Krooninen sairaus

tiivistelmä

histonideasetylaaseja (HDAC) tiedetään olevan keskeinen rooli sääntelyn useiden solujen ominaisuuksia toisiinsa kanssa kehittymistä ja etenemistä syövän. Äskettäin HDAC1 on raportoitu olevan yli-ilmentynyt maksasolukarsinoomassa (HCC), mutta sen biologinen rooli hepatokarsinogeneesin edelleen selvittämättä. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, yliekspressio HDAC1 alaryhmässä ihmisen HCCs ja maksasyövän solulinjoja. HDAC1 inaktivointi johti tuumorin solujen kasvua ja kaspaasi-riippumaton autophagic solukuoleman kautta LC3B-II aktivaatioreitin Hep3B soluissa. Vuonna solukierron säätelyssä, HDAC1 inaktivaatio selektiivisesti indusoi sekä p21

WAF1 /CIP1 ja p27

Kip1 ilmaisuja, ja samanaikaisesti tukahdutti ilmaus sykliini D1 ja CDK2. Niinpä HDAC1 inaktivaatio johti hypophosphorylation on pRb G1 /S siirtymä, ja siten inaktivoitua E2F /DP1 transkription aktiivisuutta. Lisäksi olemme osoittaneet, että HDAC1 estää p21

WAF1 /CIP1 transkriptioaktiviteettia kautta SP1-sitoutumiskohdat p21

WAF1 /CIP1 promoottori. Lisäksi jatkuva tukahduttaminen HDAC1 heikennettyjä

in vitro

pesäkkeiden muodostumista ja

in vivo

kasvaimen kasvua hiiren ksenograftimallissa. Yhdessä suosittelemme poikkeuksellisesta säätelystä HDAC1 HCC ja sen epigeneettiset sääntelyn geenin transkription autophagy ja solukierron komponentteja. N yliekspressio HDAC1 voi olla keskeinen rooli läpi systeemistä säätelyä mitoosi efektorien kehittämisessä HCC, joka tarjoaa erityisen tärkeä mahdollinen kohde syövän hoidossa.

Citation: Xie HJ, Noh JH, Kim JK, Jung KH Eun JW, Bae HJ et al. (2012) HDAC1 inaktivointi aiheuttaa Mitoottista Vian ja kaspaasi-Independent Autophagic solukuolemaa Maksasyöpä. PLoS ONE 7 (4): e34265. doi: 10,1371 /journal.pone.0034265

Editor: Andrei L. Gartel, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 syyskuu 2011; Hyväksytty: 24 helmikuu 2012; Julkaistu: 04 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Xie et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Korean ympäristöministeriön kautta ”Eco-Technopia 21 projekti” ja Public Welfare Turvallisuus-ohjelma, kautta National Research Foundation of Korea (NRF), rahoittama opetus-, Science and Technology (2010-0020764); ja National Research Foundation of Korea (NRF) avustus, rahoittama Korean hallitus (MEST) (Grant nro 2011-0010705). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) on ensisijainen pahanlaatuisuuden ihmisen maksan ja merkittävä syy sairastuvuuteen ja kuolleisuuteen. Se on seitsemänneksi yleisin syöpä maailmassa, ja kolmas johtava syy syöpään liittyvien kuolemien [1]. Molekyyli mekanismi, hepatokarsinogeneesin hyväksytään monivaiheinen prosessi, tunnettu siitä, että progressiivisen kerääntymisen ja vuorovaikutus geneettisten muutosten aiheuttaa poikkeavan kasvun ja pahanlaatuisiin maksan parenkymaalisolut, jota seuraa verisuonten invaasio ja metastaasi [2]. Globaali muutos allekirjoitukset geenin ilmentymisen ja signalointireittejä, mukana HCC kehittämiseen, tutkittiin monet tutkijat. Kuitenkin lukuisat geenejä, jotka edistävät näitä muutoksia vielä ole ominaista riittävästi.

