Krooninen sairaus

tiivistelmä

lohkaisu ja polyadenylaation kerroin 4 (CPSF4), jäsen CPSF monimutkainen, on keskeinen rooli mRNA polyadenylaation ja mRNA 3 ’päät kypsymistä. Kuitenkin, sen mahdollinen rooli keuhkosyövän synnyssä on tuntematon. Tässä tutkimuksessa selvitettiin biologisen roolin ja kliinistä merkitystä CPSF4 keuhkojen syövän kasvua ja selviytymistä ja selvitetty sen taustalla molekyylitason mekanismeja. Huomasimme, että CPSF4 oli hyvin ilmaistu keuhkoadenokarsinooma solulinjoissa ja kasvainkudoksen mutta oli havaittavissa 8 normaaleissa ihmisen kudoksissa. Olemme myös havainneet, että CPSF4 yliekspressio korreloi huonon kokonaiselossaoloaikaa potilailla, joilla on keuhkojen adenokarsinooman (

P

0,001). Monimuuttuja selviytymisen analyysit paljastivat, että korkeammat CPSF4 ilme oli itsenäinen ennustetekijä varten eloonjäämisaste potilaiden keuhkojen adenokarsinooman. Vastustamisesta CPSF4 siRNA estyy keuhkosyöpään solujen lisääntymistä, pesäkkeiden muodostumista, ja indusoi apoptoosin. Mekanismi tutkimukset paljastivat, että vaikutukset olivat saavuttaa samanaikaisesti modulaatio useita signalointireittien. Knockdovvn CPSF4 ilmentymisen siRNA merkittävästi esti fosforylaatiota PI3K, AKT ja ERK1 /2 ja JNK proteiineja. Sen sijaan, ektooppinen ilmentyminen CPSF4 oli päinvastainen vaikutus. Lisäksi CPSF4 pudotus aiheutti myös katkaisun kaspaasi-3 ja caspse-9-proteiineja. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että CPSF4 on kriittinen rooli säätelyssä keuhkosyövän solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen ja se voi olla potentiaalinen ennustetekijöitä biomarkkereiden ja terapeuttinen kohde keuhkoadenokarsinooma.

Citation: Chen W, Guo W, Li M, Shi D, Tian Y, Li Z, et al. (2013) lisääntymisen merkkejä lohkaisu ja Polyadenylaatio Specific Factor 4 Lung Adenokarsinooma ja sen kriittinen rooli syövän Cell Survival ja Proliferation. PLoS ONE 8 (12): e82728. doi: 10,1371 /journal.pone.0082728

Editor: Chunhong Yan, Georgia Regents University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 syyskuu 2013; Hyväksytty: 5. marraskuuta 2013 Julkaistu: 16 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat varat kansallisesta Natural Science Foundation of China (81272195, 81071687, 81071687, 81372133), johon ”863-ohjelma” of China (SS2012AA020403), valtio ”973 Program” Kiinan (2014CB542005), tohtoriohjelmat Foundation opetusministeriön of China (20110171110077), ja valtion Key Laboratory of Oncology Etelä-Kiinassa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat julistaa ole eturistiriitoja.

Johdanto

Ensisijainen keuhkosyöpää on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti [1]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on tärkeä muoto keuhkosyöpään ja sen esiintyvyys on lisääntynyt viime vuosikymmenien ajan. Novel käsityksen biologia NSCLC ovat parantuneet tulos tietyille potilaille [2], [3], mutta 5 vuoden yleinen eloonjäämisaste potilaiden NSCLC ei ole merkittävästi parantunut [4]. Siksi on ehdottomasti kehitettävä edelleen ymmärtäminen molekyyli- mekanismien keuhkosyövän kasvainten synnyssä ja tunnistaa uusia terapeuttisia tavoitteena parantaa ennustetta potilaille.

lohkaisu ja Polyadenylaatio Specific Factor 4 (CPSF4 vaihtoehtoisesti tunnetaan CPSF30 tai NEB1) löydettiin alun perin olennainen osa 3 ’päähän koneet solujen pre-mRNA: iden. Proteiini on jäsenenä CPSF monimutkainen, joka on raportoitu osallistua mRNA 3 ’päät kypsymisen ja niillä on keskeinen rooli polyadenylaation mRNA muiden jäsenten kanssa CPSF kompleksin [5] – [9]. On ehdotettu, että nämä mRNA 3 ’päät kypsymisen tekijöistä, mukaan lukien CPSF4 ehkä viittaavat tuumorisuppressiogeeneksi [10], [11]. Sen sijaan muut tutkimukset tunnistaa, että mahdollinen onkogeenisiä rooli näiden mRNA 3’-päissä käsittely tekijöitä useita ihmisen syövissä, [12] – [15]. In influenssaviruksen-tartunnan saaneiden solujen, CPSF4 proteiini vuorovaikutuksessa viruksen NS1-proteiinin ja esti 3 ’päähän pilkkominen ja polyadenylaation isäntä pre-mRNA: t [16]. CPSF4 proteiinia toiminnallisesti vuorovaikutuksessa tuumorisuppressoriproteiinia Cdc73 ja säädellään transkription tiettyjen geenin INTS6 HeLa solujen [10]. Vaikka toiminta CPSF4 on tutkittu eri mallia järjestelmissä, sen mahdollisen roolin kasvaimia ei ole vielä täysin tutkittu puutteen takia koskevien tietojen CPSF4 ilmaisun ja kasvainsolujen kasvua.

