Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tausta ja tavoitteet

Tämä tutkimus suunniteltiin tunnistamaan ja vahvistaa geeni allekirjoitukset, jotka voidaan ennustaa taudin elinaika (DFS) potilailla, joille tehdään radikaali resektio niiden peräsuolen maksametastaaseja ( CRLM).

Methods

Kasvain geeniekspressioprofiilien kerättiin 119 leikkauspotilaiden niiden CRLM että Paul Brousse Hospital (Ranska) ja University Medical Center Utrecht (Alankomaat). Potilaat jaettiin korkean ja matalan riskin ryhmiin. Satunnaisesti valitut koeryhmä käytetään löytää ennakoiva geeni allekirjoitukset. Kyky Näiden geenin allekirjoitusten ennustaa DFS testattiin riippumaton validointi sarja käsittää muut potilaat. Lisäksi 5 tunnettu kliininen riski tulokset testattiin meidän täydellinen potilaan kohortin.

tulos

Ei geeni allekirjoitusta todettiin merkittävästi ennustettu DFS validointi asetettu. Sen sijaan kolme viidestä kliinisen riskin tulokset pystyivät ennustamaan DFS meidän potilaiden kohortissa.

Johtopäätökset

Ei geeni allekirjoitusta todettiin, että voisi ennustaa DFS potilailla, joille tehdään CRLM resektio. Kolme viidestä kliinisen riskin tulokset pystyivät ennustamaan DFS meidän potilaiden kohortissa. Nämä tulokset korostavat tarvetta validointi riskin tulokset riippumattomissa potilasryhmien ja ehdottaa parannettu malleja tuleville tutkimuksille.

Citation: Snoeren N, van Hooff SR, Adam R, van Hillegersberg R, Voest EE, Guettier C, et al. (2012) tutkiminen Gene Expression allekirjoitukset ennustaminen Tautivapaa elossaolo jälkeen Resektio peräsuolen syövän maksametastaaseja. PLoS ONE 7 (11): e49442. doi: 10,1371 /journal.pone.0049442

Editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: May 1, 2012 Hyväksytty: 07 lokakuu 2012; Julkaistu: 21 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Snoeren et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat hollantilaisen Cancer Society apurahan 2007-3923. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin syöpä miehillä ja toiseksi naisilla maailmanlaajuisesti, noin 608,000 kuolemaa maailmanlaajuisesti [1]. Maksa on yleisin ja usein ainoa paikka, metastaattisen taudin. Kehittäminen maksametastaaseista noin 50%: lla potilaista on määräävä tekijä eloonjäämisen potilailla, joilla peräsuolen syöpä. Kirurginen resektio on paras hoitovaihtoehto potilaille, joilla on peräsuolen maksan etäpesäke tarjoaa mediaanielossaolosta yli 40 kuukauden kuluttua resektio verrattuna eloonjäämismediaani 18 kuukauden kun kemoterapiaa ja 6 to12 kuukautta, jos potilaat ovat hoitamatta [2]. Valitettavasti 60% -80%: lla potilaista kehittyy paikallinen tai etäinen toistuminen jälkeen R0 resektio peräsuolen maksametastaasin [2] – [5]. Potilaat, joilla toistuminen todennäköisesti hyötyvät adjuvanttihoitoa. Kuitenkin 20-40%: lla potilaista ei kehity toistuminen ja luultavasti parempi jättää hoitamatta jälkeen maksaresektio. Koska kemoterapia liittyy vakavia sairastuvuutta ja kuolleisuutta, hoito liittyvä riski olisi perusteltua merkittävää parannusta eloonjäämiseen näillä potilailla.

Monet tutkimusryhmät ovat yrittäneet määritellä tekijät ennustavat taudista vapaa eloonjääminen ja kokonaiseloonjääminen (OS) jälkeen resektion maksan etäpesäke [5], [6]. Äskettäin viisi julkaistu kliininen riski tulokset, jossa yhdistyvät erilaiset kliiniset tekijät, validoitu riippumattomalla potilaalla kohortin jotka osoittavat, että kaksi kliinistä riski tulokset pystyivät ennustamaan kokonaiselinaikaa riippumattomalla joukko potilaita [7]. Ennustaminen (taudista vapaan) eloonjääminen voidaan parantaa käyttämällä geenien ilmentymisen, jotka saattavat kaapata kasvain ominaisuudet eivät näy kliinis muuttujia.