histonideasetylaaseja (HDAC) on histoni muuttamalla entsyymiä perheitä, jotka säätelevät ilmentymistä ja aktiivisuutta lukuisten proteiinien mukana sekä syövän taudin alkamisen ja etenemisen, poistamalla asetyyliryhmät, ja jolloin kompakti kromatiinirakenteeseen [3]. HDAC käsittävät perheen 18 geenejä, jotka on ryhmitelty luokkiin I-IV, joka perustuu homologia niiden hiiva ortologeja [4]. HDAC1, luokkana I jäsen jakaa korkea sekvenssihomologia hiiva Rpd3, on maailmanlaajuinen geeni säädin ja transkription yhteistyössä repressorin kanssa histonideasetylaasiaktiivisuutta [5]. Poikkeava ilmentymä HDAC1 näkyy yleinen syöpien ruoansulatuskanavan, ja liittyy erilaistamattomuuden, parannettu leviämisen, invaasio, edenneen taudin ja huonon ennusteen [4]. HCC potilaalla on korkea ilmentymisen HDAC1 osoitti suurempi ilmaantuvuus syöpäsoluinvaasiota porttilaskimoon, köyhempi histologinen eroavuus, kehittyneempiä kasvaimeen solmu-etäpesäke (TNM) vaihe ja alhainen eloonjäämisaste [6]. Todettiin myös, että hyvin ilmentymistä HDAC1 syöpäsoluissa korreloi kemoterapian resistenssin ja huonon ennusteen sarjassa karsinoomien [7],. Silence of HDAC1 pienet häiriöt RNA (siRNA) tai erityisen estäjä MS-275 syöpäsoluissa voi joko pysähtymisen G1 vaiheessa solusyklin tai G2 /M siirtyminen, seurauksena on menetetty mitoosi solut, solujen kasvun estäminen, ja lisätä prosenttiosuuden apoptoottisten solujen [10], [11], [12]. Lisäksi HDAC1 knockdown vaikutti solun liikkuvuus ja invaasiota säätelemällä E-kadheriinin ilmentymisen [13], [14], ja myös osoitettu aiheuttavan autophagy HeLa-soluissa [15], ja solujen vanhenemista ihmisen fibroblastisoluissa ja eturauhassyövän solut [ ,,,0],16]. Vaikka nämä molekyyli toimintoja HDAC1 olivat hyvin dokumentoitu lukuisissa aiempien tulosten, rooli HDAC1 vuonna hepatokarsinogeneesin ei ole selvitetty.

Tässä tutkimuksessa, selvittääkseen biologisten roolien HDAC1 jotka antavat onkogeenisiä vaikutuksia ihmisen HCC, arvioimme poikkeuksellisesta säätelystä HDAC1 alaryhmässä ihmisen HCC kudosten ja tutki sääntelymekanismeja on HDAC1 apoptoosin, autophagy ja solusyklin HCC soluja. Lisäksi

in vitro

ja

in vivo

kokeellinen Tuumorigeenisuustutkimuksissa HDAC1 tutkittiin käyttäen vakaata HDAC1 pudotus solulinjoissa.

Tulokset

HDAC1 tukahduttaminen syyt mitoottista viat HCC-soluissa

aiemmin raportoitu laajamittaista transcriptomic muuttuu esineoplastiset vaurio selvän ihmisen HCCs [17]. Perusopetuksesta microarray data, me kertasi ilmaus HDAC1 on monivaiheinen histopatologiset prosessista, huonolaatuisen dysplastic kyhmyt (LGDNs) ja korkea-asteen dysplastic kyhmyt (HGDNs) ensimmäisiin HCC (Edmondson laadut 1-3). Kuten kuviossa 1A on esitetty, asiaa ilmentyminen HDAC1 nostettiin vähitellen ei-kasvain selvän syöpä. Vahvistaa yliekspressio HDAC1 HCC, teimme immunoblot-analyysi HDAC1 alaryhmässä ihmisen HCCs. Kuten kuviossa 1B on esitetty, HDAC1 näytti olevan erittäin yli-ilmentynyt kaikissa valituissa HCC kudoksissa verrattuna vastaavaan ei-syöpä kudoksiin. Expression of HDAC1 analysoitiin myös kymmenessä eri HCC-solulinjat (HepG2, Hep3B, PLC /PRF /5, SNU182, SNU354, SNU368, SNU387, SNU423, SNU449 ja SNU475) ja verrattiin kolmen selektiivinen kuolemattomiksi normaalissa maksassa hepatosyyttien solulinjoja (THLE -2, THLE-3 ja Miha). Kuten kuviossa 1C on esitetty, endogeeninen ilmentyminen HDAC1 kaikissa HCC solulinjoissa esillä suhteellisesti suurempi kuin normaali maksan hepatosyyttien solulinjat.

(A) HDAC1 mRNA: n ekspression on esitetty asteittainen kasvu pre-syöpä on ilmeistä HCCs (* p 0,05). LGDN, matala-asteista dysplastic kyhmy; HGDN, korkea-asteen dysplastic kyhmy; G1-3, Edmondson laadut 1-3. (B) Kymmenen paria kasvain (T) ja niitä vastaavien ei-kasvain (N) maksakudoksissa saatiin kirurgisen resektion. Proteiini taso HDAC1 arvioitiin Western blot-analyysi. (C) Endogeeninen tasot HDAC1 kymmenessä maksasyövän ja kolme normaali solulinjoissa. Vasta-aine vastaan ​​GAPDH toimi latauskontrollina. (D) Kohdennettu-häiriöiden HDAC1 aiheuttaa kasvun hidastumisen HCC solulinjoissa. Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT: llä osoitettuun solulinjoissa transfektoitiin joko scramble (si-Scr) tai HDAC1 siRNA (si-HDAC1). Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD (* p 0,01). Kaikki mittaukset suoritettiin kolmena kappaleena, ja jokainen koe toistettiin ainakin kaksi kertaa.

