Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

aikana androgeeniablaatio syöpäsolujen kasvua ja selviytymistä itsenäistyvät normaalia sääntelymekanismeja. Nämä androgeenista riippumaton solujen hankkia huomattava kyky sopeutua ympäröivään microenvironment joiden tekijät, kuten välittäjäaineiden, vaikuttavat niiden selviytymistä. Vaikka havainnot ovat yhä nähtävissä noin ilmaus α

1A-adrenoreseptorien eturauhassyövässä epiteelisolujen, niiden tarkka toiminnallista roolia androgeeni-riippumaton solujen on vielä vahvistettu. Edellinen työ on osoittanut, että kalvo Lipidilauttojen liittyvä avain signalointi proteiineja välittävät kasvua ja selviytymistä signaalireaktioteissä eturauhassyövän soluissa.

Menetelmät /Principal Havainnot

Jotta analysoida kalvo topologia α

1A-adrenoreseptorin selvitimme sen läsnäolo biokemiallisen lähestymistapaa puhdistettiin puhdistusaineita kestävä membraanifraktioiden androgeenisäädellyn riippumaton eturauhassyöpäsolulinja DU145. Elektronimikroskopia huomautukset osoitti colocalisation että α

1A-adrenoceptor kanssa caveolin-1 pääproteiinikomponentti kaveoleja. Lisäksi olemme osoittaneet, että agonisti stimulaatio α

1A-adrenoceptor indusoitu vastus thapsigargin-indusoitua apoptoosia ja että caveolin-1 oli tarpeen tässä prosessissa. Edelleen immunohistofluorescence paljasti suhde korkea α

1A-adrenoreseptorin ja caveolin-1 ilmentymisen kanssa pitkälle eturauhassyöpää. Samalla osoitetaan immunoblottauksella että TG-aiheuttaman apoptoosin vastus kuvattu DU145 soluissa välittyy ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasien (ERK).

Johtopäätökset /merkitys

Yhteenvetona ehdotamme, että α

1A-adrenoreseptorin stimulaatio androgeeni-riippumaton syöpäsolujen

kautta

kaveoleja on yksi mekanismeja, jotka auttavat niiden suojaa TG: n indusoiman apoptoosin.

Citation: Katsogiannou M, Boustany CE , Gackiere F, Delcourt P, Athias A, Mariot P, et ai. (2009) kaveoleja edesauttaa apoptoosiresistenssiin aiheuttama α

1A-adrenoreseptorin in androgeenin Independent syöpäsolujen. PLoS ONE 4 (9): e7068. doi: 10,1371 /journal.pone.0007068

Editor: Tšad Creighton, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 kesäkuu 2009; Hyväksytty: 25 elokuu 2009; Julkaistu: 18 syyskuu 2009

Copyright: © 2009 Katsogiannou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Ranskan tiedeministeriön ja yliopiston Lille 1, INSERM ja alue Nord-Pas de Calais sekä Ligue Nationale Contre le Cancer (Comité du Nord) ja Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yksi yleisimpiä muotoja syöpä miehillä ja toinen syy syövän kuolemaan teollisuusmaissa [1]. Erilaiset tekijät, kuten Androgeenit ja kasvutekijät säädellä epiteelisolujen lisääntymistä ja apoptoosia normaalissa eturauhasessa ja varhaisvaiheen eturauhassyöpä (PCA). Androgeeniablaatio on tällä hetkellä johtava hoitoa käytetään estämään kasvun androgeeniriippuvaisen syöpäsoluja. Kuitenkin PCa solujen lisääntymistä ja selviytymisen tulee usein riippumattomia sääntelymekanismeja johtaa hormoni tulenkestävät tauti [2], jolle ei tällä hetkellä ole onnistunut hoito. Androgeenista riippumaton PCa soluilla on huomattava kyky sopeutua ympäröivään microenvironment joiden vaikutus solunsisäisten eloonjäämisreittejä sovelletaan edelleen keskustelua [3]. Todellakin, PCa solut ovat kosketuksessa eri tekijät kuten hormonit, kasvutekijät ja välittäjäaineiden, joiden ajatellaan vaikuttavan fysiologian näissä soluissa. Muun muassa kiinnostus on osoitettu, että endogeenisen katekoliamiinien noradrenaliinin ja adrenaliinin. Itse asiassa, epiteelinalaisella stroomaan eturauhasen on erityisen runsaasti autonomisen hermoston ja α

1-adrenoseptoreihin (α

1-AR). Α

1A-AR-alatyyppiä, erityisesti löytyy sileän lihaksen soluissa, mutta sen ilmentyminen on myös kuvattu epiteelisolujen [4], [5]. Α

1A-AR on superperheen jäsen G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR) välittävä toimia aiemmin mainittu katekoliamiinien erilaisia ​​soluja [6].

