Krooninen sairaus

tiivistelmä

sykliini D1 säätelee G1 etenemistä. Sen transkription säätelyyn ymmärretään hyvin. Kuitenkin mekanismi taustalla sykliini D1 ubikinaation ja sen myöhempi hajoaminen ei ole vielä selvä. Me raportoimme, että sykliini-D1 läpikäy lisääntynyt hajoaminen sytoplasmassa aikana S-vaiheen erilaisia ​​syöpäsoluja. Tämä välittyy fosforylaation Thr286 toiminnan kautta Ras /Raf /MEK /ERK cascade ja F-box-proteiini FBXW8, joka on E3-ligaasia. Suurin osa FBXW8 ilmaistaan ​​sytoplasmassa aikana G1 ja S-vaiheen. Sen sijaan, sykliini D1 kertyy tumassa aikana G1 vaiheessa ja poistuu sytoplasmaan S-vaiheessa. Lisääntynyt sykliini D1 hajoaminen liittyy yhdessä FBXW8 sytoplasmassa, ja tehostetun fosforylaatiota sykliini D1 pysyvään ERK1 /2 signalointi. Ehtyminen FBXW8 aiheutti merkittävän kertyminen sykliini D1 sekä takavarikoimaan CDK1 sytoplasmassa. Tämä johti merkittävään vähenemiseen soluproliferaation. Nämä vaikutukset voidaan pelastaa konstitutiivisen ydin- ilmentymistä sykliini D1-T286A. Siten FBXW8 on keskeinen rooli syövän solujen lisääntymisen kautta proteolyysiä sykliini D1. Se voi esittää uusia mahdollisuuksia kehittää hoitoja kohdistaminen tuhoaminen sykliini D1 tai sen säädin E3-ligaasi valikoivasti.

Citation: Okabe H, Lee SH, Phuchareon J, Albertson DG, McCormick F, Tetsu O (2006) Kriittinen rooli FBXW8 ja MAPK sykliini D1 hajoaminen ja Cancer Cell Proliferation. PLoS ONE 1 (1): E128. doi: 10,1371 /journal.pone.0000128

Academic Editor: Dong-Yan Jin, Biokemian, Kiina

vastaanotettu: 07 marraskuu 2006; Hyväksytty: 23 marraskuu 2006; Julkaistu: 27 joulukuu 2006

Copyright: © 2006 Okabe et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia American Cancer Society, huoli Foundation, Daiichi Pharmaceuticals, UCSF Research-Evaluation jakaminen komitea, ja V säätiötä OT, National Institutes of Health (R01 CA101359) ja DGA, ja Wood säätiötä FM

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

sykliini D1 säätelee G1 etenemistä syöpäsoluissa ja yli-ilmennetään erilaisissa pahanlaatuiset kasvaimet [1 ]. Tämän seurauksena se on potentiaalinen kohde syöpähoitojen [2]. Transkription säätelyyn sykliini D1 on tutkittu laajasti, ja on hyvin ymmärretty [3] – [5]. Se on kannustanut kun esimerkiksi eri mitogeenisesta signaalit aktivoivat Ras /Raf /MEK /ERK (MAPK) Cascade. Synteesin jälkeen seuraavat MAPK cascade aktivoinnin, sykliini D1 assosioituu CDK4 /6, p21 CIP1 tai p27 Kip1 [6], [7].

Sen sijaan, mekanismi sykliini D1 ubikitinaation ja sen jälkeen hajoamista ei ole täysin tunnettu. Tiedetään, että sykliini D1 polyubiquitinated sittemmin hajonnut kautta 26S-proteasomin reitin. Tämä prosessi edellyttää fosforyloivaan sykliini D1 treoniini (Thr) -286, joka sijaitsee lähellä sen C-pää [8]. Sykliini D1 mutantti T286A on vastustuskykyinen ubikinaa-

in vitro

ja

in vivo

ja on erittäin vakaa proteiinia. Glykogeenisyntaasikinaasi- 3β (GSK3p) voi fosforyloida sykliini D1 Thr286, edistää ydinaseiden-to-sytoplasman uudelleenjako sykliini D1 [9], [10]. Kuitenkin rooli GSK3p sykliini D1 fosforylaatioon ja sen vakaus on kyseenalaistettu viime aikoina [11], [12], ja p38 SAPK2 on liitetty proteasomaalisten hajoamiseen sykliini D1 seuraavista osmoottinen shokki [13].

yritimme tunnistaa kinaasi vastuussa fosforyloimiseksi sykliini D1 Thr286. Työmme osoittaa, että sykliini D1 on horjuttanut nimenomaan aikana S-vaiheen syöpäsoluissa ja että lisääntynyt hajoaminen välittyy fosforylaation Thr286 toiminnan kautta Ras /Raf /MEK /MAPK signalointiryöpyn.

ubikitiinistä proteiini ligaasi tarpeen hajottavien sykliini D1 ei ole vielä tunnistettu. F-box-proteiini, SKP2, on ehdotettu [14], [15]. Kuitenkin SKP2-säätelyyn sykliini D1 voi olla konteksti- tai solulinja riippuvainen, ja se voi olla epäsuora [7]. Lisäksi sykliini D1 ei kerry SKP2 knockout hiiren alkion fibroblasti (MEF) soluihin [16], [17].

