Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpäsolut aktivoivat biosynteesiä tyydyttyneiden rasvahappojen (SFA) ja kertatyydyttymättömiä rasvahappoja (MUFA) ylläpitääkseen kasvava kysyntä fosfolipidejä sopivilla asyyli koostumus aikana solunjakautumista. Olemme aiemmin osoittaneet, että vakaa knockdovvn stearoyl-CoA-desaturaasi 1 (Scd1), tärkein Δ9-desaturaasi, joka muuntaa SFA osaksi MUFA, syöpäsoluissa hidastaa lipogeneesiin, vähentää proliferaatiota ja in vitro invasiivisuus, ja dramaattisesti heikentää kasvainten muodostumiseen ja kasvua. Kirjoittajat raportoivat, että farmakologinen esto Scd1 jolla oli uusi pieni molekyyli syöpäsoluissa edistänyt aktivoituminen AMP-aktivoitu kinaasi (AMPK) ja edelleen alentamiseen CoA boksylaasia toimintaa, joiden samanaikainen estäminen glukoosi-välitteisen rasvanmuodostukseen. Farmakologinen esto AMPK laskivat edelleen leviämisen Scd1-köyhdytettyä soluissa, kun taas AMPK aktivointi palautettu leviämisen kontrolloida tasolle. Lisääminen supraphysiological glukoosin tai pyruvaatti, lopputuote Glykolyysivaiheen, eivät muuttaneet sitä alhainen leviämisen määrä Scd1-ablatoitu syöpäsoluja. Tuloksemme viittaavat siihen, että syöpäsolut vaativat aktiivista Scd1 kontrolloimaan nopeutta, glukoosi-välitteisen lipogeneesi, ja että kun Scd1 toiminta on heikentynyt solujen downregulate SFA synteesin kautta AMPK-välitteisen inaktivoinnin asetyyli-CoA-karboksylaasi, mikä estää haitallisten vaikutusten SFA kertymistä.

Citation: Scaglia N, Chisholm JW, Igal RA (2009) esto StearoylCoA desaturaasia 1 inaktivoi asetyyli-CoA Carboxylase ja heikentää leviämisen syöpäsoluissa: rooli AMPK. PLoS ONE 4 (8): e6812. doi: 10,1371 /journal.pone.0006812

Editor: Marcelo Bonini, National Institutes of Health (NIH) /National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS), Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 toukokuu 2009; Hyväksytty: 04 elokuu 2009; Julkaistu: 27 elokuu 2009

Copyright: © 2009 Scaglia et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Charles ja Joanna Busch Foundation ja SEBS /NJAES, Rutgers University. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpäsolut näyttää radikaalisti muutettu aineenvaihdunta, joka edistää heidän jatkuvaa lisääntymistä. Osana metabolisen siirtymistä makromolekyyliyhdisteiden synteesiä tukemaan solunjakautumista, syöpäsolut aktivoivat biosynteesiä tyydyttyneiden rasvahappojen (SFA) ja kertatyydyttymättömiä rasvahappoja (MUFA) ylläpitämään kasvava kysyntä fosfolipidejä asianmukaisten asyyli koostumuksen kalvon biogeneesin. Näin ollen, useita kriittisiä entsyymejä, jotka osallistuvat de novo rasvahappojen synteesi on osoitettu yliekspressoituvan pahanlaatuisten solujen ATP-sitraattilyaasi, tarvitaan tuotettaessa sytosolin CoA [1], asetyyli-CoA-karboksylaasi (ACC), entsyymiä, joka katalysoi synteesi ja malonylCoA, ensimmäinen sitoutunut askel rasvahappojen synteesiä [2], [3], ja rasvahappo-syntaasi (FAS), joka syntetisoi SFA [2]. On tärkeää rasvahappojen synteesi syöpäsolujen proliferaatiota ja eloonjäämistä on korostettu sitä, että esto tahansa näiden entsyymien johtaa pysähtymiseen solujen proliferaatio ja lisääntynyt solukuolema [4] – [9]. Kuitenkin, huolimatta yliaktivoituminen tandem biosynteettisten entsyymien lopulta tekee SFA, runsasta MUFA tavataan tyypillisesti syöpäsoluja [10] – [13], mikä viittaa siihen, että biosynteesi MUFA on varmistettava syöpäsolujen lisääntymistä ja selviytymisen.

