Krooninen sairaus

tiivistelmä

kasvaimeen liittyvät makrofagit tiedetään vaikuttavan syövän etenemiseen moduloimalla immuunijärjestelmän toimintaa, angiogeneesi, ja solujen etäpesäke kuitenkin tiedetään vain vähän kemokiinin signalointi verkot, jotka säätelevät tätä prosessia. Hyödyntämällä CT26 koolonkarsinoomasoluissa ja RAW 264.7 makrofageissa mallina matkapuhelinjärjestelmä, osoitamme, että hoito CT26 solujen RAW 264.7 väliaine indusoi solujen vaeltaminen, invaasio ja metastaasi. Inflammatorinen geeni microarray-analyysi osoitti CT26 stimuloimaa RAW 264.7 makrofageissa upregulate SDF-1α ja VEGF, ja että nämä sytokiinit edistävät CT26 maahanmuuttoa

in vitro

. RAW 264.7 makrofageissa osoitti myös vankka kemotaktinen vaste kohti CT26 johdettuja kemokiinit. Erityisesti mikrosiruanalyysi ja toiminnallinen testaus paljasti CSF-1 merkittävänä kemoattrak- RAW 264.7 makrofageissa. Mielenkiintoista on, että kanan CAM malli syövän etenemisen, RAW 264.7 makrofageissa lokalisoitu nimenomaan kasvain reuna joissa niiden todettiin kasvavan CT26 kasvaimen kasvua, mikrovaskulaarinen tiheys, verisuonten häiriöitä, ja keuhkojen etäpesäkkeiden, mikä viittaa näiden solujen kotiin aktiivisesti tunkeutuvat alueille kasvain, mutta ei hypoksinen ydin kasvaimen massan. Tueksi Näiden havaintojen hypoksinen olosuhteet säädeltiin CSF-1 tuotannon useissa kasvainsolulinjoissa ja laski RAW 264.7 syöjäsolujen

in vitro

. Yhdessä meidän havainnot viittaavat malliin, jossa normoxic kasvainsolujen release CSF-1 rekrytoida makrofagien kasvaimen reuna jossa ne erittävät liikkuvuutta ja angiogeenisten tekijöiden, jotka helpottavat kasvainsolun invaasiota ja etäpesäkkeiden.

Citation: Green CE, Liu T, Montel V, Hsiao G, Lester RD, Subramaniam S, et ai. (2009) kemoatraktanttina signaloinnin kasvain solut ja makrofagit säätelee Cancer Cell Migration, etäpesäke ja Neovaskulaarinenisaatio. PLoS ONE 4 (8): e6713. doi: 10,1371 /journal.pone.0006713

Editor: Derya Unutmaz, New York University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 22, 2009; Hyväksytty: 09 heinäkuu 2009; Julkaistu: 21 elokuu 2009

Copyright: © 2009 Green et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: CEG, TL ja R.L.K tukevat NIH avustuksia R01CA097022 ja R01GM068487. V.M., R.D.L ja S.L.G. tukevat NIH apurahan R01CA94900. G.H. ja S. S. tukevat NIH apurahan R01GM078005. www.nih.gov. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

taipumus kasvainten edistymistä ja etäispesäkkeitä kuvastaa paitsi onkogeenisel- mutaatioita syöpäsoluissa mutta myös dynaaminen yhteisvaikutukset hyvänlaatuisen solujen kasvainsolun microenvironment. Ei-pahanlaatuisia soluja, jotka tunkeutua sairastua syöpään sisältyvät fibroblastit, rasvasolut, endoteelisolut, verisuonia soluja, ja immuunijärjestelmän solujen, jotka kaikki voivat myötävaikuttaa syövän etenemisessä [1]. Joukossa immuunisolujen, makrofagien on osoitettu tukea tätä politiikkaa, edistää kasvainsolujen selviytymistä, proliferaatiota, ja etäpesäkkeiden [2]. Kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM) on johdettu kiertävä ääreisverenkierron monosyytit, jotka ovat kiinnostuneita kasvaimen verisuonistossa, jossa ne ekstravasoitumaan interstitiumissa ja eriyttää [3]. Vaikka ohjautuminen makrofagien kasvaimiin on huonosti ymmärretty, kasvaimen solujen tiedetään vapauttaa makrofagien kemoattraktantteja, kuten CCL2: n, CCL5, CCL7, CCL8, CXCL12, VEGF: n ja CSF-1 [4]. Verrattuna perinteisesti aktivoitu makrofagit (M1), jotka toimivat ensisijaisena efektorisolujen synnynnäisen immuunijärjestelmän, M2 TAMeja tukea kasvainten selviytymistä edistämällä paikallisten angiogeneesiä ja kudoksen uudelleen, kun taas tukahduttaa immuunivastetta [5]. TAM paikallistaa invasiivisesta alueita kasvain, jossa ne erittävät erilaisia ​​sytokiinejä ja osallistuvien proteaasien aktiivisuutta kasvainsolun invaasiota ja etäpesäkkeiden [6], [7]. Tässä roolissa TAMeja aktiivisesti edistää kasvaimen etenemistä ja siirtymistä maligniteetin joka usein korreloi huonon kliinisen tuloksen. Kuitenkin selvittämisessä kasvainsolulyysiksestä kemokiinin verkot, jotka säätelevät syövän etenemisessä