Tässä tutkimuksessa tutkimme ilmaisun ja kliinistä merkitystä CPSF4 vuonna keuhkoadenokarsinooma ja tutkitaan sen roolit ja taustalla mekanismeja syöpäsolun selviytymisen ja proliferaation. Olemme osoittaneet, että CPSF4 yliekspressoituu osajoukko keuhkojen adenokarsinoomat, mikä korreloi huonon elinaika. Knockdovvn CPSF4 keuhkojen syövissä johtaa alentunut solujen kasvua, lisääntymistä ja lisääntynyt apoptoosi keuhkoadenokarsinooma solulinjoissa korkea endogeenisten tasojen CPSF4. Tuloksemme osoittavat, että CPSF4 voi olla mahdollinen ennustetekijöitä biomarkkereiden ja terapeuttinen kohde keuhkoadenokarsinooma.

Tulokset

CPSF4 ilmentyy voimakkaasti keuhkojen adenokarsinooman solulinjoja ja tuumorikudoksia

ensin tutkinut ilmentymistä CPSF4 proteiinin keuhkojen adenokarsinooman solulinjoja Western-blottauksella. Keuhkojen adenokarsinoomat solulinjat ilmensivät korkeita CPSF4 proteiinien verrattuna HBE (Fig. 1A). Olemme myös havainneet ilmentymisen CPSF4 proteiinin keuhkojen adenokarsinoomia kudosten ja 8 normaalia ihmisen kudoksissa (sydän, keuhkot, maksa, munuaiset, aivot, perna, munasarja-, ja kiveksissä) immunohistokemiallisesti määrityksessä. Kuten kuviossa 1B on esitetty, positiivinen värjäytyminen CPSF4 havaittiin tumassa keuhkosyövän soluja, kun taas CPSF4 värjäystä ei voitu havaita kaikki 8 normaaleissa kudoksissa, mikä viittaa siihen, että CPSF4 voisi olla mahdollinen biomarkkeri keuhkojen adenokarsinoomia.

(A) ilmentymistä CPSF4 ihmisen normaali keuhkojen solu HBE ja eri keuhkoadenokarsinooma solulinjoissa analysoitiin Western blot. (B) ekspressio CPSF4 8 normaaleissa ihmisen kudoksissa ja keuhkojen adenokarsinooma kudoksissa havaittiin immunohistokemiallisella värjäyksellä. (Suurennus, x 200). ADC, adenokarsinooma.

CPSF4 yliekspressio liittyy huonoon ennusteeseen keuhkojen adenokarsinooman potilaiden

tutkimiseksi ennusteeseen viittaavia merkitystä CPSF4 keuhkojen adenokarsinooman, suoritimme immunohistokemiallisella värjäyksellä on kudos microarray . CPSF4-positiivista värjäytymistä havaittiin tumassa keuhkosyövän soluja, mutta värjäytyminen oli negatiivinen viereisen ei-pahanlaatuinen keuhkojen kudoksia (Fig. 2A ja 2B).

(A) Edustavia esimerkkejä vahva, kohtalainen, heikko ja negatiivinen CPSF4 ilmentymisen keuhkoadenokarsinooma kudoksissa. Upper paneelit, × 40; alempi paneelit, x 400, alueelta laatikon yläpaneeli vastaavasti. (B) vertailu CPSF4 ekspressiotasoja välillä keuhkoadenokarsinooma kudosten ja viereisen ei-pahanlaatuinen keuhkojen kudoksia immunohistokemiallisesti samalla potilaalla. Edustavat kuvat pariksi keuhkoadenokarsinooma kudoksia ja viereisen ei-pahanlaatuinen keuhkojen kudoksia olivat (suurennos, × 400). (C) ROC käyräanalyysi käytettiin määrittämään raja-pisteet korkea ilmentymisen CPSF4 proteiinin keuhkoadenokarsinooma kudoksissa. Herkkyys ja spesifisyys OS piirrettiin;

p

= 0,002. (D) Kaplan-Meier-analyysi kokonaiselinaika korkea tai matala CPSF4 lauseke (

p

0,001, log-rank-testi). (E) Kaplan-Meier analyysi eloonjäämisaste mies- ja naispuolisten potilaiden, joilla on korkea CPSF4 ilme (

p

= 0,56).