α

1 AR antagonisteja käytetään jo kliinisessä hoidossa eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) [7], jossa niiden terapeuttista hyötyä johtuu jonkin toiminnon α

1-AR läsnä eturauhasen sileän lihaksen soluissa [8]. Kuitenkin useat tutkimukset ovat tuottaneet todisteita ylimääräisiä vaikutuksista α

1-AR-antagonistit kuten doksatsosiini pitkäaikaisiin BPH hoitoon. Näitä aineita on osoitettu estävän eturauhasen kasvua apoptoosin indusoimiseksi strooman ja epiteelisoluissa ja ovat nousemassa mahdollisia terapeuttisia hoito ehkäisyyn ja hoitoon androgeenista riippumattoman PCa [9], [10], [11]. Lisäksi aikaisemmissa tutkimuksissa työtovereiltasi ihmisen eturauhassyövän epiteelin (hPCE) soluihin ja androgeeniriippuvaisen eturauhassyövän LNCaP osoitti fenyyliefriini (PHE), joka on α

1A-AR agonisti, stimuloi niiden leviäminen [12 ], [13]. Huolimatta näistä lupaava havaintojen toiminnallista roolia α

1A-AR androgeeni-riippumaton PCa soluja on vielä vahvistettu.

On kuvattu, että signalointi ja kaupan useita GPCR säätelevät erikoistuneet solukalvon domeenit tunnetaan lipidilauttojen [14]. Lisäksi viimeaikaiset tiedot sydänlihassolujen ovat osoittaneet, että α

1-AR sekä molekyylit mukana sen duktioreaktiotiessä kertyy kaveoleja, alaluokka kalvo mikrodomaineja [15], [16]. Kaveoleja ovat 50-100 nm pulloon muotoinen solukalvon kohtiin,, tunnettu toisaalta korkea sisältö kolesteroli ja glykosfingolipidit ja toisaalta läsnäolo caveolin-1 (CAV-1), suuret konstitutiivinen proteiinia 20-25 kD [17]. Mielenkiintoista on, että CAV-1 on liittynyt monia sairauksia, kuten ateroskleroosi ja Alzheimerin tauti [18], [19]. Mitä sen rooli syövän, on todettu, että PCA liittyy lisääntynyt CAV-1 ilme [20]. Itse asiassa tämä proteiini on tunnistettu merkki liittyy PCa etenemiseen ja hormoni tulenkestävät tauti, pelaa ratkaiseva rooli androgen-itsenäisyyttä Eturauhassyövän soluja [21]. Vaan sen yhteyttä spesifisten reseptorien ja entsyymien solukalvon, CAV-1 voi olla suora välittäjänä selviytymisen, kasvun ja etäpesäkkeiden signaaleja PCA soluissa [22].

Toistaiseksi ei paljon tiedetään mekanismeista välittäjäaineiden osallistumista selviytymisen PCa solujen, anna-alone rooli α

1A-AR androgeeni-riippumaton epiteelisolujen ja PCa etenemistä. Tässä suhteessa on houkuttelevaa yhdistää läsnäolon α

1A-AR ja CAV-1 ja oletuksen, että α

1A-AR voisi välittää

kautta

kaveoleja sen funktionaalisia vaikutuksia kasvuun tai eloonjääminen pitkälle PCa soluja.

tavoitteena työmme oli siis tutkia roolia α

1A-AR androgeeni-riippumaton PCa soluissa. Täällä me tutkimme läsnäolo α

1A-AR in kaveoleja of DU145 soluja, androgeeni-riippumaton PCa solulinja on peräisin aivojen etäpesäke. Analysoimme seuraus α

1A-AR stimulaatiota PHE reseptoriin ja CAV-1 kalvo jakelun sekä sen vaikutus lipidikoostumuk- kalvon lauttaa jakeet puhdistettu DU145 soluista. Lisäksi kuvaamme vaikutus PHE, että apoptoosin resistenssin näiden solujen aktivaation kautta ERK ja tuloksemme voimakkaasti sitä, osallistuminen kaveoleja tällä signalointireitillä. Lopuksi, immunohistofluorescence ja RT-PCR, havaitsemme positiivinen korrelaatio α

1A-AR ja CAV-1 ilmentymisen ja pitkälle PCa. Läsnäolo α

1A-AR-rikas kaveoleja voi siten edistää yleistynyt apoptoosiresistenssiin luonteenomaiset androgeenista riippumaton eturauhasen kudosta.

Methods

Soluviljely

androgeenista riippumaton ihmisen eturauhassyövän solulinja DU145, saatu American Type Culture Collection, pidettiin viljelmässä RPMI 1640-alustassa (Life Technologies, Inc), johon oli lisätty 10% (v /v) FCS: ää (Seromed, Poly-Labo, Strasbourg , Ranska), 5 mM L-glutamiinia ja 2 mM kanamysiiniä (Sigma). Soluja kasvatettiin rutiininomaisesti 50 ml: n pulloihin (Nunc, PolyLabo, Strasbourg, Ranska) 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-95% ilma-atmosfäärissä. Nämä solut muodostavat sopiva malli aivojen metastasoituneen syöpäsolujen läsnä hormoni tulenkestävät eturauhassyöpä.

