Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Tuottaa lisätoimintaominaisuuksia tietoa kasvaimen kuvaamista, tutkimme käyttöä dual-energia tietokonetomografia kuvantamiseen hiiren keuhkokasvaimia. Kasvaimen verimäärän ja verisuonten läpäisevyyttä kvantitoitiin käyttäen kultaa ja jodia nanohiukkasia. Tämä lähestymistapa verrattiin yhden varjoainetta /single-energia CT menetelmällä.

Ex vivo

validointitutkimukset on suoritettu osoittamaan tarkkuus

in vivo

varjoainetta kvantifiointiin CT.

Methods

Ensisijainen keuhkotuumoreita kertyi

LSL-Kras

G12D; p53

FL /FL

hiirillä. Kultananopartikkeleilla injektoitiin sen jälkeen jodia nanohiukkasten kaksi päivää myöhemmin. Kullan kertyy kasvaimiin, kun jodia tarjotaan suonensisäinen kontrasti. Kolme dual-energia TT tehtiin kaksi yhtenäisen varjoainetta menetelmä ja yksi dual varjoainetta menetelmällä. Kulta ja jodi pitoisuudet kussakin scan laskettiin käyttäen dual-energia hajoaminen. Jokaisen menetelmän, kasvaimen murto veren tilavuus laskettiin perustuen jodin pitoisuuden, ja kasvaimen verisuonten läpäisevyyttä arvioitiin perustuen kertyneen kultapitoisuus. Validointiin, CT johdettu mittauksia verrattiin histologia ja induktiivisesti kytketty plasma optinen emissiospektroskopia mittaukset kultaa pitoisuuksien kudoksissa.

Tulokset

Dual-energia CT käytössä

in vivo

erottaminen kultaa ja jodia varjoaine ja osoitti otto kultananopartikkeleilla pernassa, maksassa, ja kasvaimet. Kasvaimen murto verimäärä mittauksia määritetään kaksi kuvantamismenetelmiä tulokset olivat yhteneviä, ja korkea korrelaatio (R

2 = 0,81) havaittiin välillä mitattiin murto veritilavuudesta ja histologisesti peräisin mikroverisuonten tiheys. Verisuonten läpäisevyyttä mittaukset on saatu kahdesta kuvantamismenetelmät sopi hyvin

ex vivo

mittauksia.

Johtopäätökset

Dual-energia CT käyttäen kahta nanohiukkasten vastaa yhden nanohiukkasten menetelmä, mutta sallii mittauksen murto veritilavuudesta ja läpäisevyys yhdellä skannata. Kuten vahvistanut

ex vivo

menetelmiä, CT johdettuja nanohiukkasten pitoisuudet ovat tarkkoja. Tämä menetelmä voisi olla merkittävä rooli keuhkojen kasvain luonnehdinta CT.

Citation: Ashton JR, Clark DP, Moding EJ, Ghaghada K, Kirsch DG, West JL, et al. (2014) Dual-Energy Micro-CT Funktionaalinen kuvantaminen Primary keuhkosyöpään hiirillä käyttäminen Gold ja jodi Nanoparticle varjoaine: validointitutkimuksessa. PLoS ONE 9 (2): e88129. doi: 10,1371 /journal.pone.0088129

Editor: Tanya V. Kalin, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 syyskuu 2013; Hyväksytty: 06 tammikuu 2014; Julkaistu: 10 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Ashton et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat rahoitus peräisin National Institutes of Health /National Center for Research Resources National Biomedical Technology Resource Center avustus (P41 EB015897) (CTB), ja National Cancer Institute U54 CA151668 (JLW). Muuta tukea tarjoamia NIH /NCI R21 CA175839 ja NIH /National Institute of Allergy and Infectious Diseases K02 AI093866 (DGK). JRA tukee Medical Scientist koulutusohjelma Training Grant (T32 GM007171) ja Duke Institutional Fellowship. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: KG omistaa optioita Marval Biosciences, start-up yhtiö kehittää myös liposomaalinen joditettiin CT varjoainetta. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Keuhkosyöpä edelleen johtava syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti ja kuolemien määrä johtuu keuhkosyöpään odotetaan kasvavan 50% vuoteen 2020 mennessä [1]. Tietokonetomografia (CT) on standardi kuvantamisen testi arvioimiseksi potilailla, joilla epäillään keuhkosyöpä. Valitettavasti pahanlaatuisia ja hyvänlaatuisia keuhkojen kyhmyt on usein samanlainen röntgenkuvissa ominaisuuksia CT [2], joten maligniteetti voida aina asianmukaisesti tunnistettu ja käsitelty. National Keuhkosyöpä seulonta Trial (NLCST), CT seulonta korkean riskin potilailla keuhkojen syöpäkuolleisuuden [3], ja Yhdysvalloissa Ennaltaehkäisevä Services Task Force on hiljattain suositellut rutiini CT keuhkosyövän seulonta korkean riskin potilailla; kuitenkin, tämä seulonta johtaa väistämättä havaita pieniä keuhkonoduluksia ( 1 cm), jotka eivät ole hyvin tyypillistä hetkellä kuvantamislaite säännöt (PET, CT tai MRI) [4]. NLCST osoitti, että suurin osa näistä kyhmyt eivät ole kliinisesti merkittäviä. Tämän vuoksi on tarpeen laajentaa tietojen mukaan CT Imaging kyhmy luonnehdinta-sekä luonteenomaiset tunnettujen kasvainten ja erottamiselle juuri havaittuihin pahanlaatuisia kasvaimia hyvänlaatuisesta kyhmyt.