Kehitetään kohtuullinen cut-off pisteet CPSF4 edelleen selviytyminen analyysi, me altistetaan kukin IHC pisteet ROC käyräanalyysi suhteen potilaiden hoitotuloksiin. Kuten esitetään (Fig. 2C), The CPSF4 IHC cut-off pisteet OS oli 5,0. Siten ilmaus CPSF4 kussakin näytteessä myöhemmin luokiteltu joko korkean tason (pisteet 5) tai alhainen (pisteet ≤ 5). Kliinis ominaisuudet 150 potilailla, joilla on keuhkosyöpä adenokarsinoomia on esitetty taulukossa 1A. Huomasimme, että korkea CPSF4 ilmaisu oli suurempi potilailla, joilla myöhemmin N luokituksen (P = 0,033, Chi-Square test) (taulukko 1). Ei ollut mitään merkittävää korrelaatiota CPSF4 ilmaisun ja muut ennusteeseen viittaavia parametreja, kuten potilaan sukupuoli, ikä (≥60 vs. 60-vuotiaat), T luokittelu (P 0,05, taulukko 1). Survival analyysit osoittivat, että korkea ilmentyminen CPSF4 korreloi merkitsevästi lyhyempi yleinen elinaika potilailla, joilla on keuhkojen adenokarsinooman (P 0,001, log-rank testi, Fig. 2D). Survival analyysit osoittivat myös, että ei ollut merkittävää eroa yleisen elinaika mies- ja naispuolinen potilas CPSF4 korkea (P = 0,56, log-rank testi, Fig. 2E).

Myös käytti yhden muuttujan analyysiin, arvioida assosiaatioita potilaan ennustetta ja useat ennusteeseen viittaavia tekijöitä kuten CPSF4 lauseke (korkea vs. matala), sukupuoli (mies vs. nainen), ikä (≥60 vs. 60-vuotiaat), pT vaihe (kasvaimen kokoa; T3-T4 vs. T1-T2) ja pN vaihe (imusolmuke etäpesäke, N2-N3 vs. N0-N1). Kaikki nämä parametrit paitsi sukupuolen ja iän liittyivät merkittävästi huonompi ennuste (taulukko 2). Monimuuttujamenetelmin lisäksi osoittanut, että erittäin CPSF4 taso ja pN vaiheessa olivat riippumattomia ennustavat tekijät eloonjäämisaste potilaiden keuhko adenokarsinoomat (taulukko 2). Kaikki nämä löydökset viittaavat siihen, että CPSF4 voi olla tärkeä rooli aggressiivisempaa käyttäytymistä keuhko- syöpäsoluja.

CPSF4 Knockdown estää keuhkoadenokarsinooma soluproliferaatiota ja eloonjäämisen

Sen arvioimiseksi, onko solut, jotka ilmentävät korkeita CPSF4 luottaa siihen selviytymisen ja proliferaation, transfektoimme siRNA oligonukleotidien kohdistaminen CPSF4 osaksi H1299 ja A549-soluja, jotka ilmentävät merkittäviä määriä CPSF4. Tulokset osoittivat, että DC-pohjainen CPSF4 siRNA nanohiukkasten merkittävästi vaimentua CPSF4 proteiinin ilmentymisen (Fig. 3A), ja pudotus on CPSF4 esti merkitsevästi solujen elinkelpoisuus verrattuna transfektio-spesifinen siRNA ryhmien MTT: llä (Fig. 3B).

(A) analyysi CPSF4 ilmentymisen Western blot 3 vuorokauden kuluttua siRNA transfektion. Mock, ajoneuvon valvonta; Ohjaus siRNA, epäspesifinen siRNA; CPSF4 siRNA-1 ja CPSF4 siRNA-2, CPSF4 erityisiä siRNA. (B) Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT-määrityksellä. Keskiarvo ja SD saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta on piirretty (*,

P

0,05, **,

P

0,01). (C) Soluja käsiteltiin CPSF4 siRNA tai ohjaus siRNA (50 nmol /l), joka 3 päivä ja kasvatettiin 14 päivää; pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla laskettiin. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (***,

P

0,001). (D, E) At 3 päivää sen jälkeen, kun siRNA transfektion, solukierron analysoitiin virtaussytometrialla käyttäen PI-värjäyksellä. Edustavat tiedot kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty (D). Solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa (E). (F) H1299 ja A549-soluja ympättiin kammiossa siirtoaltaat päällystetty Matrigel matriisi. Invasiivisuus Solujen määritettiin laskettiin solut kulkevat matrigeelin matriisi pohjapinta puolelle siirtoaltaat. * P 0,05 verrattuna epäspesifinen kontrolli siRNA ryhmä.