in vivo

on edelleen suuri haaste.

Angiogeneesi, joka on kriittinen syövän etenemisen, ohjataan useista tekijöistä tiedetään edistää verisuonten kasvua ja /tai kypsymisen, mukaan lukien VEGF, TGF-β, EGF, bFGF: n ja TNF-α. TAM edustavat ensisijainen lähde monet näistä angiogeenisten proteiinien kasvaimen microenvironement [8], [9], [10]. Erityisesti VEGF vapautetaan TAMeja ja on voimakas kannustin kasvua uusien verisuonten lisääntynyt mikrovaskulaarinen tiheys, verisuonten häiriöitä, ja vuotaa [11]. Verisuonet, joita ollaan remodeling ovat huokoisia ja hauraita ja siten alttiimpia kasvainsolun intravasation [12]. Siksi leviämisrintamassa, TAM saattaa edistää kasvainten etäpesäkkeiden stimuloimalla muodostumista tiheä mikrovaskulaaristen verkkojen vuotavien aluksia, jotka ovat sallittuja kasvainsolupinta intravasation, samalla aktivoivat syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota vapauttamalla erilaisia ​​kemokiinien, mitogeenien ja proteaasit.

lisäksi invasiivisia edessä, TAM voidaan myös paikallistaa sen suonettoman hypoksinen ydin kasvaimen [13], [14]. VEGF vapautuu TAMeja kasvaimen ytimessä vastauksena hypoksia ja vakauttamiseen HIF1α ja HIF2α [15], [16]. VEGF voi myös olla mukana rekrytoinnissa TAMeja kasvaimen ytimen, lisäksi muita heikosti määritelty esiintyvät tekijät solupirstaleiden aiheutuvat tuumorinekroositekijä [13]. Kun lokalisoitu ytimeen, liitettäväksi fax paitsi selkeä solujen roskat vaan myös säädellä uudissuonittumista ja kasvaimen selviytymistä. Näin ollen on olemassa osajoukkoja TAMeja että differentiaalisesti jaetaan kasvaimen mikroympäristössä että palvelemaan erikoistunut rooleja syövän etenemisen [2]. Oletamme, että kasvaimen hapettuminen on määräävä tekijä makrofagien aktiivisuuden syövissä. Esimerkiksi vuonna hypoksinen kasvain ydin, liitettäväksi fax ensisijaisesti angiogeeninen ja phagocytic, kun taas alle normoxic olosuhteissa kasvaimen reuna, TAM saattaa edistää kasvainten etäpesäkkeiden lisäämällä kudoksen uudelleen ja verisuonten tiheyden. Jälkimmäisessä tapauksessa, VEGF vapautuminen TAMeja voidaan säädellä riippumatta hypoksian vuorovaikutusten kautta invasiivisen kasvainsolujen tai stroomasolut.

merkityksen ymmärtäminen TAMeja syövän etenemisen

in vivo

mutkistaa in kyky tulkita monista seikoista läsnä microenvironment kasvain. Siksi mallijärjestelmiin että kerrata

