asema

HSA-miR-1

ja

HSA-miR-206

poikki näytteet olivat hyvin lähellä toisiaan (r = 0,94) (kuvio 1 c) . Sisällyttäminen

HSA-miR-1

kohde hakuluettelossa lisäsi tavoitteet 702. Kegg reitin kartoitus portaalin [24] – [25] validoitu tavoitteet näistä 8 miRNA on käytetty. Top eniten reittejä kartoitettu luettelossa olivat ”MikroRNA syövän” jälkeen ”proteoglykaanien syöpä” ja ”globaali syöpä polku” (taulukko S1 File S2). Muita top asiaan polku oli

PI3K-AKT

joka on yksi yleisimmistä reittejä osallisena syövän. Muut merkittävimmät muutokset olisi voinut tapahtua johtuen nämä miRNA ovat häiriöitä aktiinisytoskeletonin huolto- ja polttovälin tarttuvuus. Muut todennäköinen sekaantunut signalointipolkujen olivat

RAS

,

RAP1, MAPK, HIF-1

,

FOXO, TNF, erbB

, apoptoosin jne (taulukko S1 File S2). ”GO” termi rikastus Haku suoritettiin käyttäen tuloon 702 validoitu tavoitteiden näistä kahdeksasta miRNA (tietoja ei esitetty), ja havaittiin, että näkyvin häiritsi biologiset prosessit liittyvät ensisijaisesti solujen vaeltamiseen, menetys apoptoosin, solujen lisääntymisen jne. Mutta DAVID pohjainen ”GO” termi rikastus biologinen prosessi osoitti merkittävintä biologinen prosessi on ”Apoptosis” (taulukko S2 File S2) [26] – [28]. Kaikki nämä havainnot tukevat että nämä 8 miRNA voi olla merkittäviä toiminnallisia rooleja gingivo poskeen syöpä. Meidän RNA-Seq tiedot osoittavat, että ilmentyminen

FN1, MSN

ja

MMP-9

, joka kuuluu ”Proteoglycans syövän” geeni lista ja ovat tavoitteita alassäädetty miRNA, oli sääteli 10 13 kudosnäytteistä (keskimäärin 6,83, 2,43 ja 21,89 taittuu, tässä järjestyksessä, verrattuna viereiseen normaaliin). Samoin ennusti säätely ylöspäin

LAMC

ja alas säätely

PAI

, jotka kuuluvat

PI3K-AKT

polku, myös validoitu RNA-Seq datan sub asettaa näiden kudosnäytteistä (julkaisematon data). Nämä havainnot tukevat myös ennakoivaan koulutusjakson analyysi koskien mukana biologisen prosessin /polkuja, jotka voitaisiin kohdistaa tämä joukko 8 miRNA.

Valitut näytteet oli vähän vaihtelua kannalta sen erilaistumisen tilasta tai kliiniset lavastus. Cluster analyysi tehtiin tarkistaa, genomin laaja miRNA profiili voisi selittää tämän ominaisuuden vaihtelua. Se tehtiin käyttämällä ilmaisua sääntelyn data (ΔΔCt) 531 miRNA 18 syöpänäytteissä käyttäen K-mediaani menetelmällä. Optimaalisesti vain kaksi erillistä klustereita saatiin; yksi koostui 13 pariksi kasvaimeen normaali näytteet ja muut koostuivat 5 pariksi kasvain-normaali näytteitä. Oli selvää, että nämä kaksi klustereita näytteitä ei perusteella muodostetaan niiden erilaistumisen tilasta tai kliinisen vaiheissa. Expression of 30 miRNA oli merkittävästi vapautettiin rypäs 13 näytettä (p-arvo katkaista 0,00298 jälkeen Benjamini-Hochberg Correction, kuva 3a, kuvio 3b), mutta yksikään miRNA merkittävästi vapautettiin klusterin 5 näytettä (tuloksia ei ole esitetty ). Taita lauseke (ylös- tai alaspäin säädelty) on miRNA tuumorikudoksessa verrattuna sen viereiseen valvontaa ja näytteiden määrä tarjota ilmentymisen datan miRNA voitiin havaita Heat kartta kaaviot klusterin 13 näytettä (kuva 3b). Se osoitti, että ilmaus kaikkien miRNA ollut saatavissa kaikista näytteistä. Kuvaamaan joitakin miRNA oli säädelty useimmissa näytteissä (esim ilmentymisen

miR-31 *, miR-7, miR-21

esitetty alaosassa kuvassa) ja kuvaamaan joitakin miRNA laski -regulated useimmissa näytteissä (esim

miR-206, miR-1, miR-133a

esitetty keskellä kuva) (kuvio 3b).