muodostuminen polyubiquitin-proteiinikonjugaateilla on hyvin ymmärrettävä [18]. Kolme komponenttia osallistua peräkkäisten ubikitiinipromoottori siirron reaktiot: E1, aktivoiva entsyymi, E2 /Ubc, joka on ubikitiini-konjugointientsyymiä, ja E3, proteiini-ligaasia, joka kiinnittyy ubikitiini lysiiniryhmään on kohdeproteiinin.

paras tunnettu näiden entsyymien ovat SCF E3 ubikitiinipromoottori ligaaseina jotka säätelevät substraatti ubikinaa- on fosforylaatio riippuvaisella tavalla [19] – [21]. Nämä ligaaseihin muodostavat erittäin monipuolinen perheen komplekseja nimetty niiden osia, S-vaihe Kinase liittyvä proteiini 1 (SKP1), Cullin 1 (CUL1 /Cdc53), F-box proteiineja, ja RBX1 /ROC1. SKP1 on ratkaiseva sovitin alayksikön ja selektiivisesti vuorovaikutuksessa tukirakenteen proteiinia, joko CUL1 tai Cullin 7 (CUL7), edistää ubikitinaation kohdennettujen substraattien [22], [23]. Association of CUL7 kanssa SKP1 riippuu FBXW8 ja muodostaa määrätyn SCF kaltainen monimutkainen [22], [23]. Tutkimuksemme osoittaa, että F-box-proteiini FBXW8 tunnistaa spesifisesti sykliini D1 on fosforylaatio riippuvaisella tavalla ja säätelee sen vakaus läpi Ubikitiini-proteasomireitillä.

Tulokset

sykliini D1-proteiini horjuttanut erityisesti S-vaiheessa syöpäsoluissa

tutkimiseksi mekanismi ja merkitys sykliini D1 proteolyysin, ensin arvioitava ilmaisun profiilia sykliini D1 aikana solusyklin etenemistä liikkumattomuus kolmessa normaalissa solulinjoissa (NIH 3T3 WI -38 fibroblasteissa ja CCD841 CoN paksusuolen epiteelin soluja) ja kolmella syövän solulinjoissa (HCT 116 ja SW480 paksusuolen syöpiin ja T98G glioblastoomissa). Normaalit solut (Fig. 1A ja kuvio. S1 [A]) ja syöpäsolujen (Fig. 1 B ja kuviossa. S1 [B]) vapautettiin liikkumattomuus at G0 /G1 vaiheeseen ja solusyklin profiilit määritettiin flow-sytometria solukierron analyysit. Molemmissa solutyypeissä, sykliini D1 ilmentyminen vähitellen lisääntynyt kuluttua uudelleen tuomista solusykliä ja saavutti maksimin G1-S siirtyminen. Kaikissa kolmessa normaali solulinjoissa, sykliini D1 pysyivät vakiona S-vaiheen (Fig. 1A ja kuvio. S1 [A]), vaikka havaitsimme lievää laskua sykliini D1 ilmentyminen tulon jälkeen S-vaiheeseen. Tämä havainto on yhdenmukainen aiempien havaintojen [24], [25]. Sitä vastoin kaikki kolme syöpäsolun riviä osoitti dramaattisen vähentämisen sykliini D1 ilmaisun aikana S-vaiheen (Fig. 1 B ja kuviossa. S1 [B]). Nämä havainnot viittaavat siihen, että sykliini D1 liikevaihdon kasvoi S-vaiheen näissä soluissa.

sykliini D1 on horjuttanut aikana S-vaiheen läpi Ubikitiini-proteasomireitillä syöpäsoluissa. (A, B) Expression profiilia sykliini D1 aikana solusyklin etenemisen soluissa vapautetaan liikkumattomuus. Normaalit solut (A) ja syöpäsoluja (B) testattiin. (A) NIH 3T3 hiiren fibroblasteissa ja CCD841 CoN normaalin paksusuolen epiteelin. (B) HCT 116 ja SW480-soluissa. CCD841 CoN solut synkronoidaan G0 /G1 vaiheessa käsittelemällä ACL-4 media ilman EGF 24 tuntia, ja sitten stimuloidaan täydellinen ACL-4 media sisältäviä EGF. Muut solut vapautettiin liikkumattomuus seerumin stimulaatiota. Näytteitä kerättiin ilmoitettuina ajankohtina. Solusyklin jakaumat määritettiin virtaussytometrialla ja prosenttiosuudet kunkin vaiheen on merkitty. Western-blotit suoritettiin sykliini D1 ja β-aktiini vasta-aineiden. (C, D) Pulse-chase-analyysi sykliini D1 NIH 3T3-soluissa (C), ja HCT 116-soluja (D). Solut vapautettiin liikkumattomuus ja merkitty

