Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta merkittävästä edistysaskeleet hoidon ja eturauhassyövän ennaltaehkäisyyn se on edelleen toiseksi kuolinsyy syöpään teollisuusmaissa. Monet hoitojen aluksi osoitettu olevan hyötyä potilaille hylättiin, koska suuri lääkeresistenssin ja kehityksen nopeus kasvainten. Yksi mahdollinen terapeuttisen aineita käytetään jopa ensimmäisessä vaiheessa kliinisissä tutkimuksissa, 1,25-dihydroksi-D3, osoitettiin olevan joko ennalta arvaamattomia tai tehottomia monissa tapauksissa. Olemme jo osoittaneet, että TRPV6 kalsiumkanavan, joka on suora kohde 1,25-dihydroksi-D3-reseptoriin, positiivisesti ohjaa eturauhassyövän proliferaatiota ja apoptoosia vastus (

Lehen’kyi et ai.

, Oncogene, 2007). Kuitenkin miten tunnetut 1,25-dihydroksi D3 antiproliferatiivisia vaikutuksia voi olla yhteensopiva säätelyä pro-onkogeenisen TRPV6 kanava on edelleen mysteeri. Tässä me osoitamme, että matalan steroidi olosuhteissa 1,25-dihydroksi-D3 ylössäätelee ilmentymisen TRPV6, enchances leviämisen lisäämällä solujen määrää tulevien S-vaiheeseen. Osoitamme, että nämä pro-proliferatiiviset vaikutukset 1,25-dihydroksi-D3 suoraan välittyvät yliekspressio TRPV6 kanava, joka lisää kalsiumin ottoa LNCaP. Apoptoosin vastus androgeeniriippuvaisen LNCaP myönnetty TRPV6 kanava dramaattisesti käänteistä kun 1,25-dihydroksi D3 vaikutuksia yhdistettiin onnistuneesti TRPV6 knockdown. Lisäksi käyttö androgeenin puutteesta DU-145 ja androgeenin epäherkkä LNCaP C4-2 solulinjoja annettiin viittaavat siihen, että kyky 1,25-dihydroksi-D3 indusoida TRPV6 kanava on ratkaiseva tekijä onnistumisen tai epäonnistuminen 1,25-dihydroksi-D3-hoidoissa.

Citation: Lehen’kyi V, Raphael M, Oulidi A, Flourakis M, Khalimonchyk S, Kondratskyi A, et al. (2011) TRPV6 määrittää vaikutuksen D3-vitamiini eturauhasen syöpäsolujen kasvua. PLoS ONE 6 (2): e16856. doi: 10,1371 /journal.pone.0016856

Editor: Janine Santos, University of Medicine ja hammaslääketieteen New Jersey, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 syyskuu 2010; Hyväksytty: 16 tammikuu 2011; Julkaistu: 11 helmikuu 2011

Copyright: © 2011 Lehen’kyi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Institut National de la Sante et de la Recherche médicale (INSERM), Ministère de l’Education Nationale et Ligue Nationale Contre le Cancer. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä edelleen yleisin noncutaneous ihmisen pahanlaatuisen ja toinen kaikkein vaarallisin kasvain miehillä, joilla on korkein ilmaantuvuus teollisuusmaissa [1]. Androgeenireseptorin ja muita steroideja säätelevät elintärkeitä näkökohtia eturauhasen solujen kasvuun ja toiminta mukaan lukien proliferaatiota, erilaistumista, apoptoosin, rasva-aineenvaihduntaan, ja sekretorisen toiminta [2]. Androgeenien vaimennus on johtava käsittely ja tällä hetkellä menestynein [3]. Kuitenkin eturauhasen karsinoomat lopulta androgen-irresponsive, ja syöpä on refraktaarisia hormonihoidon – tärkein syy eturauhassyövän kuolleisuus [4].

Eri tumareseptoreista on suunnattu hoito ja niiden joukossa 1, 25-dihydroksi-D3, joka kohdistaa lukuisia kasvaimen vastaisia ​​aktiivisuuksia vastaan ​​viljeltyjen syöpäsolujen ja ksenografteissa [5]. Normaali ja pahanlaatuiset eturauhasen epiteelisolujen ilmentävät vitamiini D3-reseptorin (VDR), ja aktivointi VDR 1,25-dihydroksivitamiini D3 johtaa yleensä lisäkasvun estäminen ja solusyklin pysähtymisen [6]. Kuitenkin, ehkäistä tai hoitaa eturauhassyöpää, vuorovaikutukset muiden tumareseptorien ja signalointireitin on otettava huomioon, [7].

toiminta ionikanavia on tarkasteltava suhteessa proliferaation ja apoptoosiin. Viime aikoina kauppa toimi Ca

2+ kanavia ja Ca

2+ altaan endoplasmisen retikulumin ovat myös liittyneet eturauhassyövän kehitykseen [8]. Leviämisen eturauhassyövän solulinjoissa LNCaP ja PC3 estyi TH-1177, aine estää Ca

2+ entry [9]. Muutoksia Ca

2 + allas ja soluliman Ca

2+ ei pelkästään ole kuvattu lisäämiseksi lisääntymistä ja sarcoendoplasmatic Ca

2 + -ATPaasi (SERCA) ilmentyminen LNCaP [10], mutta myös houkutella apoptoosin [11]. Siten Ca

2 + homeostaasiin kriittisesti mukana syövän kehittymistä ja etenemistä.