: Manhattan käyrä p-arvot 520 miRNA päässä klusterin 13 näytettä. Juoni suhteellinen sijainti 520 miRNA (vaaka-akseli) ympäri ihmisen kromosomin ja niiden vastaavat -log

10 muuttaneet p-arvo (pystyakselille). Benjamini-Hochberg korjattu P-arvo katkaista oli 0,00298 (horisontaalinen viiva keskellä kuva). B: Heat kartta kaavio ΔΔCt arvojen 30 miRNA. Expression näistä miRNA oli merkittävästi vapautettiin klusterin 13 näytettä. Kukin rivi edustaa miRNA ja kukin sarake edustaa näytettä. Sky-sininen värillinen solujen seistä epäonnistui määritystä (i.e.no data kyseisissä soluissa). Punainen ja vihreä väri merkitsevät ylä- ja alas-säätely ilmaisun, vastaavasti. Lämpö kartta rakennettiin käyttäen Heatmap 2 R: n ”gplot” paketti. C: korreloi ilmaus miR-411 * ja miR-411.

Näistä 30 miRNA (taulukko 6), ilmaus 28 miRNA osoitti samanlaista ilmaisua sääntelyn mallia kuin se on jo esitetty aiemmin tutkimuksia syöpä [10], [29] – [30]. Jäljellä olevien kahden miRNA, yksi miRNA

(HSA-miR-770-5p

) ei ole liittynyt vielä mitään syöpää. Expression jäljellä yksi miRNA (

HSA-miR-211

) on vapautettu vastakkaiseen suuntaan tässä tutkimuksessa verrattuna edelliseen raportteja peräsuolen syöpä [29] – [30]. Itse asiassa, 7 miRNA, joiden ekspressio oli merkittävästi vapautettiin analyysi 18 näytettä, ovat osajoukko näistä 30 miRNA. Kuitenkin ilmaus

HSA-miR-411 *

havaittiin merkittävästi vapautettu tässä tutkimuksessa, mutta ei edellisen raportin oli osoittanut sen osallistumista syöpään. Jälleen on tunnettua, että

HSA-miR-411

ja

miR-411 *

ovat peräisin samasta esiaste miRNA ja

HSA-miR-411

on vahva yhdessä syöpä [31]. Kun pyysimme ilmaus kypsä

HSA-miR-411

ja

HSA-miR-411 *

, voimakas positiivinen korrelaatio havaittiin (r = 0,95) (kuvio 3c), vaikka ilmaus

HSA-miR-411

ei havaittu olevan tilastollisesti merkitsevä. Samoin olemme havainneet merkittäviä ilmentymisen vapauttaminen

HSA-miR-135b *

ja

HSA

-miR-99a * ja raportit yhdistyksen syövän kanssa

HSA-miR-135b

ja

HSA

–

miR-99a

[32]. Haetaan samalla tavoin, 1207 ainutlaatuinen kohdegeenien saatiin näille 30 miRNA. IPA ja Kegg kartoitus tehtiin käyttämällä näitä 30 miRNA ja niiden tunnetut 1207 kohdegeenien. IPA-analyysi, kolme syöpiä, joiden todettiin olevan yhteydessä ilmaus vapauttamisen merkittävän osan näistä miRNA, olivat hypo nielun, ruokatorven ja pään ja kaulan alueen syöpä (p-arvot 1,71 x 10

-07, 2,20 x 10

-07 ja 1,02 x 10

-07 vastaavasti). Mielenkiintoista, sama biologinen signalointireitteihin (syöpään liittyvää) on raportoitu olla mukana näiden joukko 30 miRNA koska se havaittiin 8 miRNA aikaisemmin. Mutta ero on siinä, ohjelmistoon ja kohdennettuja solmujen kaikille näistä reiteistä (taulukko S1 File S2, taulukko S2 File S2, taulukko S3 File S2 ja taulukossa S4 File S2).