Genome leveä geeniekspressioprofilointi on käytetty ennustamaan sairauden lopputulokseen tai hoitovaste monissa eri kasvaintyypeissä [8], [9] on myös osoitettu, että ilmentymisen profilointia voidaan käyttää tunnistamaan ja peräsuolen kasvaimia eri aggressiivisuus ja metastaattista potentiaalia [10] – [13]. Ei tutkimus kuitenkin on julkaistu joka geeniekspression käytettiin ennustamaan taudista vapaan eloonjäämisen jälkeen resektion Maksan kolorektaalisen etäpesäke. Tunnistaminen geenin allekirjoituksen pystyy tunnistamaan toistumista-altis peräsuolen maksametastaaseja klo resektion avaisi tien valinnassa potilaille, jotka todennäköisesti hyötyvät aggressiivisen hoidon jälkeen resektio, kun taas osinkotulojen toiset tarpeetonta hoitoa.

tulokset

potilaille ja kasvain näytteet

sata neljäkymmentäkahdeksan potilaista sai tulo- ja poissulkukriteereitä ilme. Profiilit onnistuneesti saatu 119 potilasta. Perustaso ominaisuudet 119 osallistui potilaita, on esitetty taulukossa 1, ei eronnut merkittävästi välillä huipulla pienen riskin ryhmään, lukuun ottamatta kemoterapian. Korkean riskin potilaat saivat neoadjuvanttikemoterapian useammin ja adjuvanttihoitoa harvemmin kuin matalan riskin potilaita. Potilaan näytettä oli keskimääräinen kasvainsolun osuus 45% (95% CI 40,75-49,60), kuolion 19% (95% CI 16,19-22,47) ja fibroosi 20% (95% CI 16,44-22,71). Mean seurata oli 26,7 kuukautta. Vertailu lähtötilanteen ominaisuudet 119 mukana ja 29 poissuljettu potilaat on esitetty taulukossa S1.

Potilaat jaetaan korkean ja matalan riskin ennustaminen ryhmä perustuu riskin ennustaminen eri geenin allekirjoitukset. Gene allekirjoitukset löydettiin määritellään korkean riskin DFS ≤1 vuoden ja alhainen riski kuin DFS 1 vuosi, ellei toisin mainita. Riskisuhde Geenin allekirjoituksen ennustaminen on esitetty 95%: n luottamusväli suluissa. P-arvo log-rank-testi esitetään myös, jossa p-arvo säädettiin useita testaus suluissa. V: Eloonjäämiskäyrät potilaille koulutukseen asetettu. Gene allekirjoitus keksittiin käyttämällä samaa koulutusta asetettu. B: Eloonjäämiskäyrät potilaille validointi asetettu. Gene allekirjoitus löydettiin käyttäen täyden koulutuksen asetettu. C: Eloonjäämiskäyrät potilaille validointi asetettu. Gene allekirjoitus löydettiin käyttäen koko opetusjoukolla määritellään korkean riskin DFS ≤6 kuukautta ja alhaisen riskin DFS 2 vuotta. D: Eloonjäämiskäyrät varten UMC Utrecht potilaiden validointi asetettu. Gene allekirjoitus löydettiin käyttäen UMC Utrechtin osajoukko opetusjoukolla. E: Eloonjäämiskäyrät Paul Brousse potilaiden validointi asetettu. Gene allekirjoitus löydettiin käyttäen Paul Brousse osajoukko opetusjoukolla. F: Kuten E vaan myös vain Paul Brousse potilailla, jotka saivat neoadjuvanttikemoterapian (koulutus ja validointi sarja).

Original perustamiseen Tutkimuksen: valvottu malli jakamalla potilaalla on DFS ≤1 vuoden verrattuna potilailla, joilla on DFS 1 vuoden ajan. Geeni allekirjoitus löydettiin käyttäen opetusjoukolla ja myöhemmin testattiin itsenäisissä validointi asetettu. B: Kuten A, käyttäen valvottu mallia jakamalla potilaalla on DFS ≤6 kuukautta verrattuna potilailla, joilla on DFS 2 vuotta. C: Kuten A, mukaan lukien vain potilaita kohdellaan Paul Brousse. D: Kuten A, mukaan lukien vain potilaita kohdellaan UMC Utrecht. E: Samanlaisia ​​A, mukaan lukien vain potilaita kohdellaan Paul Brousse hoidettu neoadjuvanttikemoterapian.