in vivo

kasvainsolun-TAM vuorovaikutuksia

in vitro

ovat tarpeen auttaa purkamaan monimutkaisia ​​syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden määritellyissä olosuhteissa. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme kehittäneet mallijärjestelmä suoraan tutkia sytokiinisignaloinnin välillä CT26 paksusuolen syövän solujen ja RAW 264.7 makrofageissa. Tämän ainutlaatuisen mallin järjestelmä, me osoitamme, että RAW 264.7 makrofagien ja CT26 kasvainsolut toisiaan puoleensa toisiinsa ja että makrofagit indusoivat laajasti vaeltavia ja protrusive fenotyypin kasvainsoluissa. Tulehduksellinen geenin erilaisia ​​analyysi ja toiminnallinen testaus paljasti, että kasvain-soluista peräisin CSF-1 on merkittävä kemoattraktantti RAW 264.7 makrofagien ottaa huomioon, että makrofagi johdettu SDF-1α: n ja VEGF edistää CT26 syöpäsoluinvaasiota. Edelleen, yhteensä 270 geenien RAW 264.7 makrofageissa ja 85 geenien CT26 kasvainsolut olivat ylä- tai alassäädetty aikana inkubointia elatusaineessa, mikä viittaa siihen, että uudet reitit pidemmälle kuin testattu todennäköisesti aktivoituvat kaksisuuntaisen signaloinnin. Vuonna kanan CAM ympätty kasvainsolujen, RAW 264.7 makrofageissa paikallistaa kasvain reuna, missä ne helpottavat verisuonten remontin ja kasvainsoluihin etäpesäkkeitä poikasen keuhkoihin. Nämä tulokset tukevat sitä mallia, jossa parakriinisella välinen signalointi kasvaimen solut ja makrofagit säätelee lokalisoinnin makrofagien sisällä kasvain ja taipumusta kasvainsolujen etäpesäkkeitä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat, reagenssit ja vasta

CT26 hiiri koolonsyöpälinjan, RAW 264.7 hiiren makrofagi linjan ja MDA-MB-468 rintasyöpä linja hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). CL16, metastaattinen variantti MDA-MB-435, on peräisin aikaisemmin kuvatulla tavalla [17]. CT26-soluja ylläpidettiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää, 1% penisilliini-streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad CA) ja 1% glutamiinia. RAW 264.7, MDA-MB-468 ja CL16-soluja viljeltiin DMEM: ssä (Invitrogen, Carlsbad CA), johon oli lisätty 10% FBS: ää, 1% penisilliini-streptomysiiniä ja 1% glutamax (Invitrogen, CA). RAW 264.7 ilmentävät GFP valmistettiin infektoimalla solut Lenti-Green supernatantti (BioGenova, Rockville, MD). Korkeimmat 0,1% ilmentävät solut lajitellaan FACS. CT26-solut ilmentävät DsRed tuotettiin infektoimalla solut lentivirus, pEF1-DsRed-pur, jota seurasi valinta käyttäen puromysiiniä (1 ug /ml). Milloin on osoitettu, soluja käsiteltiin estää anti-CSF-1R-mAb (AFS98, eBioscience, San Diego, CA), estää anti-EGF-R (Millipore, Billerica, MA), hiiren rekombinantti-CSF-1 (R DMEM, jossa oli 0,1% RIA-luokan fraktio V BSA: ta (Sigma-Aldrich), 1% penisilliini-streptomysiiniä ja 1% glutamiinia), täydellinen media (DMEM, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 1% penisilliini-streptomysiiniä ja 1% glutamiinia), väliaine tai muuttoliike puskuria, joka sisältää SDF-1α (100 ng /ml), VEGF165 (10 ng /ml), EGF: ää (100 ng /ml) tai CSF-1 (40 ng /ml), kuten on osoitettu. Ilmastoitu mediat kerättiin CT26 tai RAW 264.7 viljelmistä 48 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa. Laimennukset pakatun medioita tehtiin asianmukainen perusta elatusaineet. Milloin on osoitettu, anti-CSF-1R (20 ug /ml) ja anti-EGF-R (20 ug /ml) oli läsnä sekä ylä- että kaivojen koko määrityksen. Seerumin puutteessa RAW 264.7 tai CT26-solut poistettiin viljelymaljoihin Hanksin tasapainotettuun suolaliuokseen, joka sisälsi 5 mM EDTA: ta ja 25 mM Hepes, pH 7,2, ja 0,01% trypsiiniä, pestiin kahdesti muuttoliike puskurilla ja suspendoitiin sitten uudelleen siirtymätesteissä puskurissa 10