Vahvista CPSF4 siRNA estoa solujen kasvun, me seuraavaksi suoritetaan pesäkkeenmuodostus kokeiluja ja havaittiin, että CPSF4 Knockdown merkittävästi vähentynyt pesäkkeenmuodostusta H1299 ja A549-solut (Fig. 3C). Koska kasvua estävä vaikutus havaittiin siCPSF4-transfektoiduissa soluissa, olemme analysoineet transfektantit solun syklin parametrit virtaussytometrialla. Kuten on esitetty kuviossa. 3D ja 3E, kertymistä G1 solujen merkittävästi lisääntynyt CPSF4 siRNA-hoidetussa ryhmässä verrattuna epäspesifinen siRNA säätimet (75% vs. 55% H1299 ja 73% vs. 46% A549). Lisäksi meillä on myös osoitti, että knockdovvn CPSF4 siRNA huomattavasti esti soluinvaasiota sekä H1299 ja A549-solut (Fig. 3F). Nämä tulokset osoittavat, että knockdovvn CPSF4 keuhkojen syöpäsoluja johti merkittävään estoja soluproliferaatioon ja solujen invaasiota.

CPSF4 Knockdown inaktivoi PI3K /AKT ja MAPK signalointi

tunnistaa mahdollisuudet molekyylitason mekanismeja jolla CPSF4 knockdown esti keuhkosyövän solujen eloonjäämistä ja proliferaatiota, olemme analysoineet toimintaa useita pro-eloonjäämisen proteiinien Western blot-analyysi. Tulokset osoittivat, että CPSF4 pudotus sekä H1299 ja A549-soluja dramaattisesti tukahdutti fosforylaatiota PI3K, AKT, ERK1 /2 ja JNK-proteiinien, mutta huomattavasti lisääntynyt p38-proteiinin fosforylaatiota (Fig. 4A), mikä voi johtaa inaktivoinnin PI3K /AKT ja MAPK signalointireittejä.

(A) 72 tuntia sen jälkeen, kun siRNA hoidon, ilmaus CPSF4 proteiinin ja kokonais- ja fosforyloidun Akt, PI3K, ERK1 /2, JNK: n ja p38-proteiinien H1299 ja A549 havaittiin Western blot. GAPDH toimi latauskontrollina. (B) apoptoosi H1299 ja A549 määritettiin virtaussytometrialla 72 h kuluttua siRNA transfektion käyttämällä anneksiini V-FITC /PI-värjäyksen kit. Edustaja data kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty. (C) Apoptoosi laskettuna FITC-positiivisten solujen. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (*,

P

0,05). (D) 72 tuntia sen jälkeen, kun siRNA hoidon, ilmaus Bcl-2, pilkottiin kaspaasi-3 tai 9 proteiinien H1299 ja A549 havaittiin Western blot. GAPDH: ta käytettiin lastaus ohjaus.

CPSF4 pudotus indusoi apoptoosia keuhkosyöpäsoluissa

tutkimme seuraavaksi vaikutus CPSF4 pudotus on apoptoosia anneksiini V-FITC /PI staining- pohjainen FACS-analyysillä (Kuva. 4B). Knockdovvn CPSF4 siRNA johti merkittävään induktion solun apoptoosia sekä H1299 ja A549-solut (Fig. 4C). Kaspaasien aktivaatio on tärkeä tapahtuma apoptoosin signalointireitin. Seuraavaksi me havainneet vaikutus CPSF4 Knockdown ilmenemistä ja aktivointi kaksi keskeistä proapoptoottisten proteiinit: kaspaasi-3 ja kaspaasi-9, in H1299 ja A549-soluja Western blotilla. Kuten on esitetty kuviossa. 4D, CPSF4 pudotus indusoi kaspaasi-3 ja 9, tuloksena on merkittävä kasvu tasot pilkottiin kaspaasi-3 ja pilkottiin kaspaasi-9-proteiineja. Knockdovvn CPSF4 myös vaimentua ilmentymisen Bcl-2, joka on tärkeä anti-apoptoottisen proteiinin, sekä H1299 ja A549-solut (Fig. 4D) .Thus, nämä tulokset osoittivat, että CPSF4 voi ohjata useita näkökohtia apoptoosin signalointia.