Yksi mahdollinen menetelmä kasvaimen ylimääräinen luonnehdinta on tutkia keuhkojen kasvain verisuoniston. Angiogeneesi on keskeinen tekijä syövän kasvua ja etäpesäkkeiden. Erityisesti angiogeneesin edistää kasvaimen kasvua antamalla kasvaimia tarvittavat ravintoaineet ja tarjoaa kanava metastaaseja. Verisuonien muodostuu nopeasti angiogeneesi yleensä vähemmän hyvin organisoitu ja enemmän läpäisevä kuin normaalissa verisuonistossa [5]. Tiheys kasvaimen verisuoniston, joka on usein korreloi angiogeneesin laajuus, on niihin liittyvät kasvaimen aggressiivisuus ja korreloi selviytymisen [6]. On myös näyttöä siitä, että laajuus verisuonitus ja verisuonten läpäisevyyttä vaihtelee hyvän- ja pahanlaatuisten keuhkonoduluksia [7]; kuitenkin enemmän kattavia tutkimuksia, jotka suoritetaan parhaiten prekliinisen tasolla, tarvitaan selvittämään tärkeitä nämä verisuonten biomarkkereita keuhkosyövässä.

käyttäminen prekliinisissä tutkimuksissa hiirillä, olemme aiemmin osoittaneet, että veltto ja aggressiivinen keuhkojen kasvaimet voidaan eriyttää käytetään yksinkertaista energiaa mikro-CT ja jodia sisältävää liposomaalinen (Lip-I) varjoaine [8]. Lisääntynyt kertyminen nanohiukkasten (lisääntyneen verisuonten läpäisevyyttä) osoitettiin aggressiivisempia kasvaimia verrattuna indolent ne kuitenkin verisuonitiheydessä oli samanlainen kahdessa kasvaimen tyyppiä. Yksittäinen varjoainetta kokeet mukaan kaksi TT erottaa useita päiviä, mikä mahdollistaa veren puhdistuma varjoaineen jotta määrällisesti ja eriyttää verisuoni signaalin kasvain kertynyt signaali. Viive varhaisen ja viivästyneen vaiheen kuvantaminen ei ehkä tarvita, jos omaksumaan tyylikäs ratkaisu liittyy kahdentyyppisiä nanohiukkasten ja CT kuvantamismenetelmät kuten spektrin tai dual-energia (DE) CT.

DE kuvantaminen on kehittynyt tekniikka, joka on viime aikoina noussut etualalle CT teknologian [9]. Imeytymistä röntgenkuvat varjoaineista riippuu voimakkaasti sekä varjoainetta n atomipaino ja energia tapahtumasta röntgen-. Näin ollen, kaksi materiaalia eri atomipaino voidaan erottaa toisistaan ​​perustuen niiden ainutlaatuinen vaimentumiskertoimia kahdessa eri x-ray energiat. DE-CT sallii selektiivisen visualisoinnin ja kvantifiointiin useita varjoaine yhdellä skannauksella. DE-CT on edistynyt huomattavasti syövän kliininen kuvantamisessa. Keuhkotuumoreista, on osoitettu, että jodi parannusta kliinisissä DE-CT-kuvia voidaan korreloida SUV

max

18FDG- PET [10], [11], mikä osoittaa, että DE-CT on potentiaalia pidentää CT kuvantamisessa kuin pelkästään anatomista kuvantamista toiminnallisia ja molekyylikuvantaminen. Vaikka DE-CT näyttää korkea lupauksen klinikalla syövän kuvantaminen, sitä ei ole laajalti hyväksytty prekliinisissä toimialueen asettamien haasteiden vuoksi liittyy korkeampi spatiaalinen resoluutio, ajallinen tarkkuus, ja melutason mikro-CT. Olemme kuitenkin voineet osoite jotkin näistä haasteista ja ovat osoittaneet, että DE mikro-CT käyttäen nanopartikkeleita varjoaineita voi olla tärkeä rooli prekliinisissä Imaging sydämen [12], keuhko [13], ja syöpä sovelluksia [14] , [15].