Gene Expression Allekirjoitus

Käyttämällä koulutus joukko 75 potilasta molemmista keskuksista, geeni allekirjoitus havaittiin, joka koostuu 20-geenien (taulukko S2). Tämä oli kaikkein ennakoivaa geeni allekirjoitus mitattuna sisällä training set pystyy ennustamaan taudista vapaa eloonjääminen korkea tilastollista merkitystä (kuvio 1A). Kun käytetään ennustamaan riskin potilaille itsenäisessä validointi joukko 44 potilaalla, mutta tämä geeni allekirjoitus ei pystynyt merkittävästi ennustaa DFS (kuvio 1 B). Tämä viittaa overfitting koulutusta asettaa potilaat, tosiasia alleviivaa alue käyrän alla (AUC) 0,508 (95% CI 0,482-0,534) saavutettu allekirjoituksen löytö (katso menetelmät). Voima log-rank-testiä käytettiin esitetään kuvassa S1. Analyysi löytää toiminnallinen rikastamiseen 20 geenien allekirjoitus ei havaittu merkittävää etua. Koska se ei ole löytänyt ennustavan geeni allekirjoitus, me tutki tiukempaa määritelmää korkean ja matalan riskin ryhmiin johtaisi parempaan geeni allekirjoituksen jakamalla koulutus asettaa osaksi korkean riskiryhmän potilaille, joilla oli DFS alle 6 kuukautta ja alhaisen riskin ryhmä, jossa on DFS vähintään 2 vuotta (kuvio 2B). Vaikka validointitulokset tämän geenin allekirjoituksen näytti kehitys on myönteinen myös päässeet merkitys (kuvio 1 C).

Potilaat jaetaan korkean ja matalan riskin ennustaminen ryhmä perustuu riskin ennustaminen eri geeni allekirjoitukset. Gene allekirjoitukset löydettiin määritellään korkean riskin DFS ≤1 vuoden ja alhainen riski kuin DFS 1 vuosi, ellei toisin mainita. Kaikissa koulutus asettaa suhde hoidetuista potilaista neoadjuvanttikemoterapian käsittelemättömän potilaille korkean ja matalan riskin ryhmässä pidettiin mahdollisimman sama kuin estämään kaikki hoidon bias. Riskisuhde Geenin allekirjoituksen ennustaminen on esitetty 95%: n luottamusväli suluissa. P-arvo log-rank-testi esitetään myös, jossa p-arvo säädettiin useita testaus suluissa. V: Eloonjäämiskäyrät potilaille validointi asetettu. Gene allekirjoitus löydettiin käyttäen koko opetusjoukolla ohjattu varten neoadjuvant hoidon bias. B: Eloonjäämiskäyrät potilaille validointi asetettu. Gene allekirjoitus löydettiin käyttäen koko opetusjoukolla määritellään korkean riskin DFS ≤6 kuukautta ja alhaisen riskin DFS 2 vuotta ja ohjaamalla varten neoadjuvant hoidon bias. C: Eloonjäämiskäyrät varten UMC Utrecht potilaiden validointi asetettu. Gene allekirjoitus löydettiin käyttäen UMC Utrechtin osajoukko opetusjoukolla ohjattu varten neoadjuvant hoidon bias. D: Eloonjäämiskäyrät Paul Brousse potilaiden validointi asetettu. Gene allekirjoitus löydettiin käyttäen Paul Brousse osajoukko opetusjoukolla ohjattu varten neoadjuvant hoitoon harhaa.

Potilaat jaetaan korkean ja matalan riskin ennustaminen ryhmä perustuu riskin ennustamiseksi eri geenistä allekirjoitukset. Gene allekirjoitukset löydettiin määritellään korkean riskin DFS ≤1 vuoden ja alhainen riski kuin DFS 1 vuosi, ellei toisin mainita. Sekä koulutus ja validointi sarjaa erotettiin neoadjuvant käsiteltyjen ja käsittelemättömien potilailla. Tulokset näytetään vain, jos koulutus sarjaa sisälsi tarpeeksi korkea ja matala riski potilaat voivat tehdä allekirjoitus löydön mahdollisia. Riskisuhde Geenin allekirjoituksen ennustaminen on esitetty 95%: n luottamusväli suluissa. P-arvo log-rank-testi esitetään myös, jossa p-arvo säädettiin useita testaus suluissa. V: Eloonjäämiskäyrät potilaille validointi asetettu. Gene allekirjoitukset löydettiin käyttäen koko opetusjoukolla ositettu neoadjuvant hoitoa. B: Eloonjäämiskäyrät käsittelemättömän UMC Utrecht potilaista validointi asetettu. Gene allekirjoitus löydettiin käyttäen käsittelemätöntä UMC Utrecht potilaista harjoitussarjassa. C: Survival käyrät neoadjuvant käsitellään Paul Brousse potilaista validointi asetettu. Gene allekirjoitus löydettiin käyttäen neoadjuvant käsitellään Paul Brousse potilaista koulutuksen asetettu.