keskustelu ja päätelmät

ilmaisujen 7 miRNA merkittävästi vapautettiin 18 syöpänäytteissä ja merkittävä säätely ylöspäin

HSA-miR-1293

on raportoitu ensimmäisen kerran vuonna gingivo poskeen syöpä ( Taulukko 4). Kuten nyt, toiminnallista roolia

HSA-miR-1293

syövässä on hyvin rajallinen. Mukaan miRWalk [21] ja STARBASE [33], joka on yksi ennustettu tavoitteet

HSA-miR-1293

on

MAPK14

(p38), jonka on osoitettu liittyvän kasvaimen herkkyyttä että

cis

platina hoito [34]. Jos tämä ennustettu suhdetta voisi validoitu, niin ilmaus tästä miRNA voivat olla käyttökelpoisia ennustaminen potilaan herkkyys

cis

platina hoitoa. Kaksi miRNA,

HSA-miR-206

ja

HSA-miR-1

, joilla tiedetään olevan antituumorigeenistä rooli [35] – [37] ja

HSA-asennuspalveli-

206 voi välillisesti aktivoida apoptoosin esto solujen vaeltamiseen ja keskittyä muodostumiseen [38]. Down säätely ilmentymisen

HSA-miR-1

ja

HSA-miR-133a

, jota on havaittu tässä tutkimuksessa (taulukko 5), on jo raportoitu aikaisemmassa tutkimuksessa suun okasolusyöpä [39]. Itse asiassa,

HSA-miR-133a

tavoitteet useita onkogeenien ja on raportoitu olevan yleisesti alaspäin säännellään useissa muissa suusyövästä tutkimuksissa [35] – [40]. Expression sekä

HSA-miR-31

ja

HSA-miR-31 *

ilmoitettiin joissakin aiemmissa tutkimuksessa syöpää [41] – [42]. Tutkimus OSCC solulinja osoitti, että eksogeeninen toimitus

pre-mir-31

, joka parantaa jopa sukukypsien

HSA-miR-31

ja

HSA-miR-31 *

, parannettu OSCC onkogeenisuustutkimuksessa [41] – [42]. Siksi meidän havainto säätely ylöspäin

HSA-miR-31

ja

HSA-miR-31 *

, vahvistavat nykyisten raporttien suun ja muita syöpiä. Samanlainen aiemman raportin pään ja kaulan alueen syöpä, täällä myös, ilmaus

HSA-miR-204

havaittiin myös olevan merkittävästi alas säännellä [43]. Expression of

HSA-miR-7

, tunnettu OncomiR, on tiettävästi säädellään ylöspäin OSCC [44]. Se on suunnattu ensisijaisesti tuumorisuppressoriproteiinia selostukset

RECK

[16]. Tässä tutkimuksessa ilmaus

HSA-miR-7

oli myös merkitsevästi säädelty ja siten vahvistavat aiempien havaintojen liittyviä suusyövän. On pyritty ymmärtämään mahdollisia biologisia vaikutuksia kaivos- eri tietokannoissa. Pathway analyysi paljasti, että useimmat häiritsi biologisia prosesseja olisi solujen vaeltamiseen, apoptoosin ja lisääntymistä (taulukko S2 File S2). Useimmat häiritsi väyliä ennustettiin olevan ”proteoglykaanien syöpä” ja

PI3K-AKT

(taulukko S1 File S2), joita tukee myös meidän RNA-Seq tietoa ilmentymisen vapauttaminen joidenkin proteoglykaanien geenien ja

LAMC

ja

PAI

jotka kuuluvat

PI3K-AKT

reitin (julkaisematon data). Nämä havainnot tukevat myös ennakoivaan koulutusjakson analyysi koskien mukana biologisen prosessin /polkuja, jotka voitaisiin kohdistaa tämä joukko 8 miRNA.

