Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Useita hoitoja ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC) ovat histologia-riippuvaisia, ja tarve histologiaa liittyviä markkereita kasvaa. MikroRNA (miRNA) ovat lupaavia molekyylimarkkereina useita syöpiä ja eronnut ilmaus riippuen histologisia alatyyppi. Mirna perhe miR-200 on liitetty sääntely epiteelin mesenkyymisoluyhteisviljelmissä (EMT) /mesenkymaalisten-epiteelin siirtyminen (MET). EMT edellyttää syvällisiä fenotyyppisiä muutoksia, jotka sisältävät menetys solu-soluadheesion, menetys solun polariteetti, ja migraatio ja invasiivisen ominaisuuksia, jotka helpottavat etäpesäke. Dual rooli miR-200 perheen ennustetta useita kasvaimia on liittynyt kasvainsolujen alkuperää. Kuitenkin ennustetekijöiden roolia ja tehtävää miR-200 perheen alkuvaiheen NSCLC adenokarsinooma ja okasolusyöpä (SCC) ei ole vakiintunut.

Methods

miRNA ilmentyminen määritettiin käyttäen TaqMan määritykset 155 kasvaimia resekoituun NSCLC potilaiden. Funktionaaliset tutkimukset tehtiin kolmessa NSCLC solulinjoissa: H23, A-549 ja HCC-44.

Tulokset

Korkea miR-200c ilmentyminen liittyi lyhyempi yleinen (OS) koko kohortti (p = 0,024). Korkea miR-200c (p = 0,0004) ja miR-141 (p = 0,009) lauseke korreloi lyhyempi OS adenokarsinooma – mutta ei SCC. Vuonna Monimuuttuja-analyysissä riskin pistemäärä perustuu miR-141 ja miR-200C ilmentymisen esiin itsenäisenä ennustetekijä OS koko kohortin (OR, 2,787; p = 0,033) ja adenokarsinooma potilailla (OR, 10,649; p = 0,002). Toiminnalliset analyysit osoittivat, että miR-200c, liittyi mesenkymaalisten-epiteelin siirtyminen (MET) ja vaikuttaa solujen vaeltaminen ja E-kadheriinin tasolla, kun taas yli-ilmentyminen miR-141 vähensi

KLF6

proteiinin tasot ja tuottanut kasvua eritys on

VEGFA in vitro

(H23, p = 0,04; A-549, p = 0,03; HCC-44, p = 0,02) ja siihen liittyi korkea veren mikroverisuonitiheys potilaan kasvain näytteissä (p 0,001) .

Johtopäätös

korkea miR-141 ja miR-200C ilmaisu liittyy lyhyempiä OS NSCLC potilailla, joilla adenokarsinooma kautta MET ja angiogeneesiä.

Citation: Tejero R, Navarro A, Campayo M, Viñolas N, Marrades RM, Cordeiro A, et al. (2014) miR-141 ja miR-200C koska merkkiaineet Kokonaiselossaoloaika alkuvaiheen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Adenokarsinooma. PLoS ONE 9 (7): e101899. doi: 10,1371 /journal.pone.0101899

Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 helmikuu 2014; Hyväksytty: 12 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 08 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Tejero et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Instituto de Salud Carlos III (FIS-PI0900547), SDCSD Barcelonan yliopisto ja AECC-Catalunya 2013. Rut Tejero, Anna Cordeiro, Marc Ruiz-Martinez ovat APIF stipendiaattiin Barcelonan yliopisto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin syy syövän kuolema, yli 226000 uutta tapausta Yhdysvalloissa vuonna 2012 [1]. Kahdeksankymmentä prosenttia keuhkosyövässä ovat ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [2], joka on 5-vuoden pysyvyys vain 10% kaikkiaan ja 60-70% I vaiheessa potilailla, korostetaan tarvetta uusiin diagnostiikan ja terapian strategioita. Kirurginen resektio, jos mahdollista, on ainoa parantava hoito alkuvaiheen NSCLC. Kuitenkin lähes 50% resektoitiin potilailla esiintyy toistuminen ja on synkkä ennuste [2]. Useita uusia hoitoja NSCLC ovat histologian riippuvia, ja okasolusyöpä (SCC) reagoi hieman eri tavalla kuin adenokarsinooma tiettyihin hoito-ohjelmat [3], [4] [5]. Kuitenkin vain harvat histologia riippuvaiset prognostisia biomarkkerit ovat saatavissa rutiinikäyttöön kliinisessä käytössä, etenkin kokoisen potilailla.