Solutransfektiot ja sukupolven CAV-1 knock-down DU145 solulinja

Kaksi ready-to- käyttää siRNA vastaan ​​α

1A-AR (siADR1A, Eurogentec) transfektoitiin ohimenevästi (50 nM) kanssa HiPerfect transfektioreagenssin (Qiagen) in DU145 soluissa. Ohjaus siRNA (siCTL) Kokeet suoritettiin transfektoimalla siRNA vastaan ​​Luciferase.

siLuciferase (siCTL): 5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3 ’. siADR1A-1 (sekoitus): 5’-CAGGAAAGAUGCAGAGGA-3 ’ja 5′-UUCCUCUGCAUCUUUCCU-3’. siADR1A-2 (sekoitus): 5′-GCGUCUACGUGGUGGCCA-3 ’ja 5′-UUGGCCACCACGUAGACG-3’.

Stable solulinjat saatiin transfektoimalla DU145 solut Psuper koodaavalla lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) vastaan ​​CAV-1 (sekvenssi: CTGGAATAAGTTCAAATTCTT 2121 3’UTR) (DUshcav-1) (tai tyhjä Psuper vektorin ohjaus solulinjan, DUshCTL) käyttäen Nucleofector, kuten valmistajan suosittelema (Amaxa GmbH, Köln, Saksa). Transfektoimme 2 x 10

6 trypsiini-käsiteltyjen DU145 solujen 3 ug vektoria ja sitten käytetään transfektoitujen solujen siemeniin 24 kuoppalevylle (Nunc) erittäin alhainen tiheys. Kloonit underexpressing CAV-1 valittiin perusteella niiden antibioottiresistenssin puromycine ja vahvistanut Western Blot.

Vasta-aineet ja reagenssit

Ensisijainen käytetyt vasta immunofluoresenssilla (IF) mikroskopia ja immunoblottauksella (IB ) olivat: (1:100) kanin anti-α

1A adrenoseptori (Santa Cruz Biotechnology), (1:100) kanin anti-caveolin-1 (Santa Cruz Biotechnology), (1:50) hiiren anti-caveolin- 1 (BD transduktion Laboratories), (1:400) hiiren anti-β-aktiini (Sigma), (1:200) anti-kalneksiini (Chemicon, Millipore, Pariisi, Ranska), (1:1000) hiiren anti-sytokeratiini 18 (Chemicon, Millipore, Pariisi, Ranska), (1:1000) kanin anti-PARP (Cell Signaling), (1:100) hiiren anti-Bax (6A7) (Santa Cruz Biotechnology) tunnustaa alttiina epitooppia Bax aktivoituun konformaatio, (1:1000) kanin anti-prokaspaasi 3 (UPSTATE), (1:1000) anti-fosfo-p44 /42 MAP Kinase ja (1:1000) anti-p44 /42 MAP Kinase (Cell Signaling). Toissijainen käytetyt vasta IB olivat: (1:10000) piparjuuriperoksidaasi-kytkettyä anti-hiiri- tai anti-kani (Chemicon). IF, käytimme (1:1000) Alexa Fluor® 488-leimattua ja (1:2000) 546-leimatut sekundääriset vasta-aineet (Molecular Probes).

Soluja käsiteltiin 10 uM L-fenyyliefriinihydrokloridi (PHE ), 1 uM pratsosiini (PRA) ja 10 uM PD98059 kolme päivää (uusitaan 24 h) ja 10 uM Thapsigargin (TG) 48 tunnin ajan RPMI-väliaineessa. Lyhytaikainen PHE käsittelyt toteutettiin liuoksessa, joka sisälsi (mM): NaCl, 116; KCI, 5,6; CaCl

2, 1,8; MgCl

2, 1,2; NaHCO

3, 5; NaH

2PO

4, 1; HEPES, 20; pH 7,3. Kaikki kemialliset tuotteet toimitti Sigma paitsi TG (Alomone) ja PD98059 (Calbiochem).