Cluster analyysi 18 näytettä olivat osoittaneet, että ilmentyminen 30 miRNA havaittiin merkittävästi vapautettiin klusterin 13 näytettä (kuvio 3b). Kirjallisuudesta ja tietokantalouhinta näiden 30 miRNA osoittivat merkitystä näiden geenien suullisesti ja muiden syöpien (taulukko 6). Vaikka polku analyysi käyttäen 8 miRNA (tunnistettiin ekspressiotietojen 18 näytettä) ja 30 miRNA (tunnistettiin ekspressiotietojen klusterin 13 näytettä) supistuu samanlaisia ​​signalointireittien mutta määrä ja ohjelmistoon solmujen suunnattu näiden joukko miRNA ovat aivan erilainen (tuloksia ei ole esitetty). Tämä ryhmäanalyysi todella paljastava olemassaolo molekyylien heterogeenisyys, joka voi pureskella jopa resoluutio löytää hienompaa molekulaarinen merkkiaine. Mielenkiintoista, havaittu molekyyli epäyhtenäisyys kuvio mitenkään liittyvän erilaistumisen alatyyppi, joka vallitsee kudosten tai kliinisen vaiheissa näytteitä.

Niistä kaksi ennalta syöpiä, leukoplakiaan tiedetään liittyvän tupakka tapa, kun taas punajäkälä on auto immuunijärjestelmän sairaus. On todettu, että kaikki suusyöpä edeltää syövän esiasteita. Joten, me tarkistetaan onko samanlainen syöpänäytteissä ilmentyminen sääntelyn purkaminen miRNA voitiin havaita näissä kahdessa syövän esiasteita. Täällä, TaqMan tiedot osoittivat, että ilmentyminen vain

HSA-mir-31

oli merkitsevästi sääteli (4,55-kertaisesti enemmän kuin viereinen kontrollikudoksen) in valkotäpläisyydestä näytteistä (taulukko 4), mutta ei punajäkälä kudoksessa. Tosin ilmaus toisen miRNA,

HSA-mir-31 *

, oli myös säädelty 4,75 taittuu mutta merkitsevästi ei erilainen johtuen suurempi keskihajonta joukossa näytteitä. Joten, ilmaus näiden kahden miRNA on tarkistettava enemmän valkotäpläisyydestä näytteitä. Tämä toistaa jälleen kerran noin molekyylitason läheisyys valkotäpläisyydestä kanssa GBSCC kuin muiden ennalta syöpä, punajäkälä. Joten, ilmaus

HSA-mir-31 ja HSA-mir-31 *

in valkotäpläisyydestä kudoksissa voi olla potentiaalinen riski-markkereita etenemisen precancer on GBSCC.

Pieni määrä ja sekoitetaan vaiheessa kasvain näytteet ja ilmentymistestissä vain 762 miRNA mukaan TLDA (käytettävissä silloin meidän kokeilu) rajattu tämän tutkimuksen päätellä, että ilmentyminen vain 7 miRNA merkittävästi vapautettiin GBSCC kudoksissa verrattuna viereiseen kontrollisilkkipaperia. On suuri mahdollisuus, että määrä vapautetuilla miRNA kasvaa, jos voisimme määrittämään ilmaus ~2578 miRNA hetkellä tunnetut ihmisen kudoksista kuten edellä miRBase-20 [45]. Tämän seurauksena ilmaus enemmän miRNA olisi voitu tarkastaa syövän ja valkotäpläisyydestä kudosten päätellä lisää molekyylimarkkereina. Vielä tärkeämpää on, rooli näiden miRNA karsinogeneesis- on vahvistaa kansallinen toiminnallinen tutkimus.

tukeminen Information

Tiedosto S1.

Genome laaja miRNA ilmaisun profiilin 528 miRNA (poislukien 3 endogeeninen valvonta) in GBSCC. Jokainen pylväs S1 S24 edustaa tietoja 18 näytettä, kukin rivi edustaa tietoja ΔΔCt tietyn miRNA. N /A tarkoittaa tietoja ei.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0104839.s001

(XLSX)

Tiedoston S2.

Sisältää lisätaulukot.

doi: 10,1371 /journal.pone.0104839.s002

(DOCX) B

Kiitokset

sydämellisesti kiittää tohtori Analabha Basu ja Dr.