Viime vuosina MikroRNA (miRNA) ovat nousseet lupaavia molekyylimarkkereina useita syöpiä, kuten NSCLC [6 ]. Erityisiä miRNA on kuvattu histologisesti erityisiä ennustetekijöitä merkkiaineita SCC (miR-146b ja miR-155) [7] tai adenokarsinooma (miR-21) [8].

miR-200 perhe koostuu viisi jäsentä sijaitsevat kahdessa eri klustereiden: miR-200a miR-200b ja miR-429 käsittävät klusteri 1 (kromosomi 1), ja miR-200C ja miR-141 käsittävät klusteri 2 (kromosomi 12). Kaikki viisi miRNA on liitetty sääntely epiteelin mesenkyymisoluyhteisviljelmissä (EMT) /mesenkymaalisten-epiteelin siirtyminen (MET) [9]. EMT edellyttää syvällisiä fenotyyppisiä muutoksia, jotka sisältävät menetys solu-soluadheesion, menetys solun polariteetti, ja migraatio ja invasiivisia ominaisuuksia [10]. Tämä prosessi on olennaista alkion kehitykseen on myös mukana kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden [11]. MIR-200 perheen teko läpi tavoitteensa ZEB1 ja ZEB2 [9] ja TGF-β2 [12]. MiRNA voivat siten valvoa epiteelin fenotyyppi jälkeisessä transkription tukahduttaminen näiden geenien, joka ilmentää E-kadheriinin ja polariteetin Välttämättömät tekijät muodostumista solu-solu liittymissä. MIR-200 perhe näyttää olevan kaksoisrooli potilaan ennustetta. Yli-ilmentyminen MIR-200 perhe toimii merkkinä paremman lopputuloksen maha- ja munasarjojen syöpien [13], [14], [15]. Rintasyövässä [16] ja NSCLC [17] sijaan korkea ilmentyminen miR-200 perhe liittyy lyhyempi selviytymistä. Rintasyövän, MIR-200 perheen edistää etäpesäke kautta kuin E-kadheriinin liittyvä mekanismi, kohdistaminen

SEC23A

, joka välittää eritystä etäpesäkkeen heikentävän proteiinien [16]. Kuitenkin rooli korkean miR-200 tasot NSCLC ei ole vielä selvitetty.

Tässä työssä, olemme analysoineet roolia jäsenten miR-200 perheen kasvaimia toistoleikattiin pienisoluista keuhkosyöpää ja korreloivat meidän havainnot yleisten (OS) leikkauksen jälkeen, niin koko kohortti ja mukaan histologisia alatyyppejä. Lisäksi olemme tutkineet toiminnalliset vaikutukset ennustetekijöitä merkkiaineiden NSCLC solulinjoissa.

Tulokset

Potilaat

Taulukossa 1 esitetään tärkeimmät kliinisiä piirteitä kaikille 155 potilasta. Mediaani-ikä oli 65 vuotta (vaihteluväli, 35-85) ja 87% oli miehiä. Kaksikymmentäyksi (13,6%) potilaista oli Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) suorituskyky (PS) 0, ja 132 (85,2%) oli PS 1. Yhdeksänkymmentäneljä (60,6%) potilaista oli vaiheen I sairaus. Seitsemänkymmentä kolme (47,1%) potilaista oli adenokarsinooma ja 70 (45,1%) SCC. Sata ja kolmekymmentä kahdeksan (89%) potilaista oli nykyisiä tai entisiä tupakoitsijoita. Kaksikymmentä (12,9%) potilasta sai adjuvanttihoitoa (16 vaiheessa II tai III sairaus ja neljä vaiheen I taudin T 4 cm). Seuranta-ajan mediaani oli 43 kuukautta (vaihteluväli, 2-160). Jälkeen seuranta 160 kuukautta, 70 (45,2%) potilaista oli uusiutunut.