Osa kliinis tekijät erosivat toisistaan ​​merkittävästi potilaiden Paul Brousse sairaalan ja University Medical Center Utrecht ( Taulukko S3). Tutkia mahdollisuutta, että edellinen epäonnistuminen löytää ennakoiva geeni allekirjoitus ehkä ovat aiheuttaneet nämä erot geeni allekirjoitus löytö toistettiin UMC Utrechtin näytteet ja Paul Brousse näytteet erikseen. Geeni allekirjoitus peräisin UMC Utrechtin tiedoilla ei ollut hallussaan ennusteita kun validoitu (kuvio 1 D). Validointi Paul Brousse geeni allekirjoitus kuitenkaan ollut kehitys on myönteinen (kuvio 1 E). Tuloksena on Coxin monimuuttuja regressio kuitenkaan viittaa siihen, että geeni allekirjoitus ei ole itsenäinen ennustava tekijä (taulukko 2). Stage primaarikasvaimen ja hallinnon neoadjuvanttikemoterapian tuntui riittävän ennustaa DFS sisällä validointi asetettu. On mahdollista, että neoadjuvanttikemoterapian, joka annetaan ennen näytteen keräämisen, oli vaikutusta geeniekspressiomalli ja oli siten häiritsevän tekijä koejärjestely. Tämä vahvistaa puuttuminen ennusteita kun allekirjoitus löytö tehtiin yksinomaan Paul Brousse potilailla, jotka eivät saavat neoadjuvanttikemoterapian (kuvio 1 F). Lisäksi analyysi geenien differentiaalisesti ilmaisi välillä hoidetuilla potilailla neoadjuvanttikemoterapian ja hoitamattomilla potilailla ilmeni, 875 geeniä, jotka olivat huomattavasti ylä- tai vaimentua (taulukko S4) viittaa siihen, että neoadjuvanttikemoterapian indusoi huomattava muutos mitatun geeniekspression. Sen tutkimiseksi, puuttuessa ennustavan allekirjoituksen johtui neoadjuvant hoito bias korkean riskiryhmän allekirjoituksen löytö toistettiin käyttäen opetustiedostoiksi olivat tämän bias poistettiin (kuva 3) sekä analysoimalla neoadjuvant käsitellyn ja käsittelemättömän potilaille erikseen ( Kuvio 4). Tulokset viittaavat vahvasti siihen, että puuttuminen ennustavan allekirjoitus on riippumaton vaikutusten neoadjuvant hoidon, lisäämällä varoitus, että joissakin näistä vertailuista, näytteen koko on pieni. Taulukossa S5 esitetään ennakoivan kaikkien suoritusta geenin allekirjoitukset edellä kuvattu, kun käytetään ennustamaan DFS uudelleen niin dikotomisen muuttuja.

Eloonjäämiskäyrät perustuu kaikkiin 119 potilasta käyttäen tunnettuja kliinisiä ennustajia. Riskisuhde kliinisen riskin ennustaja on esitetty 95%: n luottamusväli suluissa. P-arvo log-rank-testi esitetään myös, jossa p-arvo säädettiin useita testaus suluissa. V: Iwatsuki (korkea riski ≥3, alhainen riski 3). B: Basingstoke (korkea riski ≥10, alhainen riski 10). C: Fong (korkea riski ≥3, alhainen riski 3). D: Mayo (korkea riski ≥2 pieni riski 2). E: Nördlinger (korkea riski ≥4, alhainen riski 4).

Validation of Clinical Risk Tulospalvelu

univariate selviytyminen analyysin tuloksia kaikille kliinis tekijät kuvattu taulukossa 3 . monimuuttuja Coxin regressiomallin, joka sisältää tekijöitä, jotka näkyvät p-arvot alle 0,1 univariable analyysissä korkeampi vaihe primaarikasvaimen (p = 0,006, HR = 1,444, 95% CI = 1,110-1,877), suuret resektio ( p = 0,005, HR = 2.190, 95% CI = 1,268-3,784), määrä maksametastaaseista (p = 0,031, HR = 1.142, 95% CI = 1,012-1,289) ja hallinnon adjuvanttihoitoa (p 0,001, HR = 0,382, 95% CI = 0,237-0,617) todettiin olevan riippumattomia riskitekijöitä huono DFS.

Kaikki tuotteet kliinisen riskin tulokset dokumentoitiin paitsi tilan hepatoduodenal imusolmukkeiden, mikä teki mahdottomaksi diabetesriskitestiin Zakaria on korkeampi kuin 2. Koska emme potilaita, joilla ekstrahepaattisen taudin tässä tutkimuksessa Basingstoke riskiluku ei ollut täydellinen. Kolme viidestä kliinisen riskin tulokset ennustivat DFS tarkasti meidän potilailla lukien Basingstoke, Fong ja Nördlinger riskin tulokset (taulukko 3). Näistä pisteet Fong toimivat parhaiten. Kaplan Meier -käyrät korkean ja matalan riskin ennustettu potilaille, jotka perustuvat eri kliiniset pisteytykset, on kuvattu kuviossa 5.