Nanoparticle varjoaineet ovat olennaisia ​​prekliinisiä CT tutkimuksiin, koska tavanomaisia ​​varjoaineita poistuvat verenkierrosta liian nopeasti tehokkaan kuvantamisen. Useimmat prekliinisissä eläinmalleissa, erityisesti hiiret pystyvät munuaisten selkeä pienimolekyylipainoisen kliininen varjoaine heidän verensä sekunneissa (normaali veren puoliintumisaika ihmisessä on 2-3 tuntia [16]), koska niiden erittäin suuren sydämen tuotos. Nanohiukkasten käytetään CT varjoaineina tyypillisesti on pitkä ( 2 tuntia) puoliintumisaika ja myös taipumus kerääntyä kasvainten takia tehostetun läpäisevyyttä ja säilyttäminen (EPR) vaikutus [17]. Hyödyllisyyttä näiden aineiden prekliinisissä CT kuvantaminen on vakiintunut [14], [18] – [24].

Olemme viime aikoina kehitetty DE mikro-CT menetelmä erottamiseksi kultaa ja jodia nanopartikkeleiden verisuonten kuvantaminen pehmytkudoksen sarkoomat [14]. Tässä menetelmässä kultananopartikkeleilla pistoksena ja annetaan kerääntyä kasvainkudoksessa kaksi päivää. Liposomaalinen jodi ruiskutetaan sitten ja seuraa välittömästi DE-CT kun jodi jää suonensisäisen. Verisuonten läpäisevyyttä (nopeudella kasvain nanohiukkasten otto) lasketaan mitatusta kullan pitoisuus kudoksissa, kun veren tilavuus lasketaan kudoksesta jodin pitoisuudet. Tässä työssä pyritään soveltamaan DE mikro-CT menetelmä haastava tehtävä kuvantamisen keuhkotuumoreiden kvantifiointiin kasvaimen veren tilavuuden ja verisuonten läpäisevyyttä. Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että kaksi varjoainetta (kaksi-materiaali) menetelmällä, joka vaatii vain yhden CT, erottuu edukseen myös aiemmin julkaistu single varjoainetta (single-materiaali) menetelmällä, joka tarvittiin kaksi TT toisistaan ​​useita päiviä lisäksi [8]. Mikä tärkeintä, pyrimme myös vahvistamaan meidän

in vivo

dual-energia tuloksia

ex vivo

kultakantaan mittauksia. Parhaan tietomme mukaan ei ole ollut julkaistu kliinisiä tai esikliinisiä DE-CT tutkimuksissa tiukka validointi lasketaan

in vivo

materiaalia pitoisuuksia. DE mittaukset ovat yleensä kalibroidaan käyttämällä

in vitro

haamut, lähentämistoimenpiteisiin, mutta eivät täysin edusta,

in vivo

olosuhteissa. Siksi on mahdollista saavuttaa merkittäviä virhettä DE mittauksia, kun nojaudutaan vain in vitro phantom kalibroinnit. Tässä käsikirjoitus, sitoudumme

in vivo

validointi, joka on kriittinen kehittää DE-CT prekliinisissä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

kaikki eläimet käsiteltiin mukaisesti eläinten hyvä käytäntö määrittelemät asianomaisten kansallisten ja /tai paikallisten eläinten hyvinvoinnin elimet, ja kaikki eläinten työ hyväksyi Institutional animal Care ja Käytä komitea (IACUC protokolla A283-11-11) of Duke University Medical Center. Duke University Medical Center eläinten hoito-ohjelma on akkreditoitu American Association for arviointi ja akkreditointi Laboratory Animal Care (AAALAC) ja täyttää National Institutes of Health standardien esitetty ”Guide for Care ja käyttö Laboratory Animals” (DHHS julkaisu nro (NIH) 85-23, tarkistettu 1985). Toimielin hyväksyy myös pakollisina PHS ”valiokunnalle inhimillinen hoito ja käyttö Laboratory Eläimet awardee toimielimet” ja ”NIH periaatteet hyödyntäminen ja hoidon käytettäviä selkärankaisia ​​Testaus, tutkimus ja koulutus.”.