Mammalian stearoylCoA desaturaaseihin (SCD) ovat mikrosomaalisia entsyymejä, jotka katalysoivat Δ9-desaturaatio kyllästettyä acylCoAs muodostamiseksi tyydyttymättömiä johdannaisia ​​[14]. Ilmaus Scd1, pääasiassa SCD isoformia, on lisääntynyt monissa ihmisen syövissä, kemiallisesti aiheutettujen kasvaimien, samoin kuin onkogeenin-transformoiduissa soluissa [1], [13], [15] – [18]. Olemme osoittaneet, että Scd1 moduloi ei ainoastaan ​​sisällön MUFA syöpäsoluissa, mutta myös koko prosessin lipogeneesin [19]. Merkillistä, ablaatio Scd1 ilmaisun vähentää syöpäsolujen lisääntymistä ja in vitro invasiivisuus, ja dramaattisesti heikentää kasvainten muodostumista ja kasvua [19], [20]. Olemme myös havainneet, että aktiivinen Scd1 voidaan tarvita neoplastisten solujen hengissä lipotoxic stressiä, koska Scd1 pudotus kasvaa pohjapinta apoptoosin ja herkistää solut sytotoksisille vaikutuksille yli SFA [19]. Scd1 on myös todettu peräisin siRNA kirjastosta geeni, jonka tukahduttaminen heikentää ihmisen syöpäsolu selviytymisen, mikä edelleen tukee välillä on toiminnallinen yhteys Scd1 ja syöpäsolujen kasvua [21]. Huolimatta tämä kasvava määrä tietoa, monimutkainen mekanismeja, joilla Scd1 samanaikaisesti moduloi lipidiaineenvaihdunnan ja biologisia ominaisuuksia syöpäsolujen eivät ole tiedossa.

Prosessi lipogeneesiä nisäkässoluissa säätelevät Akt ja AMP- riippuvainen proteiinikinaasi (AMPK), kaksi suurta signalointi proteiineja, jotka ohjaavat useita kriittisiä biosynteettisiä ja catabolic reaktiot. Akt on voimakas indusoija glukoosi-välitteisen lipogeneesiä syöpäsoluissa, pääasiassa säätelemällä ja transkription useiden entsyymien glykolyysin ja rasvahappojen synteesiin [22], [23]. Osana silmukka, aktiivisuus Akt moduloidaan tasot FAS ja Scd1. Havaittiin, että saarto FAS aktiivisuuden ja ablaatio Scd1 ilmaisun lasku Akt fosforylaation ja aktiivisuutta syöpäsoluissa [20], [24]. Sen sijaan, AMPK aktivointi fosforylaatio edistää downregulation useiden lipogeeniset reittejä ja aktivoi energiaa toimittaa reaktiot, kuten rasvahappojen hapettumista [25]. Yksi tärkeä tavoite on aktivoitu AMPK on ACC. Kun fosforylaatiota AMPK, ACC aktiivisuus on vähentynyt johtaa inhibitioon de novo rasvahappojen synteesiin [26]. Samanaikainen vähentäminen malonylCoA tasoilla edistää β-rasvahappojen hapettumista. SFA ovat myös tehokkaita allosteerinen estäjiä ACC, antaa negatiivisen takaisinkytkentäsilmukan rasvahapon biosynteesiä [27] – [29]. Oletamme, että kohonnut Scd1, muuntamalla SFA ja MUFA, pystyy ylläpitämään polulla rasvahapposynteesissä ja rasvansynnyn täysin aktivoitu. Tämä ehto suosii syöpäsolujen kasvua ja proliferaatiota, näin vähentäen Scd1 toiminnan pitäisi heikentää näiden kahden biologisia prosesseja.

Viime aikoina useat sarja uusia Δ9-desaturaasi selektiivinen pienimolekyylinen inhibiittoreita on julkaistu [30] – [32] . Yksi näistä SCD-inhibiittorit, CVT-11127 (N- (2- (6- (3,4-diklooribentsyyliamino) -2- (4-metoksifenyyli) -3-oksopyrido [2,3-b] pyratsin-4 (3H) -yyli) etyyli) asetamidi), on tehokas ja spesifinen estäjä rotan mikrosomaalisia ja HepG2 solu Δ9-desaturation [30], ja ne voivat olla mahdollinen arvokas väline opiskelun säätelyyn solujen aineenvaihduntaa ja signalointireitteihin mukaan Scd1 aktiivisuutta.

meidän nykyiset tutkimukset, osoitamme, että akuutti inhibitio Scd1 toimintaa CVT-11127, sekä krooninen puutos Scd1 vakaa geeni knockdown, huomattavan haitallinen de novo rasvahappojen synteesi glukoosista ihmisen keuhkokarsinooma soluja. Olemme myös ilmoittaa, että farmakologinen esto SCD aktiivisuuden rajusti soluproliferaation syöpäsoluissa, joka vahvistaa, että Scd1 toiminta on kriittinen vaatimus syöpäsolujen kasvua. Lisäksi havaitsimme, että saarto Scd1 aktivoitu AMPK ja inaktivoitu ACC mikä laski rasvanmuodostukseen. Koeolosuhteissa, jotka indusoivat lipogeneesiin, kuten stimulaatio ACC sitraatti ja esto AMPK, edelleen lasku soluproliferaatiokokeessa havaittiin Scd1-vajaiden solujen. Sitä vastoin farmakologisen aktivaation AMPK päinvastaiseksi soluproliferaation tasoa kontrollien tasoihin. Kokonaisuutena tuloksemme viittaavat siihen, että downregulation rasvahapposynteesissä kun Scd1 aktiivisuus on alhainen voi olla mukautuva suojamekanismi estää haitalliset vaikutukset ylimääräisen SFA kun sen muuntaminen MUFA on heikentynyt. Lisäksi nämä tulokset korostavat Scd1 säätelyssä neoplastisten lisääntymistä ja aineenvaihduntaa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