CPSF4 yli-ilmentyminen edistää keuhkosyövän solujen kasvua ja aktivoi PI3K /AKT ja MAPK signalointi

varmistamiseksi edelleen roolia CPSF4 säätelyssä keuhkosyövän solujen kasvun kautta PI3K /AKT ja MAPK signalointireitteihin, H1299-soluja transfektoitiin ekspressiovektorilla, joka koodaa CPSF4 (pcDNA3.1-CPSF4) tai kontrollivektorilla, josta puuttuu CPSF4 (pcDNA3.1). Tulokset osoittivat, että CPSF4 yliekspressio merkittävästi edistää solujen elinkykyä (Fig. 5A) ja pesäkkeen muodostumista (kuvio. 5B) verrattuna transfektion kontrollivektorilla ryhmiä. Tunnistaa taustalla molekyylitason mekanismit, joilla CPSF4 ovexexpression lisääntynyt keuhkosyövän solujen kasvua, analysoitiin vaikutus CPSF4 aktivoinnista AKT ja MAPK signalointi Western blot. Kuten on esitetty kuviossa. 5C, CPSF4 ovexexpression selvästi voimistunut fosforylaatiota PI3K, AKT, ERK1 /2 ja JNK proteiineja. Näin ollen nämä tulokset osoittivat, että ektooppinen ekspressio CPSF4 edistää solujen kasvua osittain aktivoitumisen kautta PI3K /AKT ja MAPK signalointi keuhkosyövän soluja.

(A) H1299-soluja transfektoitiin CPSF ilmentävällä vektorilla, 3 tai 4 päivää solujen elinkyky mitattiin MTT-määrityksellä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (*,

P

0,05). (B) H1299-solut transfektoitiin CPSF4 ilmentävillä vektoreilla tai kontrollivektorilla joka 3 päivä ja kasvatettiin 8 päivää, pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla ja laskettiin. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (*,

P

0,05). (C) H1299-soluja transfektoitiin CPSF ilmentävällä vektorilla, 72 tuntia transfektion jälkeen, ilmaus CPSF4 sekä kokonais- ja fosforyloitu Akt, PI3K, ERK1 /2, ja JNK-proteiinien havaittiin Western blot. GAPDH käytettiin latauskontrollina.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että CPSF4 oli hyvin ilmaistu keuhkojen adenokarsinooman solulinjoja ja tuumorikudoksia verrattuna normaalin keuhkojen solu- ja noncancerous keuhkojen kudoksiin, vastaavasti. Ilmentyminen CPSF4 8 normaaleissa ihmisen kudoksissa oli puutteellinen. Lisäksi ennusteeseen viittaavia tietoja meidän kudos microarray osoitti keuhkojen adenokarsinooman potilailla, joilla on erittäin ilmaistaan ​​CPSF4 on lyhyemmät selviytyminen jaksoja kuin ne, joilla CPSF4 alhainen ilme. Monimuuttuja-analyysi osoitti, että CPSF4 korkea ilmentyminen on itsenäinen ennustetekijä varten eloonjäämisaste keuhkojen adenokarsinooman potilaista. Tulokset meidän

in vitro

kokeiluja ehdotettiin, että CPSF4 kohdistama sen kasvaimia synnyttävän toiminnon säätelemällä lisääntymistä ja apoptoosia keuhkojen adenokarsinoomasolua.

CPSF4 kuuluvat pilkkominen ja polyadenylaation spesifisyys tekijä (CPSF) kompleksi, jonka muut jäsenet ovat CPSF160, CPSF100, CPSF73 ja Fip1 [17]. Viime aikoina jotkut tutkimukset ovat keskittyneet roolia joidenkin mRNA 3′-jalostuskertoimet syövässä, mukaan lukien FIP1L1, CSTF50, CSTF2 ja Neo-PAP [11] – [15]. Esimerkiksi Aragaki ja työtovereiden totesi, että CSTF2 oli erittäin ilmaistu keuhkosyöpä, kun taas sen ilmentyminen oli tuskin havaittavissa missään 29 normaalin ihmisen kudoksiin paitsi kives. Lisäksi knockdovvn CSTF2 siRNA inhiboivat keuhkosyövän soluja. Vielä tärkeämpää on, CSTF2 yliekspressio liittyi huono ennuste keuhkosyöpäpotilaita. Tässä raportissa tarjoamme kliinistä näyttöä siitä, että CPSF4 yliekspressio ennustaa huonon ennusteen keuhkoadenokarsinooma potilailla. Tukahduttaminen CPSF4 ilmaisun esti kasvua keuhkosyövän solujen

in vitro.