Solusyklianalyysiä

Soluja kasvatettiin kolmessa 60 mm annoksia per kunnossa ja huumeet levitettiin kuvatulla edellä. Käsittelyjen jälkeen solut trypsinoitiin, kerättiin ja suspendoitiin uudelleen 0,2 ml: aan steriiliä PBS: ää. 1 ml kylmää 70% etanolia, lisättiin päälle solususpensioiden samalla vorteksoiden. Näytteet sentrifugoitiin, pestiin steriilissä PBS: ssä ja inkuboitiin sitten ribonukleaasi (2 ug /ml) 15 minuuttia. Propidiumjodidia (25 ng /ml lopullinen PBS-Triton X-100 0,1%) lisättiin sitten ja annettiin inkuboitua vielä 30 min. DNA-pitoisuus mitattiin jännittävä propidiumjodidia 488 nm: ssä ja mittaamalla emissio 520 nm: ssä (FL3) käyttäen virtaussytometriä (Beckman Coulter Epics XL4-MCL kanssa Expo32 hankkiminen). Kokeet toistettiin neljä kertaa.

Western Blot

Soluviljelyalusta heitettiin pois ja pulloja pestiin jääkylmää PBS: llä. Cellular proteiinit olivat sitten uutettiin käyttäen RIPA-puskuria [1% (v /v) Triton X-100, 1% (w /v) Na-deoksikolaatti, 150 mM NaCl ja 20 mM natrium- tai kaliumfosfaattia, pH 7,2], 5 mM EDTA: ta ja anti-proteaasien cocktail (P8340, Sigma) 30 minuuttia jäillä. Sen jälkeen kun kaavinta, mahdollinen liukenematon materiaali poistettiin sentrifugoimalla 30000 x

g

10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja proteiinin määrä arvioitiin BCA-menetelmällä (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA). Yhtä suuret määrät proteiineja tehtiin SDS /PAGE (16% geelit). Lopuksi, proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille käyttäen puolikuivaa elektro-imuri (Bio-Rad). 1 tunnin kuluttua kyllästymisen 5% rasvatonta maitoa (tai 5% BSA (naudan seerumialbumiini) vain anti-fosfo-p44 /42 MAPK), kalvoja inkuboitiin yön laimennetulla ensisijaisen vasta-aineita (katso ”Vasta-aineet ja reagenssit”). Kalvot pestiin sitten (3 x 10 min), jossa on TNT-puskurilla (15 mM Tris /HCI, pH 8, 140 mM NaCl ja 0,05% Tween 20), ja sitä käsiteltiin vastaavan piparjuuriperoksidaasiin liittyy sekundaarisia vasta-aineita (anti-hiiri- tai anti-kani, Pierce), (1:10000) laimennettuna TNT /maitoa (tai TNT /BSA), 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Usean pesun jälkeen TNT-puskurissa, kalvot käsitellä kemiluminesenssiosoitusta käyttäen Super Signal West Dura kemiluminesenssisubstraatilla (Pierce) mukaan valmistajan ohjeiden. Kalvot lopuksi altistetaan X-Omat AR kalvot (Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA). Intensiteetti signaalit arvioitiin densitometrialla ja semi-kvantitoitiin käyttäen suhdetta kunkin näytteen välillä intensiteetti kiinnostavan proteiinin jaettuna aktiini tai kalneksiini intensiteettiä. Kukin koe toistettiin ainakin kaksi kertaa.

eristäminen Pesuaine membraaneiksi (DRM) ja Dot blot

Solut huuhdeltiin, romuttaa, sentrifugoitiin ja supernatantti poistettiin. Pelletti suspendoitiin uudelleen eristäminen puskuria B (mukaan Axis-Shield S33 Application Sheet) ja homogenisoitiin Dounce homogenisaattorilla (Kontes) 15 um survin välys sentrifugoitiin sitten 10 minuutin ajan 1000 x

g

. Supernatantti, joka vastaa raakaa lipidilautan uute eristettiin ja 0,2% Triton X-100 lisättiin. Epäjatkuvan 5-vaiheessa Optiprep® (Axis-Shield PoC AS) gradientti muodostettiin puskurilla D (puskuri B + 1% Triton X-100) (w /v), jotta saadaan 1,66 ml 35%; 2,5 ml 20%; 2,5 ml 15%; 2,5 ml 10%; 0,83 ml: lla 5%. Raaka lipidilautan uute tehtiin tiheä sakkaroosia (230 mg 0,5 ml lysaattia) ja pani rajapinnassa kaltevuudet 35% ja 20%. Ultrasentrifugointinopeutta 165400 x

g

4 tuntia 4 ° C: ssa 50 Ti roottorin (Beckman Coulter) seurasi kerääminen alhaalta ylöspäin 1,1 ml: n fraktioita. 1,1 ml 20% (v /v) TCA (Trikloorietikkahappo) lisättiin kutakin fraktiota, jotta proteiinien saostamiseksi. Putket säilytetään jäissä 20 min sentrifugoitiin 10000 x