35S-metioniinia 1 tunti, kun suurin osa väestön oli G1 vaiheessa (9 tuntia varten NIH3T3 ja 6 tuntiin HCT 116) tai S-vaiheessa (21 tuntia varten NIH3T3 ja 15 tuntia for HCT 116). Solut pyydystettiin kylmä metioniinin varten ilmoitettu kertaa ja sitten hajotettiin. Sykliini D1 immunosaostettiin ja analysoitiin SDS-PAGE. Autoradiografia suoritettiin. Tasot leimattiin aineenvaihdunnan-sykliini D1 arvioitiin kvantitatiivinen skannaaminen Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad) ja blotattiin kaavion määrittää puoliintumisaika sykliini D1. Solusyklin jakelu on esitetty seuraavassa lukuja. (E) vaihtuvuus sykliini D1 välittyy Ubikitiini-proteasomireitillä. NIH3T3 ja HCT 116 solut vapautettiin liikkumattomuus seerumin stimulointi ja käsitellään läsnä (+) tai puuttumista (-) on MG132 2 tuntia ennen sadonkorjuuta kunakin ajankohtana. Western blot suoritettiin sykliini D1 ja β-aktiini vasta-aineita. (F-H) Polyubiquitination sykliini D1. (F) HCT 116 paksusuolen syövän solut transfektoitiin HA-merkitty ubikitiini cDNA: n (kaistat 1-3) tai ilman sitä (kaista 4), ja sitten synkronoidaan S-vaiheeseen läpi peräkkäisten manipuloinnin seerumistarvaatio ja stimulaatiota. Soluja käsiteltiin 25 uM MG132 (kaistat 3 ja 4) tai ilman sitä (kaistat 1 ja 2) yhden tunnin ajan. Lysaatit immunosaostettiin vasta sykliini D1-aineella (kaistat 2-4) tai kontrolli-lgG (kaista 1) ja immunoblotattu HA vasta-aineella (ylempi paneeli) tai sykliini D1-vasta (alempi kuva). Tähdet osoittavat tausta epäspesifinen bändejä (F-G). (G) Nuclear (N) ja sytoplasminen (C) proteiinien fraktioitiin (Fr.) solulysaateista kerätään paneeli F, vyöhyke 3. Nuclear ja sytoplasminen uutteet immunosaostettiin vasta-sykliini D1 (kaistat 1 ja 2) tai IgG ( kaista 3) ja immunoblotattu HA vasta-aineella (ylempi paneeli) tai sykliini D1-vasta (alempi kuva). (H) Cell cycle jakaumat.

Tämän havainnon varmistamiseksi, NIH 3T3 hiiren fibroblastien ja HCT 116 paksusuolensyöpä soluja synkronoitu klo G0 /G1 vaiheen ja vapautuu quiescence ja alistettiin Pulsechase analyysi . Kuviot. 1C ja D esittävät Pulsechase analyysit

35S metabolisesti leimattu sykliini D1 9 tuntia (NIH 3T3) tai 6 tuntia (HCT 116), kun suurin osa soluista oli G1 vaiheessa, ja 21 tuntia (NIH 3T3) ja 15 tuntia (HCT 116), kun useimmat olivat S-vaiheessa (kuviot. 1C ja D, pohja taulukoita). Merkityt sykliini D1 tasot arvioitiin kvantitatiivisella skannaus (kuviot. 1C ja D). Ei ollut merkittävää eroa puoliintumisaika sykliini D1 aikana G1 ja S vaihetta NIH 3T3-soluissa. Sen sijaan, oli merkittävä ero HCT 116 soluja (S-vaiheessa T

1/2 = 11,8 min, verrattuna T

1/2 = 27,5 min G1 vaiheessa). Siten sykliini D1 on horjuttanut erityisesti S-vaiheen HCT 116-soluissa.

sykliini D1 hajoaa sytoplasmassa aikana S-vaiheen läpi Ubikitiini-proteasomireitillä syöpäsoluissa

Seuraava määritetty, jos sykliini D1 epävakauden aikana S-vaiheen johtui lisääntyneestä proteolyysin kautta ubikitiini-proteasomireitillä. Käsittelimme HCT 116 ja NIH 3T3 solujen MG132, proteasomin estäjä, 2 tuntia ennen sadonkorjuuta kunakin ajankohtana aikana solusyklin etenemisen (Fig. 1 E). Käsitellyissä HCT 116 solua, sykliini D1 kertynyt merkittävästi S-vaiheessa, jossa ei ole merkittävää kertymistä aikana G1 vaiheessa. Sitä vastoin ero kertynyt sykliini D1 välillä G1 ja S-vaiheessa NIH 3T3-soluissa näytti olevan paljon pienempi. Nämä havainnot viittaavat siihen, että näissä syöpäsoluissa, sykliini D1 on horjuttanut aikana S-vaiheen läpi 26S-proteasomin reitin.