A549 ihmisen keuhko- adenokarsinoomasolua ja WS-1 ihmisen fibroblasteja hankittiin American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). H1299 ihmisen keuhkosyövän soluja ja ihmisen MCF-7 rintasyövän solut jalomielinen lahjoitus tohtori C. S. Yang ja tri Wendie Cohick, Rutgers University, NJ, vastaavasti. Dulbeccon modifioituun Eaglen väliainetta (DMEM), jossa L-glutamiinia, MEM-vitamiinin seoksen, ja MEM-välttämätön aminohappo liuos olivat Mediatech Cellgro (Manassas, VA, USA). Minimum Essential Medium (MEM), joka sisältää Earlen suoloja ja L-glutamiinia, glukoosia DMEM: ää, fenolipunaista MEM, trypsiini-EDTA-liuoksella ja Lipofectamine ™ 2000 transfektioreagenssia ostettiin Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA). Lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, kristalliviolettia, proteaasi ja fosfataasi-inhibiittori cocktail 2, rasvahapotonta naudan seerumin albumiinia, monoklonaalinen anti β-aktiini-vasta-aine, AICAR, koentsyymi A, ATP, NADH: n ja dimetyylisulfoksidi (DMSO), olivat Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Nitroselluloosakalvolle, HPLC-laatu liuottimet, fosfaattipuskuroitu liuos ilman kalsiumia ja magnesiumia ja muita soluviljelmä tarvikkeita saatiin Thermo Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA). Anti fosfo-AMPKα (Thr172) ja fosfo-ACC (Ser79) vasta-aineet saatiin Cell Signaling Technology Inc (Danvers, MA, USA). HRP-konjugoitu anti-hiiri ja anti kaniinin IgG oli Santa Cruz Biotekniikka (Santa Cruz, CA, USA). D- [U

14C] glukoosi, [1-

14C] steariinihappo ja [1-

14C] natriumasetaattia hankittiin American Radiolabeled Chemicals, Inc. (St. Louis, MO, USA ). [Metyyli-

3H] tymidiinillä, [2-

3H] deoksiglukoosilla ja täyden valikoiman Rainbow molekyylipainomarkkeri oli GE Healthcare Bio-Sciences Corp (Piscataway, NJ, USA). Lactate iinianalyysikitissä oli Eton Biosystems Inc (San Diego, CA, USA). BCA Bradford proteiinin iinianalyysikitissä ja super signaalin West pico kemiluminesenssisubstraatilla olivat Pierce (Rockford, IL, USA). Yhdiste C: ssa oli peräisin Calbiochem (San Diego, CA, USA).

Soluviljely

WS-1, A549 ja MCF-7-soluja viljeltiin MEM ja H1299, H460 ja MDA-MB -231-soluja kasvatettiin DMEM: ssä. Media oli täydennetty 10% FBS: ää, penisilliiniä (100 U /ml), streptomysiiniä (10 ug /ml), 1% ei olennaisia ​​aminohappoja ja 1% MEM-vitamiinin liuosta (kasvualusta). Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2, ja 100%: n kosteudessa.

Cell malleja Scd1 inhibition

transfektoitu stabiilisti klonaalisen populaation A549-soluja, joissa antisense-sekvenssi ihmisen Scd1 geenin (hSCDas) on kuvattu aiemmin [20]. Lisäksi farmakologinen inhibitio SCD aktiivisuus arvioitiin, joilla on uusia kemiallisia SCD-estäjä CVT-11127 (N- (2- (6- (3,4-diklooribentsyyliamino) -2- (4-metoksifenyyli) -3-oksopyrido [2, 3-b] pyratsin-4 (3H) -yyli) etyyli) asetamidi), jonka synteesi ja rakenne on kuvattu muualla [30]. CVT-11127 käytettiin pitoisuuksina, jossa esto Scd1 oli suurempi kuin 95%. Yhteenlaskettu itämisaika aikaa SCD estäjän oli ainakin 24 tuntia, jotta yhden solupopulaation kaksinkertaistamista.