miR-200 perheen ilmaisun ja kliinisiä tekijöitä

Pariksi kasvain ja normaali kudosnäytteitä saatiin 155 NSCLC potilaat. Viisi jäsentä miR-200 löytyy kahtena ryhmänä: miR-200A /b, ja miR-429 (ryhmä 1) ja miR-200C ja miR-141 (cluster 2). Kaikki jäsenet miR-200 perhe, paitsi miR-141, oli vaimentua kasvaimen verrattuna normaaliin kudokseen (miR-200a p = 0,043; miR-200b p 0,001; miR-429, p = 0,003; miR-200c , p 0,001) (Kuva S1).

Potilaat, joilla on PS 1-2 osoittivat korkeampaa miR-429 (p = 0,039) kuin ne, joilla on PS 0. Nykyinen tupakoitsijoita oli alhaisempi miR-200a ( p = 0,027) ja miR-429 (p = 0,032) kuin koskaan tupakoineet tai entiset tupakoitsijat.

miR-141 ja miR-200C merkkiaineina OS

käyttäen cutoffs määrittelemän Maxstat paketti R, me luokitellaan potilailla, joilla on korkea tai matala ekspressiotasot viiden miRNA. Niistä 155 potilasta koko kohortin ne, joilla on korkea miR-200c osoitti lyhyempi OS (p = 0,024; Kuva 1A). Niistä 94 potilailla, joilla on vaiheen I sairaus, korkea miR-200c (p = 0,019; kuvio 1 B) ja miR-141 (p = 0,03; kuvio 1 C) olivat molemmat aiheuttaa lyhyemmän OS. Mitään merkittäviä eroja OS tunnistettiin mukaan ekspressiotasoja jäljellä miRNA.

OS mukaan (A) miR-200c ekspressiotasot koko kohortin (N = 155); (B) miR-200c ekspressiotasot I vaiheessa potilailla (N = 94); ja (C) miR-141 ekspressiotasot I vaiheessa potilailla (N = 94).

miR-141 ja miR-200c adenokarsinooma

Ei eroja OS havaittiin mukaan että ekspressiotasot joko miR-141 tai miR-200c potilailla, joilla on SCC (kuvio 2A ja 2B). Kuitenkin potilailla, joilla adenokarsinooma, miRNA tunnistettu kaksi hyvin eriytetty ryhmiä. Mean OS adenokarsinooman potilaille, joilla on korkea miR-200c ilmentyminen oli 61,2 kuukautta (95% CI = 42,9-79,5), kun se oli 145,5 kuukautta (95% CI = 134,4-156,6) niille, joilla on alhainen (P 0,001; kuvio 2C ). Mean OS adenokarsinooman potilaille, joilla on korkea miR-141 ilmentyminen oli 71,7 kuukautta (95% CI = 44,9-81,6), kun se oli 136,9 kuukautta (95% CI = 110,9-1162,9) niille, joilla on alhainen (p = 0,009; Kuva 2D ).

Kokonaiselossaoloaika mukaan (A) miR-200c ekspressiotasot potilailla, joilla SCC (N = 70); (B) miR-141 ekspressiotasot potilailla, joilla SCC (N = 70); (C) miR-200c ekspressiotasot potilailla, joilla adenokarsinooma (N = 73); ja (D) miR-141 ekspressiotasot potilailla, joilla adenokarsinooma (N = 73).

analysoidaan kombinatoorista vaikutus miR-141 ja miR-200C tuottamalla riskiluvun perustuu ilmaisun tasot molempien miRNA. Potilaat, joilla on korkea molempien miRNA luokiteltiin korkean riskin, joilla on alhainen molempien miRNA vähäriskisinä, ja ne, joilla muita yhdistelmiä kuin väli-riski. Viisi vuotta OS oli 49,4% korkean riskin potilailla, 66,7% keskitason riskin potilailla, ja 100% matalan riskin potilailla (p = 0,002; kuva 3).

miR-200c on suurempi vaikutus solujen vaeltamiseen kuin miR-141

solun muuttoliikettä mitattiin

in vitro

tyhjästä määritys transfektion jälkeen ennalta miR-200c, pre-miR-141 tai ennalta miRNA negatiivinen ohjaus. Korkea miR-200c vähensi solumigraatio verrattuna valvonta H23 solulinjassa (p = 0,005), A-549 (p = 0,0085) ja HCC-44 (p = 0,013) (kuvio 4A). Merkittäviä eroja ei havaittu miR-141, paitsi A-549 (p = 0,043). Transfektion jälkeen E-kadheriinin tasot analysoitiin immunohistokemiallisesti (kuvio 4B), ja kohonneita havaittiin transfektoiduissa soluissa ennalta miR-200c.