Kuviot 1F-H vahvistaa, että epävakautta sykliini D1 liittyy polyubiquitination. Kuviossa. 1F, HCT 116-solut transfektoitiin (kaistat 1-3) tai ilman sitä (kaista 4) HA-merkitty ubikitiini cDNA: n ja sen jälkeen synkronoidaan S-vaiheessa. Soluja käsiteltiin MG132 (kaistat 3 ja 4) tai ilman sitä (kaistat 1 ja 2) tunnin ajan. Lysaatit immunosaostettiin sykliini D1-aineella (kaistat 2-4) tai kontrolli-lgG (kaista 1) ja immunoblotattu HA vasta-aineella. Ryhmä hitaammin vaeltavat nauhojen havaittiin HA-vasta-ainetta ainoastaan ​​anti-sykliini D1 immunopresipitaateista läsnä ubikitiinipromoottori (kaistat 2 ja 3), ja alennetun liikkuvuuden vyöhykkeitä parantaa edelleen altistumisen jälkeen MG132 (kaista 3), mikä osoittaa, että näiden kaistojen mukana polyubiquitinated sykliini D1. Nämä havainnot vahvistivat, että sykliini D1 hajoaa aikana S-vaiheen läpi Ubikitiini-proteasomireitillä HCT 116-soluissa. Kuva. 1H osoittaa, että yli 70% näistä soluista oli S-vaiheessa.

Tunnistaa jossa sykliini D1 hajoaminen lisääntyy aikana S-vaiheen, poimimamme ydin- (N) ja soluliman (C) proteiini solulysaateista kerätty Kuva. 1F kaista 3 (Kuva. 1G). Histoni H1 yksinomaan havaittiin tumafraktios-, kun taas MEK1 oli täysin ilmaistu sytoplasman otteen, mikä viittaa siihen, että olemme menestyksellisesti fraktioitu solulysaateista (kuvio. S1 [C]). Suurin osa sykliini D1 sijaitsi sytoplasmassa (Fig. S1 [C]). Ydin- ja sytoplasminen uutteet immunosaostettiin vasta-sykliini D1 (kuvio 1G, kaistat 1 ja 2) tai IgG: tä (kaista 3) ja immunoblotattiin HA-vasta-ainetta. Polyubiquitinated sykliini D1 vyöhykettä pääasiassa havaittu sytoplasman otteita. Lisäksi esto ydinvoiman-to-sytoplasman lokalisoinnin sykliini D1 Leptomycin B (LMB) ei lisännyt näitä bändejä merkittävästi tumassa (kuvio. S1 [D]). Olemme päätellä, että sykliini D1 hajoaa sytoplasmassa erityisesti S-vaiheessa proteasomin riippuvaisen mekanismin HCT 116-soluissa.

MAPK vuorovaikutuksessa sykliini D1 kautta D-domain ja fosforyloi Thr286

MAPK aktiivisuus on kohonnut kaikissa kolmessa syöpäsolulinjasta (tuloksia ei ole esitetty; [VIITE 4]). Tutkimme mahdollisuutta, että Ras /Raf /MEK /ERK MAPK signalointikaskadissa voi säädellä fosforylaation sykliini D1 jäännös Thr286, jota seuraa proliini (Fig. 2A, [viitteet. 8], [9]).

MAPK fosforyloi sykliini D1 Thr286, joka laukaisee myöhemmin ubikitinaation. (A) tunnistetiedot D-verkkotunnus sykliini D1 (Cyc D1). Kuvassa täyspitkän ihmisen Cyc D1 osoittaa alueen D-domain (A. A. 179-193) ja MAPK fosforylaatiokohdan Thr (T) 286 seuraa proliini (P) (pylväs ja nuoli, tässä järjestyksessä). Aminohapposekvenssin D-domeenin Cyc D1 on linjassa muiden tunnettujen MAPK-telakointipaikkoina eri ERK substraatteja. Dupletti perus (+) ja ei-polaaristen (φ) aminohapot ovat konservoituneita tähteitä ydin D-domeeni motiivi L /I /V-X-L /I /V. Aminohappo asemissa korkeintaan 5 ’tähdettä D-domeenit on merkitty numerot vasemmalla kunkin aminohapposekvenssi vastaavasti. (B, C) p42 ERK2

in vitro

kinaasimäärityk- sykliini D1 (ylempi paneeli). (B) Villityypin tai T286A mutantti rekombinantti GST täyspitkä Cyc D1-proteiinia sekoitettiin

32P-ATP: n kinaasimäärityksessä reaktio puskurin läsnä ollessa tai puuttuessa puhdistettiin ERK2. Reaktiot suoritettiin 30 ° C: ssa 30 min ja pysäytettiin lisäämällä -näytepuskuria. Näytteet erotettiin SDS-PAGE: lla ja

32P-oton havaittiin autoradiografialla. Immunoblottaus (IB) analyysillä käyttäen vasta-aineita sykliini D1 palvelee viittaus osoittaa alustaan ​​määriä. (C) GST yksin (kaista 1), GST-C-päätteen WT Cyc D1-fuusioproteiini säilyttää sitoutumiskohdan MAPK (aminohapot 165-295, kaista 2), T286A (kaista 3) ja täydellinen poisto D- domain AD, kaista 4) käytettiin. IB-analyysillä käyttäen vasta-aineita GST tarjotaan viittaus osoittaa alustaan ​​määriä. (D) immunosaostus (IP) ja IB-analyysi seuraavissa ektooppinen ilmentyminen Flag-merkittyjen ERK2 yhdessä joko HA-merkittyjen WT tai AD Cyc D1 HCT 116 koolonkarsinoomasoluissa. Western blot input valvontaa (10% yhteensä lysaatit) on myös esitetty. (E) Western blot -analyysi, jossa Thr286 fosforyloidun sykliini D1 (pCycD1 Thr286) ja yhteensä Cyc D1 transfektion jälkeen eri muotojen HA-merkitty Cyc D1 ekspressiovektoreihin HCT 116 paksusuolen syöpäsoluja. (F, G)