SCD aktiivisuutta ja de novo rasvahapposynteesissä

Δ9 desaturaasiaktiivisuutta kokonaan solut määritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [19]. Lyhyesti, subkonfluenteista yksisolukerrokset inkuboitiin määritetyn pitoisuuden SCD estäjän tai DMSO ajoneuvon kasvualustoja 24 tuntia. Kuusi tuntia ennen sadonkorjuuta, soluja pulssitettiin [

14C] steariinihappoa (0,25 uCi /60 mm petrimaljaan) viljelyalustassa, joka sisälsi 0,5% naudan seerumialbumiinia. Solun totaali-lipidit uutettiin mukainen Bligh Dyer [33] ja transesteröidään BF

3 metanolissa 3 h 64 ° C: ssa typpi-ilmakehässä. Metyyliesterit erotettiin argentation ohutkerroskromatografialla (TLC) kuvatun menetelmän Wilson ja Sargent [34], käyttäen liuotinta faasi koostui heksaani: etyylieetteriä (90:10, tilavuus). Radioleimattu steariini- ja öljyhappoa detektoitiin Storm skannerin (Molecular Dynamics), ja sen optinen tiheys kvantifioidaan Imagequant ohjelmisto. De novo rasvahappojen synteesiin, soluja inkuboitiin 6-24 h [U

14C] glukoosia tai 24 h [

14C] natriumasetaatin läsnä ollessa tai poissa ollessa SCD estäjä. Cellular lipidejä uutettiin kuvatulla ja määrä [

14C] merkkiaineen osaksi lipidejä normalisoitiin solun sisällön kasvatettujen solujen rinnakkain petrimaljoihin. Alikvootit [

14C] glukoosi-leimattu solujen lipidit esteröity ja tasot radioaktiivisesti SFA ja MUFA määritettiin TLC: llä kuten edellä on kuvattu.

määritys glukoosin oton

Preconfluent H1299-soluja inkuboitiin 1 uM CVT-11127 tai ajoneuvon glukoosiköyhissä DMEM: ssa 24 tuntia. Cell sitten pulssitettiin 7 minuuttia 0,5 uCi /astia [

3H] deoksiglukoosilla DMEM, joka sisälsi 0,5% BSA, 25 uM HEPES ja 100 uM glukoosia. Leimattu väliaine poistettiin nopeasti ja jäljellä merkintöjä yksisolukerrokset poistettiin pesemällä kolme kertaa jääkylmällä PBS: llä. Yhteensä radioaktiivisuus soluhomogenaattien laskettiin tuikelaskijalla ja [

3H] DPM normalisoitiin solun proteiinipitoisuus.

Solun kokonais-rasvahappokoostumus

Yhteensä solulipideistä A549 ja H460 syöpäsolut käsiteltiin 10 uM tai 1 uM CVT-11127, vastaavasti, tai ajoneuvon 24 h uutettiin, kuten edellä on kuvattu. Margariinihappo (C17: 0) lisättiin sisäinen standardi alussa lipidin uuttamista. Transesteröinti ja metylaatio rasvahappojen lipidejä suoritettiin, kuten ovat kuvanneet Lepage ja Roy [35]. Rasvahapon metyyliesteriä koostumus määritettiin kaasukromatografisesti käyttäen Varian 3800 GC (Varian Inc., Palo Aito, CA), joka oli varustettu DB-23-pylvästä (J W Scientific Inc., Folsom, CA) ja FID. Rasvahapon metyyliesteriä tunnistaminen ja vastetekijät määritettiin käyttämällä standardia seoksia (NuChek Prep Inc., Elysian, MN). Kromatogrammin piikit tunnistettiin vertaamalla niiden retentioaikojen kanssa puhdasta rasvahapon standardeja ja prosenttia jakelu laskettiin.

[

3 H] tymidiinin soluun DNA

nopeus DNA synteesi arvioitiin määrittämällä tasot [

3H] tymidiinin yhdistyminen DNA: han, kun pulssittamalla solut radioleimatun merkkiaineen 2 h, mitä seurasi saostaminen kokonais-DNA ja tuikelaskennalla, kuten kuvataan [36]. Ryhmiä soluja inkuboitiin glukoosin DMEM: täydennetty eri pitoisuuksia glukoosia 22 tuntia ennen lisäystä [

3H] tymidiiniä. Muissa kokeissa, kasvualustat oli täydennetty 10 mM natriumpyruvaattia tai natriumsitraattia 22 tuntia. Sillä SCD esto, CVT-11127 lisättiin ilmoitettuun annoksia kasvualustoja 22 tuntia ennen merkintöjä ajan. Kaikissa tapauksissa koko inkuboinnin ajan kanssa aineenvaihduntatuotteiden tai inhibiittori oli 24 h.