Seuraavaksi selittää biologinen seuraukset poikkeavasta ilmentymisen HDAC1 vuonna hepatokarsinogeneesin, HDAC1 ilmentyminen kumottiin RNA-interferenssin välittämän geeni knock-down neljässä eri HCC solulinjoissa; HepG2, Hep3B, SNU182 ja SNU449 soluja. Kuten kuviossa 1D, HDAC1 ehtyminen johti huomattavaan vähenemiseen kasvainsolujen kasvua (HepG2, Hep3B ja SNU449). Tämä anti-kasvua vaikutus voi osittain selittää häiriöitä solun kasvun säätelyssä, kuten solusyklin pysähtymisen, solujen vanhenemista tai apoptoosin. Niinpä seuraavaksi tutkitaan vaikutuksia HDAC1 tukahduttaminen on solukierron säätelyssä ja solujen apoptoosin.

Poikkeava ilmentyminen HDAC1 välittämää leviämisen maksasyövän solujen purkamalla ilmaus G1 /S solusyklin proteiineja

se, että tukahduttaminen HDAC1 aiheutti taantumisen maksan syöpäsolun kasvua tarkoittaa, että HDAC1 osallistuu säätelyyn solusyklin etenemistä. Niinpä teimme solusyklin analyysi PI-värjättyä solujen HDAC1 siRNA transfektanteissa virtaussytometriaa käyttämällä. HDAC1 väheneminen johti kasvuun G1 vaiheessa 17,0% ja samanaikaisesti väheneminen S-vaiheessa ja G2 /M-vaiheessa 1,1% ja 15,9%, vastaavasti kontrolliin verrattuna (si-Scr) 48 h transfektion jälkeen (kuvio 2A) . Se, että tukahduttaminen HDAC1 aiheuttaman solukierron pysähtymisen G1 vaiheessa merkitsee, että HDAC1 voivat muuntaa toimintaa solusyklin säännellä komponentteja. Siksi tutkimme vaikutuksia HDAC1 heikentymisen sääntelyn proteiinien G1 /S solusyklin siirtyminen. G1 /S siirtymä, se on vakiintunut, että negatiivinen solu lukiertosäätelijöistä, kuten p15

INK4B, p16

INK4a, p18

INK4C, p19

INK4D, p21

WAF1 /CIP1 ja p27

Kip1, ovat keskeisiä modulaattorit hillitseviä sykliini D1 /CDK4: n ja 6, tai sykliini E /CDK2 komplekseja. Kun nämä solusyklin modulaattorit tutkittiin, HDAC1 ehtyminen selektiivisesti aiheuttama induktio p21

WAF1 /CIP1 ja p27

Kip1 joukossa alipaineensäätöventtiileillä solukierron siirtymisen Hep3B-soluissa (kuvio 2B). Erityisesti HDAC1 inaktivointi käyttämällä HDAC1 siRNA ei vaikuttanut endogeenisen ilmentymisen HDAC2, ja se aiheutti myös kertymistä asetyloitua histoni H3 ja H4 mikä HDAC1 ehtyminen erityisiä induktio p21

WAF1 /CIP1 ja p27

Kip1 in Hep3B soluissa. Lisäksi HDAC1 ehtyminen myös esiin samanaikaista tukahduttaminen CDK2 ja sykliini D1 (kuvio 2C). Yleensä aktivoidun CDK /sykliini kompleksi voi aiheuttaa hyperfosforylaatiota pRb, joka menettää kasvaimia estävä aktiivisuus, ja joka mahdollistaa lisäys E2F /DP1 transkriptionaalista aktiivisuutta. Siten tutkimme seuraavaksi häiriöstä CDK ja Sykliinien jonka HDAC1 vaikuttaa E2F /DP1 transkriptionaalista aktiivisuutta Hep3B soluissa. Kohdennettu-häiriöitä HDAC1 esiin hypophosphorylation of p130, joka on pRb isoformin (RB2). Näin ollen, jotkut loppupään kohdegeenien E2F /DP1 transkriptiotekijän, kuten E2F4, cdc2 ja sykliini A, olivat merkittävästi alassäädetty (kuvio 2D). Edelleen vahvistaa nämä tulokset ja vahvistaa transkription tasoa differentiaalisesti ilmentyvien geenien, suoritimme kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) varten

HDAC1

,

CDKN1A

(p21

WAF1 /CIP1),

CDKN1B

(p27

Kip1),

CDK2

ja

CCND1

(sykliini D1) geenejä. Kuten kuviossa 2E, HDAC1-köyhdytettyä Hep3B solut osoittivat hyvin alhaisen endogeenisen HDAC1 ilme. Pystyimme myös vahvistamaan, että molemmat

CDKN1A

(p21

WAF1 /CIP1) ja

CDKN1B

(p27

Kip1) olivat merkittävästi ajan säädellään HDAC1 inaktivaatio. Kääntäen,

CDK2

ja

CCND1

oli näyttivät alas-säädellä HDAC1 inaktivaation (kuvio 2E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että yksinomainen sääntely solusyklin proteiineja, kuten p21

WAF1 /CIP1, P27

Kip1, sykliini D1 ja CDK2 mukaan HDAC1 yli-ilmentyminen kykenee hyvin voimakas mitogeenisesta stimulaatiota aikana maksasyövän etenemisen.