In vitro

ubikitinaation määrityksiä käyttäen HeLa-solu-uutteet fraktio II lähteenä tarvittavia entsyymejä konjugoida ubikitiinipromoottori alustoille ja ATP: tä. (F) GST-täyspitkä Cyc D1 WT, T286A tai AD käytettiin reaktion joko yhdistelmä-ERK2 (kaistat 3-5) tai ilman sitä (kaistat 1-2). Näytteet erotettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblotattiin sykliini D1-vasta-ainetta. ATP lisättiin kaikkiin kaistaa, eikä ubikitiinipromoottori lisättiin kaista 1 (G) GST-täyspitkä Cyc D1 WT käytettiin kanssa tai ilman ubikitiinipromoottori. SDS-PAGE erotus, immunoblotting suoritettiin vasta-aineilla, sykliini D1 (kaistat 1, 2) tai ubikitiini (kaistat 3, 4). (H, I) Pulsechase analyysi sykliini D1 HCT 116 soluissa altistumisen jälkeen U0126. Eksponentiaalisesti kasvavat HCT 116-soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai 10 uM U0126: ssa 30 minuuttia. (H) Soluja pulssi-leimattiin

35S-metioniinia ja ajettiin varten ilmoitettu kertaa. Sykliini D1 immunosaostettiin ja analysoitiin sitten SDS-PAGE. Autoradiografia suoritettiin. (I) tasot metabolisesti leimattua-sykliini D1. (J) Western blot analyysi pCycD1 Thr286, yhteensä sykliini D1, fosforylaatio erityisiä ERK (Perk), ja koko ERK vasta-aineita. (K) Cell cycle jakaumat on esitetty.

ERK /MAPK on proliini (Pro) -johdetussa proteiinikinaasi [26]. Se edellyttää kinaasin telakointi sivuston (tai D-domain) sen alustaan ​​lisätä fosforylaatioon tehokkuutta (Fig. 2A, [ref. 27]). D-domeenit on löydetty eri ERK-substraattien, kuten Elk-1, SAP-1, SAP-2, Ets-1 ja c-Myc (Fig. 2A, [viitteet. 27], [28]). Me etsitään D-verkkotunnus sykliini D1 kanssa motiivi Scan ohjelmisto (https://scansite.mit.edu). Läpi useita tiukkoja hakuja tunnistimme erittäin merkittävä (vajaan 0,041 prosenttipiste) D-alueen aminohappoja 179-193 (Fig. 2A), mikä viittaa siihen, että Ras /Raf /MEK /ERK MAPK signalointiryöpyn voisi olla syynä sykliini D1 fosforylaatio.

Voit testata sitä mahdollisuutta, että puhdistettu ERK /MAPK saattaa fosfory- yhdistelmä-sykliini D1, puhdistettu ERK2 oli varmasti käytettiin fosforyloida glutationin

S

-transferase (GST) -cyclin D1 fuusioproteiini (kuviot. 2B ja C). Puhdistettu ERK2 fosforyloituu tehokkaasti GST-täyspitkän villityypin (WT) sykliini D1 (Fig. 2B, kaista 2). Sen sijaan, ERK2 ei fosforyloida T286A, sykliini D1-mutantti (Fig. 2B, kaista 4), mikä viittaa siihen, että Thr286 on merkittävä fosforylaatiokohdan ERK /MAPK. Identtiset tulokset saatiin, kun läsnä oli puhdistettua CDK4 /6; ERK pystyi fosforyloimaan sykliini D1 Thr286, paitsi monomeerinen muoto vaan myös sykliini D1-CDK4 /6-kompleksit (tuloksia ei ole esitetty).

Voit selvittää ERK /MAPK edellyttää D-verkkotunnuksen tehokas sykliini D1 fosforylaation Thr286, teimme

in vitro

kinaasimäärityk- käyttäen täydellistä poistamista D-domain (AD) GST-C- terminaalinen sykliini D1-fuusioproteiinia. Tämä fuusioproteiini säilyttää MAPK sitoutumiskohtaan. Kuva. 2C osoittaa, että puhdistettu ERK2 tehokkaasti fosforyloidun WT sykliini D1 (kaista 2), mutta ei T286A ja AD mutantit (kaistat 3 ja 4).

Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että MAPK vuorovaikutuksessa sykliini D1 kautta D-domain fosforyloimaan Thr286. Vahvista tätä mahdollisuutta, teimme immunosaostus ja immunoblottauksen (IP-IB) analyysi seuraavat ektooppinen ilmentyminen Flag-merkittyjen ERK2 joko HA-merkittyjen WT tai AD sykliini D1 HCT 116 koolonkarsinoomasoluissa (Fig. 2D). ERK2 liittyy hyvin WT sykliini D1 (kaista 2) ja huonosti AD sykliini D1 (kaista 3). Vahvistaa, kuinka tärkeää on MAPK fosforylaation sykliini D1 Thr286 että HCT 116-solut, transfektoimme solut erilaisten sykliini D1 ekspressiovektoreiden (Fig. 2E). Kohdunulkoinen ilmentyminen sykliini D1 erotettava endogeenisen ilmentymisen liikuntaesteisten HA-tagged sykliini D1. Analysoimme fosforylaatiotilaa eksogeenisten sykliini D1 ilmaisunsa Thr286. Sykliini D1 fosforylaatio oli merkittävästi vähentynyt poistetaan D-domain (kaista 4). Nämä havainnot viittaavat siihen, että suurin osa Thr286 fosforylaation HCT 116 soluissa kautta MAPK aktiviteetti.

Ras /MAPK-välitteistä ubikinaation ja hajoamista sykliini D1 liittyy suoraan yhdistyksen MAPK /ERK sykliini D1

tutkimme seuraavaksi MAPK-välitteisen fosforylaation sykliini D1 voi johtaa ubikinaa- sykliini D1

in vitro

(kuviot. 2F ja G). Käytimme ubikitinaation määrityksessä, joka käyttää fraktio II HeLa solu-uutteita lähteenä tarvittavia entsyymejä konjugoida ubikitiinipromoottori alustoille ja ATP [29]. Polyubiquitination sykliini D1 (kuvio 2F, kaistat 1 ja 2) on parannettu edelleen ERK2 (Fig. 2F, kaista 3 ja Fig. 2G, kaistat 2 ja 4). Hitaampi vaeltavat vyöhykettä ei havaittu ilman ubikitiinipromoottori (Fig. 2G, kaistat 1 ja 3), mikä viittaa siihen, että ne koostuvat polyubiquitinated muotojen sykliini D1 (Fig. 2G, kaistat 2 ja 4). Uskomme, että polyubiquitination tarvitaan suoraa vuorovaikutusta ERK2 sykliini D1 ja fosforylaation sykliini D1 Thr286, koska ubikitinaatio suurelta osin estää, D-domeenin deleetiomutantti muodossa (AD) ja alaniini Thr286 substituutioaste (T286A) sykliini D1 ( Fig. 2F, kaistat 4 ja 5).

vakaus sykliini D1 proteiinia säädellään ERK /MAPK toimintaa HCT 116 syöpäsoluissa

Havaitsimme myös, osuus ERK /MAPK vakautta sykliini D1 syöpäsoluissa. Suoritimme Pulsechase analyysi metabolisesti leimattu-sykliini D1 jälkeen estämällä MAPK toimintaa (kuviot. 2 H-K; [viitejulkaisut. 30], [31]). Eksponentiaalisesti kasvavat HCT 116-soluja käsiteltiin U0126: ssa 30 minuuttia, joka merkittävästi köyhdytettyä fosforyloidun muodon ERK (Perk) ja sykliini D1 Thr286 (pCyc D1 Thr286) vaikuttamatta solusyklin profiilin (kuviot. 2J ja K). Tasot leimattiin metabolisesti-sykliini D1 arvioitiin kvantitatiivisella skannausta, kuten on kuvattu edellä (kuvio. 2I). Vähentäminen MAPK aktiviteetti kasvatti puoliintumisaika sykliini D1 22,5 min 54,6 min. Nämä tulokset osoittavat, että vakaus sykliini D1 säätelee ERK /MAPK aktiivisuutta syöpäsoluissa.

sykliini D1 vakautta säädellään SCF tai SCF kaltainen reitin

Koska tiukan spesifisyys E3-ligaasi ja niiden substraattien [18], sykliini D1 on todennäköisesti oma E3 ligaasilla. Oletimme, että sykliini D1 proteolyysi välittyy SCF E3-ligaasi tai SCF kaltainen kompleksi E3-ligaasi, jossa F-box-proteiinin määrää spesifisyyden sen alustaan. Tämän ajatuksen testaamiseksi teimme IP-IB-analyysi (Fig. 3A). Sykliini D1 eksponentiaalisesti kasvavista HCT 116 solua immunosaostettiin ja peräkkäin blotattiin vasta sykliini D1, CDK4, SKP1, CUL1 ja CUL7. Sykliini D1 liittyy SKP1, CUL1 tai CUL7, ja CDK4: n, mikä viittaa siihen, että sen proteolyysin välittyy SCF (SKP1-CUL1-F-box-proteiini) tai SCF-like (SKP1-CUL7-FBXW8) kompleksi E3 ligaasit.