g

4 ° C: ssa 10 min. Sakka pestiin metanolilla, sentrifugoitiin sitten uudelleen suspendoitiin 4% (v /v) SDS: ää. Koska näytteitä ei ole erittäin keskittynyt proteiineja ja havaitsemista klassisen western blot oli vaikea saada, näytteet ladattiin nitroselluloosakalvolle 96-kuoppaisille Dot-Blot mukainen valmistajan ohjeiden mukaisesti (Bio-Rad). Lyhyesti, kymmenen fraktioista pipetoitiin nitroselluloosakalvolle sarjaan. Kun kuiva kalvo inkuboitiin blokkausliuoksessa 1 h (TNT /maito) hybridisoitiin haluttuja vasta-aineita seuraavia klassisen IB kuvatulla tavalla (katso ”Western Blot”). Varotoimiin vastaavasti otettu pitämään joitakin tärkeitä tekijöitä vakio käsiteltyjen ja käsittelemättömien olosuhteissa. Solutiheys kokeisiin käytetyt oli vakio, ja kun kylmä detergenttiuuton tehtiin sekä pitoisuus pesuaineen ja suhde solujen määrä /pesuaineen konsentraatio olivat samat. Kukin kuoppa ladattiin 25 ui kustakin fraktiosta. Tämä standardoitu menetelmä toistettiin vähintään kolme kertaa ja sitä käytettiin arvioimaan muutosten eristämiseen kohdemolekyylin DRM välttäen vääriä arvioita kun perustuu suhteelliset määrät suhteessa kaikkiin muihin molekyyleihin.

kvantifiointi fosfatidyylikoliini (PC) ja sfingomyeliini (SM) B

Lipidit uutettiin menetelmän mukaisesti Folchin et al. [23]. Dimyristoyylifosfatidyylikoliini (DMPC Sigma), dimyristoyylifosfatidyyliseriini (DMPS Avanti Polar Lipids), lauroylsphingomyelin (LSM Avanti Polar Lipids) käytettiin sisäisinä standardeina. Fosfolipidi-analyysi suoritettiin Hypersil Si 2 x 200 mm: n kolonni (Agilent Technologies, Massy, ​​Ranska) seuraavan protokollan [24]. Positiivinen ESI-MS suoritettiin MSD 1100 Mass Spectrometer (Agilent Technologies). Aukon jännite asetettiin 120 V, kapillaarin jännite 3,5 kV, kuivaus- kaasu (typpi) virtaus 8 l /min ja skannaus välillä m /z 400 950. Integroitu huippu olivat poimituista Ion Kromatogrammit (EIC) m /z = 700-950 retentioajan (RT) PC, PS, SM jaettiin EIC m /z = 679 at RT DMPC, m /z = 681 at RT on DMPS tai m /z = 647 at RT LSM. -Tasot määritettiin vertaamalla tämän suhteen kanssa standardikäyrän tunnettuja määriä fosfatidyylikoliinia ja sfingomyeliinin.

kvantifiointi Kolesteroli

Extraction ja saippuointi suoritettiin mukaisesti edellä kuvatun mukaisesti [25], jossa joitakin muutoksia. Kvantifiointi kolesterolin suoritettiin käyttäen HP6890 kaasukromatografilla varustettu HP7683 Suutin ja HP5973 Mass Selective Detector (Agilent Technologies). Kromatografia suoritetaan käyttäen HP-5MS kvartsilasikapillaarikolonnissa (30 m x 0,25 mm sisähalkaisija, 0,25 um kalvon paksuus, Agilent Technologies). Valittu ioni-seurantaohjelma käytettiin massaspektrometriaa. Ionit käytetty analyysi (m /z) olivat seuraavat: epikoprostanolia, 370; kolesteroli, 368. kalibrointikäyrät saatiin analysoimalla standardit valmistetaan aitoja standardeja (Steraloids) ja uutetaan käytetty menetelmä näytteitä.

Edellä kvantifiointi protokollia lipidien ja kolesterolin toistettiin kolme kertaa kolmen yksittäisen kokeita ei-käsiteltyjen (kontrolli) ja käsiteltiin DU145 solut PHE 10 min. Koska määrät lipidien ja kolesterolin määrällisesti kussakin fraktiossa (ng /ml tai ug /ml) vaihtelivat hieman joukossa kokeita, tulokset normalisoitiin määrittämällä keskiarvoja kolmesta kokeesta edustaa prosenttiosuus lipidien ja kolesterolin kussakin fraktiossa hallinnassa olosuhteissa verrattuna PHE-käsitelty olosuhteissa.

solukalvon ”Rip Off”

Tämä menetelmä perustui julkaistun protokollan [26]. Soluja kasvatettiin lasipeitinlevyille. Formvar® kuparisten verkkojen (mukaan [27]) päällystettiin polylysiini. Peitelaseja sijoitettu solun alaspäin päälle verkot ja lievää aiheuttaisivat käyttämällä kumitulpan sitten peitelaseja käännetään ja verkot huolellisesti irrallaan kiinnitettiin sitten 8% (v /v) PFA (paraformaldehydi). Pesun jälkeen PBS: ssä ja kylläisyyttä PBS /2,5 mM glysiini /aasi seerumin immunoleimaus suoritettiin standardimenetelmillä käyttämällä ensisijaista vasta sen jälkeen lajispesifinen anti-IgG kulta konjugaatteja 6 nm, 12 nm ja 18 nm. Lopuksi hilat vastakkain ja valmis havainto on Hitachi H-600 siirto elektronimikroskoopilla (suurennus x 20000) 75 kV.