Keskustelu

Tämä tutkimus suunniteltiin tunnistamaan ja vahvistaa geenin ilmentymisen perustuva luokittelija joka ennustaa DFS. Valitettavasti emme löytäneet geenin allekirjoitus, joka voisi merkittävästi ennustaa DFS itsenäisessä validointi asetettu. Geeni allekirjoitus kehitetty käyttäen vain Paul Brousse potilaan näytteitä ei käynyt ilmi myönteinen kehitys, kun validointi. Kuitenkin Coxin monimuuttuja regressiomallin, allekirjoitus ei osoittautunut olevan itsenäistä vaikutusta DFS. Sen sijaan, että heijastaa tuumoribiologiassa, geeni allekirjoitus näytti vaikuttaa harhaa ennen kemoterapian, tämä mahdollisuus olisi otettava huomioon tehtäessä tulevia tutkimuksia. Tämä näkemys vahvistettiin sekä puuttuminen ennusteita geenissä allekirjoitus suunniteltu alaryhmässä lukien vain Paul Brousse saavilla potilailla neoadjuvanttikemoterapian sekä analyysin ero geenin ilmentymisen välillä hoidetuilla potilailla neoadjuvanttikemoterapian ja hoitamattomilla potilailla, jotka osoittivat 875 geenit differentiaalisesti ilmaisi. Sulkea pois, että puuttuminen ennakoivan geeni allekirjoituksen johtui neoadjuvant hoito bias korkean riskin potilasryhmässä, allekirjoitus löytö toistettiin käyttäen opetustiedostoiksi olivat neoadjuvant bias poistettiin sekä analysoimalla neoadjuvant käsitellyn ja käsittelemättömän potilaille erikseen . Samanlaisia ​​aiemmin Tutkimuksen tulokset tuloksena geeni allekirjoitukset eivät ennustaneet DFS validointi asettaa osoittaa, että yliedustettuina neoadjuvant hoitoa korkean riskin potilasryhmässä ei selitä Positiivisten tulosten puuttuminen.

Myös testattu viisi tunnettu kliininen riski tulokset ja totesi, että Basingstoke, Fong ja Nördlinger merkittävästi ennustettu DFS meidän potilasryhmässä. Se, että kolme viidestä tulokset olivat ennakoiva on merkittävä ottaen huomioon, että näiden kliinisten riski pisteiden (CRS) kehitettiin aikana, jolloin käyttö kemoterapia ensisijainen CRC oli harvinaista [14] – [18]. Samat viisi kliinistä riskiä tulokset hiljattain vahvistanut Reissfelder ja työtovereiden. He havaitsivat, että Fong ja Iwatsuki tulokset pystyivät ennustamaan tautikohtaisten selviytymisen niiden potilaiden, mutta ei Nördlinger ja Basingstoke indeksi [7]. On huomattava, että vain Fong pistemäärä oli ennustava molemmissa tutkimuksissa. Ei-merkitsevä korrelaatio Iwatsuki pisteet DFS saattaa johtua siitä, että korkeimman pistemäärän ei voitu laskea, koska meillä ei kirjata tilan hepatoduodenal imusolmukkeiden. Jäljelle jää kysymys: miksi emme ole löytänyt allekirjoitusta ennustamiseen DFS jälkeen resektio peräsuolen maksametastaaseja? Vaikeudet ennustettaessa (taudista vapaa) selviytymisen geeniekspressioprofilointi on raportoitu viime aikoina. Lauss ym arvioida suorituskykyä 8 julkaistu geeni allekirjoitukset ennustamisessa toistumisen virtsarakon syövän joista yhdenkään selvisivät validointi [19]. Tarkastelu arvioidaan geeni allekirjoitukset kehitetty ennustamaan hengissä keuhkosyövän 16 tutkimuksissa havaittiin kaikkien riittämättömiä käytettäviksi kliinisessä käytännössä, koska puuttuva tai puutteellinen validointi. Näissä tutkimuksissa joko allekirjoitus ei outperform kliiniset tekijät tai kirjoittajat eivät ratkaisseet vaikutuksen tahansa kliinisten tekijöiden [20].

