Krooninen sairaus

tiivistelmä

vaihtoehtoinen silmukointi liittyy ero eksonin valinta Geenitranskriptikuvion tuottaa mRNA ja proteiini-isoformit rakenteellisten ja toiminnallisten monimuotoisuutta. Epänormaali vaihtoehtoisen silmukoinnin on osoitettu liittyvän pahanlaatuisen fenotyypit syöpäsolujen, kuten Chemo-vastus ja invasiivisia toimintaa. Seulonta pieniä molekyylejä ja lääkkeet moduloimiseksi Silmukointi ihmisen maksasyövän solulinjaa Huh-7, huomasimme, että amiloridi, eroaa neljän pH-vaikuttavia amiloridi analogit, voisi ”normalisoida” silmukointia

BCL-X, HIPK3

ja

RON /MISTR1

selostukset. Meidän proteomic analyysit amiloridi käsiteltyjä soluja havaittiin hypo-fosforylaation silmukoinnin tekijä SF2 /ASF, ja alentuneesta SRp20 ja kaksi un-tunnistettuja SR proteiineja. Olemme edelleen havaittu vähentynyt fosforylaatiota AKT, ERK1 /2 ja PP1, ja lisääntynyt fosforylaatiota p38 ja JNK, mikä viittaa siihen, että amiloridi hoito alas-säätelee kinaasien ja ajan säätelee fosfataasien signaalin polkuja tiedetään vaikuttavan silmukoinnin tekijä proteiinin fosforylaatiota. Nämä amiloridi vaikutukset ”normalisoitu” onkogeeninen Silmukointi ja silmukoinnin tekijä hypo-fosforylaation molemmat kumottu esikäsittely kanssa PP1 estäjä. Global eksoni joukko amiloridi käsitellyn Huh-7-soluissa havaittiin silmukoinnin muutoksille 584 eksonien 551 geenitranskriptien, joista monet koodaavat proteiineja pelaa keskeinen rooli ioninkuljetusmeka-, soluväliaineen muodostumisen, solun tukirangan remontin, ja genomin ylläpitoon. Cellular toiminnalliset analyysit paljastivat myöhemmin hyökkäyksen ja muuttoliike vikoja, solusyklin häiriöitä, sytokineesi vajaatoiminta, ja tappava DNA heikkenemistä amiloridi saaneilla Huh-7-soluissa. Muut ihmisen kiinteiden kasvainten ja leukemiasoluja, mutta ei muutaman normaalit solut, osoittivat samanlaisia ​​amiloridi-muuttunut Silmukointi kanssa devitalized seuraus. Tämä tutkimus tarjoaa siten mekanistinen perustan hyödyntämiseen pienimolekyylisiä modulaatio Silmukointi syövän hoito.

Citation: Chang J-G, Yang D-M, Chang W-H, Chow L-P, Chan W-L, Lin H-H, et al. (2011) pienimolekyylisiä Amiloride moduloi onkogeeninen RNA Vaihtoehto Jatkaminen on Devitalize ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 6 (6): e18643. doi: 10,1371 /journal.pone.0018643

Editor: John D. Minna, Univesity Texas Southwestern Medical Center at Dallas, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 lokakuu 2010; Hyväksytty: 11 maaliskuu 2011; Julkaistu: 09 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Chang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Research myöntää NSC-95-2320-B-037-049 (JGC), NSC 95-2311-B-009-004-MY3 (HDH) ja NSC 97-2627-B-009-007 (HDH) alkaen National Science neuvoston Taiwanin ja DOH95-B-11-TM007 (WKY) ja DOH96-TD-I-111-TM003 (WKY) Department of Health of Taiwan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Proteome monimutkaisuutta laajennetaan vaihtoehtoisen silmukoinnin (AS), joka on prosessi ero eksonin ottamista tai pois samasta esi-mRNA-molekyylien tuottaa erilaisia ​​mRNA ja proteiini-isoformit [1], [2]. AS prosessia ohjataan kaksi hyvin säilyneitä proteiinin perheet: arginiini /seriini dipeptidin toistoja (SR) liittyvien proteiinien ja heterogeeninen ydin- ribonukleoproteiineissa (hnRNP) liittyvien proteiinien [3], [4]. SR proteiinit sisältävät modulaarinen kaksiosaisen rakenteen, mukaan lukien yksi tai kaksi RNA tunnustamista motiivia N-päässä ja RS verkkotunnuksen runsaasti arginiinia /seriini dipeptidi toistoja on C-päässä [5], [6]. Toiminta N-terminaalinen motiiveja SR proteiinien käsittää sekvenssin-spesifinen sitoutuminen eksoni liittämiseen exhancers. C-terminaalin RS domain toimii yleisenä aktivaatiodomeenissa liittämiseen linkittämällä heterogeenisen RNA sitovan motiivin [6]. SR proteiinit säätelevät valintaa AS sivustoja, jotka poikkeavat kanoninen liitoskohdat, siis osallisuuden tai syrjäytymisen vaihtoehtoisten eksonien. Toisaalta, joissakin hnRNPs, kuten hnRNPA1, saattavat estää AS toimintaa SR proteiinien sitoutumisen kautta eksoni liittämiseen vaimenninelementit [7].