Liposomeja jodi Fabrication

liposomaalisen jodia valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [25]. Lipidi-seos (200 mmol /l), joka koostuu 1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-fosfokoliinia (DPPC), kolesterolia ja 1,2-distearoyyli-sn-glysero-3-fosfoetanoliamiini-N- [metoksi ( polyetyleeniglykoli) -2000] (DSPE-MPEG 2000) on 55:40: 5 moolisuhde liuotettiin etanoliin ja sammutettua väkevällä jodiksanoli liuosta (550 mg I /ml). Saatu lipidi liuos peräkkäin suulakepuristettiin Lipex Thermoline suulakepuristimessa (Northern Lipids, Vancouver, Brittiläinen Kolumbia, Kanada) koon liposomien on -100 nm. Liposomiliuokseen diasuodatettiin käyttäen MicroKros® moduuli (Spectrum Laboratories, Milpitas, CA) poistamiseksi un kapseloitu jodiksanoli.

Liposomalia Jodi Characterization

kokojakauma liposomien lopullisessa formulaatiossa oli määritetään dynaamisen valon sironnan (DLS) avulla Malvern Zetasizer Nanoseries (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) 25 ° C: ssa. Transmissioelektronimikroskopia (TEM) suoritettiin ylimääräisiä koon analysointiin ja varjoaine karakterisointi. Liposomit spot-kuivataan hiilen elokuva verkkoon ja kuvattiin käyttäen FEI Tecnai G

2 Twin TEM (FEI, Hillsboro, OR) on käyttöjännite 120 mV. Partikkelihalkaisija mitattiin 200 liposomien avulla ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/, NIH). Jodi pitoisuus lopullisessa liposomaalisen liuos kvantifioitiin mittaamalla UV-absorbanssi 245 nm: ssä käyttäen Cary 50 spektrofotometrillä (Varian Medical Systems, Palo Alto, CA).

In vitro

liposomien stabiilisuutta varmistettiin mittaamalla vapautuminen jodiksanoli liposomeista inkuboinnin jälkeen fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 37 ° C: ssa 72 tunnin ajan. Pitoisuus jodiksanoli vapautetaan inkuboinnin jälkeen määritettiin dialysoimalla liposomit vastaan ​​500 ml: aan PBS: ää ja mittaamalla UV-absorbanssi dialysaatin kvartsikyvettiin.

kultananohiukkasten Fabrication

Kultananohiukkasia (AuNPs) tuotettiin käyttäen Frens menetelmällä [26]. 500 ml 1 mM liuosta, jossa oli HAuCl

4 ultrapuhdasta vettä kiehuvaksi. Esilämmitetyssä liuokseen, jossa oli 540 mg natriumsitraattia liuotetaan 3 ml: ssa vettä ruiskutetaan nopeasti kultaa liuokseen ja tuloksena saatua seosta sekoitettiin voimakkaasti. Väri muuttui keltaisesta värittömästä tummanpunainen aikana 30 sekuntia. Reaktiota jatkettiin keittämällä 15 minuuttia, minkä jälkeen reaktioastia poistettiin lämmönlähde ja annetaan jäähtyä jatkuvasti sekoittaen 1 tunnin ajan. Jäähdytyksen jälkeen nanohiukkasten suodatettiin käyttäen 0,45 um polyeetterisulfonisuodatinta. Passivoi tuotetaan nanohiukkasia, suuren ylimäärän 5 kDa tioli-polyetyleeniglykoli (PEG; Laysan Bio, Arab, AL) lisättiin suodatettuun nanohiukkasia, jotka sitten keinutettiin huoneenlämpötilassa 4 tunnin ajan. Sitoutumaton PEG-molekyylit poistettiin ja hiukkaset konsentroidaan käyttämällä 100 kDa keskipakoisvoiman suodatin.

kultananohiukkasten Characterization

kokojakauma ja pinta vastaa kultananopartikkeleilla leimasi DLS ja zeta-potentiaali käyttämällä Malvern Zetasizer Nanoseries 25 ° C: ssa. DLS kokojakauma vahvistettiin TEM käyttämällä FEI Tecnai G

2 hengen TEM toimii 200 mV. Hiukkasen halkaisija ja kuvasuhde mitattiin 200 AuNPs avulla ImageJ. Absorptiospektrit AuNPs suspendoitu ultrapuhdasta vettä kerättiin 400-650 nm käyttäen UV-Vis spektrofotometri. Vakautta PEGyloidun nanohiukkasten vastaan ​​aggregaation vahvistettiin tarkkailemalla UV-Vis-spektrin 6 tuntia lisäämisen jälkeen fysiologiset suolaliuokset 0,9% NaCl tai Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), elatusaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ratkaisuihin paljas tai PEGyloidun AuNPs. Lopullinen pitoisuus kultaa konsentroitiin AuNP liuoksessa määritettiin UV-VIS-absorbanssi käyttäen julkaistua ekstinktiokerrointa 12 nm AuNPs 450 nm: ssä [27], ja sen jälkeen korreloi mittauksia induktiivisesti kytketty plasma optinen (ICP-OES ), kuten alla on kuvattu.