6 solua /ml. 10

5 solua 100 ul: ssa siirtolaisuuden puskuria lisättiin sitten päällekkäin maahanmuuton kammioon ja sen annettiin kulkeutua alapuolelle huokoisen kalvon eri kertaa kolmena kappaleena. RAW 264.7 siirtynyt 24 tuntia kaikissa olosuhteissa ja CT26 muuttivat 3 tuntia kaikissa olosuhteissa. Nonmigratory solut ylemmän kalvon pinnan poistettiin vanupuikolla, ja muuttavat solujen kiinnitetty pohjaan membraanin pinta värjättiin 0,1% kristalliviolettia 0,1 M boraattia, pH 9,0, ja 2% etanolia 20 min huoneen lämpötila. Lukumäärä chemotaxing solua per kalvo laskettiin käyttäen käänteisen faasikontrastimikroskooppia 40X. RAW 264.7 kemotaksista hypoksisissa olosuhteissa, alempi kammio, johon on lisätty täysin DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää luoda kemotaktinen kaltevuus. RAW 264.7 annettiin sitten siirtyä 24 tuntia alle normoxic (21% happea) tai hypoksinen (1% happea) olosuhteissa käyttäen IsoTemp inkubaattorissa (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Vaeltavat solut kiinnitettiin 100% metanolissa 5 minuutin ajan ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla 0,1 M boraattia, pH 9,0, 2% etanolia 20 min. Membraanit leikattiin Transwell ja laitettiin 200 ml: ssa 10%: etikkahappomarkkinoiden eluoimiseksi tahra sitten absorbanssi luettiin 570 nm: ssä.

tutkimiseksi makrofagien tunkeutuminen kollageeni, CT26-DsRed tai punainen fluoresoiva (580 nm viritys /605 nm emissio) polystyreeniä mikropalloja (10 um; Molecular Probes, Carlsbad, CA) on upotettu steriilisuodatetussa tyypin 1 kollageeni geeli (PureCol; Nutacon, Leimuiden, Alankomaat), joka sisälsi 1X RPMI (Sigma-Aldrich), 25 mM natriumfosfaattia bikarbonaatilla ja pH säädettiin arvoon 7,4 käyttäen 0,1 M natriumhydroksidia, kuten aiemmin on kuvattu [19]. Kollageenin, joka sisälsi CT26-DsRed (10

7 solua /ml) tai helmien (10

7 helmeä /ml), annettiin geeli 10 ul: n fibronektiinin (10 ug /ml, Sigma-Aldrich) päällystetyn Lab-Tek kammio dioja (Nunc, Rochester, NY) 30 minuutin ajan ennen kuin lisättiin RAW 264.7-GFP (10

5 solua /ml). Alustava migraatio RAW 264.7-GFP rajapinnassa kollageenin pudotus kuvioitiin klo 20X (NA = 0,75) 12 tunnin ajan 4 kuvaa /h käyttäen Nikon C1-Si käänteinen -konfokaalimikroskoopilla (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) varustettu PMT ilmaisimet ja laserit sopiva GFP (488 nm) ja DsRed (561 nm). Descanned kuvat hankittiin käyttäen Nikon EZ-C1 ohjelmisto sitten sulatettu solujen seurannan avulla Imaris (Bitplane, Saint Paul, MN). Sijainti koordinaatit centroids yksittäisten RAW 264.7-GFP kirjattiin kussakin kehyksessä yli timecourse muuttoliikkeen. Nämä koordinaatit käytettiin sitten laskea uppouma ja kokonaismatka muuttivat solujen sisä- ja ulkopuolella 100 pm kollageenin pudota rajan. Leikkeitä inkuboitiin vielä 7 päivää, sitten kuvataan käyttämällä konfokaalimikroskopialla (10X, NA = 0,45) 1 um: n välein koko Z-akselin kollageenin pudota.

kana CAM-määritys

kanan alkion etäpesäke määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [20], [21]. Lyhyesti, CT26-DsRed (2 x 10

6 solua) yksin tai yhdistettynä RAW 264.7-GFP (2 x 10

5 solut) solut suspendoitiin jäällä Matrigel (BD Bioscience) sitten ympättiin poikasen suoni kalvo (CAM) kehitystoksi- päivänä 9. Kun 11 päivää, kehittävään päivänä 20, alkioita uhrattiin ja ensisijainen tuumorit poistettiin, kuvaamisen at 0.63X ja 2X mukaan stereomikroskooppikäyttöön, punnittiin ja mitattiin halkaisija. Sydän ja keuhkot eristettiin, ja solujen levittämistä kvantifioitiin laskemalla soluklusterien käyttämällä konfokaalimikroskopia 10x (NA = 0,45), jonka vaihe etäisyydellä 1 mikrometriä. Kasvaimet sittemmin leikkeet ja laitettiin suoraan lasikannella kuvantamiseen konfokaalimikroskopiaa (10X, NA = 0,45). Kasvaimia kuvattiin 0-0,5 cm reuna tai reuna (kasvaimen kehällä), 0,5 cm 1 cm kehältä (kasvain seinä) ja 1,0 cm 3 cm kasvaimen reuna-(kasvaimen ydin). Kvantitointi RAW 264.7-GFP jakauma CT26-DsRed kasvainten määritettiin keskiarvo GFP pikselin bittinen kartat yli näkökenttä tuottamaan fluoresenssin voimakkuuden keskiarvo kullekin alueelle kasvaimen käyttäen Image Pro Plus v4.5 (Media Cybernetics, Bethesda , MD). Kirkkauden ja kontrastin säädöt tehtiin tasapuolisesti kaikkia kanavia ja ei muuttanut suhteelliset erot GFP pikselin intensiteettiä eri alueilla kasvain.