Hep3B-solut transfektoitiin kontrolli (ei mitään), lipofektamiinin vain (Reag), 100 nmol /l salattu siRNA (si-Scr) tai 100 nmol /l HDAC1-spesifisten siRNA (si-HDAC1). (EN) virtaussytometrianalyysin tehtiin propidiumjodilla (PI) värjätä tukahduttamista HDAC1 in Hep3B soluissa. Kaksi erillistä koetta samoin tuloksin suoritettiin. (B) Oikean tukahduttaminen HDAC1 aktiivisuuden, proteiini ilmauksia asetyyli-histoni H3 ja H4 määritettiin immunoblottauksella. Proteiini ilmauksia alipaineensäätöventtiileillä G1 /S solusyklin siirtyminen arvioitiin myös HDAC1-köyhdytettyä Hep3B soluissa. (C) tukahduttaminen CDK ja tuovat lisätietoa G1 /S siirtymisen HDAC1 ehtyminen. (D) vaikutukset HDAC1 heikentymisen pRb ja E2F /DP1 kohdegeenin ilmaisuja. (E) validointi mRNA ilmentymisen HDAC1 säännellyn geenien kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysillä. Suhteellinen ilmentymistaso kunkin geenin normalisoitiin GAPDH-mRNA: n samasta näytteestä. Ekspressiotaso kvantifioitiin ImageJ ja normalisoitiin GAPDH. Arvot on annettu kertamuutosta suhteessa si-Scr tansfectants. Suhteellinen proteiinien taso näkyy vaakapalkkia oikealla puolella jokainen immuno- (* p 0,05). Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa samat tulokset. Tyypillinen tulos kolmen suoritettu kokeesta.

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että HDAC-inhibiittorit voimakkaasti aktivoida ilmentymistä p21

WAF1 /CIP1 tehostamalla histoni asetylaatio p21

WAF1 /CIP1 promoottori lukien Sp1- sitomiskohta vapauttamalla repressorin HDAC sen sitova [18], [19]. Lisäksi oli joitakin todisteita siitä, että endogeeninen ilmentyminen p21

WAF1 /CIP1 säädellään transkription tasolla rekrytoimalla HDAC1 että p21

WAF1 /CIP1 promoottorialue [20], [21]. Nykyinen tulokset viittaavat myös siihen, että transkription suppressio p21

WAF1 /CIP1 läpi HDAC1 sitovia promoottorialue on hallitseva maksan syöpäsoluja. Validoida tämän epäsuorasti suoritimme kromatiinin immuunisaostustesti kanssa kvantitatiivinen PCR (chip qPCR) varten osoitetun p21

WAF1 /CIP1 promoottorialueille joka oli analysoitu edellisessä raportissa (kuvio 3A) [22]. Olemme havainneet, että HDAC1 on erittäin liittyy proksimaalisen alueen p21

WAF1 /CIP1 promoottori (alue D kuviossa 3B). Tämä tulos on vielä vahvistanut ChIP-qPCR analyysi samalla promoottorialueen p21

WAF1 /CIP1 (alue D), ja joka osoitti, että asetylointi tilan histoni H3 ja /tai H4 on parannettu genomiseen lokukseen, että kumota HDAC1 (kuvio 3C).

(A) kaavamainen p21

WAF1 /CIP1 promoottori kuvaa tutkituilla alueilla Chip-qPCR (mustat palkit, A-D). (B) yhdistys HDAC1 että p21

WAF1 /CIP1 promoottori arvioitiin vahvistusta kunkin alueen immunosaostettiin HDAC1. Määrä DNA saostetaan joko anti-HDAC1 tai kontrolli-lgG ilmaistiin prosenttiosuutena koko panos genomista DNA: ta. Tulos neljän itsenäisen kokeen on esitetty keskiarvona ± SD. (C) asetylaatiot histoni H3 ja H4 liittyvät proksimaalisen p21

WAF1 /CIP1 promoottori korotettiin estämällä yhteenliittymän HDAC1. Hep3B-solut transfektoitiin ohimenevästi ohjaus (si-Scr) tai HDAC1 siRNA (si-HDAC1) 48 tuntia, ja sille suoritettiin ChIP-qPCR-analyysillä käyttäen asetyyli-histoni H3 (anti-Ac-H3) tai H4 (anti-Ac- H4) vasta-aine tai kontrolli-IgG. Saostunut genomista DNA monistettiin varten proksimaalisen promoottorin p21

WAF1 /CIP1 lokuksen (alue D) reaaliaikaisella PCR: llä. Saostuneen DNA ilmaistiin prosenttiosuutena koko panos genomista DNA: ta. Tulos kolmen erillisen kokeen oli näytetään keskimääräisenä ± SD. (D) HDAC1 säätelee p21