Meidän on kiinnitetty huomiota se havainto, että ohimenevää reseptorin potentiaali erittäin Ca

2 + selektiivinen kanava subfamily V jäsen 6, TRPV6 ilmentyy voimakkaasti edenneen eturauhassyövän ja merkittävästi korreloi Gleason 7 luokittelu, joilla on vahva merkki syövän etenemisen ja myöhemmät invaasion terveiden kudosten [12], [13]. Olemme aiemmin osoittaneet, että TRPV6 muodot erittäin kalsiumselektiivistä kanavien eturauhasen soluissa, jonka virran amplitudi ja inaktivoitumisen käyttäytyminen ovat tiukasti säännelty solunsisäisen kalsiumpitoisuuden [10], [14]. Sitä paitsi olemme jo osoittaneet, että TRPV6 kanava valvontaan osallistuvien eturauhassyövän leviämisen ja apoptoosin vastus [15]. Kuitenkin tarkka rooli TRPV6 eturauhasessa patofysiologiassa edelleen kuviteltu, ja sen sääntely androgeenien – contradictive [16]. Lisäksi VDR ollessa suora aktivaattori

trpv6

promoottori [17], ja 1,25-dihydroksi D3 laajalti käytetty syöpähoidon suorittanut kiehtova hypoteesi TRPV6 sääntelyä ja merkitystä eturauhassyövässä. Meidän tutkimukset perustuvat siihen, että 1,25-dihydroksi-D3, jota käytetään jo ensimmäisessä vaiheessa kliinisissä tutkimuksissa osoitettu olevan joko ennalta arvaamattomia tai tehottomia monissa tapauksissa, ja se, että TRPV6 joka positiivisesti ohjaa eturauhassyövän proliferaatiota ja apoptoosiresistenssiin [15] on välittömänä kohteena 1,25-dihydroksi-D3 [17]. Kysymys miten tunnetun 1,25-dihydroksi D3 antiproliferatiivisia vaikutuksia voi olla yhteensopiva säätelyä pro-onkogeenisen TRPV6 kanava oli Tutkimuksen tarkoituksena.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Human LNCaP (imusolmuke eturauhasen syöpä), LNCaP C4-2, ja DU-145-solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC) ja niitä viljeltiin RPMI-väliaineessa (Gibco-BRL, CergyPontoise, Ranska ), jota oli täydennetty 10 tai 2% naudan sikiön seerumia (FCS), ja joka sisälsi kanamysiiniä (100 ug /ml) ja L-glutamiinia (2 mM). Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2 ilmassa. Elatusaine vaihdettiin kolme kertaa viikossa ja viljelmät jaettiin käsittelemällä soluja 0,25% trypsiiniä (PBS: ssä) 5 minuutin ajan 37 ° C: ssa ennen konfluenssin. Kokeita varten solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille PCR ja western-blottauksella ja päälle lasipeitinlevyille immunosytokemiaa ja kalsiumin kuvantaminen. Sillä 1,25-dihydroksi-D3-tutkimuksissa soluja käsiteltiin EtOH kontrollina 1,25-dihydroksi-D3. Hiili-raidallinen vasikan sikiön seerumia (2%) lisättiin fenolipunaista RPMI yhdessä kanamysiinille ja L-glutamiinia, kuten edellä on inkuboida solujen kanssa luomaan steroidi-puutteellisissa olosuhteissa.

RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen guanidiumtiosyanaatti-fenoli-kloroformi uuttomenetelmää. Jälkeen DNaasi I (Life Technologies) käsittely poistaa genomista DNA: ta, 2 ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin cDNA: ksi 42 ° C: ssa käyttäen satunnaisia ​​heksameerialukkeita (Perkin Elmer), ja MuLV käänteistranskriptaasia (Perkin Elmer) kanssa 40 ul: n lopullisessa tilavuudessa, seuraa reaaliaikaista kvantitatiivista PCR: ää.

Quantitative real-time PCR

Quantitative real-time PCR TRPV6 ja HPRT mRNA-transkriptien tehtiin käyttäen MESA GREEN qPCR Mastermix Plus SYBR Pitoisuus (Eurogentec, Ranska ) on Biorad CFX96 Real-Time PCR Detection System. Sekvenssit alukkeiden on esitetty taulukossa 1. HPRT-geenin käytettiin endogeenisen ohjaus normalisoida vaihtelut RNA uuttoa, aste RNA: n hajoamisen, ja vaihtelu RT tehokkuutta. Määrällisesti tuloksia käytettiin vertailevan kynnyssykli menetelmä ΔΔC (t).