(A) sen jälkeen, kun 36 tai 48 h transfektion ennalta miRNA in NSCLC solulinjat, solumigraatio mitattiin

in vitro

tyhjästä määritys. Korkea miR-200c vähensi soluvaelluksen vertailuryhmän kaikissa solulinjoissa (H23, p = 0,005; A-549, p = 0,0085, HCC-44, p = 0,013), kun taas korkeita miR-141 vähensi solujen muuttoliike ainoastaan ​​A-549 (p = 0,04). (B) E-kadheriinin tasot arvioitiin immunohistokemiallisesti ja kohonneeseen havaittiin transfektoiduissa soluissa ennalta miR-200c verrattuna niihin, jotka oli transfektoitu ennen miR-141 tai pre-miR-ohjattu kaikissa kolmessa solulinjoissa.

miR-141 säätelee negatiivisesti KLF6, mikä lisää VEGFA tasolle

in vitro

, ja liittyy suurempi mikroverisuonitiheys potilasnäytteistä

Koska miR-141 yliekspressio oli aiemmin liittyvät korkeammat verisuonten muodostumista munasarjakasvaimia hiiren mallit [18], tutkimme mahdolliset vaikutukset tämän mekanismin on ennustetekijöiden roolista miR-141 NSCLC. Käyttämällä TargetScan 6.2 tunnistimme KLF6 otaksutuksi kohteena miR-141, mutta ei miR-200c. Immunoblottauksen KLF6 on H23-soluissa, jotka on transfektoitu pre-miR-141or pre-miR-200c osoitti, että vain miR-141 vähensi merkittävästi KLF6 proteiinin tasot 24 h (kuvio 5A). Koska KLF6 säätelee ilmentymisen ja erittymisen VEGFA, kriittinen angiogeeninen tekijä [19], tutkimme lisäävät miR-141 ekspressiotasot on

VEGFA

tasoilla. Me yliekspressoitu molemmat miR-141 ja miR-200C on H23, A-549 ja HCC-44 NSCLC solulinjojen ja käsiteltiin solut DFX tuottamaan hypoksia. 48 tunnin jälkeen, analysoitiin proteiinin tasot VEGFA supernatantissa näiden solujen. Yli-ilmentyminen miR-141 tuotti keskimääräisen kasvua 28% vapautumisen VEGFA (H23, p = 0,04; A-549, p = 0,03, HCC-44, p = 0,02), kun taas ei havaittu merkittäviä eroja havaittiin asennuspalveli- 200c, paitsi HCC-44-solulinja (p = 0,04) (kuvio 5B).

(A) immunoblottauksen KLF6 transfektoiduissa soluissa valmiiksi miR-Negative Control tai ennalta miR-141 /200c . miR-141 vähensi merkittävästi KLF6 proteiinin taso kolme solulinjoissa. (B) 48 tunnin kuluttua transfektion ennalta miRNA in hypoksisissa olosuhteissa, VEGFA pitoisuus viljelmän supernatantissa mitattiin ELISA: lla. Kaikki tulokset ovat keskiarvo ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta. (C) yhteensä 29 adenokarsinooma kasvainkudossektioista analysoitiin immunohistokemiallisesti CD34 + kuin aluksen merkki; kaksi edustavaa tapausta korkea /alhainen miR-141 on esitetty. (D) Merkittävät erot veren mikroverisuonitiheys välillä adenokarsinooman, joilla on korkea miR-141 ja ne, joilla on alhainen miR-141 havaittiin (p 0,001).

yrittänyt seuraavaksi määrittää, jos on olemassa suhde miR-141 ekspressiotasot ja verisuonten lukumäärä potilaan näytteissä. Määrittämisen jälkeen verisuonten lukumäärä tuumorin näytteissä 29 potilasta immunohistokemiallisesti käyttämällä vasta-ainetta CD34 +, joka on merkki verisuonen endoteelin (kuvio 5C), me luokiteltu kasvain näytteet kahteen ryhmään: korkea tai alhainen miR-141. Keskimääräinen määrä verisuonia kasvainten korkeita oli 22% korkeampi kuin keskimääräinen kasvaimissa alhainen (P 0,001; Kuva 5D).