Uskomme, että suunnittelu Tutkimuksemme oli laadultaan riittäviä pystyä löytämään geenin allekirjoituksen ennustamiseen DFS. Ei kuitenkaan voida sulkea pois, että käyttökelpoista geeni allekirjoitus on olemassa, mutta ei löytynyt takia rajoittavia tekijöitä tutkimuksessamme. Nämä potentiaaliset tekijät sisältävät määrittelemme korkean ja matalan riskin potilailla allekirjoitus löytö, potilaiden määrä tutkimuksessa mukana etenkin kun otetaan huomioon heterogeenisyys potilasryhmässä, sisällyttäminen potilaiden vain kahdessa sairaalassa, olemassaolo ennen hoidon vaikutus ja rajoitukset herkkyys mikrosiruja.

maksametastaaseista ovat luonteeltaan painottuu aggressiivisempi alaryhmä CRC. Tämän vuoksi voidaan arveltu, että geeniekspressiomalleja jotka luonnehtivat nopeasti toistuvat maksametastaaseista ovat liian hienovaraisia ​​olla paljastanut käyttäen otoskoko Tässä tutkimuksessa käytetyt. Lisäksi toistumisen resektion jälkeen metastaaseja voi olla riippuvainen ominaisuuksista maksan etäpesäkkeiden, vaan läsnäolosta mikrometastaasien aikaan maksan resektio.

Vaikka emme voi sulkea pois, että on olemassa ennustavaa geenin allekirjoitus ei lisäetuna geeniekspression allekirjoitukset ennustamisessa taudista vapaan eloonjäämisen metastasoituneen kolorektaalisyövän tauti voitaisiin perustaa perusteella tämän tutkimuksen tulokset. Lopuksi Fong kliininen riski pisteet, jo validoitu Reissfelder et al [7], on tehokkain riskiluku ennustamiseksi DFS sairastavien potilaiden resektoidun CRLM viidestä testattujen riski tulokset tutkimuksessamme. Tämä kliininen riskiluokitus olisi käytettävä kerrostuneisuus prospektiivisissa kliinisissä tutkimuksissa harkitsevat hyöty adjuvanttia hoitomuotojen leikkauspotilaiden varten CRLM.

Materiaalit ja menetelmät

Potilasnäytteet

Jäädytetyt kasvain näytteet 148 potilasta saatiin Paul Brousse sairaalassa Villejuif, Ranskassa ja UMC Utrecht Alankomaissa marraskuun 2000 elokuussa 2010. tutkimus protokolla hyväksyi Medical eettisen komitean (MEC) ja University Medical Center Utrecht tunnustetun 16 artiklan WMO (hollantilainen laki lääketieteellisestä tutkimuksesta, jossa ihmisillä). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta. Näytteitä otettiin mukaan potilaiden 18 vuotta tai vanhempi, joille tehtiin parantava resektio varten histologisesti vahvistettuja metastaaseja CRC: tä. Potilailla, joilla on ollut ei-peräsuolen pahanlaatuinen kasvain ekstrahepaattisen sairaus tai makroskooppisia jäljellä tauti (R2) leikkauksen jälkeen suljettiin pois. Potilailla, jotka saivat paikallista ablaatiohoitojen terapiaa tai chemoembolization yksinään tai yhdessä resektio suljettiin pois. Vain näyte otettiin mukaan, jotka jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä 30 minuutin kuluessa resektion ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Määrä strooman, kasvain, hyvänlaatuinen maksan solut ja nekroosia määritettiin kahden tutkimuksen patologit (C.G ja P.J.vD). Potilaat, joiden näytteet sisälsivät hyvänlaatuinen maksakudosta tai riittämätön kasvaimen solut suljettiin pois tutkimuksesta. Intraoperatiivinen ultraääni maksan suoritettiin kaikille potilaille arvioida koko ja sijainti maksan etäpesäkkeitä. Koko aineisto määritettiin käytettävissä potilaan kasvain näytteet kahteen osallistuvissa toimielimet, jotka täyttivät kaikki sisään tulevat ja poissulkemisperusteita. Potilas-, kasvain- ja kirurgiset ominaisuudet poimittiin meidän takautuvasti kerättyjen tietokantoja. Määritelmä synkronisen maksan etäpesäke (diagnoosi kahden kuukauden kuluttua alustavan diagnoosin) perustui toimittamat US National Cancer Institute.

Seuranta

Kaikki potilaat saivat standardin seurata kierre CT vatsan ja rinnan 3 kuukauden välein seurata toistuminen. Taudista vapaa eloonjääminen määritettiin aika resektion aikaan ensimmäisen merkin uusiutumisen CT skannaus. Kaikki potilaat sensuroitiin aikaan kuoleman tai viimeisen seurannasta. Elinaika määritettiin käyttäen Kaplan-Meier-selviytymisen toiminto.

geeniekspressioprofilointi

RNA: n eristämistä.