Ultrastructural Microscopy

transmissioelektronimikroskopiaa, Solut kiinnitettiin 2,5% glutaraldehydiä valmistettu 0,1 M kakodylaattipuskurissa ja jälkifiksattiin 1% osmiumtetroksidilla samassa puskurissa. Sen jälkeen asetonitriiliä kuivuminen, pelletti upotettiin Epon. Serial ohuita leikkeitä (90 nm) leikattiin käyttäen Reichert Ultracut E ultramikrotomilla ja kerätään 150 mesh kuusikulmainen vanhentunut kuparia ristikot. Värjäyksen jälkeen 2% uranyyliasetaatilla valmistettiin 50% etanolia ja inkuboimalla johtaa sitraattiliuosta, osat havaittiin Hitachi H-600 transmissioelektronimikroskoopilla.

epäsuoralla immunofluoresenssilla

Resektio BPH yksilöt ihmisen eturauhasen jäädytettiin nestetypessä jäähdytettiin isopentaani ja pidetään ”Tissue-Tek®” -80 ° C: ssa ennen 10 um: n leikkeitä valmistettiin -20 ° C: ssa, säädetty asetettiin lasilevyille ja eteni IF tutkimuksessa. Normaali ja syöpä- eturauhaskudoksiin toimitti kudos-array dioja (SuperBioChips Laboratories), parafiini poistettiin mukaan valmistajan merkintöjä (Cliniscience) ennen valmistelu IF mukaan [28]. Lyhyesti, kaikki levyt blokattiin 30 min aikana PBS /1,2% (v /v) gelatiinia inkuboidaan sitten halutun primaarisilla vasta-aineilla 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa jälkeen sekundääriset vasta-aineet (1 h, 37 ° C). Kuvaus suoritettiin käyttämällä Zeiss LSM 510 confocal pään (Carl Zeiss) liitettynä Zeiss Axiovert 200 M mikroskoopilla x 40 öljy-upotus objektiivilinssin (numeerinen aukko 1,45). Dioja skannattiin käyttäen argonioni laser ja helium /neon-ioni laser. Kaikki skannausparametrejä pidettiin vakiona koko eri kokeissa. AIM 3,2 konfokaalimikroskoopilla ohjelmisto (Carl Zeiss) käytettiin tiedonkeruu ja analyysi.

RT-PCR

Käänteinen transkriptio-PCR suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [29]. 178 pb α

1A-AR isoformi 1 amplikonin monistettiin 5′- AGACCAATCCTCCTGTACCAC-3 ’(eteenpäin) ja 5′-CTCTGCATCTTTCATGTCCTAG-3′ (reverse). 220 pb CAV-1 amplikoni monistettiin 5’- AGTGCTCCTGTTCTCCCTTC-3 ’(eteenpäin) ja 5′-CTTGTCGATGGCTTCCTTCAC-3′ (taaksepäin) (Eurogentec). 236 pb GAPDH amplikonia sisäisen valvonnan monistettiin 5’- TTCACCACCATGGAGAAGGC-3 ’(eteenpäin) ja 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3′ (reverse). 241 pb sytokeratiinia 18 amplikonin monistettiin 5’- TGAGTCAGAGCTGGCACAGA-3 ’(eteenpäin) ja 5′-TGGTGTCATTGGTCTCAGACA-3′ (reverse). Lopuksi 210 pb sytokeratiini 14 amplikonin monistettiin 5’- TGCGAGATGGAGCAGCAGAA-3 ’(eteenpäin) ja 5′-TGCCATCGTGCACATCCATGA-3’ (reverse). α

1A-AR, CAV-1, sytokeratiini 14 ja 18 mRNA ilmaisuja todensi geeli tiheys analyysi käyttämällä GAPDH mRNA sisäisenä kontrollina.

Human Tissue yksilöitä

Human BPH koepaloja saatiin suostuu potilaista, joille on paikallisten eettisten näkökohdat. Kaikki kokeet, joissa potilaan kudokset suoritettiin hyväksynnän numero ”CP 01/33”, jonka antaa ”Comité Consultatif de Protection des personnes dans la Recherche Biomédicale de Lille”.

Tilastollinen

tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen paritonta

t

testit (vertaamiseksi kaksi ryhmää) tai varianssianalyysi testien seurasi Dunnettin (useita ohjaus

versus

testi vertailut). Eroja pidettiin merkittävinä, kun

p

0,05 (*),

p

0,01 (**) ja

p

0,001 (***).