WAF1 /CIP1 transkriptio kautta SP1-sitoutumiskohdat p21

WAF /CIP1 promoottori. Ilmoitettu konstruktit, pWWP, pWPdel-BstXI, pWP101, pWPmt-Sp1-3, pWPmt-Sp1-5,6, pWPdel-Smal ja SP1-luc transfektoitiin transientisti Hep3B-solujen, 100 nmol /l salattu siRNA (äänen- SCR) tai 100 nmol /l HDAC1 erityisiä siRNA (si-HDAC1), tässä järjestyksessä. Promoottori aktiivisuus mitattiin, ja kertainen induktio mukaan HDAC1 ehtyminen laskettiin. Vasemmalla järjestelmässä kutakin konstruktia esitetty. Kaikki tiedot on esitetty keskiarvona ± SD (n = 3) (* p 0,05).

Kuten edellä on kuvattu, on olemassa rikastettu SP1-biding sivustoja alueella D. Joten seuraavan kerran olivatko HDAC1 tukahduttaa p21

WAF1 /CIP1 ilmentymisen kautta SP1-sitoutumiskohdista p21

WAF1 /Cip1promoter. Tämän varmistamiseksi suoritimme toimittaja määritystä reportterirakenteet kuvattu materiaalit ja menetelmät. Kuten on esitetty kuviossa 3D, HDAC1-vajaiden Hep3B-soluja (si-HDAC1) ilmeni kohonneita lusiferaasiaktiivisuuden, kun läsnä on SP1-sitoutumiskohtien, sisältää ainakin Sp1-3 on Sp1-6 (pWWP, pWPdel-BstXI ja pWP101). Kuitenkin p21

WAF1 /CIP1 transkription aktiivisuus ei indusoitunut mutanttimuotojen Sp1-5,6 (pWPmt-Sp1-5,6) in si-HDAC1 soluja. Mielenkiintoista, p21

WAF1 /CIP1 transkriptio oli vielä indusoitiin kaksi mutantti plasmidien (eli pWPdel-SmaI ja SP1-luc), jossa on kaksi tai kolme tandem Sp1-sitoutumiskohtaan lähelle TATA tai transkription aloituskohdasta. Tämä tulos osoittaa, että proksimaalinen alueen ympärillä TATA p21

WAF1 /CIP1 promoottori odotetaan olevan tärkeä paikka säätö- p21

WAF1 /CIP1 transkriptio HDAC1 sisään Hep3B soluissa.

Targeted- esto HDAC1 indusoi autophagic solukuolemaa Hep3B-solujen

Viimeaikaiset tutkimukset ehdotti, että käsittely histonideasetylaasi-inhibiittorit indusoi ei pelkästään apoptoottisia, mutta myös autophagic solukuolemaa [23], [24], [25]. Todettiin myös, että knockdovvn HDAC1 indusoi autophagic solukuolemaa HeLa-soluissa [15]. Näin ollen tutkimme vaikutuksia HDAC1 tukahduttaminen aktivoinnista solukuoleman Hep3B-soluissa. Kuten on esitetty kuviossa 4A, virtaussytometria-analyysi, jolla mitataan anneksiini V värjättiin solut osoittivat merkittävää induktiota apoptoottisten solujen kontrolliin verrattuna (si-Scr). Lisäksi HDAC1 ehtyminen ei vaikuttanut ilmaisuja proapoptootti- komponentteja, kuten AIF, Bax ja Rahastolla-1, eikä se aiheuta kaspaasi-3 ja PARP pilkkominen (kuvio 4B). Nämä tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen HDAC1 ei vaikuttaa lähinnä apoptoottisen signaalin HCC.

(EN) virtaussytometrianalyysin kautta toteutettiin anneksiini V-FITC merkintöjä ja PI värjäytymisen tukahduttamista HDAC1. Kaksoisvärjäys anneksiini V-FITC ja PI kertoo, että määrä solujen myöhäisessä vaiheessa apoptoosin oli hieman suurempi (ylhäällä oikealla) in HDAC1-köyhdytettyä Hep3B soluissa. Kaksi erillistä koetta samoin tuloksin suoritettiin. (B) Sekä PARP ja kaspaasi 3 pilkkominen ei havaitse HDAC1 esto. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa samat tulokset.