qPCR

CT26, MDA-MB-468 tai CL16 kasvainsoluja inkuboitiin 37 ° C: ssa sopivan täydellisessä elatusaineessa 24 tuntia hypoksisissa (1,0% happea) tai normoxic (21% happea) olosuhteissa. Kokonais-RNA uutettiin sitten käyttäen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA), valmistajan mukaan suosituksia. cDNA syntetisoitiin 2 ug kokonais-RNA: sta käyttäen iScript cDNA-synteesin kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). qPCR suoritettiin käyttäen System 7300 väline (Applied Biosystems, Foster City, CA), ja yhden askeleen ohjelma: 95 ° C, 10 min; 95 ° C, 30 x, 60 ° C: ssa, 1 min 40 sykliä. CSF-1 ja GAPDH-mRNA: n tasot mitattiin kolmena rinnakkaisena ja normalisoidaan HPRT-1-mRNA: n.

Microarray-analyysi

tutkimiseksi inflammatorista geenin ilmentymistä, ilmastoitu puskureita kerättiin CT26 tai RAW 264.7 viljelmistä 48 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa ja lisättiin viljelmiä vastakkaisten solutyypin 24 tuntia. mRNA eristettiin sitten käyttämällä RNeasy-kittiä (Qiagen, Valencia, CA), käänteiskopioitua käyttäen iScript cDNA-synteesin kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ja analysoitiin kolmena kappaleena hybridisoimalla Codelink Mammalian Tulehdus Bioarray sisältävät yksijuosteisen 30 -mer oligonukleotidikoettimia (GE Healthcare, Piscataway, NJ), valmistajan mukaan suosituksia. Raaka-geenin ilmentyminen rinnakkaiskokeista laskettiin keskiarvo ja normalisoitiin käyttämällä CodeLink Gene Expression Analysis v5.0 Software (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Määrittämään tilastollisesti merkitsevä säätelyä tai downregulation geenitranskriptien, haimme Variance- mallinnettu Posterior päättely Regional Exponentials (VAMPIRE) mikrosiruanalyysi web Suite raaka transkriptio ilmaisun arvoja, kuten aiemmin on kuvattu [22], [23]. Ryhmä kerrallaan virhe liittyy monivertailuja korjattiin käyttämällä konservatiivista Bonferroni korjattu raja on 5% (alfa = 0,05). Hierarkkinen klusterointi standardoituja array tietojen suoritettiin käyttäen dChip (etäisyys: korrelaatio, sidos: Centroid), joka perustuu geenin ontologian annotointeja angiogeneesin, solujen lisääntymisen ja kemotaksista [24]. Sillä heatmap analyysi, intensiteetti pistemäärät lasketaan merkityksestä geenin ylä- tai alassäätöä, määritettynä VAMPIRE analyysi. Nämä geenit toteutettiin tämän jälkeen perustuen geeni ontologian annotointeja angiogeneesin, solujen lisääntymisen ja kemotaksista käyttämällä dChip (etäisyys metrinen: korrelaatio, sidos menetelmä: keskiarvo).

Tilastollinen

Tietojen analysointi suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism versio 4.0-ohjelmisto (GraphPad Software, San Diego, CA.). Kaikki tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SE. Nonparametric ryhmä tulokset analysoitiin varianssianalyysillä (ANOVA) ja Neuman-Keuls testin jälkeen. Gauss-jakautunut keskiarvot analysoitiin Student

t

testiä. Ryhmä vertailuja pidettiin merkittävä 2-tailed

P

arvot alle 0,05.