Tulokset

α

1A-AR liittyy CAV-1 klo DU145 solun pinnalla

Aikaisemmat tutkimukset ovat kuvattu suoran vuorovaikutuksen α

1A AR CAV-1 [15]. Lisäksi α

1A-AR signalointi tiedetään paikallistaa kaveoleja [14], [30]. Tutkia kalvo topologia α

1A-AR, käytimme ”rip-off” tekniikka kehitettiin tarttuvien solujen mahdollistaa eristämistä ja havainnon elektronimikroskoopilla laajoilla alueilla solukalvon [26]. α

1A-AR immunokulta värjäytymistä (6 nm pisteillä, musta nuolenkärki) colocalizes CAV-1 (18 nm pisteitä, valkoinen nuolenkärki) in solukalvon mikrodomaineja noin 50-100 nm (kuvio 1).

plasmamembraanit ”repäisi-off” kuvatulla tavalla ”menetelmät” -kappaleessa ja inkuboitiin anti-CAV-1 ja anti-α

1A-AR-vasta-aineita. Toissijainen vasta yhdistettynä 6 nm ja 18 nm: n kulta hiukkasia käytettiin vastaisesta α

1A-AR (musta nuolenkärki) ja anti-CAV-1 (valkoinen nuolenkärki) vastaavasti. Ristikot Sitten käsitelty elektronimikroskoopilla havainto. Rinnakkaispaikantumisen Molempien proteiinien on merkitty piireissä. Bar, 200 nm.

Plasmamembraanin proteiinia uudelleenjako ja lipidien koostumus muutoksia DRM jakeet aiheuttama fenyyliefriini

analyysi solukalvon mikrodomaineja, kaveoleja tai lipidilautan koostumus tyypillisesti alkaa pesuaineella liukenemisen kokonaisten solujen seuraa tiheysgradienttisentrifugaatiolla ja talteenotto DRM kevyiden jakeiden kaltevuus. Olemme tutkineet yhdistyksen α

1A-AR puhdistetulla DRM DU145 koko solukalvouutteet koskevasta OptiPrep® tiheysgradientilla. Karakterisointiin DRM jakeet, kun läsnä on erityisiä plasmamembraanin markkeri pan kadheriinin arvioitiin aluksi positiivisena kontrollina (kuvio 2A, a). Läsnäolo kaikilla 10 Puhdistetut fraktiot osoittaa, että yksittäinen DRM jakeet vastaavat solukalvon alueille. Lisäksi ydinvoiman proteiini PCNA (leviämisen solun tuma-antigeenin) ja mitokondrioiden proteiini Bax käytettiin negatiivisina kontrolleina kun ne ovat tiedossa ei yhdistää solukalvon. Poissaolollaan DRM jakeet vahvistaa ilman saastuminen solunsisäisiä kalvoja (kuvio 2A, a).

(A) DRM murto kasvaa tiheyden (fraktiosta 1 ja 10) saatu mainittuja ”Menetelmät” -kappaleessa ja analysoitiin Dot blot. (A) Pan kadheriinin käytettiin positiivisena kontrollina vahvistetaan, että saaduista fraktioista vastaavat solukalvon. PCNA (leviämisen solun tuma-antigeenin) ja Bax käytettiin negatiivisina kontrolleina, niiden puuttuminen vahvistaa ei-saastuminen DRM jakeet solunsisäisten proteiinien tiedetään liittyvän lautat. (B) Dot blot DRM fraktionkeräyksellä hallita kunnossa (CTL) ja 10 min käsittely 10 uM fenyyliefriinillä (PHE). Purinerginen reseptori P2Y2- käytettiin negatiivisena kontrollina spesifisyyden vaikutusta fenyyliefriini proteiinien uudelleenjako murto. Musta suorakulmio merkitsee muutos α

1A-AR, CAV-1 ja Ga

Q11 proteiinin vaaleammaksi tiheyteen jakeet. (B) Lipid koostumus 10 fraktioiden kvantitoitiin kuten on kuvattu ”Menetelmät” -kappaleessa valvonta (musta pylväs) ja PHE käsiteltyjen solujen (harmaa pylväät) ja (a) lysofosfatidyylikoliinin (LPC), (b) fosfatidyylikoliini (PC), (c) sfingomyeliini (SM), (d) kolesterolia. Virhepalkit edustavat SEM laskettiin kolmen erillisen kokeen. Tilastollinen analyysi käyttää

t

testi; *,

p

0,05, **,

p

0,01 ja ***,

p

0,001.