In vivo

Kasvaimen Imaging

Keuhkokasvaimia tuotettiin intranasaalisesti injektio adenovirusta, joka ekspressoi Cre-rekombinaasia (Gene Transfer Vector Core, University of Iowa) osaksi

LSL-Kras

G12D; p53

FL /FL

yhdiste mutanttihiirissä kuten aiemmin on kuvattu [28] – [30]. Hiiret primaaristen keuhkokasvaimet käytettiin kuvantamistutkimukseen 12 viikon kuluttua adeno-Cre-infektion, jossa vaiheessa useita aggressiivisia keuhkojen adenokarsinooman (~0.5-1.5 mm halkaisijaltaan) olivat läsnä kussakin hiiri. Kaikki eläimet kuvattiin 24-30 viikon iässä. Yhteensä viisi eläintä, käytettiin kuvantamistutkimukseen. Johtuen pituussuuntaiseen luonne tämän tutkimuksen kukin hiiri toimi omana kontrollinaan.

Pituussuuntainen DE mikro-CT-kuvantaminen suoritettiin kaikille eläimille, kuten on esitetty kuviossa 1. Kolme DE mikro-CT-skannaukset suoritettiin kunkin hiiri, jotta voidaan verrata yhden materiaalin menetelmällä (TT 1 ja 2) kanssa uusia kahden materiaalin menetelmällä (CT 3). Toteamme, että toisin kuin edellisessä tutkimuksessa [14], DE-mikro-CT suoritettiin vaikka yhdellä varjoainetta, joka antoi meille mahdollisuuden mitata kultapitoisuus ilman vertailua ennalta kontrasti scan. Päivänä 1 AuNP varjoainetta ruiskutettiin suonensisäisesti häntälaskimoon tilavuudessa annoksena 0,32 ml /25 g kehon painoa ja injektion skannaukset (TT 1) otettiin heti hankittu. Sitten odottanut 48 tuntia, jotta riittävästi aikaa kultaa kertymistä esiintyy kasvaimia. Tämän viiveen jälkeen (päivä 3) toinen dual-energia CT (CT 2) saatiin. Välittömästi sen jälkeen toisen skannauksen, liposomaalinen jodia varjoainetta ruiskutettiin häntälaskimoon tilavuudessa annoksena 0,3 ml /25 g kehon painoa ja kolmannen dual-energia CT (CT 3) suoritettiin. Sen jälkeen kolmas skannaus, hiiret lopetettiin ja kudokset kerättiin validointitutkimuksissa jäljempänä kuvatulla tavalla.

AuNPs injektoitiin päivänä 1, jonka jälkeen välittömästi CT 1. Kaksi päivää myöhemmin, CT skannaa 2 oli tehty , välittömästi Lip-I injektio ja CT 3. Kaikki skannaa olivat dual-energia mikro-CT yritysostoja.

Dual-Energy Micro-CT System

erikoisvalmisteinen dual-lähde mikro-CT-kuvantamisjärjestelmä käytettiin tutkimuksessa [31]. Eläimiä skannattiin taas vapaasti hengittävä nukutuksessa käyttäen 2-3% isofluraania toimittama nenä-kartio. Kehon lämpötila ylläpidettiin lämpölampuilla, peräsuolen koetin, ja palaute ohjain (Digi-Sense®, Cole Parmer, Chicago, IL). Mahdollinen hengitysteiden gating käytettiin vaikutusten minimoimiseksi eläimen hengityksen liikkeen aikana skannaa [32]. Pneumaattinen tyyny on sijoitettu eläinten rintakehän yhdistetty paineanturiin tarkkailuun käytettiin hengitys. LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) hakemus käytettiin seurata hengitys- signaalin ja laukaista röntgenputket lopussa kulunut laskemalla kiinteän aikaviiveen huipusta hengityselinten signaalia. Yritysostot tehtiin molemmille kuvantamisen ketjujen kullakin Kiertokulma on 10 ms viive kahden röntgenputken vastuut minimoimiseksi rajat hajottaa. Koska tämä on hyvin pieni viive suhteessa pituuteen litteä pää uloshengityksen vaiheessa, se ei vaikuta suorituskykyyn hengitysteiden salpauksen. Kaikkiaan 360 katselua mitattiin kullekin kuvantamisen ketju yli 360 astetta. Jokainen prospektiivisesti säätelemiin scan kesti noin 7 minuuttia. Skannauksen parametrit dual-energia skannaukset olivat: 80 kVp, 160 mA, 10 ms /altistuksen ensimmäisen kuvantamisen ketjua ja 40 kVp, 250 mA, 16 ms /altistuminen toisen kuvantamisen ketjua. Yhteenlaskettu säteilyannos liittyy kolme TT oli 0,39 Gy.