Tulokset

Muuttoliike ja morfologiset analyysi CT26 Syöpäsolut viljeltiin yhdessä RAW 264.7 Makrofageilla

ensin suoritetaan kinemaattisen analyysin kasvainsolun muuttoliikkeen käyttäytymistä ja määrätietoinen solujen muoto muuttuu vastauksena yhteistyötä kulttuurin makrofageihin. Suoraan tutkia, miten makrofagit muuttaa muuttavien käyttäytyminen ja pysyvyys koolonkarsinoomasoluissa, CT26 hiiren paksusuolen syövän solut kuvattiin konfokaalimikroskopiaa yhdessä viljelemisen aikana 15 tuntia, kun läsnä tai poissa RAW 264.7 hiiren makrofageja (Fig. 1

). CT26-solut yksinään osoitti kokonaissiirtymää pituus 199 ± 78 pm (keskimääräinen ± SD) (Fig. 1

B

). Tämä arvo on erotettavissa CT26 viljeltiin yhdessä RAW 264.7-soluja, jotka osoittivat siirtymän pituus 154 ± 46 um. Vaikka samanlainen muuttoliike pituuksia, CT26, jotka olivat viljeltiin yhdessä RAW 264.7 solut vaelsivat pitkin huomattavasti suorempi tie, jossa suoruus arvot 0,34 CT26 viljeltiin yhdessä RAW 264.7 soluja verrattuna 0,15 CT26 yksinään (Fig. 1

B

). Tämä 2-kertainen nousu suoruuden liittyi merkittävä kasvu kokonaisuppoumaa tai pysyvyys Maahanmuuton CT26 soluja viljeltiin yhdessä RAW 264.7 soluja. CT26-solut viljeltiin yhdessä makrofagien näytteillä keskimääräinen tilavuus 49 ± 24 um verrattuna 28 ± 20 pm varten CT26 pelkät solut (Fig. 1

B

). Nämä havainnot viittaavat siihen, että RAW 264.7 makrofageissa edistää muuttoa CT26 solujen

in vitro

. Tärkeää on, CT26 soluja viljeltiin kanssa tai ilman makrofagien osoittivat samanlaisia ​​elinkelpoisuutta. Itse asiassa analyysi kasvainsolujen kasvua usean päivän osoitti, että CT26-solut kasvoivat nopeammin, kun läsnä on makrofagien (tuloksia ei esitetty). Co-viljeleminen RAW 264.7 soluja CT26-solut eivät muutu RAW 264.7 solun tarttumista soluväliaineen proteiinien. Lisäksi arvioinnissa RAW 264.7 solun käyttäytymistä tässä kokeessa ei havaittu merkittäviä eroja vaellusetäisyydet, siirtymä, suoruus, tai solun muodon, kun solut olivat viljeltiin yhdessä CT26-soluja (tuloksia ei esitetä), mikä viittaa siihen, ilman kemiallista kaltevuudet riittävä makrofagin kemotaksista. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että RAW 264.7 makrofageissa aiheuttaa pysyvää CT26 syöpäsolun muuttoliikkeen 2-pintoja.

A, B) CT26-DsRed (10

5 /ml) inkuboitiin fibronektiinin RAW 264.7 GFP (10

5 /ml), kuten on esitetty, 12 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Tänä aikana suoruus, kokonaispituus matkusti ja kokonaisannos siirtymä yksittäisten CT26 solun centroids jäljitettiin (keltaiset viivat) 4 kuvaa /h läsnä ja poissa ollessa RAW 264.7 makrofageissa käyttämällä konfokaalimikroskopialla klo 20X. Tiedot esitetään yksittäisinä rata kvantitointiin 55-75 solujen yli 3 kokeita, joissa keskimääräinen merkitty bar. Suurennus laajuus palkki edustaa 30 um. * Tarkoittaa merkitsevää eroa siirtymäpolun suoruus (p 0,0001). ** Tarkoittaa merkitsevää eroa siirtymäpolun tilavuus (p 0,0001).

kyky syöpäsolujen muodostaa invadapodia ja kalvo ulokkeet on yhdistetty lisääntyneeseen muuttoliikkeen ja kudosten invasiivisuus [25]. Siksi tutkimme CT26 solumorfologiaan vastauksena viljellään yhdessä RAW 264.7 makrofageissa. Sisällä 6 tuntia, co-viljely RAW 264.7 makrofageissa edistettävä tehostettua mesenkymaalisten fenotyyppi CT26 soluissa, ovat tyypillisiä monet pitkä kalvo ulkonemia, jotka säteilevät ulospäin solun elin (Fig. 2

). Tämä morfologia säilyi yli 12 tuntia ja oli ilmeistä kaikissa CT26 solujen Yhdessä viljelemisen, jotka olivat kosketuksissa yhden tai useamman makrofageja (Fig. 2

B

). Määrittämään minimiaika RAW 264.7 soluja herättämään CT26 morfologian muutoksia, mittasimme kinetiikka muodon muutoksen (Fig. 2