Western-blotting

, puoliksi LNCaP-soluja käsiteltiin jääkylmää hajotuspuskuria, joka sisälsi: 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM MgCI, 1 mM PMSF, 1% Nonidet P-40, ja proteaasi-inhibiittoriseosta Sigma. Lysaatteja sentrifugoitiin 15000 x g 4 ° C: ssa 20 minuutin ajan, sekoitetaan näytteen kanssa, joka sisälsi: 125 mM Tris-HCI, pH 6,8, 4% SDS, 5% β-merkaptoetanolia, 20% glyserolia, 0,01% bromifenolisinistä, ja keitettiin 5 minuuttia 95 ° C: ssa. Kokonaisproteiinia näytteet altistettiin 8, 10, ja 15% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille puolikuivalla Western blottauksella (Bio-Rad Laboratories). Membraani blokattiin 5% maitoa, joka sisälsi TNT-puskurissa (Tris-HCl, pH 7,5, 140 mM NaCl ja 0,05% Tween 20) yli yön, sitten tutkittiin käyttämällä erityisiä rabit polyklonaalista anti TRPV6 vasta-ainetta (Alomone Labs Ltd., 1/200) , anti-PCNA (Santa-Cruz, 1/1000), anti-β-aktiini (Lab Vision Co, 1/1000) vasta-aineita. Bändit kalvolle tehtiin näkyviksi käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin menetelmällä (Pierce Biotechnologies Inc.). Densitometrinen analyysi suoritettiin käyttäen Bio-Rad kuva mittausjärjestelmällä (Bio-Rad Laboratories).

Immunosytokemia

soluja kasvatetaan lasipeitinlevyille pestiin kerran PBS: llä ja, tarvittaessa, niitä inkuboitiin koleratoksiinin B-alayksikköä Alexa Fluor® 488 konjugaatti (Molecular Probes, 1/2000) 15 min, sitten pestään kerran PBS: llä ja kiinnitettiin 3,5% paraformaldehydillä PBS: ssä. PBS-glysiiniä (30 mM) käytettiin reaktion kanssa myöhemmin läpäiseväksi 0,1% Triton X-100. Solut pestiin jälleen PBS: llä ja altistettiin tavanomaisiin immunovärjäyksen menettelyä. Alexa Fluor® 546 vuohen anti-kani-IgG: llä (Molecular Probes, 1/4000) käytettiin sekundaarisena vasta-aineena TRPV6 värjäystä. Fluoresenssi analyysi suoritettiin käyttäen Carl Zeiss laserskannaus Systems LSM 510 kytketty Zeiss Axiovert 200 M 63 x 1,4 numeerinen aukko öljyssä objektiivi huoneenlämmössä. Molemmat kanavat olivat innoissaan, kerätään erikseen ja sitten yhdistettiin ohjelmistojen avulla Carl Zeiss LSM Image Tarkastaja.

Solulisääntyminen

Solulisääntyminen mitattiin käyttämällä CellTiter 96 Aqueous One Solution soluproleferaatiomäärityksessä (Promega, Madison , WI), joka perustuu solujen muuntaminen kolorimetrisen reagenssin MTS [3,4- (5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsoliumin suola] liukoisiksi formatsaanin by dehydrogenaasientsyymien löytyy ainoastaan ​​metabolisesti aktiivisia, jakautuvat solut. Jokaisen käsittelyn 20 ui väriaineen liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisella levyllä ja inkuboitiin 2 tuntia. Sen jälkeen, absorbanssi kirjattiin 490 nm: n aallonpituudella käyttäen ELISA-levylukijaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Solujen lisääntyminen esto lasketaan seuraavasti: (

A

control-

A

sample)/(

A

control-

A

blank)×100%.

Cell sykli ja apoptoosin määrityksiä

Virtaussytometria määritykset suoritettiin solupopulaatioiden viljeltiin kolmena kappaleena 25-cm

2 pulloissa kuten alunperin on kuvattu [18]. Noin 10

6 solut kiinnitettiin 1 ml jääkylmää 70% metanolia 30 minuutin ajan. Kiinnityksen jälkeen solut pelletoitiin sentrifugoimalla poistamiseksi fiksatiiveja, pestiin kolme kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) 4 ° C: ssa, suspendoitiin uudelleen 100 ui PBS: ää, käsiteltiin 100 ui RNAasi A: ta (1 mg /ml, Sigma), ja värjättiin propidiumjodidilla (PI, Sigma) lopulliseen konsentraatioon 50 ug /ml. Värjätyt solut säilytettiin 4 ° C: ssa pimeässä ja analysoitiin 2 tunnin sisällä. Värjätyt näytteet mitattiin FACScan-virtaussytometrillä (Becton-Dickinson, San Jose, CA). Tiedot hankittiin 7000 tapahtumia, joilla on variaatiokerroin on alle 5%, ja punainen fluoresenssi mitattiin käyttämällä fluoresenssidetektoria 3 (FL3) on

X

akselin. Tiedot tallennettiin ja analysoitiin käyttäen CellQuest ohjelmisto arvioida solusyklin leviäminen (subG1 (apoptoottisten), G0 /G1, S ja G2 /M vaiheet).