jälkikäsittely ja Dual-Energy hajoaminen

DE mikro-CT tietojenkäsittely seurasi vuokaavion kuviossa 2. Raaka 40 kVp ja 80 kVp aineistot rekonstruoitiin käyttämällä Feldkamp algoritmia [33] matriisissa 512 × 512 × 512 88-pm isotrooppinen tilavuusalkiosta kokoa. Affine rekisteröinti suoritettiin parantamaan rekisteröinnin välillä vastaavat 40 ja 80 kVp rekonstruoitu määriä käyttäen muurahaisia, avoimen lähdekoodin, ITK-pohjainen rekisteröinti Toolkit (Advanced normalisoituminen Työkalut, https://picsl.upenn.edu/ANTS/, SVN 1409; [ ,,,0],34], [35]). Parantaa hajoaminen, kukin aineisto oli denoised käyttää yhteisiä kahden- suodatus (BF). Yhteinen BF on spektrin laajentaminen hyvin tunnettu reunat säilyttävällä soitussuotimena että pitää jakelua naapurimaiden voxels sekä avaruudessa ja intensiteettiä. Yhteinen BF toteutettiin MATLAB (MathWorks, Natick MA), ja yleensä päätökseen 15 20 minuuttia per tehoarvojoukon. Tiedot soveltamisen yhteisen BF hiiren mikro-CT data [36] ja määrälliseen arviointiin soveltamisen BF DE mikro-TT [13] on kuvattu aiemmin.

Raw 40 kVp ja 80 kVp aineistoja hankittiin, ja sitten ne tehtiin affiininen rekisteröinti ja yhteistyöhankkeista suodatus tuottaa suodatettua aineistoja. Dual-energia hajoaminen suoritettiin seuraavilla suodatetaan kuvia, mikä johti kahden riippumattoman kuvaa (kartat), joka edustaa jodi ja kullan pitoisuus kussakin vokselin. Saatuaan kaksi karttaa, että kuvat ovat päällekkäin ja luuttomaksi segmentoitua ulos (väriltään valkoinen) muodostamaan lopullisen pitoisuuden kartta overlay. Nämä kuvat otettiin CT 3, jossa sekä jodi ja kullan olivat läsnä veressä. Mittakaavapalkki edustaa 1 cm kaikki kuvat. 40 ja 80 kVp kuvat ikkunoidaan -300-+1.200 HU, jodi kartat ikkunoidaan 0,25-15 mg /ml, ja kulta kartat ikkunoidaan 0,25-6 mg /ml.

DE hajoaminen kultaa ja jodia suoritettiin rekisteröinnin jälkeen ja suodatuksen käyttäen vastaavia 80 ja 40 kVp-suodatettujen tietojen, kuten aiemmin on kuvattu [14], [37]. Kunkin vokselin hajoaminen mukana ratkaiseminen kahden yhtälön kaksi tuntematonta, C

I ja C

Au, jotka edustavat pitoisuuksia jodi ja kullan vastaavasti sovitussa vokselin. Mitattu CT vaimennuksen arvo kussakin vokselin on lineaarinen yhdistelmä tuntemattoman kultaa ja jodin pitoisuudet mg /ml kerrottuna kertoimien CT herkkyyden matriisin, kuten on esitetty seuraavalla kaavalla:

Tässä, C

I ja C

Au ovat tuntemattomia pitoisuuksia jodi ja kullan vastaavasti tietyllä voxel, CT

40 ja CT

80 ovat mitataan vaimennukset että vokselin 40 ja 80 kVp, ja CT

I, 40, CT

I, 80, CT

Au, 40, ja CT

Au, 80 ovat empiirisesti määrätty kertoimet vakion herkkyyden matriisi jodin ja kultaa 40 ja 80 kVp mitatussa vaimennus (HU yksikköä) per varjoainetta pitoisuus (mg /ml). Tuntematon pitoisuudet jodi ja kullan kussakin vokselifantomeita määritettiin kääntämällä tätä herkkyyttä matriisi ja löytää pienimmän neliösumman ratkaisu seuraavista järjestelmän yhtälöt MATLAB:

Skannaus energiat optimaalisen kultaa ja jodia hajoaminen valittiin seuraten tulokset edellisessä simulaatioita ja

in vitro

tutkimuksissa [37]. Nämä tutkimukset osoittivat, että suurin spektrin ero kultaa ja jodi polykromaattiseksi röntgen lähteistä tapahtui käyttöjännitteiden 40 ja 80 kVp. Arvot kertoimien herkkyys matriisin jokaisessa energia (CT