määritys solun kasvukäyrät

Solut siirrostettiin 12-kuoppaisille levyille (14000 solua per kuoppa). Kaksikymmentä neljä tuntia myöhemmin, yksisolukerrokset huuhdeltiin PBS: lla ja ryhmien soluja inkuboitiin 0,5 tai 5,5 mM glukoosia kasvualustoja. Kasvualusta vaihdettiin joka 48. h sen jälkeen. Joitakin kokeita, soluja inkuboitiin 24 h ja 48 h: n kasvavilla pitoisuuksilla natriumoleaatti jopa 100 uM. Solujen lisääntyminen arvioitiin kristallivioletilla värjäämällä kuvatun menettelyn mukaan Menna et al. [37], muutoksin. Lyhyesti, solut kiinnitettiin metanolilla, värjättiin 0,1% kristallivioletilla tislattuun veteen ja huuhdottiin kolme kertaa vedellä. Väriaineen värjäytyneiden solujen liuotettiin 10% metanolia, 5% etikkahappoliuos ja kvantitoitiin spektrofotometrillä 580 nm: ssä. Arvo tyhjän hyvin vähennettiin kussakin tapauksessa. Arvot eri ajankohtina normalisoituivat tiedot 24 tunnin kuluttua kylvö vältetään erot johtuvat erot soluadheesion tehokkuutta tai solukuolemaan.

Lactate mittaus

määrittämiseksi laktaatin , 9 x 10

4-solut ympättiin 6-kuoppalevyille ja kasvatettiin, kunnes yksisolukerrokset saavutti 80% konfluenssin. Sitten solut huuhdeltiin PBS: llä ja kasvatettiin 10% FBS: ää, fenoli-MEM: ssä, jossa konsentraatiot SCD estäjän tai ajoneuvon 24 tuntia. Joitakin määrityksiä, solujen käynnissä salpaus SCD toiminnan inkuboitiin 10 mM natriumsitraattia 24 h. Sisällön laktaatin elatusaine kvantifioitiin laktaatti määritys (Eton Biosciences Inc), mukaisesti valmistajan ohjeiden ja normalisoitiin solun kokonaisproteiinista.

immunoblottauksella

Preconfluent soluja käsiteltiin kuten on kuvattu, huuhdottiin jääkylmällä PBS: llä, raaputetaan kylmässä hypotonisessa lyysipuskuria (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 10 mM NaF, 1 mM EDTA, sekä proteaasi ja fosfataasi-inhibiittori cocktailit) ja sonikoitiin. Viisikymmentä mikrogrammaa kokonais-solun proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Sen jälkeen estää, kalvoja inkuboitiin polyklonaalisella kanin fosfo-AMPKα (Thr172) ja fosfo-ACC (Ser79) yön yli tai monoklonaalisia hiiren anti β-aktiini 2 tunnin 1:1,000 laimennoksia. Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita käytettiin 1:10,000 laimennoksia. Proteiinit membraanin havaittiin käyttämällä West Pico kemiluminesenssidetektiolla kit ja kvantifioitiin ChemiDoc (BioRad) digitaalinen kuva, jossa käytetään QuantityOne ohjelmistoa. Kaikki analyysit proteiinin kaistan tiheyden tehtiin lineaarisen osuuden kylläisyyttä käyrät ja normalisoitiin β-aktiini sisältö samoista näytteistä.

määritys solun

Yhteensä solun proteiinipitoisuus oli mitattuna Bradfordin menetelmällä käyttäen BSA standardina.

tilastollinen

tulokset edustavasta kokeesta, jossa on vähintään 3 näytettä per koeryhmä esitetään keskiarvoina ± S. D. tilastollinen merkitys tietojen määritettiin Studentin t-testiä.

Tulokset

farmakologinen esto SCD aktiivisuuden heikentää syöpäsolujen lisääntymistä

Olemme aiemmin raportoitu, että krooninen ehtyminen Scd1 hidastaa solujen lisääntymistä in onkogeenin transformoitujen ja syöpäsolujen [19], [20]. On arvioitava mahdollisuudet käyttää äskettäin kehitetty SCD estäjiä uusina syöpälääkkeiden, testasimme potentiaalista kasvua estävää vaikutusta CVT-11127, uusi pienimolekyylinen estäjä SCD toimintaa useaan keuhkosyövän solulinjoja. Tämä yhdiste todettiin olevan tehokas ja desaturaasi-selektiivinen estäjä SCD toimintaa rotan maksan mikrosomipreparaateilla ja ihmisen HepG2-soluissa [30]. Nämä kirjoittajat raportoitu, että CVT-11127 ei inhiboi rotan mikrosomaalisia Δ5 ja Δ6 desaturaaseja pitoisuuksina jopa 30 uM, mikä osoittaa, että CVT-11127 on selektiivinen Δ9 desaturaaseja. Niinpä inkuboitiin A549, H1299 ja H460-soluja kasvavien pitoisuuksien kanssa SCD inhibiittoria 24 tuntia ja sai progressiivinen alenemisella solun replikaation syöpäsolujen suhteen ajoneuvon (DMSO) saaneista soluista (kuvio 1). H1299 solut osoittivat noin 55% ja 65%: n lasku solujen lisääntymisen korko läsnä oli 1 uM ja 5 uM CVT-11127, vastaavasti (kuvio 1A). A549-solut olivat vähemmän herkkiä solun kasvua estävää vaikutusta CVT-11127, koska nämä solut vähensivät replikaatio korkoa 20% ja 40%, kun hoidettiin 5 uM ja 10 uM CVT-11127, vastaavasti (kuvio 1 B). Lisäksi leviämisen määrä H460: lla käsiteltyjen solujen CVT-11127 oli 60% pienempi kuin vehikkelillä käsiteltyihin kontrolleihin (kuvio 1C), mikä osoittaa, että nämä solut ovat yhtä herkkiä Kasvua estävät vaikutus SCD inhibiittoria H1299-soluissa.