Kalsium Imaging

Cells maljattiin lasipeitinlevyille ja ladattiin 4 uM Fura-2 AM huoneen lämpötilassa 45 min kasvualustassa. Äänitykset tehtiin HBSS, joka sisälsi (mM): 140 NaCl, 5 KCI, 2 MgCl

2, 0,3 Na

2HPO

3, 0,4 KH

2PO

4, 4 NaHCO

3, 5 glukoosia ja 10 HEPES pH säädettiin arvoon 7,4 NaOH: lla. CaCl

2 säädettiin 0,07 mM tai 1,8 mM riippuen kokeilu. Peitinlasit asetettiin sitten perfuusiobioreaktorissa kammiossa lavalla mikroskoopin. Fluoresenssi kuvia soluja tallennettu videokuvan analyysijärjestelmä (Quanticell). Fura-2 fluoresenssi, emissioaallonpituudella 510 nm, tallennettiin jännittävä koetin vaihtoehtoisesti 340 ja 380 nm. Signaali suhde 340/380 nm muutettiin [Ca

2 +]

i tason käyttämällä

in vitro

kalibrointia.

siRNA solutransfektiolle

LNCaP-solut transfektoitiin yli yön 200 nM siRNA-TRPV6 1 ja 2 kuoppaa kohti kuuden kuoppalevyllä käyttäen ”Gene portteri 2” (Gene Therapy Systems, Inc.) lopulliseen tilavuuteen 1 ml. Ready-to-use siRNA-TRPV6s (käsittely vaihtoehto: A4) syntetisoitiin Dharmacon Research Inc (Lafayette, USA) (katso taulukko 1).

reagenssit

Kaikki reagenssit hankittiin Sigma (Sigma, L’Isle d’Abeau Chesnes, Ranska) ellei toisin mainita.

tilastot

tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD. Tilastollinen analyysi suoritettiin Studentin paritonta

t

-testaukset. * – P 0,05 tai ** – P 0,01 osoittaa tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

The effect of 1,25-dihydroksi D3 eturauhassyövän soluproliferaatioon on tutkittu kahdessa koeolosuhteissa : 2% ja 10% vasikan sikiön seerumia (FCS) -supplemented RPMI. Kasvu androgeeniriippuvaisen LNCaP-solulinja yllättäen kasvoi 100 nM 1,25-dihydroksi D3 2% FCS keskipitkällä ja vaimentaa 10% FCS (Fig. 1A). Olemme jo osoittaneet roolin TRPV6 kanavan leviämisen eturauhasen syöpäsolujen [15], ja siksi pyrimme tutkimaan sääntelyn TRPV6 kanavan ilmentymisen 1,25-dihydroksi D3. Koska on osoitettu, että

trpv6

on VDR-säänneltyjen geeni [17], olemme tutkineet säätelyyn TRPV6 ilmentymisen 1,25-dihydroksi D3 LNCaP-soluissa eri steroidi mediasisältöä (Fig . 1B, C). 1,25-dihydroksi D3 näyttää suoraan aktivoida

trpv6

geenin LNCaP, vaikka 10% FCS sen vaikutukset olleet kovinkaan merkittäviä (Fig. 1 B) kuin 2% FCS (Fig. 1 C) . 1,25-dihydroksi-D3 huomattavasti annoksesta riippuen kasvoi TRPV6 mRNA: n ekspression 2% FCS: ää sisältävää RPMI (Fig. 1 C). Voit tarkistaa, onko vähentynyt vaikutuksia 1,25-dihydroksi D3 johtuivat FCS sisältöä eikä optimaalista vaikutusta aika suoritimme ajan käyrä käyttämällä maksimaalista 100 nM kolmen päivän eri aikaan (Kuva. 1 D). Vahvista merkittävän induktion TRPV6 proteiinin 1,25-dihydroksi D3 2% FCS, joka sisälsi RPMI saadaan reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR western-blottaus suoritettiin. Se osoitti huomattavaa kasvua TRPV6 proteiinin tason aktivoinnin kanssa 100 nM 1,25-dihydroksivitamiini D3 (Fig. 1 E). Immunosytokemialla käyttäen TRPV6 spesifistä vasta-ainetta osoitti ekspressiota TRPV6 kanavien LNCaP-soluissa (kuvio. 1 F) sekä sen lokalisointi solukalvon avulla koleratoksiinin (CTX) konjugoituna FITC merkintöjä erityisesti G2M lipidien kalvo. Näin ollen, vaikutukset 1,25-dihydroksi-D3 kasvuun androgeeniriippuvaisen LNCaP riippuu suhteellisesta steroidi sisältöä. Sitä paitsi, 1,25-dihydroksi-D3 lisää merkittävästi ilmentymistä TRPV6 kanavan matalan steroidi olosuhteissa.