I, 40, CT

I, 80, CT

Au, 40, ja CT

Au, 80) määritettiin empiirisesti käyttämällä kalibrointi phantom kuten aiemmin on kuvattu [14]. Sillä phantom kalibrointia, CT vaimennus injektiopulloa tunnettujen kulta ja jodin pitoisuus mitattiin 40 ja 80 kVp, ja kertoimet herkkyyden matriisin määritettiin sovittamalla tunnettuja kultaa ja jodin pitoisuudet on mitattu CT vaimennus käyttäen lineaarista ainakin neliösummaregressioanalyysilla kullakin energiatasolla. Näitä arvoja CT

I, 40, CT

I, 80, CT

Au, 40, ja CT

Au, 80 käytetty tässä tutkimuksessa olivat 28,7, 42,6, 88,5, ja 58,8 HU /mg /ml, vastaavasti. Sen jälkeen hajoaminen, vokseleiksi negatiivisia pitoisuuksia molempien materiaalien asetettiin nollaan. Vokseleiksi negatiivisella pitoisuus yhdestä materiaalista ja positiivinen pitoisuus muuta materiaalia heijastettiin aliavaruus positiivinen pitoisuus.

In vitro

validointi Hajoamisen menetelmän avulla sekä digitaalisia ja fyysisiä haamut on osoitettu edellisessä työssä [14]. Validointivaiheet tutkimukset osoittivat kykyä Hajoamisen menetelmän mitata kultaa ja jodin pitoisuudet sekä silloin, kun ne ovat riippumattomia toisistaan ​​ja kun he ovat läsnä samassa vokseli.

Kuva-analyysi

CT kuvat analysoitiin käyttämällä Avizo (FEI visualisointi Sciences Group, Burlington, MA). Alueet vastaavat veren (kammion onteloon ja suuria aluksia) ja pernassa automaattisesti Lohkoihin käyttäen 80 kVp tietokokonaisuus, kun taas alueet, jotka vastaavat maksaan ja munuaisiin olivat puoliautomaattisesti segmentoida käyttämällä samaa keräämiseen. Jokainen segmentoitu alue mukana koko elintä, mutta jätetty suurten verisuonten sisällä urut. Kasvaimet segmentoitu puoliautomaattisesti käyttäen kultaa kartan dual-energia hajoaminen. Karkea alueet olivat käsin piirretty rajojen ulkopuolella kasvain, ja nämä alueet olivat kynnysarvo valitsemaan vain voxels jotka sisälsivät kultapitoisuus 0,25 mg /ml ja 3 mg /ml. Näitä raja-arvoja valittiin, jotta suljetaan normaaliin keuhkoparenkyymistä, suurten verisuonten ja luun päässä segmentoitu kasvaimia. Kaikkiaan 27 keuhkotuumoreista 5 hiiret tunnistettiin ja segmentoida kussakin 3 DE mikro-TT.

Seuratut segmentointi, kulta ja jodi mitattiin kullakin segmentoida kiinnostava alue laskemalla keskiarvon kullan arvosta ja jodi karttoja koko kohdealueen. Koska molemmat nanopartikkelit ovat pitkä puoliintumisaika varjoaineita, ne jäävät lähes kokonaan verisuoniston välittömästi ruiskeen antamisen jälkeen. Murto verimäärä (FBV) kunkin elimen voidaan näin ollen arvioida mittaamalla kultaa tai jodi pitoisuus elimessä heti nanohiukkasten injektion. Laskimme FBV päivänä 1 käyttämällä AuNPs ja uudelleen päivänä 3 käyttäen Lip-I. FBV laskettiin seuraavalla kaavalla: missä C

Au, day1 on keskimääräinen kullan pitoisuus kudoksessa heti kultaa injektio päivänä 1, C

Au, veri, day1 on keskimääräinen kullan pitoisuus segmentoidun veressä päivänä 1, C

I, Day3 on keskimääräinen jodi pitoisuus kudoksessa heti Lip-I injektio, ja C

I, veri, Day3 on keskimääräinen jodi pitoisuus mitattiin segmentoitu veressä päivänä 3. FBV laskettiin kullekin segmentoidun kasvain, perna, maksa ja munuainen sekä ajankohtina. Tämä laskennallinen FBV on arvio verisuonten tiheys kudoksen, ja korreloi mikrovaskulaarisen tiheys lasketaan analysoimalla kuvia histologisten kudosleikkeiden, kuten alla on kuvattu.

määrittämisen jälkeen FBV kussakin kudoksessa, pitoisuus kulta kertynyt kussakin kudoksessa laskettiin. Koska sen pitkä puoliintumisaika veressä, yli puolet ruiskutetaan varjoainetta pysyi veressä päivänä 3. Siten kudos kulta pitoisuus mitattiin CT kullan kartta sisältää sekä kultaa että kulkeutuu kudokseen ja kullan, joka jää suonensisäisen kudoksessa. FBV edellä on laskettu voidaan vähentää suonensisäisestä kullan pitoisuus seuraavalla kaavalla: missä C