Seuraavaksi, onko HDAC1 inaktivointi aiheuttaa aktivoitumisen autophagic solukuoleman, tutkimme mikroskooppinen rakenne solujen transmissioelektronimikroskopialla (TEM) in HDAC1 -depleted Hep3B-soluissa. Kuten odotettua, noin 40-45%: n HDAC1 siRNA-transfektoiduissa soluissa kehitetään autophagic onteloita jälkeen 72 h transfektion jälkeen (kuvio 5A). Suuremmilla suurennoksilla, useimmat vacuoles sisälsi elektroni tiheitä ja huonontunut organelles. Sen sijaan ohjata siRNA (si-Scr) transfektoidut-solut pelkästään vakuoleja, ja vähemmän soluja sisältäviä vacuoles sytoplasmassa havaittiin (oikealla kaksi paneelia kuvassa 5A). Mikrotubuluksiin liittyvä proteiini 1 kevytketjun 3 (LC3) on yhteinen merkki havaitsemiseksi autophagy. LC3 on posttranslationaalisesti modifioitu poistamalla sen C-pään tuottamiseksi LC3-I (~18 kDa), jossa fosfatidyylietanoliamiini lipidaatio synnyttää LC3-II (-16 kDa). Rikastuminen membraaniin sitoutunut LC3-II autophagosomes on erottuva ilmiö autophagic solukuoleman määrä ja LC3-II korreloi hyvin useissa autophagosomes. Meidän kokeissa HDAC1 pudotus huomattavasti konversio LC3B-I-LC3B-II yhtä paljon kuin keramidin, joka on voimakas autophgy indusoija, teki Hep3B-soluissa (kuvio 5B). Sitä vastoin käsittely 3-metyyliadeniini (3-MA, spesifinen inhibiittori autophagy) esti LC3B-I LC3B-II konversio HDAC1 inaktivaatio Hep3B-soluissa (kaista 5 kuviossa 5B). Lisäksi immunofluoresenssivärjäystä LC3B paljastui, että HDAC1 inaktivoitumisen aiheuttama renkaan muotoiset täplät tasaisesti koko solulimaan, mikä osoittaa yhdistyksen välillä LC3 ja autophagosomal kalvot, ja tämä yhdistys merkittävästi estänyt 3-MA käsittely (kuvio 5C). Tämän mukaisesti tulos, vähentää solujen elinkelpoisuuden aiheuttama HDAC1 inaktivaatio esti tehokkaasti 3-MA käsittely (kuvio 5D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että HDAC1 pudotus aktivoituu autophagic solukuolemaa HCC-soluissa. Kiinnostavaa kyllä, Huomasimme myös, että HDAC1 inaktivointi ei vaikuttanut Beclin-1, joka osallistuu aikana alkuvaiheissa autophagy, ja että se edistää ytimenmuodostusta autophagic rakkulat, ja rekrytointi proteiinien sytosolin [26]. Tämä sekaantunut että HDAC1 inaktivoitumisen aiheuttama Beclin-1 riippumaton autophay sisään Hep3B soluissa. Voit tarkistaa, että HDAC1 inaktivoitumisen välittää LC3B riippuvaista autophagic solukuolemaa, LC3B hiljennettiin vuonna Hep3B soluissa. Kuten kuviossa 5E, LC3B-II muuntaminen aiheuttama HDAC1 inaktivaatio estyi täysin LC3B Knockdown sisään Hep3B soluissa. Lisäksi vähentynyt solujen elinvoimaisuuden HDAC1 inaktivaatio merkittävästi palautti kotransfektiojärjestelmää of LC3B siRNA Hep3B soluissa (kuvio 5F). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että HDAC1 inaktivaatio vaikuttaa kaspaasi-riippumattoman solukuoleman kautta LC3 riippuvainen autophagy in Hep3B-soluissa.

(A) Hep3B-solut transfektoitiin HDAC1 siRNA (100 nmol /l) 72 tuntia, kiinteät ja tarkistetaan alla siirto elektronimikroskoopilla (TEM) (vasen kaksi paneelia). Jossa suurennettuna, autophagosomes sisältävä elektronin tiheitä ja hajoaa soluelimiin havaittiin HDAC1-vajaiden solujen. Sitä vastoin paljon ehjä mitokondrioita havaittiin Hep3B-soluissa, jotka oli transfektoitu si-Scr (oikealla kaksi paneelia). Nuolet osoittavat läsnäolo autophagosomes. (B) Kun knockdovvn HDAC1, LC3 muuntaminen (LC3B-I LC3B-II) oli merkittävästi lisääntynyt, kun taas taso Beclin 1 eivät muutu. Parallel hoito 5 mM 3-MA 48 tuntia esti LC3B-II aktivaation aiheuttama HDAC1 knockdown. Hep3B-soluja käsiteltiin myös 25 uM keramidin 24 h positiivisena kontrollina autophagy. Densitometrian tulos immunoblot on esitetty pylväsdiagrammi (keskiarvo ± SD). Suhteellinen proteiinin ilmauksia HDAC1, LC3B-II ja Beclin 1 normalisoitiin kanssa ilmentymisen valvonnan taso (si-Scr) (* p 0,05). (C) Kun immunofluoresenssianalyysillä, sytosolin ilmaus LC3B indusoitui HDAC1 Knockdown, ja joka purettiin käsittelemällä 3-MA Hep3B soluissa. (D) MTT-analyysi osoittaa, että solujen elinkelpoisuus oli taantunut jonka HDAC1 Knockdown sisään Hep3B solussa. Useita elävien solujen lisääntynyt rinnakkain hoitoon 3-MA 48 h (* p 0,05). (E) Co-transfektio siRNA kohdistaminen LC3B ja /tai HDAC1. LC3B konversio indusoitiin si-HDAC1 puuttuessa si-LC3B. Taso proteiinit kvantitoitiin ImageJ ja normalisoitiin GAPDH. Pylväsgrafiikka osoittaa suhteellinen suhde si-Con transfektantin (* p 0,05). (F) MTT-analyysi osoittaa, että solut elinkelpoisuus saatiin talteen ilmeisesti läsnäollessa si-LC3B in HDAC1 pudotus Hep3B soluja (* p 0,05, si-HDAC1 + si-LC3B vs si-HDAC1).