AS siis säätelee geeniekspressiota muodostetaan erillisiä proteiini-isoformit osallistuvat erillisiä toiminnot solun tapahtumien, kuten apoptoosin, sukupuoliasioissa, aksoniohjauksen, solun herätteen, ja solun supistuminen [8], [9]. AS myös on keskeinen rooli inhimillisen perinnöllisiä sairauksia ja syöpää [10], [11], [12], [13], [14]. Poikkeava AS proto-onkogeenien ja /tai tuumorisuppressorigeeneille voivat edistää solun pahanlaatuinen fenotyypit, kuten resistenssi apoptoosin edistäminen ja metastaasit, ja stimulaatio tuumoriangiogeneesissa [11], [12], [13], [14 ]. Postulating että moduloiva nämä syöpään liittyvien geenien voi olla merkittävä vaikutus niiden patogeeniset toiminnasta, olemme etsineet pienten molekyylien tai huumeiden moduloivien vaikutuksia AS. Tässä tutkimuksessa olemme havainneet, että amiloridi, tunnettu diureetti, voi muuttaa onkogeeninen AS ihmisen maksasyövän Huh-7-soluissa sekä monissa muissa ihmisen syövän ja leukemiasolulinjoilla, ja siten tutkia alla olevan solu- ja molekyylitason mekanismeja mahdollisia terapeuttisia vaikutuksia.

tulokset

Amiloride ”normalisoi” isoentsyymi silmukointi on

BCL-X, HIPK3

ja

RON /MISTR1

in Huh -7 solut

äskettäin on tullut selväksi, että epätasapainoinen silmukointi tiettyjen geenien liittyy pahanlaatuinen ominaisuuksia ihmisen syöpäsoluja [11], [12], [13], esimerkiksi vastustuskyvyn kemoterapiaa ja sädehoitoa kanssa

BCL-X,

onkopsykologista kehityksellisesti erilaistumaton tilassa

HIPK3,

ja invasiivisia metastaattisen potentiaalin kanssa

RON /MISTR1

. Maksasolukarsinoomassa Huh-7-soluissa,

BCL-X

on vaihtoehtoisesti saumattu anti-apoptoottisen suuria RNA-isoformin,

BCL-XL,

yli pro-apoptoottisen pieniä RNA-isoformin,

BCL-XS

[15];

HIPK3

on saumattu eksoni 11-ulkopuolelle U (-) sekä eksoni 11-mukana U (+) isoformeja vuorovaikutukseen Fas /FADD moduloida apoptoosia kehitysprosessiin [16]; ja

RON /MISTR1

on saumattu 5-kb täyspitkän (

flRON

) RNA ja 2-kb eksoni 11-ulkopuolelle

RON

(

sfRON

) RNA-isoformien, joista jälkimmäinen on korreloitu epiteelin ja mesenkymaalitransitioon syövän invaasio ja metastaasi [17], [18]. Seulottiin yli 500 pieniä molekyylejä ja lääkkeet, myös kliinisessä käytössä, huomasimme, että amiloridi kohdistama voimakas vaikutus AS näiden geenitranskriptien (kuvio 1A). Huh-7-soluja käsiteltiin amiloridi osoittivat, että: (a) suhteellinen lasku

BCL-XL

ja kasvu

BCL-XS

RNA-isoformeja; (B) suhteessa ylläpito

HIPK3

U (-) ja lasku

HIPK3

U (+) isoformeja; ja (c) vähennys sekä eksonin 11 (+)

flRON

ja eksonin 11 (-)

sfRON

RNA isoformeja. Tällaiset vaikutukset amiloridi oli annoksesta ja ajasta riippuvaa, on havaittavissa 2 tuntia ja merkitty 24 tunnin kuluttua inkubaation 0,5 mM amiloridi. Nämä havainnot viittaavat siihen, lisääntynyt hyödyntäminen alkupään vaihtoehtoisia 5′-silmukointikohtaan eksonissa 2

BCL-X

, lisääntynyt eksonin 11 (U) poissulkeminen

HIPK3

, ja laski liittämiseen komplekseja muodostettu tuotantoon sekä

RON /MISTR1

eksonin 11 (+) ja eksonin 11 (-) isoformeja. Siten amiloridi pystyi mukauttamaan AS näiden kolmen geenin transkriptien kohti vähemmän pahanlaatuinen ”normalisoitu” malleja, samanlainen terveisiin aiemmissa raporteissa [15], [16], [17], [18].