Au, accum on kertynyt (ekstravaskulaarista) kulta pitoisuus kudoksessa, C

Au, tot on yhteensä kullan pitoisuus kudoksessa lasketaan CT kulta karttaa päivänä 3, C

Au, iv on pitoisuus kultaa sisällä kudos, joka jää suonensisäisen, ja C

Au, veri on pitoisuus kultaa irtotavarana veressä lasketaan CT kulta karttaa päivänä 3. Nämä yhtälöt käytettiin laskettaessa kertyneet kulta kussakin kasvain ja urut. Yhtä varjoainetta menetelmässä FBV CT skannaa 1 ja kullan pitoisuudet CT 2 käytettiin näissä laskelmissa. Kahden varjoainetta menetelmässä FBV ja kullan pitoisuudet olivat molemmat CT 3. validointi, nämä kertynyt kulta pitoisuuksia verrattiin pitoisuudet kultaa kunkin elimen mitattiin ICP-OES.

validointitutkimuksiin

Tissue käsittelyä.

Näytteet verta, keuhkojen kasvaimet ja muut elimet (munuaiset, maksa, perna) uutettiin kaikki hiiret analyysiä varten. Verta otettiin hiiristä ensimmäinen CT päässä kasvojen suoneen. Päätelaite veri piirtää ja elinryöstöt suoritettiin seuraavan kolmannen CT. Kukin hiiri pantiin syvässä anestesiassa intraperitoneaalisesti pentobarbitaalia. Anestesia varmistettiin varvas hyppysellinen. Vatsaontelon avattiin ja otettiin verta hitaasti Alaonttolaskimo kun taas sydän oli vielä pelaajan. 0,5-1,0 ml verta kerättiin kustakin hiirestä, minkä jälkeen alaonttolaskimoon ja aortta katkaistu ja jäljellä oleva veri annettiin valua vatsaonteloon. Henkitorvi kanyloitiin, jossa on 20-gaugen neula, jonka kautta 01:01 seos cryoembedding väliaineen (MMA) ja 30% sakkaroosia injisoitiin keuhkoihin täyttää ilmatilasta myöhempää kudoksen leikkauksen. Sen jälkeen inflaation kanssa upotusaineeseen, keuhkot poistettiin hiirestä ja joko välittömästi leikellään keuhkotuumoreista tai upotettiin OCT ja jäädytettiin kuivajäässä. Keuhkokasvaimia uutetaan leikeltiin keuhkot liotettiin PBS: ssa 5 minuutin huuhdella pois jäljellä verta ja jäädytettiin sitten -80 ° C: ssa ICP-OES analyysi. Sen jälkeen keuhko louhinta, maksassa, pernassa ja munuaisissa kunkin hiiren kerättiin ja puolitetaan. Ensimmäisen puoliskon kunkin toimielimen välittömästi upotettiin OCT kuivajäässä leikkaamista varten. Toinen puoli liotettiin PBS: ssa 5 minuuttia ja pakastettiin -80 ° C: ssa ICP-OES analyysi. Kaikki kudokset pidettiin jäädytettyinä -80 ° C: ssa, kunnes valmis jatkokäsittelyyn.

Histologia.

8-jam: n jää- kasvaimen leikkeet immunovärjättiin endoteelisolujen markkerin CD31. Ennen värjäystä, leikkeet kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, huuhdeltiin PBS: llä ja blokattiin 10% FBS PBS: ssä yhden tunnin ajan. Sitten leikkeitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen (rotan anti-hiiri-CD31, BD Pharmingen), laimennettu 1:250 estopuskurissa 2 tuntia huoneen lämpötilassa. Objektilasit huuhdeltiin kolme kertaa PBS: llä 10 minuutin ajan poistamaan sitoutumaton primaarisen vasta-aineen, jonka jälkeen sekundääristä vasta-ainetta (Alexa Fluor488-konjugoidulla aasin anti-rotta-IgG, Invitrogen) laimennettuna 1:500 estopuskurissa lisättiin ja inkuboitiin 1 tunnin ajan pimeä. Tumat vastavärjättiin DAPI. Muutama 8-um: n leikkeitä käytettiin myös hematoksyliinillä ja eosiinilla (H & E) värjäys. H & E-värjäys, näytteet värjättiin hematoksyliinillä, huuhdeltiin vedellä ja etanolilla, värjätään eosiinilla Y, sitten huuhdeltiin etanolilla ja ksyleenillä ja kiinnitettiin mikroskopiaan.

immunovärjättiin leikkeet kuvattiin käyttämällä Zeiss Axiovert 135 ylösalaisin