Pitkittyneen tukahduttaminen HDAC1 vaimentaa Tuumorigeenisuustutkimuksissa Hep3B solujen sekä

in vitro

ja

in vivo

Tuloksemme osoittivat, että ohimenevä häiriö HDAC1 aiheutti

in vitro

autophagic solukuoleman ja kasvun pysähtymisen Hep3B soluissa. Siten sen tutkimiseksi, vakaa tukahduttaminen HDAC1 johtaa tukahduttaminen hepatokarsinogeneesin perustimme vakaa HDAC1 pudotus solulinjoja (HDAC1KD # 1 ja HDAC1KD # 2), ja vahvisti inaktivoimiseksi HDAC1 tunnistamalla p21

WAF1 /CIP1 ja p27

Kip1 induktio ja cdc2 väheneminen pysyviä solulinjoja (kuvio 6A). Sitten arvioitiin kasvuvauhti vakiintuneiden solulinjojen. Kuten kuviossa 6B, HDAC1KD # 1-solut osoittivat alentunut kasvunopeus verrattuna joko Mock-transfektantin (Mock # 1) tai Hep3B vanhempien soluja (Ei mitään). Tämän perusteella tulos, seuraavan kerran suoritetaan pesäkkeitä muodostava määrityksessä, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Klonaalisen solujen kasvua merkittävästi vaimentaa jatkuva tukahduttaminen HDAC1 in HDAC1KD # 1-soluissa, verrattuna kontrolliin (Mock # 1) (kuvio 6C, p 0,05). Lopuksi, sen osoittamiseksi, että HDAC1 yliekspressio vaikuttaa hepatokarsinogeneesin

in vivo

, me ihon alle ruiskutetaan pysyviä solulinjoja (ts HDAC1KD # 1 tai Mock # 1) kateenkorvattomiin nude-hiiriin. Yleinen kasvaimen kasvu ja tilavuus vähensi merkittävästi HDAC1 solulinjaan (HDAC1KD # 1) verrattuna kontrolliryhmään (Mock # 1) (kuvio 6D, p 0,05). Klo 37 päivää inokulaation Kasvainmassaa oli havaittavissa Mock ryhmässä. Sitä vastoin hiirissä, jotka oli injektoitu HDAC1KD # 1, kasvaimen massa oli havaittavissa vain 48 päivää inokulaation jälkeen. Keskimääräinen kasvaimen tilavuus lopetuksen oli paljon pienempi ryhmässä ruiskutetaan HDAC1KD # 1 kuin Mock # 1-soluissa (kuvio 6E, p 0,05). Lisäksi, immunoblot-analyysi paljasti, että ilmaukset p21

WAF1 /CIP1, p27

Kip1 ja LC3B-II: ta indusoituu merkittävästi HDAC1 puutteellinen Ksenograftikudoksista (kuvio 6F, p 0,05). Nämä tulokset merkitsevät sitä, että tukahduttaminen HDAC1 edistää eston hepatokarsinogeneesin

in vivo

.

(A) Vahvistus HDAC1 tukahduttaminen tunnistamalla sen erityinen kohdegeenien solukierron säätelyssä. Tyypillinen tulos kolmen erillisen kokeen näytettiin. Proteiini ilmaisuja kvantitoitiin ja normalisoitiin GAPDH, ja näytettiin suhteellisena suhde Mock. (B) Solujen kasvu Hep3B-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti salattu shRNA (Mock # 1) tai HDAC1 shRNA (HDAC1KD # 1) määritettiin laskemalla koetta kullakin osoitetulla ajankohtana. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD kolmesta kokeesta. (C)

In vitro

pesäkemuodostusta. Solukloonit, jotka ilmentävät salattu shRNA (Mock # 1) tai HDAC1 shRNA (HDAC1 KD # 1) pidettiin 6-kuoppaisille levyille. Käyrä palkki osoittaa pesäkkeiden lukumäärä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (* p 0,05, HDAC1KD # 1 vs Mock # 1). (D) Yleinen kasvaimen kasvua Hep3B solun ksenograftien. (E) Hiiret tapettiin kahdeksankymmentä päivää injektion jälkeen, ja tuumorin paino mitattiin. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD (* p 0,05). (F) Tällä hetkellä uhrauksen, ksenograftikasvaimissa irrotettiin ja kokonais- proteiini uutetaan viisi satunnaisesti valittua hiiret kussakin ryhmässä suoritettiin Western blot-analyysi käyttäen osoitti vasta-aineita. Proteiini ilmaisuja normalisoitiin kuin GAPDH, ja suhteellinen ekspressio kunkin tason proteiinin kuvattu pylväskaaviona (* p 0,05).