RNA uutettiin Huh-7-solut altistettiin sisältävään kasvualustaan ​​amiloridi tai muita pHi modulaattori amiloridi johdannaiset ja tutkittiin onkogeeninen RNA vaihtoehtoisen silmukoinnin RT-PCR: llä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Paneeli (A) esittää, että amiloridi lisääntynyt käyttö ylävirran vaihtoehtoisten 5′-silmukointikohdan sisällä eksonin 2, joka tuottaa apoptoottisen BCL-XS-isoformi (ylärivi), lisäsi eksonin 11 (U eksoni) ohitetaan ja HIPK3, joka lisää apoptoottisten isoformin (keskimmäinen rivi), ja hieman lisääntynyt eksoni 11 ohita RON 0,5 mM pitoisuuden (alarivi). Paneeli (B) esittää, että liitoksen kuviot testattujen geenien ei vaikuttanut merkittävästi neljä amiloridi johdannaiset, mukaan lukien 5- (N-etyyli-N-isopropyyli) -amiloride tai EIPAn; 5- (N-metyyli-N-isobutyyli) amiloridi tai MIBA; 5- (N, N-dimetyyli) amiloridi tai DMA; ja 5- (N, N-heksametyleeni) amiloridi tai HMA, yhtä suurissa pitoisuuksissa pHi modulaatiota.

Koska amiloridi on prototyyppi solunsisäisen pH: n (pHi) modulaattori lääkettä, tutkimme neljä amiloridi johdannaisten vastaavaa tai suurempi phi vaikuttavia annoksia. Havaitsimme, että nämä johdannaiset ei aiheuttanut samanlaisia ​​”normalisoi” vaikutus

BCL-X

,

HIPK3,

ja

RON /MISTR1

AS kuvioita Huh-7-soluissa (kuvio 1B). Sitä vastoin aikaisemmassa tutkimuksessa [19], me havaitsimme, että 5- (N-ehyl-N-isopropyyli) amiloridi (EIPA), mutta ei amiloridi moduloitu AS vähentämällä patogeenisen exon7 poissulkeminen

SMN2

selostukset perinnöllinen selkäränkalihassurkastuminen soluja. Nämä paradoksaalinen havainnot osoittavat monimutkaisuutta AS mekanismien ja myös ehdottaa, että liitos sivuston valinta

BCL-X

,

HIPK3,

ja

RON /MISTR1

transkriptien amiloride- käsiteltiin Huh-7-soluissa välittyy solu-spesifinen silmukoinnin mekanismi (t) pikemminkin kuin pelkästään solunsisäisen pH: n muutos.

proteomiikan havaitseminen enimmäkseen hypo-fosforyloitu silmukoinnin tekijä SF2 /ASF sytoplasmassa ja tumassa amiloridi käsitellyn solut

fosforylaation tilan SR-proteiinin komponenttien AS komplekseja tiedetään vaikuttavan proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen silmukoinnin toiminnon, seuraavan kerran käytetään 2D-geelielektroforeesilla analysoida ero ilmentyminen seriinin-fosforyloitujen proteiinien. Löysimme yli kymmenen proteiinien kvantitatiivinen muutosten jälkeen amiloridi hoidon (kuva 2). Valitsemalla näistä seitsemän proteiinin paikkoja Proteomiikan tunnistamiseen massaspektrometrillä (taulukko 1), löysimme yksi niistä on ASF /SF2, silmukointioperaation tekijä tiedetään olevan osallisena AS on

RON

transkriptio [20] . Voit tarkistaa tämän havainnon, suoritimme western blotit ASF /SF2 ja löysi lyhensi ASF /SF2 fosforylaatio sekä sytoplasmassa ja tumassa amiloridi käsitellyn Huh-7-soluissa (kuvio 3A). Analyysi muun proteiinin aineosien silmukoinnin kompleksit (kuten SRp20, hnRNPA1, hnRNPA2 /B1, Sam68 ja yhteiset SR proteiinit) osoitti, että SRp20 ja kaksi un-tunnistetaan fosforyloitu SR proteiinit vähensi myös sytoplasmassa ja tumassa jälkeen amiloridi hoidon (kuvio 3B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että amiloridi moduloi AS on

BCL-X

,

HIPK3,

ja

RON /MISTR1

kautta hypo-fosforylaation ASF /SF2 ja vähentynyt ilmentyminen SRp20 ja joitakin muita SR proteiineja.

2D-lielektroforeesianalyysi proteiinien uutettu Huh-7-soluissa ilman (vasemmalla) ja (oikealla) 0,5 mM amiloridi hoitoa 24 tunnin osoitti merkittäviä muutoksia vähintään kymmenen paikkoja, joista seitsemän (osoitettu nuolilla) eristettiin nano-LC-MS /MS-spektrometriaa analyysi ja proteiinin tunnistamiseen, kuten on esitetty taulukossa 1.

Western blot-analyysi subsellulaarisen fraktioiden Huh-7-soluissa ja ilman 0,5 mM amiloridi 24 tunnin käsittely suoritettiin käyttäen spesifisiä vasta-aineita vastaan ​​eri liitos proteiinitekijöiden ja β-tubuliinia. (Paneeli EN) amiloridi käsittely lisäsi defosforyloitiin SF2 /ASF muodot sekä sytoplasman ja ydinvoiman jakeet. (Paneeli B) toinen amiloridi hoito vähensi ilmaus SRp20 ja kaksi un-tunnistetaan fosforyloitu SR proteiineja sekä C (soluliman) ja N (ydin) solufraktiossa.