A, 1,25-dihydroksi-D3 vaikutuksia proliferaationopeus mitataan MTS-määritys LNCaP inkuboitiin joko 2 % tai 10% FCS: ää sisältävää RPMI, * – P 0,05, ** – P 0,01, verrattuna niiden valvontaa (DMSO), n = 3. B, The säätelyä TRPV6 mRNA ilmentyminen 1,25- dihydroksi D3 LNCaP viljeltiin 10% FCS sisältävää RPMI; * – P 0,05, verrattuna kontrolliin (DMSO), n = 3. C, The säätelyä TRPV6 mRNA: n ilmentymisen 1,25-dihydroksi-D3-LNCaP-solut, joita kasvatettiin 2% FCS: ää sisältävää RPMI; * – P 0,05, ** – P 0,01, verrattuna kontrolliin (DMSO), n = 3. D, aika-riippuvuus TRPV6 ilmaisun alle 100 uM 1,25-dihydroksi D3 kohtelun LNCaP inkuboitiin 10 % FCS sisältävää RPMI. * – P 0,05, ** – P 0,01, verrattuna kontrolliin (DMSO), n = 3. E, western-blottaus TRPV6 proteiinin tasot aiheuttama 1,25-dihydroksi D3 käsittely 3 päivänä LNCaP inkuboitiin 2% FCS sisältävää RPMI. F A konfokaalimikroskopialla esittää kuvion TRPV6 proteiinin ilmentymisen ja lokalisointi päälle solukalvon LNCaP-soluja viljeltiin 2% FCS: ää sisältävää RPMI. Koleratoksiinin konjugoitu FITC (CTX, vihreä) käytetään värjäämään plasmamembraanin sekä TRPV6 kanavan (TRPV6, punainen), ja niiden yhdistäminen (CTX + TRPV6) on esitetty.

TRPV6 on mukana in1,25-dihydroksi-D3-indusoitua proliferaatiota LNCaP-solujen

tietojen mukaan edellä saatua vaikutukset 1,25-dihydroksi-D3-2% FCS: ää, tutkittiin edelleen. Koska olemme jo osoittaneet roolin TRPV6 kanavan leviämisen eturauhasen syöpäsolujen [15], ja tietäen, että ei ole kemiallista yhdistettä saatavilla toistaiseksi selektiivisesti estää TRPV6, käytimme siRNA lähestymistapaa valikoivasti pudotus TRPV6. Kolme menetelmää koskevan lähestymistavan käytettiin arvioimaan leviämisen LNCaP 2% FCS sisältävää väliainetta (Fig. 2A-C). Lukumäärä elinkelpoisia lisääntyvien solujen mitattiin MTS-määritys. siRNA-TRPV6 merkittävästi vähentynyt määrä lisääntyvien solujen päivästä 2-4 transfektion jälkeen (D0) (Fig. 2A). 100 nM 1,25-dihydroksi D3 pystyi lisäämään leviämisen LNCaP taas TRPV6 Knockdown käänteistä tämä stimulaatio tasolle jopa alhaisempi kuin verrokeilla. siRNA vastaan ​​androgeenireseptorin (AR), tiedetään olevan ratkaiseva eturauhasen kasvua ja kehitystä, käytettiin positiivisena kontrollina saavuttaa vahva ja luotettava vaikutuksia eturauhasen solujen elinkykyä.

, LNCaP lisääntymistä 2% FCS sisältävä RPMI käsiteltiin 1,25-dihydroksivitamiini D3 (100 nM, sovelletaan D1), siRNA-TRPV6 (siTRPV6, 80 nM, transfektoitiin D0), yhdistetyt hoidon 1,25-dihydroksi-D3 ja siTRPV6 edellä määriteltyjä, ja siRNA-AR (Siar, 80 nM, transfektoitiin D0) positiivisena kontrollina. * – P 0,05, ** – P 0,01, verrattuna kontrolliin, n = 4; B, solusyklikontrollin määritystä LNCaP (inkuboitu 2% FCS sisältävää RPMI) samoissa olosuhteissa kuin MTS-määritys (A) (D3 on yhtä kuin 100 nM 1,25-dihydroksi D3), jonka suorittaa virtaussytometrillä solut värjättiin propidiumjodidilla. * – P 0,05, ** – P 0,01, § – P 0,05 vs. D3-vitamiini; n = 3. C, western-blottaus lisääntyvien solujen tuma-antigeenin (PCNA) on edellä kuvatulla verrattuna p-aktiini. D, apoptoosimäärityksessä suorittaa virtaussytometrialla kuin subG1 populaatio LNCaP-soluja viljeltiin 2% FCS: ää sisältävää RPMI värjättiin propidiumjodidilla. * – P 0,01 vs. kontrolli; n = 3.