Keskustelu

histonideasetylaaseja (HDAC: t ) edustavat perheen entsyymejä, jotka yhteistyössä histoni asetyylitransferaasientsyymin moduloida kromatiinirakenteeseen ja transkriptioaktiviteettia muutosten kautta asetylointi aseman nukleosomaalisten histonien [27]. Kertyvät todisteita ovat ehdottaneet, että HDAC säätävät sekä ilmaisun ja aktiivisuutta lukuisten proteiinien mukana sekä syövän taudin alkamisen ja etenemisen [27], [28]. Viime aikoina useat tutkimukset ovat osoittaneet, että tietyt HDAC perheet poikkeavasti ilmaistaan ​​kasvaimia ja on tarpeeton toiminto syövän kehittymisessä [4], [29]. Johdonmukaisesti, yhä enemmän näyttöä ehdotti poikkeava ilmentyminen HDAC1 kasvainsairaudet, ja osoitti, että HDAC1 ehtyminen aiheuttaa kasvun pysähtymisen ja apoptoosin tiettyjen ihmisen syöpäsoluja [10], [27], [29]. Kuitenkin rooli HDAC1 vuonna hepatokarsinogeneesin ei ole vielä selvitetty. Tässä tutkimuksessa olemme ehdottaneet, että kumoamisen poikkeavasta ilmentymisen HDAC1 aktivoinut kaspaasin riippumaton autophagic solukuoleman ja pidätti G1 /S solusyklin siirtyminen ihmisen Hep3B soluissa, ja näin ollen tukahdutti kasvaimen solujen kasvua ksenografti- eläinmallissa.

tuoreessa tutkimuksessa mahalaukun syövän, HDAC1 ilmentyminen raportoitu olevan yli-ilmentyneen ja oli ennusteen arvioinnissa mahasyövän [8]. Induktio HDAC1, 2, 3 ekspressiotasot myös osallinen vähensi merkittävästi potilaiden eloonjäämisen kolorektaalisyövässä [30]. Osuus on HDAC1 ilmentää pahanlaatuisiin normaalin maksan tutkittiin myös siirtogeenisen hiiren mallia [31]. Lisäksi tuoreessa raportissa ehdotettiin, että molemmat HDAC1 ja HDAC2 yhteistyöhaluisesti säännelty leviämisen hiiren alkion fibroblasti (MEF) ja oli keskeinen rooli hematopoieettisten eriyttäminen [32]. Maksasolukarsinoomassa, korkea HDAC1 ilmentyminen liittyi syöpäsoluinvaasiota porttilaskimoon, huono histologisia erilaistumista ja alhainen potilaan eloonjääminen [6]. Tämän vahvisti myös meidän aiemmin julkaistu kattava mRNA-pohjainen ilmaisun microarray data [17]. Näistä harha liittyviä geenejä monivaiheinen hepatokarsinogeneesin, me toisteta HDAC1 ilmaisun ja osoittivat erittäin yli-ilmentymisen avoin HCC. Immunoblottianalyysi HDAC1 alaryhmässä ihmisen HCC kudosten ja maksasyövän solulinjoja osoittivat yliekspressio HDAC1 vuonna HCCs, ja kohdennettuja-häiriöiden HDAC1 aiheutti kasvun hidastumista erilaisissa HCC solulinjoissa (kuvio 1). Kasautuvan todisteet viittaavat siihen, että HDAC1 yliekspressio näkyy erityisen tavallisia syöpien ruoansulatuskanavan ja liittyy erilaistamattomuuden, parannettu leviämisen, invaasio, kehittynyt sairaus ja huono ennuste. Ei kuitenkaan on yritetty selittää taustalla olevien mekanismien vastuussa kasvaimia synnyttävän potentiaalin HDAC1 HCC. Siksi arvioitiin vaikutuksia HDAC1 inaktivaation sääntelyn proteiinien solujen kasvua ja kuoleman mekanismi.

On hyvin raportoitu, että HDAC-välitteinen tukahduttamisesta geenit voivat aiheuttaa hallitsemattoman solukasvun koska HDAC tukahduttavat transkription sykliini -riippuvaista estäjät (CDKIs), jolloin jatkuvan leviämisen [27]. In osteosarkooman ja rintasyövän soluja, on raportoitu, että pudotus on HDAC1 johti solusyklin pysähtymisen joko G1 tai G2 /M-vaiheen siirtymä, ja prosenttiosuus kasvoi apoptoottisten solujen [10]. Tuloksemme osoittivat, että häiriöt HDAC1 indusoi p21

WAF1 /CIP1 ja p27

Kip1 ilmaisuja merkitsemättä inhibition G1 /S siirtyminen solusyklin (kuvio 2B). Lisäksi HDAC1 Knockdown tukahdutti ilmaus sykliini D1 ja CDK2 (kuvio 2C).