Amiloride alasajaa fosforylaatio AKT-kinaasin ja PP1 fosfataasin

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että amiloridi estää fosforylaatio kinaasien ja fosfataasien, jotka liittyvät PI3K-AKT reitti [21], [22], [23], ja että AKT-kinaasin ja PP1 fosfataasi voi säädellä toimintaa SR proteiinien [23], [24], [25], [26], [27], [28]. Siksi määritettiin vaikutukset amiloridi on fosforyloidun Akt-muotoja kinaasin ja niihin liittyvien fosfa- in Huh-7-soluissa. Alentuneet Ser (473) p-AKT ja Thr (320) p-PP1 havaittiin sytoplasmassa ja tumassa, mikä viittaa siihen, inhibitio AKT-kinaasin aktiivisuuden ja aktivointi PP1 fosfataasin aktiivisuuden (kuvio 4A). Sen määrittämiseksi, onko inaktivaation Akt-kinaasin sinänsä olisi merkitystä säätelyssä vaihtoehtoisen silmukoinnin, Huh7 soluja käsiteltiin PI3K-AKT-reitin inhibiittorit, kuten LY294002, wortmanniini ja trisiribiinin; 1 uM trisiribiinin muttei LY294002 tai wortmanniini vähentynyt taso p-Akt. Kuitenkin trisiribiinin tässä pitoisuudessa kohdistu mitään vaikutusta vaihtoehtoinen silmukointi

BCL-X

ja

HIPK3

selostukset (kuva S1). Mielenkiintoista, esikäsittely Solujen okadahapolla estävän PP1 fosfataasiaktiivisuus kumottu vaikutuksia amiloridi on

BCL-X

ja

HIPK3

liittämiseen, sekä vaikutukset amiloride on defosforylaatiosta of SF2 /ASF ja vähentämällä että SRp20 tasolla, mutta okadahappo kohdistama ole varmaa vaikutusta ilmaus hnRNP A1 ja hnRNP A2B1 (kuva 4B). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että PP1 on tärkeä rooli moduloimaan fosforylaation SR liitos tekijöitä ja siten modulaatio onkogeenisen AS Huh-7-soluissa sen jälkeen, kun amiloridi hoidon.

(paneeli A). Western-blotit osoittavat merkittävää laskua sytoplasmisen p-Akt, ydin- p-Akt ja ydinvoiman p-PP1 in Huh-7-solut käsiteltiin amiloridi 0,3 mM ja yläpuolella. (Paneeli B) RT-PCR: llä ja western blot-analyysit osoittavat, että esikäsittely kanssa PP1-inhibiittorin, okadahapon, kumosi amiloridi vaikutuksia BCL-X ja HIPK3 onkogeeniset Silmukointi, fosforylaatiota ASF2 /ASF silmukoinnin tekijä ja taso ja SRp20 in Huh-7-soluissa.

genominlaajuiset eksoni-array havaitseminen muuttunut silmukointi monia toiminnallisia geenien amiloridi-käsitellyissä soluissa

on mahdollista, että vaikutukset amiloridi fosforylaation ja solunsisäisen lokalisaation liitos tekijöiden ja mRNA vienti [29] voi vaikuttaa liittämiseen muiden geenitranskriptien lisäksi

BCL-X, HIPK3

ja

RON /MISTR1

. Käyttämällä geenijärjestelyillä pelimerkkejä (Affymetrix GeneChip® Human eksoni 1,0 ST Array 518000 eksonit 42974-geenejä) eksonin erilaisia ​​analyysi (joukko parametreja korrelaatiokertoimen ≥0.7, silmukoinnin indeksi ≤-1,585, ja log

2 suhde ≤- 1,585), huomasimme, että amiloridi vaikuttanut liitoksen kuviot 551 geenien osallistuu vähintään 584 eksonia, joka sisälsi 495 tunnettua proteiinia koodaavan geenien mukana 526 eksonit (taulukko S1; MIAME hakunumero # GSE24581). Nämä 495 tunnettua proteiinia koodaavan geenien voitiin luokitella toimintakategorioihin mukana tukirankansa remodeling, soluadheesiota, ioninkuljetusmeka-, transkriptiotekijät, immuunivasteen, ja lihasten supistumisen (kuva 5A-C ja taulukko S2). Voit tarkistaa nämä eksonin array tuloksia, valitsimme seitsemän (

APF-1, CRK, MBNL2, MIZF, WAC, PAPDS

ja

surviviinista

) analysoitavaksi RT-PCR ja todellakin vahvisti selvästi AS kuvio korjauksilla näiden geenin transkriptien amiloridi käsiteltyjä soluja (kuvio 5D).