FBXW8 ubiquitinates sykliini D1 on Thr286 fosforylaatio riippuvaisella tavalla. (A) IP-IB-analyysi (vasemmalla). Proteiinia eksponentiaalisesti kasvavista HCT 116 solua saostettiin vasta sykliini D1 tai IgG. Immunosaostumat alistettiin SDS-PAGE: lla ja peräkkäin blotattiin sykliini D1, CDK4, SKP1, CUL1 ja CUL7 vasta-aineita. IB-analyysi 5% kokosolulysaateille annettiin kontrollina (oikealla). (B) IB analyysi seuraavat ehtyminen SKP1 lauseke 48 tunnin hoidon jälkeen SKP1 siRNA kaksijuosteiset oligonukleotidit HCT 116-soluissa. Non-kohdistaminen siRNA (Control) ja mock transfektio (-) toimivat kontrolleina. (C) IP-IB-analyysi. Kaksikymmentäkuusi F-box täyspitkän koodaavan cDNA: t kloonattiin V5 tai Flag-epitoopin tag ekspressiovektorit. Nämä V5 tai Flag-merkityn F-box-proteiinin DNA transfektoitiin yhdessä HA-tagged sykliini D1 (HA-Cyc D1) ja CDK4 ekspressiovektoreiden osaksi T98G soluihin. Solut kerättiin 24 tuntia myöhemmin. Näytteet saostettiin HA-epitooppi-tag-vasta-aine. Immunosaostumat suoritettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen värjättiin V5 tai Flag (F-box-proteiinien), HA (Cyc D1) vasta-aineita. IB-analyysi 10% kokosoluliuotteista annettiin (alhaalla). (D) IP-IB-analyysi (top). V5-merkitty F-box-proteiinin DNA-plasmidit transfektoitiin yhdessä joko HA-tagged sykliini D1 (Cyc D1) villityypin (WT) tai T286A mutantti, ja CDK4 ekspressointivektoreilla T98G soluissa. Näytteet saostettiin HA-epitoopin tag-vasta-ainetta. Immunosaostumat suoritettiin SDS-PAGE ja tämän jälkeen blotattiin V5 (F-box-proteiinien), HA (Cyc D1), ja Thr286 fosforyloitu sykliini D1 (pCyc D1 Thr286) vasta-aineita. IB-analyysi 10% kokosoluliuotteista annettiin vertailun (alhaalla). (E)

In vitro

ubikitinaation määritys.

In vitro

käännetty F-box-proteiinien yhdistelmä-GST-täyspitkän sykliini D1 (Cyc D1) villityypin, HeLa solu otteita fraktio II ATP, Ubiquitin ja ERK2 ja

in vitro

-translated joko SKP1, RBX1 ja CUL1 tai SKP1, RBX1 ja CUL7 proteiineja inkuboitiin 30 ° C: ssa 2 tunnin ajan. Näytteet erotettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblotattiin sykliini D1-vasta-ainetta. (F)

In vitro

polyubiquitination sykliini D1 kautta SCF kaltainen (SCFL) kompleksi FBXW8 (SKP1-CUL7-FBXW8-RBX1 /SCFL

FBXW8). WT tai T286A GST Cyc D1 inkuboitiin, kun läsnä oli puhdistettu ERK2 (kaistat 1 ja 3) tai sen puuttuminen (kaista 2), 30 ° C: ssa 2 tunnin ajan. Näytteet erotettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblotattiin sykliini D1-vasta-ainetta. Tähti osoittaa epäspesifisiä bändejä. (G) ennastus polyubiquitination sykliini D1 kautta SCFL

FBXW8

in vitro

käyttäen puhdistettua E1 ja E2. GST-WT Cyc D1 inkuboitiin rekombinantti SCFL

FBXW8 läsnä ollessa tai poissa ollessa E1 ja E2 /UbcH5C. Näytteet erotettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblotattu sykliini D1-vasta.

Voit testata, onko taso sykliini D1 pääasiassa säätelee SCF tai SCF kaltainen koulutusjakson, teimme immunoblot-analyysillä 48 h kuluttua heikentävien SKP1 ilmaisutapoja siRNA kaksijuosteiset oligonukleotidit HCT 116-soluissa (kuvio. 3B). siRNA for SKP1 vähensi SKP1 ilmaisun ja johti kertymistä sykliini D1. Nämä havainnot tukevat vahvasti ajatusta, että sykliini D1 vakautta säädellään SCF tai SCF kaltainen reitin.

FBXW8, F-box-proteiinia, erityisesti yhdistää sykliini D1 on Thr286 fosforylaatio riippuvaisesti

vieressä tunnistaneet proteiini vastaa sykliini D1 vakautta. Testasimme ehdokas ihmisen F-box-proteiinin geenien tunnistamiseen ainutlaatuinen E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla sykliini D1. Substraattispesifisyys SCF komplekseja tapahtuu läpi proteiini-proteiini vuorovaikutus aloilla, jotka ovat usein tryptofaani-asparagiinihappo (WD) 40 motiiveja tai leusiinirikkaita toistoja (LRR) sisällä F-box proteiinit [20], [21]. Haimme NCBI tietokannoista ihmisen F-box-proteiinien kanssa WD40 tai LRR motiiveja. Löysimme noin 70 mahdollisia geenejä. Näistä 9 oli WD40 toista motiiveja ja 17 oli LRR-motiiveja.