C

). Alkaa aluksi solujen tarttuminen maljan, suuret ja pienet akselit vaeltavien CT26-solut määritettiin 20 minuutin välein koko 12 tunnin kulttuurin tai ilman RAW 264.7 soluja käyttäen kammion dia ja konfokaalimikroskopialla. Kuten odotettua, CT26-solut yksinään tai yhdessä viljelemisen olivat tehokkaasti ympäri alkuperäisen tarttuvuus astian muodon indeksit ~ 1. CT26-soluja inkuboitiin RAW 264.7 solut tehtiin nopea soluelongaatiota, kuten pääakselin pitkin polarisoitu kalvo laajennukset oli ~ 4 kertaa pidempi kuin pienemmän akselin jo 4 tunnin jälkeen, alkuperäisen solun tarttumisen verrattuna soluja viljeltiin ilman RAW 264.7 makrofagit (Fig. 2

C

). Muoto muutos saavutti ylänkö ~5.5 jälkeen 8 tuntia yhteistyön kulttuuri. Kuten odotettua, CT26-solut, jotka viljeltiin yksin myös osoitti alussa kasvu kunnossa laajennus kuin ne noudatetaan ja leviämistä. Kuitenkin tässä tapauksessa solut vain laajennettu lyhyen ulokkeita ja jättänyt venyttää merkittävästi, sillä muodon indeksin ainoa saavutti korkeintaan ~ 2 6 tunnin kuluttua viljelyn (Fig. 2

C

). Yhdessä kvantitatiivinen analyysi CT26 solujen vaeltamiseen ja morfologia dynamiikka osoittaa, että RAW 264.7 makrofagit saavat aikaan nopea ja jatkuva kasvu solujen vaeltamiseen, joka liittyy lisääntyneen muodostumisen kalvon ulokkeita.

DsRed-CT26 (10

5 /ml), inkuboitiin fibronektiinin GFP-RAW 264.7 (10

5 /ml), kuten on esitetty, 15 tuntia 37 ° C: ssa. Fluoresenssikuvia hankittiin käyttäen konfokaalimikroskopia (20X) 4 kuvaa /h. A) aikakäyrä Ds-Red-CT26 dynamiikka yli 12 tuntia, kun sitä inkuboidaan yksin tai RAW 264.7-GFP makrofagit. Kuvat edustavat CT26 liikkumisen 3 erillisestä kokeesta. Suurennus laajuus palkki edustaa 20 um. B) Kumulatiivinen CT26-DsRed jakelun ja uloke jälkeen 15 tunnin inkuboinnin yksinään (oikealla) tai RAW 264.7-GFP makrofageja (vasemmalla ja keskellä, vihreä kanava pois päältä). Kuvat ovat edustavia 3 erillisestä kokeesta. Suurennus laajuus palkki edustaa 30 um. C) muoto indeksi (suuret /pieniakseli) on CT26 solujen läsnä ollessa tai poissa ollessa RAW 264.7 soluja seurataan yli 12 tuntia muuttoliikkeen. Data edustaa keskiarvoa ± SEM 10 solua yli 3 eri kokeesta.

RAW 264.7 makrofagien ja CT26 tuumorisoluissa liukenevan Kemotaktiset tekijöitä, jotka edistävät vastavuoroinen Kemotaksia

seuraava tutki induktio invasiivinen fenotyypin CT26 soluissa RAW 264.7 solut johtui suora vuorovaikutus makrofagien tai vastaus liukoisen kemotaktisten tekijöiden vapauttaa makrofagit käyttäen standardia Boyden kammion määritys [18]. CT26-solut osoittivat annoksesta riippuvia ja vankka kemotaktinen vaste kohti gradientilla RAW 264.7 soluravintoliuoksista (CM), kun taas altistuminen ohjata ruselatusaineeseen yksinään ei aiheuttanut vaeltava vasteen (Fig. 3

). Tärkeää on, solujen siirto on pääasiassa suuntaavat kohti konsentraatiogradienttia, kuten tuumorisolun muuttoliikettä väheni -60%, kun RAW 264.7 solun CM lisättiin tasaisesti sekä ylä- että kammioiden (Fig. 3

). Nämä havainnot osoittavat, että RAW 264.7 makrofagit vapauttavat liukoisen tekijöitä, jotka edistävät vaeltamista samansuuntaisesti CT26 koolonkarsinoomasoluissa.