Bioinformatiikka analyysit 495 geenitranskriptien kanssa amiloridi modifioidun vaihtoehtoisen silmukoinnin, havaitsee genominlaajuisia eksoni-array mittaukset, suoritettiin mukaan geenin ontologian luokkiin biologisen prosessin (A), Molecular Function (B) ja Cellular Komponentti (C). Amiloridi-muuttunut AS malleja

APAF1, CRK, MBNL2, MIZF, WAC, PAPD5

ja

SU

R

VIVIN

erityistä proteiinia koodaavaa geeniä transkriptien havaitse exon- erilaisia ​​analyysi todensi RT-PCR saumattu RNA isoformeja (paneeli D).

yksityiskohtainen geeni ontologian (GO) tasot, RNA-transkriptit osoittavat amiloridi kärsivissä AS sisältyvät: a). 4 5 geenien (80,0%) ja ”microfilamentti motorisen aktiivisuuden” (GO 0000146), ja 28/132 (21,2%) geenien ”motorisen aktiivisuuden” (GO 0003774); b). 5 7 (71,4%) of ”kationin: kloridi symporter aktiivisuus” (GO 0015377), 5/18 (27,8%) ja ”anioni-kationi symporter” (GO 0015296), 3/10 (30,0%) ja ”natrium kalium vaihtamalla ATPaasi ”(GO 0005391), ja 2/8 (25,0%) epäorgaanisia anioninvaihto- aktiivisuutta” (GO 0005452); c). 2 3 (66,7%) nitric- leenioksidisyntaasia aktiivisuutta (GO 0004517); d) 16/29 geenejä (62,1%) ja ”soluväliaineen rakenteellisia ainesosana annetaan vetolujuus” (GO 0030020), 38/346 geenit (11,0%) ja ”solun tukirangan proteiineihin sitoutumisen” (GO 0030020), 2/7 (28,6% ) kollageenin sitoutumisen (GO 0005518); 2/8 (25,0%) ja ”myosiinin sitovia” (GO 0017022), ja muut. 213 apoptoosiin liittyvien geenien, 6 (

CCAR1, EP3000, KIAA1967, PRKDC, ja PRPF8

) osoitti muuttuneen vaihtoehtoisen silmukoinnin mukaan amiloridi. 608 syöpään liittyvien geenien, 32 mukaan lukien

RON /MISTR1, ATM

(ataksia teleangiectasis mutatoitunut) ja

FANCM

(Fanconin anemia M-proteiini) esiintyi amiloridi. Kuten

ATM

tärkeä rooli DNA-vaurioiden korjaamiseen, kun

FANCM

on mukana kokoonpanossa Fanc proteiinikomplekseille jotka ylläpitävät genomin eheyttä ja vakautta [30], muutettava näiden kahden geenin transkriptien by amiloridi voi johtaa kromatiinin hajoaminen, todennetuiksi meidän myöhemmissä kokeissa. Kuitenkin

RON /MISTR1

, mutta ei

BCL-X

ja

HIPK3

, oli yksi 495 geenit havaittu olevan amiloridi-muuttunut liittämiseen kuvioita eksonin erilaisia ​​analyysi, oletettavasti koska tiukkojen määrällisten perusteiden ja /tai lyhyitä saumattu sarjoissa

BCL-X

.

käyttäen tunnettua konsensus nukleotidisekvenssien liittämiseen säätelyelementtejä, me edelleen tunnistaa mahdollisia liitos tehostajana ja äänenvaimennin elementtejä vaihtoehtoisen silmukoinnin eksonin 5′-sivuava introni ja 3′- intronin alueilla 495 geenien vaikuttaa amiloridi (taulukko S3). Nämä silmukoinnin cis-elementit ovat sitoutumiskohtiin ASF /SF2, SRp55 ja muita tuntemattomia säätelytekijöitä. Aikana vuorovaikutukset SF2 /ASF ja muut SR proteiinin tekijöitä cis-elementtien liittämiseen komplekseja, toiminnallinen tila proteiini-proteiini-sitoutumisen komplekseja voidaan moduloida fosforylaation tila proteiinien [21], [23], [31] , [32]. Tämä merkitsee sitä, että muuttuneen silmukoinnin näiden geenitranskriptien oli välittyvät amiloridi aiheuttama hypo-fosforylaation SF2 /ASF ja muut SR proteiineja.

Vähentynyt solun liikkuvuus /hyökkäys toimintaa ja köyhdytettyä cytoskeletal rakenteiden seuraavat AS muutosten mukana geenien jälkeen amiloridi altistuksen

Koska muuttunut

RON /MISTR1

liittämiseen välittämiä SF2 /ASF on osoitettu johtavan lisääntyneeseen liikkuvuuteen ja invasiivisia toimintoja solujen [20], tutkimme funktionaalisen vaikutuksen amiloridi indusoima lasku eksonin 11 (+) fl