Monimuuttujatestaus analysoi

monimuuttujamenetelmin koko kohortin me sisältyvät kaikki kliiniset ja biologiset tekijät kanssa univariate P≤0.1 ja diabetesriskitestiin perustuu miR-141 ja miR-200c ilme. MIR-141 /miR-200c riskiluku (korkean riskin vs muut) noussut itsenäisenä prognostinen markkeri lyhyemmän OS (OR, 2,787; 95% CI = 1,087-7,148; p = 0,033), yhdessä vaiheessa I ja ikä 65 (taulukko 2).

Monimuuttuja-analyysissä myös vain adenokarsinooma potilailla miR-141 /miR-200c riski tilanne oli myös itsenäinen ennustetekijä OS (OR, 10,649; 95% CI = +2,433-46,608; p = 0,002) sekä iän 65 (taulukko 2).

keskustelu

Tässä työssä, olemme havainneet, että korkea asennuspalveli- 141 ja miR-200C ilmaisu liittyy lyhyempiä hengissä resektoitiin NSCLC adenokarsinooma potilaille, mukaan lukien ne, joilla on varhaisvaiheen tauti. Lisäksi kombinatoorista vaikutus kahden miRNA oli itsenäinen ennustetekijä OS. Erilaisia ​​mekanismeja osallistuvat vaikutuksia näillä miRNA; kun taas miR-141 näyttää toimivan avulla angiogeneesiä estämällä

KLF6

ja lisäämällä

VEGFA

tasoilla, miR-200c on rooli säätelyssä MET.

Äskettäin fenotyyppinen plastisuus on oletettu häiriö- EMT-MET prosessien [20]. Induktio MET yliekspressiolla miR-200 perheenjäsenten on tärkeää myöhemmässä vaiheessa etäpesäkkeitä prosessissa. Vaikka EMT mahdollistaa solun siirtyä primaarikasvaimen, MET mahdollistaa sen asuttaa ja tuottaa etäpesäkkeitä kaukaisiin elimiin [10], [11]. Siten sekä downregulation ja yli-ilmentyminen miR-200 perheenjäsenet ovat liittyneet huonompi ennuste. Sen tutkimiseksi, jos sääntely täyttää miR-141 ja miR-200C oli histologia riippuva, ​​tutkimme niiden ennusteen arvioinnissa on kaksi suurta histologinen alatyyppi ja löysivät miR-141 ja miR-200C liittyivät OS vain adenokarsinooma potilailla. On havaittu, että NSCLC adenokarsinooma on enemmän mesenkymaaliset kaltainen kasvain tyyppiä, koska se on havaittu, että vimentiinin, merkkiaine mesenkyymisolujen, on yli-ilmentynyt hyvin eriytetty adenokarsinoomia ja H23, A-549 ja HCC-44-solulinjojen , mutta ei havaittu SCC kudoksissa [21], [22]. Mukaisesti tuloksemme, miR-200c yliekspressio markkerina huono ennuste on aiemmin raportoitu kohortin 70 NSCLC potilaiden koostuu sekä adenokarsinooma ja SCC histologialtaan [17], mutta sen ennusteen arvioinnissa ei tarkasteltu potilaiden alaryhmässä adenokarsinooma. Muissa tuumorimalleissa, kuten rintasyövän, yliekspressio miR-200 perheenjäsenten lisännyt etäpesäkkeiden [23], ja se on yhteydessä huonoon ennusteeseen [16]. Lisäksi korkea seerumin miR-141 on yhteydessä huonoon ennusteeseen paksusuolensyöpä [24] ja korkea miR-200c huonon ennusteen mahasyövän [25]. Sen sijaan teoksen tietojen avulla online TCGA tietokanta kertoi, että alhainen miR-200b *, miR-200a ja miR-429 liittyivät lyhyempi OS heterogeeninen kohortin NSCLC potilaat, jotka sisältyvät ne, joilla on etäpesäkkeitä [26] .