solusyklin määrityksessä käytetään propidiumjodidivärjäys suoritettiin tarkkoja vaikutuksia TRPV6 Knockdown sekä 1,25-dihydroksi D3 vaikutuksia ja rooli TRPV6 siinä, solusyklin vaihe jakelu LNCaP-soluja viljeltiin 2% FCS, joka sisälsi RPMI-väliainetta (Fig. 2B). Itse asiassa olemme vahvistaneet, että siRNA-TRPV6 vähensi solujen merkitty S-vaiheessa. Prosenttiosuus soluista tuli S-vaihe oli merkittävästi korkeampi 100 nM 1,25-dihydroksi-D3-käsitellyissä soluissa kuin verrokeilla. Pretransfection LNCaP-solujen siRNA-TRPV6 heikennettyjä 1,25-dihydroksi D3 lisäsi jakautumista, mutta ei täydessä laajuudessa. siRNA-AR, kuten edellä käytettiin positiivisena kontrollina ja se osoitti huomattavaa laskua% soluista tuli S-vaiheessa.

seurataan myös proteiinin taso proliferoivan solun tuma-antigeeni (PCNA) käyttäen samoissa olosuhteissa. PCNA vaikutti olevan merkittävästi vähentynyt upon siRNA-TRPV6 knockdown. 1,25-dihydroksi-D3-käsiteltyjä soluja ilmaistaan ​​2-kertaa vähemmän PCNA, kuten havaittiin myös yhdistetyn hoidon siRNA-TRPV6 ja 100 nM 1,25-dihydroksi-D3. Taso PCNA siRNA-AR-käsiteltyjä soluja ei ollut havaittavissa (kuvio. 2C).

solusyklin määritys sallii myös mittaamalla apoptoottisten solujen määrässä kuin subG1 väestöstä käyttää. 100 nM 1,25-dihydroksi D3 ei ollut vaikutusta apoptoosiin itse taas siRNA-TRPV6 ollut merkittävää vaikutusta apoptoosiin rate (Fig. 2D). Kuitenkin, yhdistämällä käsittely 100 nM 1,25-dihydroksi-D3 kanssa transfektio siRNA-TRPV6 lisäsi merkittävästi apoptoottisten solujen määrässä paljon enemmän kuin siRNA-TRPV6 esikäsittely yksinään (Fig. 2D). Siten TRPV6 on mukana sekä leviämisen ja apoptoosin vastus LNCaP ja vaikutukset 1,25-dihydroksi D3 riippuvat voimakkaasti TRPV6 ilme.

TRPV6 välittää 1,25-dihydroksi D3-aiheuttama Ca

2 + -uptake LNCaP-soluissa

jotta tutkia osuutta TRPV6 kuin erittäin Ca

2 + selektiivinen kanavan Ca

2 + -uptake LNCaP-soluissa, mittasimme solunsisäinen kalsiumpitoisuus ([Ca

2 +]

i) LNCaP-soluissa viljelty 2% FCS, joka sisälsi RPMI jälkeen seurauksena muutoksia solunulkoisessa kalsiumpitoisuus ([Ca

2 +]

o). Kontrollisoluissa käsiteltiin EtOH (CTRL) vaihtelut [Ca

2 +]

O tuotetaan merkittäviä muutoksia [Ca

2 +]

i (Fig. 3A). siRNA-TRPV6 Knockdown laski amplitudi 2 mM [Ca

2 +]

O-herätti kasvu [Ca

2 +]

i (Fig. 3A ja C). 100 nM 1,25-dihydroksi D3 kasvoi itsestään pohjapinta [Ca

2 +]

i merkittävästi sekä lisääntynyt [Ca

2 +]

i vastauksen soveltamisesta 2 mM [Ca

2 +]

o joka oli täysin päinvastaiseksi esikäsittely siRNA-TRPV6 (Fig. 3C). Nämä tiedot osoittavat, että TRPV6 konstitutiivisesti välittää Ca

2 + -uptake LNCaP-soluissa ja TRPV6 myös osuus 1,25-dihydroksi-D3-välitteisen parannettu Ca

2 + -uptake.