RON

ja eksonin 11 (-) sf

RON

isoformia (kuvio 1 C) ja laskua eksonin 13 ja eksonin 20 osallisuutta havaita eksoni erilaisia ​​analyysi (taulukko S1). Migraatio soluja kaavittiin yksikerroksista reuna oli heikentynyt 0,4 mM amiloridi (kuvio 6A). Fluoresoiva phalloidin sitova osoitti muuttaminen F-aktiinisytoskeletonver- tukirakenteet peräisin peri-ydin- verkon rakenteeseen ohjaus solut solun pinnan jakauman ilmeisesti jäykkä kotelo useiden tumien amiloridi käsiteltyjä soluja, ja myös vakavia ehtyminen soluliman sisällön mukaan lukien F-aktiini, altistumisen jälkeen 0,4 mM tai suurempia pitoisuuksia amiloridi (kuvio 6B). Nämä havainnot heikentää solujen liikkuvuuden ja epänormaali sytoplasman organisaatio F-aktiini ovat johdonmukaisia ​​sen eksonin joukko havaintoja muuttuneen Silmukointi monien keskeisten vuorovaikutuksessa proteiinin komponentteja soluväliaineen, kuten kollageenia perheiden cytoskeletal verkkoja sekä myosin perheet ja niiden sitoutuminen proteiinit (Taulukko S1), lisäksi

RON /MSTIR

ja niihin liittyvien säätelymolekyylien.

(paneeli A). Solumigraatiota määritettiin konfluentteja Huh-7-yksisolukerrokset kaavittu muovinen kaavin, altistetaan kasvualustaan ​​tai ilman 0,45 mM amiloridi 48 tunnin ajan, huuhdeltiin 2x PBS: lla ja edelleen syötetään kasvualustaa amiloridi. Serial mikroskooppivalokuvasta samoilla alueilla (merkitty vihreällä tai punaisella pohjalle puolella ruokia) otettu 48 ja 96 tuntia näyttää täydellisen inhibition solumigraation reunasta amiloridi saaneista yksikerroksisen. (Paneeli B), solut altistetaan konsentraatiot amiloridi kasvatusväliaineessa 36 tuntia kiinnitettiin paraformaldehydillä, permealized ja värjättiin DAPI ja FITC-phalloidin havainnointiin konfokaalimikroskopialla. DAPI-värjättyä ytimet ovat magenta-pseudocolored in sulautunut konfokaali valokuvia. (Paneeli C) Estovaikutus amiloridin on sytokineesin havaittiin mitoosi Huh-7-soluissa ravistaa pois lautasen, uudelleen pinnoitettu kasvualustaan, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia amiloridi. Jakava tytär solut fiksattiin 24, 48 ja 72 tuntia, värjätään ja valokuvattiin mikroskoopilla. (Paneeli D) mittaus etäisyydet kahden ytimet jakavat tai jaettuna tytär soluja osoittaa, että amiloridi estää postmitoottisia sytokineesiin ja erottaminen tytär soluja. Halkaisija solun tumassa on asetettu 10. Keskimääräinen ja keskihajonta kunkin keräyspiste on 15 vuodesta 20 tytärsolu paria.

häiritsemisestä on solusyklin etenemisen ja mitoosi sytokineesiin mukaan amiloridi

eksonin erilaisia ​​analyysi amiloridi-käsiteltyjen Huh-7-soluissa (taulukko S1 S2) havaittu muutoksia RNA silmukoinnin pääasiassa proteiineja, jotka liittyvät sytokineesi, liittyy liuenneen aineen kuljetukseen, ja toiminnot aktiini, mikrotubulusten, ja cytokinesis- liittyvät kinaasit [33]. Lisäksi muuttuneen Silmukointi on

CENPE

(sentromeerin proteiini E 312kDa),

CEP250

(centrosomal proteiinia 250kDa) ja

CEP192

(centrosomal proteiini 192kDa) olisi odotettavissa johtaa tehottomaan kromatidin erottaminen solusyklin aikana. Itse asiassa, leviämisen Huh-7-soluissa estyi 0,3 mM amiloridi tai korkeampi kasvualustassa (kuvio 7A). Lisäksi siellä oli kertymistä G2 /M tetraploidi soluja alkaa 24 tuntia, tulossa merkitty 48 tuntia (kuvio 7B). Valon mikroskooppinen tutkimus oli monia bi-tumallisten ja myöhäisvaiheen Anaphase solut, jotka olivat oletettavasti G2 /M tetraploidi solupopulaation noudatettava fluorocytometry. Aikana solusyklin etenemisen ja tytär solujen erottaminen, kun läsnä on vaihtelevia pitoisuuksia amiloridi, mitoottiset solut altistetaan amiloridi 0,3 mM tai enemmän kehittynyt bi-tumalliset lomakkeita 24 tunnin ajan, mutta sen jälkeen jättänyt tuottaa erotettiin tytärsoluihin (kuvio 6C ja 6D) . Nämä kolme havainnot merkitsevät sitä, että läpi muuttamalla RNA AS geenien amiloridi aiheuttaa häiriöitä sytokineesin estämällä mitoosi soluja kulkee myöhään Anaphase prosessien abscission, jako ja erottelu tytär soluja. Lopuksi olemme vahvistaneet aiemman raportin, Huh-7-solut ilmentävät Prominin /AC133 /CD133, immunologinen markkeri ”syöpä varsi-like” soluihin [34], ja lisäksi havaittiin, että amiloridi 0,3 mm alassäädetty CD133 ilmentyminen huh-7-soluissa (kuvio S2-A), jolloin tukahduttaminen lukumäärä ja koko solun pesäkkeitä kokoonpanojen (kuvio S2-B).