Kokonais-RNA eristettiin yksittäisistä kudosnäytteistä käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen) noudattamalla valmistajan protokollaa. RNA puhdistettiin käyttämällä RNeasy mini-(Qiagen), ja saatettiin DNaasikäsittely käyttäen Qiagen DNA-sarjaa. Saanto ja laatu kokonais-RNA tarkastettiin spektrofotometrisesti ja Agilent Bioanalyzer (Agilent). Kolmetoista näytteet suljettiin pohjalta RNA tuotto ja cRNA tuotto (RNA eheys numero [RIN] 6). Kahdeksan näytettä suljettiin pois johtuen vahvistus epäonnistumisia, ja 8 enemmän näytteitä ei täyttänyt merkintöjä kriteerit, jolloin tietoja 119 näytteistä.

cRNA synteesiä ja fluoresenssileimayhdistei-.

Kaikki vahvistusta ja merkintämenettelyjä suoritettiin 96 kuopan levyille (4titude, Bioke) on räätälöity Sciclone ALH 3000 Workstation (Caliper LifeSciences), jossa on PCR PTC-200 (Bio-Rad Laboratories), SpectraMax 190 spektrofotometrillä (Molecular Devices), ja magneettinen helmi-paikannin (Beckman). cRNA-tuotteet puhdistettiin ja konsentroitiin RNAClean (Agencourt, Beckman) valmistajan protokollan. mRNA monistettiin in vitro transkription avulla ankkuroidun alukkeen ja T7-RNA-polymeraasia 1 ug kokonais-RNA: ta. Ensin kaksijuosteinen cDNA templaattina muodostettiin kuten T7-promoottorin. Seuraavaksi tätä mallia käytettiin in vitro transkriptio T7 Megascript Kit (Ambion) tuottaa cRNA. Aikana in vitro transkriptio, 5- (3-aminoallyl) UTP: llä (Ambion) sisällytettiin yksijuosteiseen cRNA. Näytteet, joiden tuotto on alle 2000 ng tai pienillä cRNA fragmenttien (mediaani alle 500 nt) ei käytetty. Cy3 tai Cy5 fluoroforin (GE Healthcare) kytkettiin cRNA. Käytimme kokonais-RNA ja cRNA laadunvalvontakriteerit mukaisesti Kasvaimen Analyysi Best Practices työryhmässä [21]. Tuotto ja etiketissä sisällyttämisen cy-leimattu cRNA tarkistettiin käyttäen spektrofotometrisesti. Vain näytteiden välillä 1,5% ja 3% Cy-inkorporaatio oli mukana. Ennen hybridisaatiota, 300-1000 ng Cy-leimatun cRNA yhdestä koepala sekoitettiin yhtäläinen määrä kääntöpuolen väriä Cy-leimatun materiaalin Vertailunäytteen.

Microarray hybridisaatio.

Kunkin näyte, kaksi ilmaisua profiileja väriaine-swap kokeita syntyy. Näytteet verrataan kaupallinen viite (Universal Human viite RNA luettelo # 740000, Stratagene). Human Array-Ready Oligo set (versio 2.0) hankittiin Qiagen ja bongattiin Codelink dioja (GE Healthcare) kanssa pöly suodatetaan ja kosteuden suhteen kontrolloidussa clean room. Mikrosiruissa sisälsi 70-mer oligo- nukleotidit edustavat 21,329 ihmisen geenien ja ilmenevän geenin osiksi (EST), sekä 3871 ylimääräisiä paikkoja valvontaa varten. Gene merkinnät päivitettiin BLAST analyysi kaikista ominaisuuden sekvenssit käyttävät Ensembl rakentaa 55. Arrays hybridisoitiin on Tecan HS4800PRO hybridisaatio asema, käyttäen protokollaa kuvattu aiemmin [22]. Hybridisoitiin liukuu skannattiin Agilent skanneri (G2565BA) 100% hitsaustehot ja 60-90% PMT. Sen jälkeen automaattinen tietojen poiminta käyttämällä Imagene 8.0.1 (BioDiscovery), printtip Loess normalisointi suoritettiin keskimääräinen spot intensiteettiä [23]. Dye bias korjattiin perustuu sisällä asettaa arvio [24].