A, TRPV6 osallistuminen Ca

2+ kertymä LNCaP viljeltiin 2% FCS sisältävää RPMI ja käsiteltiin joko siCT (CTRL) tai siRNA-TRPV6 (molemmat 80 nM, 24 tuntia). B, Ca

2+ kertymä LNCaP viljeltiin 2% FCS sisältävää RPMI ja alle 1,25-dihydroksivitamiini D3 (100 nM, 3 päivää) käsitellään joko siCT (CTRL) tai siRNA-TRPV6 (molemmat 80 nM, 24 tuntia). C, vastaava histogrammi, joka esittää suhteellista [Ca

2 +]

i tasoilla jälkeen seuraava [Ca

2 +]

O kytkimet olosuhteissa kuten edellä. * – P 0,05 (verrattuna kontrolliin); ** – P 0,01, n = 140

vaikutukset 1,25-dihydroksi-D3 eri androgeenistä riippumattomia solulinjoja

Kaksi eri androgeenistä riippumattomia solulinjoja käytetyt: androgeenireseptoriantagonistin puutosta DU-145 ja androgeenin tunteeton LNCaP C4-2 solulinjoissa. Soluja viljeltiin samoissa olosuhteissa 2 tai 10% FCS RPMI ja vaikutukset 1,25-dihydroksi D3 tutkittiin (Kuva. 4). Vaikutukset 1,25-dihydroksi D3 androgeenireseptorin puutteellinen DU-145-solulinja oli todennäköisesti seerumin riippuvaista vuodesta 2% FCS proproliferative vaikutukset 1,25-dihydroksi D3 oli säilytetty (kuvio 4A), kun taas 10 % FCS sen vaikutukset kumottiin (Fig. 4B). Toinen solulinja tunteeton steroideja, mutta silti ilmentävät androgeenireseptorin, LNCaP C4-2 käytettiin, jos vaikutukset 1,25-dihydroksi-D3 osoitettiin olevan FCS-riippumaton ja 100 nM 1,25-dihydroksi-D3 kohdistuu sen voimakas anti-proliferatiiviset vaikutukset (Fig. 4C-D). Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR suoritettiin osoittaa säätelyyn TRPV6 ilmentymisen DU-145-soluissa 100 uM 1,25-dihydroksi D3 sekä 2 ja 10% FCS sisältävässä alustassa (Fig. 4E). Steroidi-puutteellisissa olosuhteissa tapauksessa LNCaP-soluja (LNCaP-ST) käytettiin myös vahvistaa, että induktio TRPV6 ilmentymisen riippuu vahvasti steroidin pitoisuus viljelyväliaineessa (Fig. 4F). Siten pro-proliferatiiviset vaikutukset 1,25-dihydroksi-D3 kasvuun PCa solujen määritetään sen kyky indusoida TRPV6 kanavan ja sen induktio näyttää olevan voimakkaasti steroidi-riippuvainen.

A, B, vaikutukset 1,25-dihydroksi-D3 androgeenireseptorin-puutteellisia DU-145-solulinjan sekä 2 ja 10% FCS: ää sisältävää RPMI (A ja B, vastaavasti), * – P 0,05 (verrattuna kontrolliin ), n = 3. C, D, vaikutukset 1,25-dihydroksi D3 on androgeenireseptorin erottelua LNCaP C4-2 solulinja sekä 2 ja 10% FCS sisältävää RPMI (C ja D, vastaavasti), * – P 0,05 (verrattuna kontrolliin), n = 3. E, suhteellinen ilmentymistaso TRPV6 kanavan DU-145-soluja käsiteltiin 100 uM 1,25-dihydroksi-D3 3 päivä 2 ja 10% FCS: ää sisältävää RPMI medium, * – P 0,05 (verrattuna kontrolliin), n = 3. F, ilmaus TRPV6 kanavan aiheuttama 100 nM 1,25-dihydroksi-D3 3 päivää LNCaP-solujen steroidi-menettänyt RPMI (LNCaP- ST), n = 3.

keskustelu

Yksi tärkeä havainto esillä työ on, että 1,25-dihydroksi D3 voi tehostaa leviämisen LNCaP. Olemme selkeästi osoittaneet, että sekä proliferaationopeus ja solujen lukumäärä pääsemästä S-vaiheen kasvatetaan upon 1,25-dihydroksi D3 hoitoa. Nämä vaikutukset täysin riippuvaisia ​​ilmentymistä ja toimintaa TRPV6 kanava, joka on aiemmin osoitettu olevan osallisena eturauhassyövän kasvua ja apoptoosin vastus [15]. Aiemmin raportoitu 1,25-dihydroksi D3 lisääntymistä estävä aktiivisuus eturauhasen syöpä voi vaarantua TRPV6 säätelyä.