Merkittävää prognostisia arvo CPSF4 voi selittyä sen toiminta pro-eloonjäämisen keuhkojen syöpäsoluja. Vielä ei tiedetä, miksi CPSF4 yliekspressoitiin keuhkosyöpäsolut; kuitenkin tulosten perusteella esillä olevassa tutkimuksessa, uskomme, että CPSF4 voi olla mahdollinen diagnostinen ja /tai terapeuttinen kohde keuhkojen adenokarsinooman.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että siRNA-välitteinen CPSF4 pudotus estivät solujen kasvua ja indusoi apoptoosin keuhkosyövän soluista, jotka ilmentävät korkeita CPSF4. Tutkia alleviivaus molekyylitason mekanismeja, tutkimme PI3K /AKT, MAPK ja apoptoosin signalointireitteihin muutos. Inaktivaatio PI3K /AKT, MAPK signalointireittejä mukaan CPSF4 pudotus, kuten on esitetty tukahdutti fosforylaatio PI3K, AKT, ERK1 /2 ja JNK, havaittiin keuhkosyövän solulinjat. PI3K /AKT ja MAPK reittejä ovat mukana monenlaisia ​​solun prosessien, kuten kasvua, proliferaatiota, erilaistumista, transkription sääntely, ja kehitys [18], [19]. Nämä kaksi signalointireiteissä aktivoituvat keuhkosyöpää ja on tunnistettu uusia tavoitteeksi hoito [20] – [22]. Siten CPSF4 voisi käyttää sen kasvua säätelevä vaikutus, ainakin osittain, moduloimalla PI3K /AKT ja MAPK signalointireittejä keuhkojen syöpäsoluja. Vaikka muut yksityiskohtaiset analyysit ovat tarpeen määrittää kohdistu suoraa CPSF4, havainnot tässä tutkimuksessa tarkoita biologisen merkityksen CPSF4 säätelyssä keuhkosyövän solujen kasvua ja selviytymistä. Siten tuloksemme antavat perusteet farmakologinen tutkimus CPSF4 mahdollisena uusia terapeuttisia tavoite keuhkosyöpään.

Yhteenvetona CPSF4 oli hyvin ilmaistu keuhkosyövän solulinjoissa ja kasvain kudosten ja korreloivat positiivisesti huonon ennusteen of potilaalla on keuhko adenokarsinooman. Knockdovvn CPSF4 ilmentymisen siRNA esti merkitsevästi solujen kasvua ja aiheutti apoptoosia keuhkoadenokarsinooma solulinjoissa kautta samanaikaisesti inaktivointi PI3K /AKT ja MAPK signalointi- ja aktivointi kaspaasiriippuvaisen apoptoottisia reittejä. Sen sijaan, ektooppinen ilmentyminen CPSF4 oli päinvastainen vaikutus. Nämä tulokset siis osoittavat, että CPSF4 tärkeä rooli säätelyssä kasvua ja selviytymistä keuhkoadenokarsinooma soluja ja voi olla potentiaalinen terapeuttinen kohde keuhkosyöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus hyväksynyt eettinen komitea Sun Yat-sen University Cancer Center. Kaikki näytteet tässä tutkimuksessa käytetyt olivat anonyymejä ja kerätään potilailta rutiinikäyttöön patologian käyttöön. Ei tietoisen suostumuksen (kirjallinen tai suullinen) saatiin käyttöön takautuvasti kudosnäytteitä tutkimuspotilaat, koska suurin osa potilaista oli kuollut ja tietoinen suostumus ei pidetty tarpeellisena ja luopua eettinen komitea.

solulinjojen ja soluviljelmä

Ihmisen NSCLC solulinjat (H1299, A549, H1975, H1437) saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), ja niitä viljeltiin RPMI-1640-alustassa (Invitrogen, Carlsbad , CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia. Normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (HBE) pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia. Soluja pidettiin kosteutetussa ilmakehässä ja 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Western blot-analyysi

Solulysaatit eroteltiin elektroforeesilla 8-12% natriumdodekyylisulfaattia sulfaatti- polyakryyliamidigradienttigee- minigeelissä (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) ja siirrettiin elektroforeettisesti nitroselluloosamembraanille (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Western-blotit, joissa vasta-aineita CPSF4 (Proteintech Group, Inc., Chicago, USA), fosfori-PI3K p85 (Tyr458) /p55 (Tyr199), PI3K, fosfori-Akt (Ser473), Akt, pTyr202 /Y204-ERK1 /2, ERK1 /2, pThr183 /Tyr185-SAPK /JNK, SAPK /JNK, pilkottiin kaspaasi-3, pilkotaan kaspaasi-9 ja GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) kantavassa proteiinin vyöhykkeet havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Lung adenokarsinoomat kudos microarray