A549 (A) ja H1299 (B) soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien kanssa ja CVT-11127 (CVT) tai DMSO-ajoneuvon 24 h, kuten on kuvattu, ja solujen lisääntyminen määritettiin Kristalliviolettiliuos määrityksessä. Sillä samanlainen analyysi, H460-solut (C) käsiteltiin 1 um CVT-11127 24 tuntia. Määrittämiseksi DNA-synteesin, A549 (D) ja H460 (E) soluja inkuboitiin 10 uM ja 5 uM CVT-11127 tai ajoneuvon 24 h ja pulssitettiin [

3H] tymidiiniä (1 uCi /astia) ja 2 h 37 ° C: ssa. Yhteensä [

3H] -leimattua DNA saostettiin, radioaktiivisuus kvantitoitiin tuikelaskimessa ja normalisoitiin proteiinin pitoisuus. F, MCF-7 ja MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen ja WS-1 ihmisen ihon fibroblasteja inkuboitiin 10 uM CVT-11127 (CVT) tai DMSO-ajoneuvon 24 h ja soluproliferaatiota arvioitiin kristalliviolettivärjäys- menetelmällä. E, H460-soluja inkuboitiin 48 tunnin ajan 1 uM CVT: n läsnä ollessa 1, 10, 50 ja 100 uM natriumoleaatin kompleksoitu BSA: ta (1:02 BSA: rasvahappo-suhde). Cell inkuboitiin DMSO ajoneuvon katsottiin kontrolliryhmään. Solujen kasvua arvioitiin kristalliviolettivärjäys- menetelmällä. Arvot edustavat keskiarvoa ± S.D. kolminkertaisten määritysten. *, P 0,05 tai vähemmän kontrolliryhmään verrattuna, Studentin t-testillä.

inkubaation SCD estäjän johtanut myös syvällinen vähennys (-60%) vuonna sisällyttäminen [

3H ] tymidiinin syntetisoituneeseen DNA, varhainen merkki soluproliferaation korko, sekä A549- ja H1299 syöpäsolulinjoissa (kuvio 1 D ja E). Sen valvomiseksi, että Kasvua estävät vaikutus SCD kemiallisen inhibiittorin ei solutyyppispesifiselle, MCF-7 ja MDA-MB-231 rintasyövän soluja, samoin kuin normaaleissa ihmisen WS-1 fibroblastit, inkuboitiin CVT-11127 24 h ja soluproliferaatiota arvioitiin Kristalliviolettiliuos värjäytymistä (kuvio 1 F). Todettiin, että rintasyöpä solut olivat yhtä herkkiä sytostaattinen toiminnan pienimolekyylisiä SCD estäjä. Kuitenkin leviämisen WS-1 normaali iho fibroblastit ei vaikuttanut hoitoon, mikä viittaa siihen, että Kasvua estävät vaikutukset SCD estäminen voi olla riippuvainen määrä solun replikaation. Lisäksi kasvavia pitoisuuksia oleaatti soluviljelyelatusainetta osittain tai kokonaan päinvastaiseksi soluproliferaation inhibointi H460-soluja inkuboitiin pienen molekyylin SCD-inhibiittori (kuvio 1G). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin H1299-soluja (tietoja ei esitetty). Nämä havainnot osoittavat, että öljyhappo on olennaisesti tarvitaan täysin aktiivinen replikaation syöpäsoluja.

Kuten odotettua, kasvua estävän vaikutuksen CVT-11127 korreloi positiivisesti, joilla on merkittävä inhibitio SCD aktiivisuuden keuhkosyövän soluja . Kuten on esitetty kuviossa 2A-C, hoitoon A549 ja H1299-soluja 24 tuntia 10 uM ja 5 uM CVT-11127, vastaavasti, vähentää SCD aktiivisuus yli 95%, määritettynä tuotanto [

14C ] öljyhappo sen radioleimatun esiaste, steariinihappo. Tämä vahvistaa, että CVT-11127 on erittäin tehokas tukahduttaa erittäin korkea SCD aktiivisuus löytyy näitä syöpäsolulinjoissa.