Koska miRNA moduloida tasoilla useita kohdeproteiinien riippuen niiden sekvenssiin, niiden vaikutus on riippuvainen proteiinien ilmaistaan ​​kunkin solutyypin [27]. Sekä miR-141 ja miR-200c sijaitsevat samassa kromosomialueelle (12p13.31) sekä sama transkription lähtö- sivustolla [28], mutta jos ryhmä miRNA on miR-200 perheen mukaan samankaltaisuutta niiden siemen sekvenssi, voimme tunnistaa kaksi eri klustereiden – miR-200BC /429 ja miR-200A /141 – jotka eroavat toisistaan ​​yhden nukleotidin muutos [29]. Vaikka miR-141 ja miR-200c transkriptionaalisesti säädellään samalla tavalla, ne eroavat toisistaan ​​tavoitteensa. Kun olemme analysoineet roolia miR-141 ja miR-200c EMT /MET että H23, A-549 ja HCC-44 solulinjat, vain miR-200c vaikutteita EMT kaikissa kolmessa solulinjoissa. Yliekspressio miR-200c lisäsi proteiinin tasot E-kadheriinin ja vähentää siirtymisen kapasiteetin kasvainsolujen, kuten aiemmin on esitetty Ceppi

et ai

eri paneelissa NSCLC solulinjoissa. Ceppi

et al

tutki ilmaus miR-200c

in vitro

ja

in vivo

ja vahva käänteinen korrelaatio invaasio havaittiin. Palauttaminen miR-200c osaksi erittäin invasiivisen /aggressiivinen NSCLC-solujen aiheuttama menetys mesenkymaaliseen fenotyypin palauttamalla E-kadheriinin ja vähentää N-kadheriiniekspressiota, ja estivät

in vitro

soluinvaasiota sekä

vuonna vivo

etäpesäkkeiden muodostumisen [30]. Lisäksi Pacurari et ai. havaitsi, että miR-200c downregulation SCC keuhkojen kasvain näytteet korreloi kohonneeseen DCL1, ATRX ja HFE – biomarkkerit liittyvät EMT [31].

Vaikka miR-141 on mir-200 perheenjäsen, se ei ollut mukana EMT /MET.

in vitro

yli-ilmentymiseen miR-141 liittyi vähentäminen

KLF6

proteiinin tasot, jotka tuottavat kasvu eritystä

VEGFA

. Lisäksi kasvaimet, joilla on korkea miR-141 oli suurempi määrä verisuonia. On osoitettu, että syöpään liittyvän fibroblasteissa (valuuttalisiin) eristettiin hiiren keuhkon adenokarsinoomat erittyy runsaasti VEGFA ja parannettu kasvainsolun invaasiota in yhteisviljelmä tutkimuksissa [32]. Kun olemme analysoineet ilmentymisen miR-141 kasvaimen ja pariksi normaalia kudosta, emme noudata merkittäviä eroja ekspressiotasoja, joka johtaa meidät spekuloida, että ennustetekijöiden rooli miR-141 voi liittyä ilmaisunsa CAF soluissa eikä kasvainsoluja. Yli-ilmentyminen miR-141 johtaisi ylituotantoa VEGFA ja lisääntynyt neoangiogeneesiin, jotka ovat aikaisemmin liittyneet ennusteen NSCLC [33].

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimuskanta ja etiikka selvitys

sata ja viisikymmentäviisi aikuisilla potilailla, joilla on diagnosoitu NSCLC, joille tehtiin täydellinen kirurginen resektio at Hospital Clinic Barcelona maaliskuun 1996 ja joulukuun 2009 on mukana tutkimuksessa. Hyväksyntä tutkimuksessa saatiin keskuksen Institutional Review Board, ja kirjallinen suostumus saatiin kunkin osallistujan mukaisesti Helsingin julistuksen.