(paneeli A) huh-7-soluja maljattiin 6-kuoppalevyille 3 x 10

5 solua kuoppaa kohti yhdessä yössä muutettiin kasvualustaan, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia amiloridi; solumäärät määritettiin yksi ja kolme päivää myöhemmin. Solumäärä 24 tuntia kasvavan esto amiloridi 0,4 mM ja yläpuolella. Edelleen solumäärä vähenee näkyivät 72 tuntia, koska solukuoleman ja irtoaminen elatusaineessa, joka sisälsi amiloridi 0,3 mM ja yläpuolella. (Paneeli B) fluorometrilaitteen analyysi osoittaa amiloridi eston solusyklin etenemisen kanssa kertymistä G2 /M vaiheessa olevien solujen. (Paneeli C) Apoptoosi on ilmeistä fluorometrilaitteen havaitseminen anneksiiniV sitoutumisen Huh-7-solut käsiteltiin 0,5 mM amiloridi. (Paneeli D) Merkittyjä tuman DNA hajoamista havaittiin Huh-7-solut käsiteltiin 0,4 mM amiloridi mutta ei 0,2 mM amiloridi, erityisesti todettava 48 ja 72 tuntia.

Solukuolemaan Vaikeaa DNA hajoaminen jälkeen amiloridi aiheuttama muuttuneita silmukointi funktionaalisten molekyylien apoptoosin ja DNA: n korjaukseen polkuja

amiloridi käsiteltyjä soluja, silmukoinnin muutokset

BCL-X

ja

HIPK3

RNA: t ( Kuva 1A) ennustaisi muuttuneisiin solujen apoptoosin mekanismeja, ja muuttunut AS on

ATM

ja

FANCM

RNA: t (taulukko S1) muuttaisi DNA: n korjaukseen ja solun genomiin suojamekanismeja. Huh-7-soluja viljelmässä, jossa on 0,3-0,5 mM amiloridi osoittaa, ettei vain vähäinen solujen kasvua, vaan myös myöhemmin menetys aluksi päällystetty Huh-7-soluissa (kuvio 7A). Apoptoosi ilmeni lisääntynyt prosenttiosuudet anneksiiniV sitovien solujen altistuksen jälkeen 0,3-0,5 mM amiloridi 24 tai 46 tuntia (kuvio 7C). Lisäksi fluorocytometric analyysi solun DNA osoitti laaja tuman DNA pirstoutumista ja hajoamista enemmän soluja kuin ne osoittivat voidaan apoptoosin; altistuksen jälkeen 0,4 mM amiloridi, vain 48,2%, 6,5%, ja 1,2% Huh-7-solut oli ehjä solu DNA jälkeen 24, 48, ja 72 tuntia (kuvio 7D).

Samanlaisia ​​moduloiva vaikutus amiloridin on oncognic silmukointi muissa ihmisen kiinteiden kasvainten ja leukemiasolulinjoilla

määrittämiseksi yleisyyttä amiloridi havaittujen vaikutusten Huh-7-soluissa, käytimme vielä 10 vahvistettu ihmisen syövän ja leukemian solulinjoja, mukaan lukien 2 hepatooma HepG2 ja Hep3B; rabdomyosarkooma TE671; 3 glioblastooma 8401, ASCG13T1xm ja ASCG7T (4); 2 paksusuolen syöpä invasiivinen solulinjoissa HT29 ja COH; ja 3 leukemiat K562, HL60 ja Molt4 soluja, ja normaali luuytimestä peräisin mesenkymaalisten strooman linjan KP-hMSC sekä muutama normaali veren lymfosyyttiviljelmät, suorittaa erilaisia ​​Edellä mainittujen kokeiden. Tuloksemme osoittivat, että yleisesti amiloridi taipumus vaikuttaa pahanlaatuinen fenotyyppi liittyvän AS enemmän kuin normaali AS solussa. Ensimmäinen, olennaisesti kuten Huh-7-soluissa (kuvio 1), löydettiin amiloridi-moduloitu ”normalisointi” on abornal

BCL-X

ja

HIPK3

silmukoinnin kuviot hepatooma Hep G2, rabdomyosarkooma TE671, glioblastooma 8401, leukemiat K562, HL60 ja Molt4 (esim täydentävät tiedot [35]). Merkittävintä on, amiloridi voisi moduloida transkriptio /silmukointi

BCR-ABL

fuusiogeenin ja uudelleen herkistää solunsalpaajaresistentti

Bcr-Abl

T3151 mutanttisoluja imatinibi [35]. Päinvastoin, käyttämällä amiloridi enintään 2 mm kasvualustaan, emme havainneet mitään muutosta