sen määrittämiseksi, onko ennalta määritelty mikrodomaineja osallistuvat α

1A-AR signalointireitin vuonna DU145 soluissa, tutkimme α

1A-AR stimulaatiota sen erityisen agonistin fenyyliefriini (PHE). Dot blot-analyysi DRM jakeet paljasti jakelun CAV-1 harvaan asutuilla kaltevuus (5% -20%) jakeet 1-6 ja α

1A-AR fraktioihin 1 ja 3-6 valvonta (CTL) olosuhteissa. 10 minuutin kuluttua hoidon 10 uM PHE CAV-1 jakautuminen havaittiin alhaisen tiheyden gradientti (5% -10%) jakeet 1-5 ja α

1A-AR oli nyt havaittiin kaikissa fraktioissa 1-6 (mukaan lukien alhaisen tiheyden jae 2) (kuvio 2A, b, yläpaneeli CTL alempi paneeli PHE). Tärkeää on, Ga

Q11 (an α

1A-AR efektori) sisältö osoitti siirtyminen jakeet 4-5 jakeet 1-5 jälkeen PHE hoidon ja kuitenkin olla suurempi tiheys jakeet, mikä viittaa siihen, että reseptorin aktivoituminen ei liity kaikki Ga

Q11 proteiinien läsnä kalvon tasolla. Olemme myös arvioinut purinerginen reseptoria P2Y2- käytettiin negatiivisena kontrollina spesifisyyden muutoksen proteiinin jakeluun aiheuttama PHE. α

1A-AR ja P2Y2 ovat molemmat GPCR samankaltaisten signalointireitteihin. P2Y2 sijaitsee samassa jakeet, onko DU145-soluja käsiteltiin tai ei (kuvio 2A, b, CTL ja PHE), siis osoittaa spesifisyyden aikaisemmin havaittu PHE-indusoidun muunnetun proteiinin jakeluun.

Lisäksi, olimme kiinnostunut lipidikoostumus puhdistetun DRM fraktioita. Lipidejä tiedetään rikastettu biologisessa lipidilauttoihin, kuten lysofosfatidyylikoliini (LPC), sfingomyeliini (SM), fosfatidyylikoliini (PC) ja kolesterolia [31], [32], analysoitiin. Jälleen kerran, tutkimme mahdolliset korjauksilla lipidikoostumuk- DRM jakeet jälkeen PHE stimulaation. Meidän havainnot osoittavat merkittävää kasvua määrät näiden lipidien pääasiassa alhaisen tiheyden gradientti (5% -10%), fraktioita 1-5 seurauksena PHE stimulaation (kuvio 2B, a, b, c, d). Nämä tulokset ovat yhtä mieltä tunnustettu tosiasia, että paljon lipidejä pitoisuus aiheuttaa kelluva rasva mikrodomaineja harvaan asutuilla jakeet sentrifugoinnin aikana. Aiemmin julkaistut tiedot rasva malli järjestelmissä osoittavat, että koko Lipidilauttojen riippuu lipidien kalvokoostumusta [33], [34]. Havaitut muutokset Lipidikoostumusten johtuen kalvo uudelleenjärjestely voi selittää kevyempiä tiheyden mikrodomaineja tuloksena uudelleenjaon α

1A-AR, CAV-1 ja Gαq

11 havaita DRM jakeet.

Protein ja lipidien uudelleenjärjestely aiheuttamien fenyyliefriini liittyy CAV-1-rikas kalvo klusterointi

on ajateltu, että kun solunulkoinen ärsyke, solukalvon on varautunut muodostumista vakaammaksi verkkotunnuksia ja molekyyliklusterit tiiviimmän koon ja eliniän kuten kaveoleja [35], [36]. Jotta ymmärtäisimme osallistumista kaveoleja että α

1A-AR signalointi, selvitimme vaikutus PHE stimulaation DU145 solun pinnan morfologia (kuvio 3A). Solut, joita oli käsitelty 10 minuuttia 10 uM PHE liittyy lukuisia pinnan kohtiin, jotka vastaavat kaveoleja (kuvio 3A, b) verrattuna ei-käsitellyissä soluissa (kuvio 3A, a). Kaveoleja ovat havaittavasti pyöreitä profiileja yhtenäinen muoto ja 50-80 nm halkaisijaltaan. Tässä edustaja elektronimikrokuvasta kaveoleja ovat läsnä yhtenä kuoppia (kuvio 3A, b, mustat nuolenpäät) ja joskus monimutkaisempia järjestelyjä yhdistetty soluliman caveolar profiileja (kuvio 3A, b, valkoinen nuolenkärjet).

(A) edustavia elektronimikroskoopilla DU145 solujen (a) käsittelemätön ehto (b) jälkeen 10 min käsittely 10 uM PHE. Kaveoleja ja caveolin sisältävien rakkuloiden 50-80 nm halkaisijaltaan ovat tiheä elektroneja on merkitty mustalla nuolenpäitä. Valkoinen arrowheads osoittavat monimutkainen muotoinen kaveoleja.