Data saavutettavuutta.

mukaisesti ehdotettujen MIAME (Minimum tietoa microarray kokeilu) standardeja, ensi- ja käsitellyt tietoja sekä pöytäkirjat talletetaan Array Express (https://www.ebi.ac.uk/microarray-as/aer) hakunumerolla E-TABM-1112.

tunnistaminen toistumisen Signature

kohortti satunnaisesti jaettu koulutus joukko (n = 75) ja validointi asettaa (n = 44). Viimeksi mainittu ei ole osallistunut geenin valintaan välttää valinta bias. Varten löytää geenin allekirjoituksen potilaiden taudin tuli jaettu suuri riski ja matalan riskin ryhmään. Korkean riskin potilaat määriteltiin ne, joilla uusiutumisen 1 vuoden kuluessa (kuva 2). Tämä kynnys perustuu havaintoon, että DFS 1 vuosi ennustaa haitallisia kokonaiselinaika kuten ovat kuvanneet Fong et ai [14]. Jako perustuu DFS ≤6 kuukautta (suuri riski) ja DFS 2 vuosi (alhainen vaara) sovellettiin myös (kuvio 2B). Käyttämällä training set geenit rankattiin perustuu kolmeen eri mittareita (signaali-kohina-suhde, t-testin tilastollinen ja Coxin suhteellinen riskisuhde). Tämä sijoitus tehtiin käyttämällä useita otosta valittaessa 2/3 näytteiden jokaisen iteraation. 75 sijoilla geenejä käytettiin ennustamaan vaaraluokan näytteiden jäljellä 1/3 näytteiden lähimpien keskimääräistä luokittelu [9] ja jätä-yksi-out cross validointi (LOOCV). Näiden ennusteiden yhteenlaskettu pinta-ala käyrän 1000 toistojen laskettiin josta käy ilmi yhteenlasketun ennustavan voiman 75 geenin allekirjoitukset, jolloin arvoa merkittävästi yli 0,5 pistettä todellinen ennusteita. Sijoitusta Geenien keskiarvona kaikki 1000 toistojen [25]. Saadusta paremmuusjärjestykseen, geeni allekirjoitus vahvin ennustetekijöiden teho (mitattu yleinen tarkkuus ennustaminen) määritettiin käyttäen lähimpään keskimääräistä luokittelua ja LOOCV alkaen parhaaksi luokiteltu geenin ja lisäämällä sen jälkeen seuraavaksi korkein geenin jokaisen iteraation (eteenpäin valinta ) [9]. Riippumaton mitta ennusteita saatiin käyttämällä saatua geeniä allekirjoituksen ennustaa vaaraluokan näytteiden validointi asettaa (lähin keskiarvo, LOOCV). Kaplan-Meier-analyysit käytetty arvioimaan DFS ja eloonjäämiskäyriä kahden ennustetun riskiluokkaan verrattiin käyttämällä Mantel-Cox log-rank-testi. Tehon analyysi log-rank-testi tehtiin käyttäen PS-ohjelman [26]. Toiminnallinen geeniperimä rikastamiseen analyysi suoritettiin käyttäen Babelomics 4.2 web-pohjainen analyysi Suite sisältää kaikki tietokannat käytettävissä rikastamista analyysi [27].

Analyysi Differential Gene Expression

Geenien ilmentyminen potilailla hoidettu neoadjuvanttikemoterapian verrattiin ilmaisun hoitamattomilla potilailla ANOVALLA [28]. Kiinteässä vaikutus analyysi, näyte, array ja väriaine vaikutuksia mallinnettiin. P-arvot määritettiin permutaatio F2-testi, jossa jäännökset olivat sekoitetaan 5000 kertaa maailmanlaajuisesti.

Kliininen Risk Tulospalvelu

univariate Coxin suhteellista riskiregressioanalyysiä mallia käytettiin arvioimaan riskisuhteita viiden kliininen riski tulokset, jotka laskettiin kullekin potilaalle [14] – [18] monimuuttuja-analyysissä suoritettiin myös syöttämällä tekijät p-arvot alle 0,1 alkuanalyysin perusteella.

tilastollinen testaus ja ohjelmiston

Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia ja tilastollinen merkitsevyys oletettiin p-arvot alle 0,05. Tarvittaessa p-arvot korjattiin niiden väärät löytö korko käyttämällä Benjamini-Hochberg menetelmä [29]. Tilastolliset analyysit tehtiin R 2.7.0 ylimääräisiä Bioconductor paketteja ja SPSS for Windows-versio 15,0 (SPSS, Chicago, Illinois, USA).

tukeminen Information

Kuva S1.

Power of log-rank-testi. Tilastollinen voima log-rank-testiä funktiona riskisuhde geenin allekirjoituksen ennustuksen validointi asetettu.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0049442.s001

(TIF) B Taulukko S1.

potilas- ja kasvaimen ominaisuuksista in- ja poissuljettu potilaat.

doi: 10,1371 /journal.pone.0049442.s002

(DOC) B Taulukko S2.

univariate Coxin regressioanalyysi allekirjoitusta geenien.

doi: 10,1371 /journal.pone.0049442.s003

(DOC) B Taulukko S3.