Tissue microarray (halkaisija 1,5 mm, syvyys, 4 um), jota käytetään immunovärjäyksellä analyysi CPSF4 proteiinin ilmentymisen hankittiin Shanghai outdo Biotech (Shanghai, Kiina, https://www.superchip.com.cn/). Microarray koostui 150 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut keuhkojen adenokarsinoomia ja vastaavat viereisen ei-pahanlaatuinen keuhkojen kudoksiin. Nämä kudosnäytteet oli saatu potilaista, joilla ei ole syöpähoidon ennen kasvaimen resektiota. Kudosnäytteet olivat histologisesti tutkittiin ja luokitellaan joko 2004 Maailman terveysjärjestön luokittelujärjestelmä [23]. Yksityiskohtaiset kliiniset ja patologisten tietojen, mukaan luettuna kliininen ja patologinen kasvaimen solmu-etäpesäke (TNM) vaihe ja kokonaiseloonjääminen (OS) kesto oli käytettävissä kaikissa tapauksissa. Patologinen TNM tilan kaikki keuhkojen adenokarsinooman arvioitiin kriteerien mukaisesti seitsemän painos amerikkalaisen sekakomitean Cancer (2010).

immunohistokemia (IHC) ja histologinen arviointi

immunohistokemia suoritettiin käyttäen Envisionþ Kit /HRP (DakoCytomation). Lyhyesti, objektilasit upotettiin Target Retrieval Solution (pH 9, DakoCytomation) ja keitettiin 108 ° C: ssa 15 minuuttia autoklaavissa antigeenin haku. CPSF4-vasta-aine (1:50 laimennos) lisättiin kuhunkin diaan jälkeen estää endogeenisen peroksidaasin ja proteiineja, ja leikkeitä inkuboitiin HRP-leimatun anti-kani-lgG [Histofine Yksinkertainen Stain MAX PO (G); Nichirei] toissijaiseksi vasta-aine. Substraatti-chromogenwas lisättiin, ja näytteet vastavärjättiin hematoksyliinillä. Negatiivinen kontrolli saatiin korvaamalla ensisijainen vasta-aine normaalilla kaniinin IgG.

immunoreaktioita arvioitiin riippumattomasti kahdella patologit sokaissut ennusteeseen viittaavia tietoja. Tumavärjäystä intensiteetti luokiteltiin: poissa värjäystä kuin 0, heikko 1, kohtalainen 2, ja vahva kuin 3. prosenttiosuus värjätään solujen käsiksi käyttämällä viiden asteikon pisteytystä: 0 (ei positiivisia soluja), 1 ( 25% positiivisia soluja), 2 (25% -50% positiivisia soluja), 3 (50% -75% positiivisia soluja), ja 4 ( 75% positiivisia soluja). Lukemat kudos- laskettiin kertomalla intensiteetti ja prosenttiarvo (välillä Tässä laskelmassa siis 0-12). Vastaanotin toimii (ROC) käyrä analyysi, jonka avulla määritetään sulku sijoituksen kasvain ”high ilmaisu” käyttämällä 0, 1-kriteeri. Lyhyesti, herkkyys ja potilaan lopputulokseen tutkitaan kussakin pisteet piirrettiin synnyttämiseksi ROC käyrä. Lukemat valittiin kynnysarvon, joka oli mahdollisimman lähellä sekä maksimi herkkyys ja spesifisyys. Kasvaimet nimetty ”low ilmaisulla” CPSF4 oli niille suhde on alle tai yhtä suuri kuin raja-arvo, kun taas ”high ilmaisu” kasvaimet olivat pistein arvoa suurempi. Helpottaakseen ROC käyrä analyysi, viittaavia tekijöitä olivat kahtia: selviämistila (kuolema johtuu keuhkojen adenokarsinooman vs. sensuroitu).

valmistaminen DC nanohiukkasten ja kapselointi siRNA

DOTAP-kolesteroli (DC) oli ostettiin Avanti Polar-lipidien Inc. (Birmingham, AL, USA). HPLC-luokan kloroformia saatiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) kantavassa nanohiukkasten jonka on laatinut Emulsiflex-B3 korkea keapainehomogenisaattorissa (TES) (Avestin Inc., Ottawa, Kanada) [24], [25]. Nanosomeja pidettiin huoneenlämmössä 1 h ennen yön yli säilyttää 4 ° C: ssa.

CPSF4 siRNA ja epäspesifinen siRNA ostettiin Shanghai GenePharma Co. (Shanghai Kiina). Sekvenssit ihmisen CPSF4-spesifisten siRNA olivat 5′-CAU GCA CCC UCG AUU UGA ATT-3 ’(siRNA-1) ja 5′-GGU.ta CAC CUG UUA CAA GUG UTT -3′ (siRNA-2); epäspesifinen siRNA, 5’-UUC UCC GAA RTY GUC ACG UTT-3 ’. CPSF4 yli-ilmentyminen vektorit pcDNA3.1-CPSF4 ja ohjaus- vektorin pcDNA3.1 suunniteltiin ja syntetisoitiin Cyagen (Cyagen Biosciences Inc., Yhdysvallat). Toimittamista CPSF4 siRNA tai CPSF4 ilmentämään vektorin keuhko- syöpäsoluja, siRNA tai plasmidivektori kapseloidaan DC nanosomeja, joka oli validoitu aikaisemmin [26] – [28].