määrittämiseen Δ9-desaturoiva aktiivisuutta syöpäsoluissa, A549 (A, B) ja H1299 solujen (A, C) käsiteltiin 24 h 10 uM ja 5 uM CVT vastaavasti, tai DMSO ajoneuvon. Kuusi tuntia ennen sadonkorjuuta, solut pulssitettiin [

14C] 18: 0 (0,25 uCi /astia). Muuntamisen jälkeen metyyliesterit, rasvahappoja erotettiin hopeanitraattikerrostettu kyllästetty TLC-levyjen. Radioaktiivinen paikkoja vastaavat SCD substraatti ja tuote ([

14C] 18:1), visualisoitiin Phosphor Imager (A) ja kvantifioidaan densitometrinen analyysi (B ja C). Arvot edustavat keskiarvoa ± S.D. kolminkertaisten määritysten. *, P 0,05, Studentin t-testi.

seurauksena vähentämiseen Scd1 aktiivisuuden suhteen pienmolekyylisalpaaja-, jakelu SFA ja MUFA yhteensä solulipideistä A549-solujen oli huomattavasti muuttunut (kuvio 3A ja B). Suhdelukuja MUFA SFA sekä n-7 ja n-9 rasvahappoa sarja väheni 25% ja 35%, vastaavasti soluissa käsiteltiin 24 h CVT-11127 suhteen apuaineella hoidettuihin kontrolleihin. Lisäksi, suhteet MUFA /SFA H460-soluissa havaittiin vähentynyt 47% (n-7MUFA /SFA) ja 60% (n-9MUFA /SFA) soluissa meneillään samanlainen käsittely CVT-11127 suhteessa DMSO-käsiteltyjen soluja (kuvio 3C ja D). Häiriöt solun MUFA sisältöä inkubaatioista pienmolekyylisalpaaja- havaittiin niinkin aikaisin kuin 1 tunti käsittelyn jälkeen (tuloksia ei ole esitetty). Nämä havainnot osoittavat selvästi, että rasvahappojen kokonaismäärästä asyyliketju Lipidien koostumus syöpäsoluissa on valvonnassa Scd1 toiminnan silloinkin, kun näitä soluja viljeltiin alustassa FBS, joka sisältää merkittäviä määriä MUFA.

A549-soluja (A, B) ja H460-soluja (C, D), inkuboitiin 10 uM ja 1 uM CVT-11127 (CVT), vastaavasti, tai DMSO: ssa 24 tuntia. Cellular lipidit uutettiin ja rasvahapot muunnettiin niiden metyyliesterin muodossa transesteröimällä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Rasvahapon metyyliesteriä koostumus määritettiin kaasukromatografisesti ja prosenttia Rasvahappojen jakauma laskettiin. Arvot ilmaisevat suhde 18: 1 n-9/18: 0 (A, C) ja 16:1-n7 + 18: 1n-7/16: 0 (B, D), ja edustavat keskiarvoa ± S.D. 4-5 näytteitä. *, P 0,01 tai vähemmän, Studentin t-testillä.

esto Scd1 pienenee de novo lipidisynteesiin glukoosista

Syöpäsolut muokannut joukko signalointi ja aineenvaihdunnan polkuja parantaa käyttöä glukoosia pääasiallisena alustana makromolekyyliyhdisteet biosynteesin ja energiaa tuottavien reaktioiden [38]. Aikaisemmin osoitimme, että krooninen ehtyminen Scd1 estää kokonaisesiintyvyys lipogeneesiin [19], [20]. Jotta leikellä mekanismeihin aineenvaihdunnan sääntelyä Scd1, tutkimme vaikutus akuutin eston SCD aktiivisuuden kanssa romaani pienimolekyylinen CVT-11127 on lipogeeniset polkuja. Dokumentoida vaikutus akuutin SCD inaktivaation glukoosi-lipidien biosynteesin, A549 ja H1299-soluja käsiteltiin SCD-inhibiittorin tai ajoneuvon 6 h ja 24 h vastaavasti, ja muodostumista solun kokonais-lipidien [

14C] glukoosi oli määritetään. Kuten esitetty kuviossa 4A ja B, radioleimattujen glukoosin yhteensä solulipideistä oli merkittävästi heikentynyt (30%) in SCD estäjä saaneilla H1299 ja A549-soluja suhteen apuaineella hoidettuihin kontrolleihin. Kuten aiemmin havaittu [20], radioleimattujen glukoosin lipidejä laski -20% vakaissa Scd1-pudotus A549 (hSCDas) soluja (kuvio 4C), joka vahvistaa, että läsnä on täysin aktiivinen Scd1 on ratkaisevan tärkeää ylläpitää nopeutetun glukoosi-välitteisen lipogeneesiä syöpäsoluja. Muutos muodostumisessa [

14C] glukoosi-leimattu lipidien ei aiheuttama puutteellinen glukoosin koska emme havainneet muutoksia määrä [