saadaan näiden geenien suorittamalla ensin käänteistranskriptaasi-PCR (RT-PCR) käyttämällä kokonais-RNA: ta HEK 293, HCT 116 tai WI-38-soluissa . Täyspitkän cDNA: me noutaa kloonattiin V5 tai Flag-epitoopin tag ekspressiovektorit. Puuttumaan onko mikään tuote näiden geenien voisi tunnistaa sykliini D1, me ohimenevästi transfektoitu DNA plasmidiperhe V5 tai Flag-merkityn F-box proteiineja T98G soluihin tai ilman N-terminaalista HA-merkitty sykliini D1 ja CDK4 ekspressiovektoreita ( kuva 3C). 24 tunnin kuluttua solut otettiin talteen ja suoritettiin IP-IB-analyysi. Näytteet saostettiin HA-epitooppi-tag-vasta-ainetta ja värjättiin Flag (FBXW7 ja FBXL5) tai V5 (muut), ja sykliini D1-vasta-aineita. Paneelissa C esitetään sykliini D1 kanssaan kaksi F-box proteiineja, FBXW8 (kaista 7) ja FBXL12 (kaista 15). FBXW8 hallussaan WD40 motiiveja ja FBXL12 oli LRR motiiveja.

Koska F-box-proteiini Alustan tulee fosforyloitua [19], testasimme ovatko FBXW8 ja FBXL12 tunnistavat sykliini D1 on Thr286 fosforylaatio riippuvaisella tavalla. Me transfektoitu tilapäisesti T98G solujen V5-merkitty F-box-proteiinin DNA plasmidit ja sykliini D1 (villityyppi tai T286A mutantti) ja CDK4 ekspressiovektorit. Näytteet saostettiin HA-epitooppi-tag-vasta-aineella ja niitä blotattiin V5, HA: n ja Thr286 fosforyloitu sykliini D1-vasta-aineita (Fig. 3d). FBXW8 liittyi sekä sykliini D1 villityypin ja T286A mutantti, mutta suurin osa oli pakko villin tyypin, joka oli lähinnä fosforyloitiin Thr286. Sitä vastoin emme nähneet merkittävää eroa villityypin sykliini D1 ja mutantti yhdessä FBXL12. Nämä tulokset viittaavat siihen, että FBXW8 tunnistaa sykliini D1 on Thr286 fosforylaatio riippuvalla tavalla, mutta FBXL12 ei. Tämän mukaisesti havainnon, FBXL12 ei ollut osallisena sykliini D1 polyubiquitination

in vitro

(Fig. 3E, kaista 9). Olemme päätellä, että FBXW8 voi olla rooli sykliini D1 vakautta.

FBXW8 ubiquitinates sykliini D1 on Thr-286 fosforylaation riippuvaisesti

olivatko

in vitro

ubikinaa- of sykliini D1 vaatii FBXW8 (Fig. 3E). Inkuboimme kukin

in vitro

-translated F-box proteiinin yhdistelmä-GST-sykliini D1 (Cyc D1), osa II HeLa solu-uutteita ATP, ubikitiinipromoottori ja ERK2 ja joko

in vitro

-translated SKP1, RBX1 ja CUL1 tai SKP1, RBX1 ja CUL7 proteiineja. Seuraavaksi blotattiin heille sykliini D1-vasta. Sykliini D1 ubikitinaation havaittiin yhdistelmiä FBXW8 kanssa SKP1, CUL1, ja RBX1 (kaista 5), ​​tai FBXW8 kanssa SKP1, CUL7, ja RBX1 (kaista 6). Kuitenkin polyubiquitinated bändit eivät suurentuneet muut yhdistelmät. Sen varmistamiseksi, että SCF kompleksit koottu oikein, kun

in vitro

käännös, suoritimme immmunoprecipitation keskenään Tuotepakkaus proteiinin

35S-leimattua

in vitro

käännetty näytteiden (ei esitetty ) ja testataan, onko kompleksit sisältävät β-TRCP olivat toimintakykyisiä polyubiquitination ja β-kateniinin (Fig. S1 [E]). Tuloksemme viittaavat siihen, että sykliini D1 ubikinaation liittyy FBXW8.

tutkimme seuraavaksi

in vitro

ubikinaa- sykliini D1 kautta SCF kaltainen (SCFL) kompleksi FBXW8 (SKP1-CUL7-FBXW8-RBX1 /SCFL

FBXW8) vaatii fosforylaatio sykliini D1 Thr286 (Fig. 3F). Polyubiquitination kautta SCFL

FBXW8 dramaattisesti vähentää ehtyminen ERK2 (kaista 2). Lisäksi sykliini D1 polyubiquitination pitkälti estänyt alaniini-for-Thr286 korvaaminen (T286A, kaista 3), mikä viittaa siihen, että fosforylaatio sykliini D1 Thr286 on tarpeen ubikinaa- by SCFL

FBXW8. Nämä tiedot ovat hyvässä mukaiset havaintomme että FBXW8 nimenomaan yhdistää sykliini D1 on Thr286 fosforylaatio riippuvaisella tavalla.

Lopuksi rekonstruoitu sykliini D1 polyubiquitination

in vitro

käyttämällä puhdistettua E1 ja E2 entsyymit (Fig. 3G). SCFL

FBXW8 edistää UbcH5C katalysoidun polyubiquitin ketjun kokoonpano [22]. Kuva.