BCL-X

ja

HIPK3

silmukoinnin kuvioita viljellyissä aktivoitu normaalissa perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (täydentävä tietoja [35]) eikä ikuisti luuydinperuskudos- KP-hMSC soluissa. Johdonmukaisesti, amiloridi välillä 0,02 mM-0,5 mM oli sytotoksinen syöpäsoluille, mutta ei normaaleihin soluihin viljelmässä (kuvio S3 A ​​ B). Käyttäen 72 tunnin

in vitro

dosviljelmämäärityksessä, huomasimme, että 50%: n kasvua estävää annosta amiloridi oli noin 0,02 mM TE671, 0,10 mM K562, 0,20 mM Huh-7, 0,3 mM kahdelle muut HCC Hep-G2 ja Hep-3B, ja 0,2-0,4 mM kolmen glioblastoma multiforme riviä mutta 3 mM tai mitattavissa normaalin solulinjojen (Kuva. S3-B). Edelleen, suoritimme globaali eksoni array analyysi myelooista leukemiaa räjäytykset K562 ja glioblastooma 8401, ja ilman amiloridi hoitoa, sillä vertailu Huh-7 (taulukot S1, S2 ja S3). Cross-sovitus 200 top-teki amiloridi-moduloidun geeneistä kunkin kolmen solulinjojen paljasti melko yleinen piirre amiloridi-moduloidun liitos, eli 187 geenejä tai 93,5% näistä 200 oli sama kolme solua; 188 (187 plus

DNAH8

) varten Huh-7 ja 8401; 189 (187 plus

LRP2 /RyR2

) varten Huh-7 ja K562; ja 190 (187 plus

ABL1, ColSA2, NAALAD2

) varten 8401 ja A549 (kuvio S4-A). GO analyysi 187 yhteisen geenit mukaan biologisia prosesseja (kuvio S4-B), molekyyli- toiminnot (kuva S4-C) ja solujen komponentit (kuvio S4-D) ryhmiin osoitti prosentuaalinen jakauma on samanlainen kuin amiloridi-moduloitu 495-geenit huh-7-soluissa (kuvio 5), mikä merkitsee sitä, K562 ja 8401-solujen, kuten huh-7-soluissa, amiloridi-moduloitu AS aiheuttaa samanlaisia ​​vaikutuksia solun tukirangan rakennetta, sytokineesi, ja DNA: n korjaukseen, sekä apoptoosi-mekanismi ja liuenneen aineen kuljetusjärjestelmä.

keskustelu

tutkimus perustuu alunperin havaintoon, että amiloridi muuttanut vaihtoehtoista silmukointi on

BCL-X, HIPK3

ja

RON /MISTR1

selostukset onkogeenisistä malleja kohti normaaleille ihmisen maksasyövän Huh-7-soluissa. In jatkokokeilu, havaitsimme hypo-fosforylaation SR liitos tekijöistä, erityisesti SF2 /ASF, sekä alkupään proteiinikinaaseja ja fosfataasi, viittaa siihen, että amiloridi voivat vaikuttaa toiminnallista tilaa eksonin mukaanotto /komplekseja. Global eksoni analyysi tosiaankin paljastanut korjauksilla kuten monissa geenissä selostukset matkapuhelinverkoissa. Tämän seurauksena amiloridi käsiteltyä Huh-7-solut osoittivat väheni muuttoliike /invaasio cytokinetic ominaisuudet, jälkeenjäänyt solusyklin etenemisen kanssa mitoosi vikoja, lisääntynyt apoptoottiset merkkejä, vakava solun DNA vahinkoja ja lopullinen solukuolemaa. Tutkimalla sen jälkeen, olemme nyt saadut tulokset, jotka amiloridi hoito voi tuottaa vastaavia AS modulointi- ja devitalizing vaikutuksia useissa muissa ihmisen pahanlaatuisten kiinteiden syöpien ja leukemiasolulinjoilla lisäksi maksasolusyövän Huh-7, mutta ilmeisesti ei muutaman viljeltiin normaaleja soluja testasimme (kuviot S3 ja S4).

erillinen ominaisuus amiloridi moduloinnissa AS välittämä pahanlaatuisten fenotyypit

Amiloride, 3,5-diamino-6-kloori-N- (diaminomethylene) pyratsiinikarboksiamidi monohydrokloridi , kehitettiin 1960-luvulla [36] ja on ollut huumeita käytetään kliinisesti turvotuksen hoitoon ja verenpainetauti perustuu sen natrium liikenteen ja nesteen homeostaasin vaikutukset [37]. Siksi me aluksi ajateltiin, että sen vaikutukset kasvaimia synnyttävän Silmukointi olisi välittyvän muutokset solunsisäinen pH ja ioni liikettä. Ei kuitenkaan samanlainen AS muutoksia havaittiin Huh-7-solut käsiteltiin neljä voimakkaampi Phi vaikuttavat amiloridi analogit, kuten EIPAn, jota aiemmin osoitti moduloimaan patogeenisten

SMN2

transkriptio soluissa selkäränkalihassurkastuminen potilaiden . Siten kyky muuttaa AS onkogeenis- RNA: iden näyttää olevan selvä ominaisuus amiloridi.

AS ohjataan erittäin konservoituneita SR proteiinit [1], [3], [5] ja sillä on tärkeä