3H] deoksiglukoosilla otto käsitellyissä soluissa CVT tai ajoneuvoon ( Kuva 4D). Radioleimattujen glukoosia rasvahapot syöpäsolun lipidien pelkistettiin käsittelemällä CVT (kuvio 4E), mikä viittaa siihen, että epänormaali muodostuminen lipidien läpikäyvien solujen inhibitio Scd1 voi johtua viallisesta de novo rasvahappojen biosynteesiä. Kuten odotettua, glukoosi-leimatun MUFA lähes täysin tukahdutetaan H1299 solut lohkon SCD aktiivisuuden (kuvio 4E, yläpaneeli). Lisäksi biokemiallinen muutos lipogeneesiä solujen kemiallisen saarto SCD näyttää sijaitsee alavirtaan muodostumista CoA vuodesta alentuneen muodostumisen [

14C] asetaatti-leimattu lipidien havaittiin CVT-käsiteltyjen H1299-solujen suhteen ajoneuvon käsiteltyä valvonta (kuvio 4F).

A549-soluja (A) ja H1299-soluja (B) inkuboitiin 10 uM ja 1 uM CVT-11127 (CVT), vastaavasti, tai DMSO: ssa 24 tuntia. Sitten soluja pulssitettiin 1 uCi D- [U-

14C] glukoosia jopa 24 tuntia. C, A549-solut, jolla on vakaa pudotus on Scd1 lausekkeen (hSCDas) ja mock-transfektoituja ohjaus solut altistettiin samanlainen inkuboitu [

14C] glukoosia. Cellular lipidejä uutettiin ja sisällyttäminen [

14C] glukoosia lipidejä kvantifioitiin tuikelaskennalla ja normalisoidaan proteiinin pitoisuus. D, pohjapinta glukoosin sisäänotto määritettiin H1299 soluissa, joita käsiteltiin 1 uM CVT tai ajoneuvon 24 tunnin arvioimalla ottoa [

3H] deoksiglukoosilla. E, H1299-soluja inkuboitiin [

14C] glukoosin läsnä ollessa tai ilman 1 uM CVT: ssa 6 tuntia ja veren kokonaiskolesterolia [

14C] rasvahappoja, sekä radioaktiivisesti SFA ja MUFA (ylempi paneeli), määritettiin argentation TLC, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. F, nopeus lipidisynteesiin H1299 soluissa arvioitiin inkuboimalla 1 uM CVT tai ajoneuvon ja 0,5 uCi /astia on [

14C] asetaattia 24 tuntia. Lipidit uutettiin ja radioaktiivisuus lipidejä määritettiin tuikelaskennalla. Arvot edustavat keskiarvoa ± S.D. kolminkertaisten määritysten. *, P 0,05 tai vähemmän, Studentin t-testillä.

stimulointi Glykolyysivaiheen /lipogeneesiin ei käännä vähentynyt leviämisen Scd1-vajaiden solujen

Kuten edellä on kuvattu, sekä välittömät farmakologinen salpaus SCD toiminnan ja stabiili geeni knockdovvn Scd1 muuttanut merkitsevästi hinnat glukoosi-välitteisen lipogeneesiin ja solunjakautumista. Oletimme, että häiriön aerobinen Glykolyysivaiheen voi olla ensisijainen syy heikentynyt leviämisen ja selviytymistä Scd1-vajaiden solujen ([19], [20] ja kuvio 1). Sitten määritetään määrä Glykolyysivaiheen A549 ja H1299 solujen tasojen arviointiin laktaatin elatusaine, indikaattori aerobinen glykolyyttisen korko syöpäsoluissa [39], ja löysi kasvoi 30-60% soluissa meneillään farmakologinen esto SCD verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin kontrolleihin (kuvio 5A). Vahvista, että muutos vuon glykolyyttisten metaboliittien ei ollut vastuussa puutteellinen replikointi Scd1-ablatoitu soluja, inkuboimme soluja alustassa, joka sisälsi hyvin alhainen (0,5 mmol), normaali (5,5 mM) tai korkea (25 mM) tasoille glukoosin ja määritettiin DNA-synteesin nopeus ja solujen kasvua. Kuten on esitetty muissa syöpäsolulinjoissa, A549-solut näytetään tiukat glukoosia riippuvuuden lisääntymistä (kuvio 5B). Kun kasvanut olennaisesti glukoosi-MEM: ssä (joka sisälsi -0,5 mM glukoosia 10% FBS-ravintolisistä) 24 h, radioleimattujen tymidiinin DNA: han Scd1-puutosta (hSCDas) ja valvonta-solujen väheni 70%, kun verrattuna soluihin kasvaa tavanomaisissa viljelyolosuhteissa (5,5 mM glukoosia). Kuitenkin merkittävästi vähentynyt DNA-synteesin nopeus havaitaan Scd1-ablatoitu soluista säilyi riippumatta glukoositasoa elatusaineet.