Useat teokset on jo julkaissut TRPV6 induktion 1,25-dihydroksi D3 suolistossa [19], munuaisen [20], puoliympyrän muotoinen kanava [21], ja jopa syöpäsolujen [22]. Viisi VDR reagoiva elementit löydettiin ihmisen koodaava geeni epiteelin kalsiumkanavan TRPV6 viittaa sen suora sääntely 1,25-dihydroksivitamiini D3 kautta mahdollista reseptoria [17]. Olemme vahvistaneet meidän solumallissa että ilmaus TRPV6 suoraan voimistuvan 1,25-dihydroksi D3-annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla. Tuloksemme viittaavat siihen, että luonne ilmentymisen lisääntyminen on steroidiriippuvaiset koska steroidi-riistää olosuhteet vaikutukset 25-dihydroksi D3 lakkautetaan. Tämä havainto on yhdenmukainen tietojen toiminta 1,25-dihydroksi D3 LNCaP-solut ovat riippuvaisia ​​steroidi yhteissääntelyä ja että esimerkiksi androgeenireseptorin ilmentymisen lisääntyminen 1,25-dihydroksivitamiini D3 todennäköisesti edistää synergistinen toimia 1 , 25-dihydroksivitamiini D3 ja DHT näissä soluissa [23]. Tiedot laboratorion Feldman osoittavat, että lisäämällä DHT 1 nM keskipitkällä palautti antiproliferatiivista aktiivisuutta 1,25-dihydroksi D3, kun taas antiandrogeeni, Casodex, täysin tukossa 1,25-dihydroksi D3 antiproliferatiivisia ja PSA stimulaatio toimintaa kun soluja viljeltiin FBS: ia [23].

kyky 1,25-dihydroksi-D3 estää eturauhasen kasvua, on osoitettu ensisijainen viljellyistä soluista peräisin normaaleista kudoksista, eturauhasen hyvänlaatuinen liikakasvu (BPH) ja eturauhassyövän ja useita ksenograftimalleja eturauhassyövän [5], kuitenkin, ei ole mitään tekemistä TRPV6 reagointikykyä on osoitettu tähän mennessä. Mekanismi 1,25-dihydroksi D3 aktiivisuus ei ole täysin selvä, mutta koskee eri toimintaa edeltävälle reseptoriin farmakokineettisistä eroista, sekä eroista toiminnalliset konformaatio ligandisitoutuneena VDR monimutkainen, joka voi muuttaa ominaisuuksia retinoidi X -reseptorin hybridisaatio, DNA: ta sitova ja koaktivaattoria rekrytointi [24]. Mekanismi kasvun inhibition 1,25-dihydroksi-D3 näyttää olevan mutifactorial mutta induktio p21

WAF1 /CIP1 ja /tai p27

Kip1 näyttää olevan merkittävä reitti [25].

Olemme ensimmäinen ilmoittaa, että vaikutukset 1,25-dihydroksi D3 voi olla pro-proliferatiivisia kun välittyy suoraan induktio

trpv6

geenin ilmentymistä ihmisen erittäin syöpä- androgeeniriippuvaisissa LNCaP-solulinjasta. Kysymys jää avoimeksi, 1,25-dihydroksi D3 hoito on toteutettavissa syövän vaiheissa ja etäpesäkkeiden ollessa erillisiä korkea TRPV6 ilmaisua, tai muuten, että eturauhassyövän solut koepaloja vielä reagoi 1,25-dihydroksi D3 käsittely yliekspressiolla TRPV6.

Näin 1,25-dihydroksi D3 ylössäätelee TRPV6 mikä lisää huomattavasti [Ca

2 +]

i tehostetun Ca

2 + -uptake mukaan LNCaP. Tämä 1,25-dihydroksi-D3-indusoitu Ca

2 + -uptake lisää merkittävästi proliferaation nopeuden ja solujen lukumäärä pääsemästä S-vaiheen ja edistää myös parannettu apoptoosiresistenssiin. Kiehtovan, apoptoosin pysyy muuttumattomana, kun 1,25-dihydroksi-D3-hoito, joka voidaan selittää reagointikykyä LNCaP-solulinjan 1,25-dihydroksi-D3 kautta lisäämään ilmentymistä TRPV6 kanavan ja siten parantaa vastustuskykyä apoptoosin. Kuitenkin, kun LNCaP-soluja käsiteltiin 1,25-dihydroksi-D3 mutta pretransfected siRNA-TRPV6 ja näin ollen vailla tämän kanavan ne ovat paljon enemmän alttiiksi apoptoosin, että se on verrattavissa vaikutus siRNA vastaan ​​AR käytetään positiivisena kontrollina. Tämä merkitsee sitä, että kalsium syötetään syöpäsolun kautta TRPV6 kanavaa käytetään vaikutusten torjumiseksi 1,25-dihydroksi-D3, joka on oltava antiproliferatiivinen puuttuessa tai alhainen läsnä tämän kanavan. Voimme päätellä, että TRPV6 on vakava määräävä 1,25-dihydroksi D3 pro- tai antiproliferatiivista aktiivisuutta.

tiedot eivät ole ristiriidassa aiemmin julkaistuja teoksia ja ovat sopusoinnussa hypoteesin, että kasvua estäviä vaikutuksia 1 , 25-dihydroksivitamiini D3 ovat osittain välittyvät sen kyvyn moduloida PCNA ilmaisun [26]. PCNA proteiini taso on kaksijakoinen laski upon 1,25-dihydroksi D3 hoito on edelleen vähentynyt LNCaP siRNA-TRPV6 kanssa tai ilman 1,25-dihydroksi D3.