Solujen lisääntyminen ja pesäkemuodostusta

Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen MTT-määritystä (Promega) mukaan valmistajan protokollaa. Solujen elinkelpoisuus määritettiin transfektion jälkeen CPSF4 siRNA tai CPSF4 ilmentävillä vektoreilla. 48 tuntia käsittelyn jälkeen, solut (H1299 ja A549) kerättiin, laskettiin ja yksittäisiä soluja ympätään (400 solua /kuoppa) kolmena kappaleena osaksi 6-kuoppaisille levyille. Soluja käsiteltiin CPSF4 ilmentävillä vektoreilla tai CPSF4 siRNA joka 3 päivä ja kasvatettiin 8-14 päivää [29]; pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Pesäkkeet, jotka sisälsivät enemmän kuin 50 solusta, laskettiin.

In vitro invaasiomääritys

in vitro

invaasio kammio määritys suoritettiin Millicell soluviljelyinsertissä (24-kuoppaiset PCF 8,0 ui, Millipore). Lyhyesti, insertit seisoo 24-kuoppaisen soluviljelylevyn levy päällystettiin 100 ul: lla 1 mg /ml matrigeeliin Matrix (BD Falcon, USA) seerumivapaassa RPMI-1640-väliaine ja kuivattiin ilmassa. 48 tunnin kuluttua CPSF4 siRNA hoidon solut (H1299 ja A549) kerättiin, laskettiin, ja 100 ui seerumia, joka sisälsi 5 x 10

4 solut lisättiin insertin. Alempi osastossa oli 0,5 ml RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää. Tämä seuraa inkubaatio, 5% CO

2 37% 24 tuntia. Sitten kiinteä solut, jotka tunkeutuvat kalvon läpi alempaan puolella formaliinin kanssa, ja nämä solut värjättiin kristallivioletilla. Invasiivisuus Solujen määritettiin laskemalla tunkeutuvat solut alempaan puolelle suodattimen huokosten läpi alla mikroskoopilla x100 suurennoksella. Me analysoitiin 3 kertaa ja satunnaisesti valittua 3 kenttiä laskettiin kutakin määritystä varten.

Apoptoosi ja solusyklin analyysi

havaitsemiseksi apoptoosin ja solusyklin solut (H1299 ja A549) transfektoitu siRNA oli analysoitiin virtaussytometrialla. 72 h transfektion jälkeen solut (1 x 10

5 solua /ml) värjättiin 5 ui anneksiiniV-FITC ja 5 ui PI (propidiumjodidin) käyttämällä anneksiini V-FITC /PI-värjäyksen kit (Becton Dickinson, CA, USA), sijoitetaan huoneen lämpötilassa 15 minuutin ajan pimeässä, ja sitten analysoitiin virtaussytometrillä (EPICS XL, Beckman Coulter). Apoptoosi laskettuna FITC-positiivisten solujen. Solusyklin analyysi suoritettiin käyttäen PI-värjäyksellä. Transfektoidut solut kerättiin trypsinisaatiolla, kiinnitettiin 70% kylmällä etanolilla 30 minuutin ajan. Käsittelyn jälkeen 100 mg /ml RNaasi (Sigma-Aldrich), solut värjättiin 50 mg /ml PI (Sigma Aldrich) PBS: ssä. Virtaussytometria (EPICS XL, Beckman Coulter) suoritettiin välittömästi. Raaka Aineisto analysoitiin Multicycle for Windows (Beckman Coulter).

Tilastollinen

Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan kahden riippumattoman tietoryhmiä. Mediaani immunohistokemiallisella värjäyksellä pisteet käytettiin kynnysarvon jakaa potilaita matalan ja korkean CPSF4 ilmaisun ryhmiä. Chi-square testejä voidaan hahmottaa suhdetta CPSF4 ilmaisun ja ennusteeseen viittaavia tila. Kaplan-Meier eloonjäämisestä piirrettiin ja log-rank suoritettiin. Yhden ja usean analyysit tehtiin siksi, että Coxin suhteellinen vaara regressiomallin määrittää assosiaatioita ennusteeseen viittaavia muuttujien ja syöpään liittyvää kuolleisuutta.

P

arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä kaikissa tapauksissa.