RNA ja miRNA analyysi

Yhteensä RNA ja miRNA havaitseminen suoritetaan FFPE kasvainkudoksista kuten aikaisemmin on kuvattu [34]. MiRNA havaitseminen suoritettiin käyttäen kaupallisia määrityksiä (TaqMan MicroRNA määrityksissä, hetta Biosystems).

Western blot -analyysi

Western blot -analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [35] käyttämällä seuraavia primaaristen vasta-aineiden: KLF6 sc -7158 (Santa Cruz Biotechonology) ja α-tubuliinin (Sigma).

immunohistokemia

immunohistokemiallista määritystä suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [36] käyttämällä Flex hiiren monoklonaalinen anti-ihmisen CD34-luokka II klooni QBend 10 Ready-to-use (Dako) ja monoklonaalisia hiiren anti-ihmisen E-kadheriinin Clone NCH-38 (Dako).

Verisuonten kvantifiointiin

neljä itsenäistä alueet valittiin alla 40X kenttä, ja 200X kentän (0,785 mm

2 per kenttä) ja käytettiin laskemaan CD34-positiivisia suonia kaikilla näillä alueilla. Kaksi riippumatonta patologia tutki dioja, ja keskimäärin neljä 200X kentän laskee CD34-positiivisia suonia kirjattiin.

Solulinjat miRNA transfektio ja VEGF kvantifiointiin

H23 (American Type Culture Collection) ja HCC-44 (DSMZ) soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä (Invitrogen), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (Invitrogen). A-549 (DSMZ) soluja viljeltiin DMEM: ssä (Invitrogen), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia.

Yksi päivä ennen transfektiota, 7 x 10

4-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille. Seuraavana päivänä solut transfektoitiin 100 nM esi-miR-141 /200c tai pre-miR-Negative Control # 2 käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 24 h transfektion jälkeen solut käsiteltiin 400 uM desferrioksamiinia aiheuttaa hypoksisissa olosuhteissa. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen, VEGF pitoisuus supernatanteissa mitattiin kolmena kappaleena käyttäen VEGF Human Elisa Kit (ab100662, Abcam).

Cell muuttoliike analyysi

Solun muuttoliikettä mitattiin

in vitro

naarmu määritys [37]. 5 * 10

5 solua maljattiin 12-kuoppalevylle päivää ennen transfektiota ennalta miRNA. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen, yksisolukerrosta raaputettiin suoraviivaisesti luoda ”tyhjästä” ja p100 pipetillä kärjestä. Vaellusetäisyydet (um) arvioitiin 36 h (HCC-44) tai 48 h (H23 ja A-549) transfektion jälkeen käyttäen CellSense Entry 1.7 ohjelmisto (Olympus).

Tilastolliset analyysit

OS laskettiin leikkauksen aikana on kuolinpäivästä tai Viimeisimmässä seurannassa. Kaplan-Meier -käyrät OS, niiden 95%: n luottamusväli (CI), vedettiin ja verrattiin avulla log-rank-testi. Kaikki tekijät, joiden p-arvo 0,1 yksiulotteista analyysissä oli mukana Coxin monimuuttuja regressio analyysejä OS.

Pariksi t-testiä käytettiin vertaamaan ekspressiotasoja miRNA välillä kasvainkudoksen ja pariksi normaalia kudosta. Ei-pariksi t-testiä käytettiin vertaamaan eroja kahden ryhmän välillä. Optimaalinen cutoffs of miRNA ilmaisun tietojen OS arvioitiin avulla maksimaalisesti valittujen log-rank tilastojen avulla Maxstat paketti (R paketti). Sovellettavuus Näiden cutoffs vahvistettiin Kaplan-Meier testi. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen PASW Statistics v18 (SPSS) ja R v2.8.1. Merkitsevyystasoksi asetettiin ≤0.05.

tukeminen Information

Kuva S1.

ekspressiotasot miR-200 perheenjäseniä saatu 155 NSCLC kasvain ja pariksi normaalia kudosta. (A) Ryhmä 1: miR-200a miR-200b, ja miR-429. (B) Ryhmä 2: miR-141 ja miR-200c.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0101899.s001

(TIF) B