A) CT26 (10

5 /ml) lisättiin ylempään on Boyden-kammion RAW 264.7 elatusaine, kontrollipuskurin tai täydellinen DMEM lisätään alempaan hyvin. CT26 annettiin kulkeutua 3 tuntia 37 ° C: ssa ennen värjäystä ja kvantitoimiseksi kemotaksista. Data edustaa keskiarvoa ± SEM 15-30 satunnaisesti valittujen kenttien 3-6 erillisen kokeen. * Merkitsee merkitys välillä 50% RAW CM ja median ohjaus (p 0,001) ja 50% RAW CM ja 100% RAW CM ylös /alas (p 0,001). B) RAW 264.7 (10

5 /ml) lisättiin ylempään kuoppaan Boyden-kammion CT26 väliaine, hallita puskuria tai täydellinen DMEM lisätään alempaan hyvin. RAW 264.7 annettiin kulkeutua 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa ennen värjäystä ja kvantitoimiseksi kemotaksista. Data edustaa keskimäärin ± SEM 15-30 satunnaisesti valittujen kenttien 3-6 erillisen kokeen. ** Tarkoittaa merkityksen välillä 25% CT26 CM ja median ohjaus (p 0,001) ja 25% CT26 CM ja 100% CT26 CM ylös /alas (p 0,001). C) GFP-RAW 264.7 (10

5 /ml) inkuboitiin fibronektiinillä päällystetyn kammion dioja 10 ui kollageenia tippaa, joka sisälsi DS-Red-CT26 (10

7 /ml) tai 10 um punaisia ​​fluoresoivia helmiä (10

7 /ml). Makrofagin tunkeutuminen kasvaimeen upotettu tai helmi upotettu kollageenin drop kuvioitiin sen jälkeen 7 päivää 10X konfokaalimikroskopialla. Sivukuva ja ylhäältä katsottuna kuvien edustavat keskimääräistä makrofagien vaste yli 6 kollageenin kasvaimia. Suurennus laajuus bar ylhäältäpäin kuvia edustaa 200 um. D) välinen rajapinta makrofagit ja kollageenin kasvain pudotus oli kuvataan useilla konfokaalimikroskopia (20X) 12 tunnin ajan 4 kuvaa /h lisäyksen jälkeen RAW 264.7 kammioon dia. Tänä aikana, dynamiikkaa syöjäsolujen kvantitoitiin seuraamalla yksittäisen solun centroids 4 kuvaa /h. Makrofagit aloittamista muuttoa 100 pm kasvaimen rajan (katkoviiva valkoinen viiva) näytteille keltainen raitoja. Makrofagit aloittamista muuttoliikettä yli 100 pm kasvaimen rajan näytteille valkoinen raitoja. Kuva edustaa keskimääräistä makrofagien vastauksena 6 erillistä kollageenin kasvaimia. Suurennus laajuus palkki edustaa 30 um. E) Track tilavuus ja koko radan pituus oli kvantitoitiin syöjäsolujen sisällä ja ulkopuolella 100 pm kollageenin kasvain rajan. Data edustaa keskiarvoa ± SEM 15 makrofagien sisällä 100 pm ja 15 makrofagit jälkeen 100 pm kollageenin kasvain rajan. #denotes merkittävä ero siirtymäpolun tilavuus (p 0,05). ## Tarkoittaa merkitsevää eroa yhteensä siirtymäpolun pituus (p 0,0001).

RAW 264.7 makrofagit osoittivat vankkaa ja annoksesta riippuvaa kemotaktista vastauksena gradienttia CT26-CM (Fig. 3

B

). Todellakin, laajuus solun siirtymisen laimentamaton CM oli ~ 10-kertaa suurempi kuin pohjapinta tasoilla muuttoliikkeen havaittu vastauksena joko seerumia sisältävää alustaa tai muuttoliike, joka sisälsi ainoastaan ​​naudan albumiinia. RAW 264.7 solujen siirto on erittäin suuntaava ja johdu satunnainen kemokineettiset liikettä kuin lisäämällä CT26 CM sekä ylemmän ja alemman kammiot kumosi kokonaan siirtymä vastaus (Fig. 3

B

). Mielenkiintoista, toisin kuin yhdessä viljelemisen järjestelmä, jossa RAW 264.7 eivät osoita nousua vaellusetäisyydet tai siirtymä, kaltevuuden kemotaktinen tekijöitä Boyden kammiossa oli riittävän jyrkkä saamaan aikaan vankka kemotaksista RAW 264.7 makrofageissa.

tutkimiseksi edelleen makrofagi kemotaksista kohti kasvainsoluja, olemme kehittäneet uuden 3D migraatiokokeessa jossa CT26-solut upotettiin kollageenigeelissä ja paikka tipoittain päälle peitelevy RAW 264.7 solut jakautuvat tasaisesti pitkin kehää geelimatriisista. Kuten on esitetty kuviossa.